Name: Hybrydyzacja in situ mikroRNA dla tkanek nerek utrwalonych formaliną (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-30T19:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: Naucz się hybrydyzacji in situ mikroRNA w tkankach nerek utrwalonych formaliną. Ta metoda umożliwia lokalizację i ilościowe określenie ekspresji mikroRNA w różnych segmentach nefronu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez granty amerykańskich Narodowych Instytutów Zdrowia HL082798 i HL111580.

1. Skrawki tkanki nerkowej
<ol>
	<li>Utrwalone formaliną (10%) skrawki nerek zatopione w parafinie są wycinane na szkiełkach mikroskopowych o grubości 5 mm za pomocą Microm HM 355 S. Preparaty mogą być przechowywane przez kilka miesięcy przed analizą.</li>
</ol>
2. Przygotowanie roztworu
<ol>
	<li>Przygotuj 1 l 1x PBS w ddH2O w autoklawowalnej butelce z zakrętką. Napełnij kolejną butelkę 1 litrem ddH2O. Do każdej butelki dodaj 1 ml DEPC, przykryj i energicznie wstrząśnij. Pozostaw roztwory na noc w temperaturze pokojowej, aby zniszczyć RNA, a następnie autoklaw. Dodaj 400 ml Tween-20 do 1 l 1x PBS, aby uzyskać PBS-T.</li>
	<li>Przygotować bufor proteinazy K (50 mMTris-HCl, pH 8,0 i 1 mM CaCl2 w wodzie uzdatnionej DEPC).</li>
	<li>Przygotować roztwór 0,2% glicyny w PBS-T.</li>
</ol>
3. Przygotowanie tkanek
<ol>
	<li>Przygotować dużą objętość buforu hybrydyzacyjnego (50-100 ml) składającego się z 50% formamidu, 5 x SSC, 0,1% Tween, 9,2 mM kwasu cytrynowego w celu dostosowania do pH 6, 50 μg/ml heparyny i 500 μg/ml RNA drożdży w ddH2O. Podzielić na 1 ml porcji i przechowywać w temperaturze -80 ºC.</li>
	<li>Usuń parafinę z tkanki myjąc 3x w świeżym ksylenie przez 5 min każde.</li>
	<li>Uwodnić skrawki tkanek przez 5 minut inkubacji w zmniejszających się stężeniach etanolu (100%, 75%, 50% i 25%) w ddH2O.</li>
	<li>Preparaty należy potraktować wystarczającą ilością DEPC, aby całkowicie pokryć skrawki tkanek (około 0,4-0,5 ml) przez 1 minutę. Upewnij się, że chusteczki nie wysychają.</li>
	<li>Opłucz szkiełka w PBS-T poddanym działaniu DEPC dwa razy przez 5 minut, zbierając DEPC zawierające odpady w celu prawidłowej utylizacji. Od tego momentu wszystkie odczynniki powinny być poddawane działaniu DEPC w celu wyeliminowania RNAZ.</li>
	<li>Wstępnie rozgrzać bufor proteinazy K i dodać proteinazę K do końcowego stężenia 10 μg/ml. Przykryć skrawki tkanek roztworem proteinazy K i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Szybko usuń roztwór proteinazy K i dodaj 0,2% glicyny do PBS-T na 30 sekund.</li>
	<li>Przepłukać szkiełka w PBS-T poddanym działaniu DEPC dwa razy po 30 sekund każda.</li>
	<li>Utrwal skrawki w świeżo przygotowanym 4% paraformaldehydzie na 10 minut.</li>
</ol>
4. Hybrydyzacja
<ol>
	<li>Dodać 50 μl buforu hybrydyzacyjnego (50% formamidu, 5 x SSC, 0,1% Tween, 9,2 mM kwasu cytrynowego do dostosowania do pH 6, 50 μg/ml heparyny, 500 μg/ml RNA drożdży) na wycinek tkanki i przykryć wolnymi od RNAzy HybriSlips wyciętymi nieco większymi niż skrawki tkanki.</li>
	<li>Prehybrydyzacja skrawków w piecu do hybrydyzacji o kontrolowanej wilgotności przez 2 godziny w temperaturze hybrydyzacji określonej dla sondy znakowanej digoksygeniną 3' (zwykle DNA Tm sondy -21 °C, (tj. 54 °C dla miR-382, sondy DNA Tm = 75 °C), przy użyciu chusteczek laboratoryjnych nasączonych 50% formamidem / 50% 5x SSC w celu utrzymania wilgotności komory.</li>
	<li>Rozcieńczyć sondę miRNA, kontrolę pozytywną (U6, małe jądrowe RNA) i kontrolę ujemną (sekwencja zakodowana) do 40 nM w buforze hybrydyzacyjnym (potrzeba 75 μl buforu na sekcję).</li>
	<li>Podgrzewać sondę w buforze hybrydyzacyjnym w temperaturze 65 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Usuń szkiełka z pieca do hybrydyzacji i usuń szkiełka nakrywkowe i nadmiar bufora hybrydyzacyjnego z prehybrydyzacji.</li>
	<li>Dodać 75 μl sondy zawierającej bufor na każdy wycinek tkanki, bezpośrednio do tkanki. Przykryj tkankę preparatem HybriSlips na tyle dużą, aby pokryć jej sekcje tkanki.</li>
	<li>Utrzymując uchwyt szkiełka poziomo, wróć do pieca do hybrydyzacji w celu inkubacji przez noc w temperaturze z kroku 4.2 (około 16 godzin).</li>
</ol>
5. Pranie surowości
<ol>
	<li>Dodaj 200 μl 2x SSC, podgrzane do temperatury hybrydyzacji, tuż pod jedną krawędzią szkiełek nakrywkowych, aby pomóc uwolnić szkiełko nakrywkowe z tkanki. Zdejmij szkiełko nakrywkowe, przechylając szkiełko.</li>
	<li>Umyć szkiełka w 200 μl 50% formamidu, 50% 2x SSC w temperaturze hybrydyzacji 3x przez 30 min każde.</li>
	<li>Przepłukać szkiełka 5x w PBS-T w temperaturze pokojowej przez 5 minut każda na wytrząsarce orbitalnej na niskich obrotach.</li>
</ol>
6. Wykrywanie
<ol>
	<li>Inkubować szkiełko w buforze blokującym (2% surowica kozia lub końska, 2 mg/ml BSA w PBS-T) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej na niskiej prędkości.</li>
	<li>Rozcieńczyć fragmenty anty-DIG-AP Fab w buforze blokującym w stosunku 1:100. Dodać 100 μl na każdy fragment tkanki i przykryć HybriSlips wyciętym na tyle dużym, aby pokryć sekcje.</li>
	<li>Inkubować przeciwciała w wilgotnej komorze w temperaturze 4 °C przez noc (około 16 godzin).</li>
	<li>Umyj szkiełka w PBS-T 7x, przez 5 minut każda na wytrząsarce orbitalnej z niską prędkością.</li>
	<li>Umyj szkiełka w buforze AP (100 mM TrisHCl pH 9,5, 50 mM MgCl 2,100 mM NaCl, 0,1% Tween 20) 3x po 5 minut każda.</li>
	<li>Dodać roztwór NBT/BCIP do buforu AP (bufor 200 μl/10 ml)</li>
	<li>Dodać 400-500 ml rozcieńczonego roztworu NBT/BCIP do każdego szkiełka, aby całkowicie pokryć wszystkie skrawki tkanki. Rozwijać w ciemnej, równej, nawilżonej komorze przez 4-5 godzin.</li>
</ol>
7. Montaż prowadnic
<ol>
	<li>Odwadniać sekcje w rosnących stężeniach etanolu (25%, 50%, 75%, 100%) przez 5 minut każda.</li>
	<li>Inkubować w ksylenie 5x w celu oczyszczenia skrawków.</li>
	<li>Zamontuj prowadnice w średnim roztworze montażowym Permount i wysusz przez noc.</li>
</ol>

<ol><li>Nagalakshmi, V. K., Ren, Q., Pugh, M. M., Valerius, M. T., McMahon, A. P., Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dicer+regulates+thedevelopment+of+nephrogenic+and+ureteric+compartments+in+the+mammalian+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Dicer regulates thedevelopment of nephrogenic and ureteric compartments in the mammalian kidney.</a> Kidney Int. 79 (3), 317-330 (2011).</li>
<li>Ho, J., Pandey, P., Schatton, T., Sims-Lucas, S., Khalid, M., Frank, M. H., Hartwig, S., Kreidberg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pro-apoptotic+protein+Bim+is+a+MicroRNA+target+in+kidney+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Neph%22%5BJournal%5D)">The pro-apoptotic protein Bim is a MicroRNA target in kidney progenitors.</a> J. Am. Soc. Neph. 22 (6), 1053-1063 (2011).</li>
<li>Tian, Z., Greene, A. S., Pietrusz, J. L., Matus, I. R., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-target+pairs+in+the+rat+kidney+identified+by+microRNA+microarray%2C+proteomic%2C+and+bioinformaticanalysis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-target pairs in the rat kidney identified by microRNA microarray, proteomic, and bioinformaticanalysis.</a> Genome Res. 18 (3), 404-411 (2008).</li>
<li>Mladinov, D., Liu, Y., Mattson, D. L., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+contribute+to+the+maintenance+of+cell-type-specific+physiological+characteristics%3A+miR-192+targets+Na%2B%2FK%2B-ATPase+%CE%B21%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs contribute to the maintenance of cell-type-specific physiological characteristics: miR-192 targets Na+/K+-ATPase β1.</a> Nucleic Acids Res. 41 (2), 1273-1283 (2013).</li>
<li>Liu, Y., Taylor, N. E., Lu, L., Usa, K., Cowley, A. W., Ferreri, N. R., Yeo, N. C., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+medullary+microRNAs+in+Dahl+salt-sensitive+rats%3A+miR-29b+regulates+several+collagens+and+related+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Renal medullary microRNAs in Dahl salt-sensitive rats: miR-29b regulates several collagens and related genes.</a> Hypertension. 55 (4), 974-982 (2010).</li>
<li>Kato, M., Zhang, J., Wang, M., Lanting, L., Yuan, H., Rossi, J. J., Natarajan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-192+in+diabetic+kidney+glomeruliand+its+function+in+TGF-b-induced+collagen+expression+via+inhibition+of+E-box+repressors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-192 in diabetic kidney glomeruliand its function in TGF-b-induced collagen expression via inhibition of E-box repressors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (4), 3432-3437 (2007).</li>
<li>Krupa, A., Jenkins, R., Luo, D. D., Lewis, A., Phillips, A., Fraser, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+microRNA-192+promotes+fibrogenesis+in+diabetic+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Neph%22%5BJournal%5D)">Loss of microRNA-192 promotes fibrogenesis in diabetic nephropathy.</a> J. Am. Soc. Neph. 21 (3), 438-447 (2010).</li>
<li>Wang, B., Herman-Edelstein, M., Koh, P., Burns, W., Jandeleit-Dahm, K., Watson, A., Saleem, M., Goodall, G. J., Twigg, S. M., Cooper, M. E., Kantharidis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-cadherin+expression+is+regulated+by+miR-192%2F215+by+a+mechanism+that+is+independent+of+the+profibrotic+effects+of+transforming+growth+factor-%CE%B2%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">E-cadherin expression is regulated by miR-192/215 by a mechanism that is independent of the profibrotic effects of transforming growth factor-β.</a> Diabetes. 59 (7), 1794-1802 (2010).</li>
<li>Kato, M., Arce, L., Wang, M., Putta, S., Lanting, L., Natarajan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microRNA+circuit+mediates+transforming+growth+factor-%CE%B21+autoregulation+in+renal+glomerular+mesangial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">A microRNA circuit mediates transforming growth factor-β1 autoregulation in renal glomerular mesangial cells.</a> Kidney Int. 80 (4), 358-368 (2011).</li>
<li>Gottardo, F., Liu, C. G., Ferracin, M., Calin, G. A., Fassan, M., Bassi, P., Sevignani, C., Byrne, D., Negrini, M., Pagano, F., Gomella, L. G., Croce, C. M., Baffa, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-RNA+profiling+in+kidney+and+bladder+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Urol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Micro-RNA profiling in kidney and bladder cancers.</a> Urol. Oncol. 25 (5), 387-392 (2007).</li>
<li>Juan, D., Alexe, G., Antes, T., Liu, H., Madabhushi, A., Delisi, C., Ganesan, S., Bhanot, G., Liou, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+microRNA+panel+for+clear-cell+kidney+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Urol%22%5BJournal%5D)">Identification of a microRNA panel for clear-cell kidney cancer.</a> Urol. 75 (4), 835-841 (2010).</li>
<li>Xu, X., Kriegel, A. J., Liu, Y., Usa, K., Mladinov, D., Liu, H., Fang, Y., Ding, X., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+ischemic+preconditioning+contributes+to+renal+protection+by+upregulation+of+miR-21%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Delayed ischemic preconditioning contributes to renal protection by upregulation of miR-21.</a> Kidney Int. 82 (11), 1167-1175 (2012).</li>
<li>Kriegel, A. J., Mladinov, D., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+study+of+microRNAs+and+its+application+in+kidney+disease+and+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Translational study of microRNAs and its application in kidney disease and hypertension.</a> 122 (10), 439-447 (2012).</li>
<li>Kloosterman, W. P., Wienholds, E., de Bruijn, E., Kauppinen, S., Plasterk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+miRNAs+in+animal+embryos+using+LNA-moidified+oligonucleotide+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">In situ detection of miRNAs in animal embryos using LNA-moidified oligonucleotide probes.</a> Nat. Methods. 3 (1), 27-29 (2006).</li>
<li>Nelson, P. T., Baldwin, D. A., Kloosterman, W. P., Kauppinen, S., Plasterk, R. H., Mourelatos, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAKE+and+LNA-ISH+reveal+microRNA+expression+and+localization+in+archival+human+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">RAKE and LNA-ISH reveal microRNA expression and localization in archival human brain tissue.</a> RNA. 12 (2), 187-191 (2006).</li>
<li>Obernosterer, G., Martinez, J., Alenius, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locked+nucleic+acid-based+in+situ+detection+of+microRNAs+in+mouse+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Locked nucleic acid-based in situ detection of microRNAs in mouse tissue sections.</a> Nat. Protocols. 2 (6), 1508-1514 (2007).</li>
<li>Kriegel, A. J., Liu, Y., Cohen, B., Usa, K., Liu, Y., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiR-382+targeting+of+kallikrein+5+contributes+to+renal+inner+medullary+interstitial+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Genomics%22%5BJournal%5D)">MiR-382 targeting of kallikrein 5 contributes to renal inner medullary interstitial fibrosis.</a> Physiol. Genomics. 44 (4), 259-267 (2012).</li>
</ol>

Nie ma nic do ujawnienia.

Celem tego artykułu było opisanie protokołu hybrydyzacji miRNA in situ , który dobrze sprawdza się w tkankach nerkowych utrwalonych w formalinie. Podczas opracowywania tego protokołu zidentyfikowano kilka ważnych źródeł artefaktów barwiących. Zwrócenie szczególnej uwagi na te punkty może pomóc uniknąć zabarwienia artefaktu i zwiększyć prawdopodobieństwo udanego przebiegu ISH.
Jedna z najłatwiejszych do uniknięcia przyczyn artefaktu barwienia może wystąpić, gdy skrawki tkanek wysychają...

MicroRNA to małe (około 22 nukleotydy długości) niekodujące RNA, które są wytwarzane endogennie. Na ogół działają w celu tłumienia ekspresji białek poprzez represję translacyjną lub degradację mRNA. miRNA wiążą się z celami mRNA z niepełną komplementarnością, dzięki czemu pojedynczy miRNA może tłumić wiele celów.
Zrozumienie, które typy komórek i struktury wyrażają miRNA, jest ważną częścią zrozumienia mechanizmów, poprzez które zmiany w ekspresji miRNA wpływają na fenotypy komórek i tkanek. Podczas gdy metody takie jak sekwencjonowanie miRNA, qPCR i Northern blotting mogą być stosowane do wykrywania miRNA w całych tkankach, takie podejście nie pozwala na określenie, z jakiego konkretnego typu komórek pochodzą w danej tkance. Sekcja składników komórkowych i strukturalnych przed analizą przy użyciu tych metod może być bardzo trudna, a warunki potrzebne do uzyskania odpowiednich izolacji mogą prowadzić do zmian w ekspresji genów lub degradacji RNA. Hybrydyzacja mikroRNA in situ to metoda stosowana do wizualizacji lokalizacji i poziomów ekspresji mikroRNA w tkankach. Technika ta jest szczególnie cenna w tkankach złożonych z niejednorodnych struktur, takich jak nerka.
Wykazano, że mikroRNA odgrywają rolę regulacyjną w rozwoju nerek2,3 i fizjologii4. Wykazano również, że zmiany w ekspresji mikroRNA są związane z patologią nerek, taką jak zwłóknienie5-10, nefropatia cukrzycowa7, rak nerki11,12 i ostre uszkodzenie nerek13. W naszych badaniach odkryliśmy, że optymalizacja hybrydyzacji in situ mikroRNA dla tkanek nerek była cenna dla określenia dokładnych lokalizacji strukturalnych ekspresji miRNA zarówno w zdrowiu, jak i chorobie14. Określenie kanalikowatej i komórkowej ekspresji różnych mikroRNA jest ważne, ponieważ ich regulacja celów może być zależna od funkcji komórkowych. W stanach chorobowych ważne jest również określenie, w jaki sposób zmiany w ekspresji miRNA mogą wpływać na funkcję.
Celem opisanej tutaj metody było rozwinięcie istniejących metodologii ISH opracowanych przez Kloostermana i wsp. 15, inni badacze16,17 i ci sugerowani przez Exiqon1 i optymalizują metodę dla tkanek nerkowych utrwalonych w formalinie. Z powodzeniem zastosowaliśmy tę metodę do identyfikacji wyraźnych regionalnych różnic w ekspresji nerkowego mikroRNA miR-382 z jednostronną niedrożnością moczowodu18. Takie podejście można zastosować również w przypadku innych tkanek, z dodatkową optymalizacją.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>pirowęglan dietylu</td><td>Sigma</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Ksyleny</td><td>Sigma</td><td>534056</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Ultra Pure</td><td>200CSPTP</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Life Technologie</td><td>15506-017</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C2536</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>J.T. Baker</td><td>4059-00</td><td></td></tr><tr><td>Kwas cytrynowy</td><td>Sigma</td><td>C2404</td><td></td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Sigma</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>Buffer Life Technologies</td><td>15557-044</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>SAGENT</td><td>25021-400-30</td><td></td></tr><tr><td>Drożdże RNA</td><td>Life Technologies</td><td>AM7118</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266-1004</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>J.T. Baker</td><td>4058-01</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Fermentas</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>3' DIG- sonda miRNA</td><td>Exiqon</td><td>miR dependent-05</td><td></td></tr><tr><td>3' DIG- Sonda miR z kodowaniem</td><td>Exiqon</td><td>99004-05</td><td></td></tr><tr><td>3' Sonda DIG-U6 miR</td><td>Exiqon</td><td>99002-05</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Digoxigenin-Ab Fab</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>NBT/BCIP</td><td>Roche</td><td>11681451001</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>Fisher</td><td>Dopasowane do rozmiaru</td><td></td></tr><tr><td>tkanki Microtom HM 355 S</td><td>Thermo Scientific</td><td>23-900-672</td><td></td></tr><tr><td>Wysuwany piec hybrydyzacyjny</td><td>Boekel</td><td>241000</td><td></td></tr><tr><td>Zespół tacy aluminiowej</td><td>Boekel</td><td>C2403973</td><td></td></tr><tr><td>Wkładka do stojaka ze stali nierdzewnej</td><td>Boekel</td><td>C2403754</td><td></td></tr></tbody></table>

hybrydyzacja in situ mikrorna dla tkanek nerek utrwalonych formaliną

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

W tym artykule opisujemy metodę kolorymetrycznego wykrywania miRNA w nerkach poprzez hybrydyzację in situ z sondami mikroRNA oznaczonymi digoksygeniną. Protokół ten, pierwotnie opracowany przez Kloostermana i współpracowników do szerokiego zastosowania z sondami miRNAExiqon 1, został zmodyfikowany w celu przezwyciężenia wyzwań związanych z analizą miRNA w tkankach nerkowych. Należą do nich takie kwestie, jak identyfikacja struktury i trudne do usunięcia resztki sondy i przeciwciała. Zastosowanie stosunkowo cienkich skrawków tkanek o grubości 5 mm pozwoliło na wyraźną wizualizację struktur nerkowych, przy jednoczesnym zachowaniu w komórkach silnego sygnału sondy. Ponadto zoptymalizowano koncentrację sondy i warunki inkubacji, aby ułatwić wizualizację ekspresji mikroRNA o niskim tle i niespecyficznym sygnale. W tym miejscu opisany jest zoptymalizowany protokół, obejmujący wstępne pobranie i przygotowanie tkanek poprzez montaż szkiełek na końcu zabiegu. Podstawowe składniki tego protokołu mogą być modyfikowane w celu zastosowania do innych tkanek i modeli kultur komórkowych.

Obszary przekroju tkanki, które wysychają podczas etapów hybrydyzacji, inkubacji lub przemywania, zazwyczaj wykazują ciemniejsze barwienie podczas procesu detekcji NBT/BCIP. Rysunek 1 przedstawia fragment przekroju nerki, w którym HybriSlip zsunął się z krawędzi tkanki, co doprowadziło do jej częściowego odwodnienia. Mimo rehydratacji i pokrycia w kolejnych etapach, sygnał w odwodnionej części jest sztucznie zawyżony.
Znaczenie kontrolowania czasu wywoływania NBT-BCIP zostało ...

Ten artykuł opisuje protokół hybrydyzacji in situ zoptymalizowany do kolormetrycznego wykrywania ekspresji mikroRNA w stałych odcinkach nerki z formaliną.

Hybrydyzacja in situ mikroRNA dla tkanek nerek utrwalonych formaliną

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA ...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest lokalizacja i ilościowe określenie ekspresji mikroRNA w tkankach nerek. Osiąga się to najpierw poprzez hybrydyzację sondy znakowanej digeksygeniną z określonym mikroRNA w tkance nerki. W drugim kroku tkankę inkubuje się z przeciwciałem przeciwko digeksygeninie, sprzężonym z fosfatazą alkaliczną.Następnie do tkanki dodaje się substrat N-B-T-B-C-I-P w celu wizualizacji lokalizacji mikroRNA poprzez powstanie niebieskiego produktu w miejscach hybrydyzacji sond mikroRNA; uzyskane wyniki pokazują, gdzie mikroRNA są ekspresowane w obszarach nerek i segmentach nefronów na podstawie hybrydyzacji komplementarnych sond mikroRNA. W tej procedurze wykorzystuje się utrwalone w formalinie i zatopione w parafinie przekroje nerek, naniesione na szkiełka mikroskopowe przy grubości 5 µm. Aby przygotować przekroje nerek do analizy, należy najpierw usunąć parafinę z tkanki poprzez trzykrotne przemycie w świeżym ksylenie przez 5 minut.Następnie należy rehydratować przekroje tkanek poprzez pięciominutowe inkubacje w malejących stężeniach etanolu w wodzie dwukrotnie destylowanej. Następnie preparaty na szkiełkach należy potraktować wystarczającą ilością dathylu,

microrna-in-situ-hybridization-for-formalin-fixed-kidney-tissues

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

MikroRNA in situ hybrydyzacja dla formalinowo fiksowanych tkanek nerkowych

Niniejszy protokół hybrydyzacji in situ w preparatach całych określa krytyczne etapy zapewniające powtarzalne, wysokiej jakości wyniki w badaniach ekspresji genów w embrionach myszy w wieku od E8.5 do E11.5 dnia.

Hybrydyzacja in situ w całym preparacie zarodków myszy od E8.5 do E11.5

W niniejszej pracy opisujemy wydajną, wysokoprzepustową metodę hybrydyzacji in situ (ISH) służącą do wizualizacji wzorców ekspresji mRNA w przekrojach rozwijającej się tkanki prostaty zarodka myszy. Metodę tę można łatwo dostosować do wizualizacji wzorców ekspresji mRNA w innych tkankach myszy lub w tkankach innych gatunków.

Metoda wysokoprzepustowej hybrydyzacji in situ do charakteryzacji wzorców ekspresji mRNA w dolnym odcinku dróg moczowo-płciowych płodu myszy

Tutaj opisujemy uproszczony protokół analiz ekspresji mikroRNA (miRNA) w archiwalnych tkankach klinicznych z utrwalonym formaliną, parafiną (FFPE) lub świeżo mrożonym rakiem prostaty (PCa) z wykorzystaniem ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (RT-PCR) i hybrydyzacji in situ (ISH).

Analizy ekspresji miRNA w tkankach klinicznych raka gruczołu krokowego

Tutaj prezentujemy protokół do wykrywania ekspresji miRNA w próbkach pobranych od pacjentów z rakiem piersi za pomocą hybrydyzacji miRNA in situ.

Kliniczno-patologiczna analiza ekspresji miRNA w tkankach raka piersi przy użyciu hybrydyzacji miRNA in situ

mikro-RNA (miRNA) to krótkie i wysoce homologiczne sekwencje RNA, służące jako posttranskrypcyjne regulatory informacyjnych RNA (mRNA). Obecne metody wykrywania miRNA różnią się czułością i swoistością. Opisujemy protokół, który łączy hybrydyzację in situ i barwienie immunologiczne w celu jednoczesnego wykrywania cząsteczek miRNA i białka na odcinkach tkanki serca myszy.

Specyficzne tkankowo profilowanie ekspresji miRNA w wycinkach serca myszy przy użyciu hybrydyzacji in situ

Opisujemy protokół laserowej mikrodysekcji podsegmentów ludzkiej nerki, w tym kłębuszka nerkowego, kanalika proksymalnego, grubej kończyny wstępującej, przewodu zbiorczego i śródmiąższu. RNA jest następnie izolowane z uzyskanych przedziałów i przeprowadza się sekwencjonowanie RNA w celu określenia zmian w sygnaturze transkryptomicznej w każdym podsegmencie.

Zastosowanie mikrodysekcji laserowej do odkrycia regionalnej transkryptomiki w ludzkiej tkance nerkowej

Ten artykuł przedstawia protokół wykrywania ekspresji mikroRNA w nerkach mysiego modelu ostrego uszkodzenia nerek za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym. Protokół ten kładzie nacisk na mysi model niedokrwiennego uszkodzenia nerek i staranną ekstrakcję próbek mikroRNA.

Ilościowa metoda wykrywania mikroRNA w nerce mysiego modelu niedokrwiennego uszkodzenia nerki

Opisujemy metodę oceny ekspresji mikroRNA w nerkach myszy z jednostronną niedrożnością moczowodu (UUO) za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją. Protokół ten jest odpowiedni do badania profili ekspresji mikroRNA nerek u myszy z UUO oraz w kontekście innych stanów patologicznych.

Ilościowa ocena ekspresji mikroRNA PCR w czasie rzeczywistym w nerce myszy z jednostronną niedrożnością moczowodu

mikroRNA biorą udział w patogenezie nefropatii IgA. Opracowaliśmy niezawodną metodę wykrywania poziomów ekspresji mikroRNA w nerkach mysiego modelu nefropatii IgA (myszy HIGA). Ta nowa metoda ułatwi sprawdzenie udziału miRNA w nefropatii IgA.

Wykrywanie ekspresji mikroRNA w nerkach myszy nefropatycznych z immunoglobuliną A

Tutaj dostarczamy egzogenne, sztucznie syntetyzowane mimiki miRNA do nerki poprzez wstrzyknięcie do żyły ogonowej wektora niewirusowego i nanocząsteczek polietyleniminy w kilku modelach myszy z chorobą nerek. Doprowadziło to do znacznej nadekspresji docelowego miRNA w nerce, co spowodowało zahamowanie progresji choroby nerek w kilku modelach mysich.

Dostarczanie egzogennego, sztucznie syntetyzowanego miRNA naśladującego mimikę do nerki przy użyciu nanocząstek polietyleniminy w kilku mysich modelach choroby nerek

Protokół opisuje tandemowy test hybrydyzacji immunofluorescencji z tkanką formalinowo-zafiksowaną w parafinę, mającą na celu jednoczesne wykrywanie i ilościowe mikroRNA oraz multipleksowane białka.

Amplifikacja i rozpoznawanie mikroRNA poprzez hybrydyzację in situ z użyciem kwasów nukleinowych z zamkniętymi nukleinami jako nowatorska metoda wykrywania i ilościowania

Naucz się hybrydyzacji in situ mikroRNA w tkankach nerek utrwalonych formaliną. Ta metoda umożliwia lokalizację i ilościowe określenie ekspresji mikroRNA w różnych segmentach nefronu.

Hybrydyzacja in situ mikroRNA dla tkanek nerek utrwalonych formaliną

Przeglądaj więcej filmów