Name: Hybrydyzacja in situ mikroRNA dla tkanek nerek utrwalonych formaliną (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-30T19:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: Naucz się hybrydyzacji in situ mikroRNA w tkankach nerek utrwalonych formaliną. Ta metoda umożliwia lokalizację i ilościowe określenie ekspresji mikroRNA w różnych segmentach nefronu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty amerykańskich Narodowych Instytutów Zdrowia HL082798 i HL111580.

1. Skrawki tkanki nerkowej
<ol>
	<li>Utrwalone formaliną (10%) skrawki nerek zatopione w parafinie są wycinane na szkiełkach mikroskopowych o grubości 5 mm za pomocą Microm HM 355 S. Preparaty mogą być przechowywane przez kilka miesięcy przed analizą.</li>
</ol>
2. Przygotowanie roztworu
<ol>
	<li>Przygotuj 1 l 1x PBS w ddH2O w autoklawowalnej butelce z zakrętką. Napełnij kolejną butelkę 1 litrem ddH2O. Do każdej butelki dodaj 1 ml DEPC, przykryj i energicznie wstrząśnij. Pozostaw roztwory na noc w temperaturze pokojowej, aby zniszczyć RNA, a następnie autoklaw. Dodaj 400 ml Tween-20 do 1 l 1x PBS, aby uzyskać PBS-T.</li>
	<li>Przygotować bufor proteinazy K (50 mMTris-HCl, pH 8,0 i 1 mM CaCl2 w wodzie uzdatnionej DEPC).</li>
	<li>Przygotować roztwór 0,2% glicyny w PBS-T.</li>
</ol>
3. Przygotowanie tkanek
<ol>
	<li>Przygotować dużą objętość buforu hybrydyzacyjnego (50-100 ml) składającego się z 50% formamidu, 5 x SSC, 0,1% Tween, 9,2 mM kwasu cytrynowego w celu dostosowania do pH 6, 50 μg/ml heparyny i 500 μg/ml RNA drożdży w ddH2O. Podzielić na 1 ml porcji i przechowywać w temperaturze -80 ºC.</li>
	<li>Usuń parafinę z tkanki myjąc 3x w świeżym ksylenie przez 5 min każde.</li>
	<li>Uwodnić skrawki tkanek przez 5 minut inkubacji w zmniejszających się stężeniach etanolu (100%, 75%, 50% i 25%) w ddH2O.</li>
	<li>Preparaty należy potraktować wystarczającą ilością DEPC, aby całkowicie pokryć skrawki tkanek (około 0,4-0,5 ml) przez 1 minutę. Upewnij się, że chusteczki nie wysychają.</li>
	<li>Opłucz szkiełka w PBS-T poddanym działaniu DEPC dwa razy przez 5 minut, zbierając DEPC zawierające odpady w celu prawidłowej utylizacji. Od tego momentu wszystkie odczynniki powinny być poddawane działaniu DEPC w celu wyeliminowania RNAZ.</li>
	<li>Wstępnie rozgrzać bufor proteinazy K i dodać proteinazę K do końcowego stężenia 10 μg/ml. Przykryć skrawki tkanek roztworem proteinazy K i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Szybko usuń roztwór proteinazy K i dodaj 0,2% glicyny do PBS-T na 30 sekund.</li>
	<li>Przepłukać szkiełka w PBS-T poddanym działaniu DEPC dwa razy po 30 sekund każda.</li>
	<li>Utrwal skrawki w świeżo przygotowanym 4% paraformaldehydzie na 10 minut.</li>
</ol>
4. Hybrydyzacja
<ol>
	<li>Dodać 50 μl buforu hybrydyzacyjnego (50% formamidu, 5 x SSC, 0,1% Tween, 9,2 mM kwasu cytrynowego do dostosowania do pH 6, 50 μg/ml heparyny, 500 μg/ml RNA drożdży) na wycinek tkanki i przykryć wolnymi od RNAzy HybriSlips wyciętymi nieco większymi niż skrawki tkanki.</li>
	<li>Prehybrydyzacja skrawków w piecu do hybrydyzacji o kontrolowanej wilgotności przez 2 godziny w temperaturze hybrydyzacji określonej dla sondy znakowanej digoksygeniną 3' (zwykle DNA Tm sondy -21 °C, (tj. 54 °C dla miR-382, sondy DNA Tm = 75 °C), przy użyciu chusteczek laboratoryjnych nasączonych 50% formamidem / 50% 5x SSC w celu utrzymania wilgotności komory.</li>
	<li>Rozcieńczyć sondę miRNA, kontrolę pozytywną (U6, małe jądrowe RNA) i kontrolę ujemną (sekwencja zakodowana) do 40 nM w buforze hybrydyzacyjnym (potrzeba 75 μl buforu na sekcję).</li>
	<li>Podgrzewać sondę w buforze hybrydyzacyjnym w temperaturze 65 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Usuń szkiełka z pieca do hybrydyzacji i usuń szkiełka nakrywkowe i nadmiar bufora hybrydyzacyjnego z prehybrydyzacji.</li>
	<li>Dodać 75 μl sondy zawierającej bufor na każdy wycinek tkanki, bezpośrednio do tkanki. Przykryj tkankę preparatem HybriSlips na tyle dużą, aby pokryć jej sekcje tkanki.</li>
	<li>Utrzymując uchwyt szkiełka poziomo, wróć do pieca do hybrydyzacji w celu inkubacji przez noc w temperaturze z kroku 4.2 (około 16 godzin).</li>
</ol>
5. Pranie surowości
<ol>
	<li>Dodaj 200 μl 2x SSC, podgrzane do temperatury hybrydyzacji, tuż pod jedną krawędzią szkiełek nakrywkowych, aby pomóc uwolnić szkiełko nakrywkowe z tkanki. Zdejmij szkiełko nakrywkowe, przechylając szkiełko.</li>
	<li>Umyć szkiełka w 200 μl 50% formamidu, 50% 2x SSC w temperaturze hybrydyzacji 3x przez 30 min każde.</li>
	<li>Przepłukać szkiełka 5x w PBS-T w temperaturze pokojowej przez 5 minut każda na wytrząsarce orbitalnej na niskich obrotach.</li>
</ol>
6. Wykrywanie
<ol>
	<li>Inkubować szkiełko w buforze blokującym (2% surowica kozia lub końska, 2 mg/ml BSA w PBS-T) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej na niskiej prędkości.</li>
	<li>Rozcieńczyć fragmenty anty-DIG-AP Fab w buforze blokującym w stosunku 1:100. Dodać 100 μl na każdy fragment tkanki i przykryć HybriSlips wyciętym na tyle dużym, aby pokryć sekcje.</li>
	<li>Inkubować przeciwciała w wilgotnej komorze w temperaturze 4 °C przez noc (około 16 godzin).</li>
	<li>Umyj szkiełka w PBS-T 7x, przez 5 minut każda na wytrząsarce orbitalnej z niską prędkością.</li>
	<li>Umyj szkiełka w buforze AP (100 mM TrisHCl pH 9,5, 50 mM MgCl 2,100 mM NaCl, 0,1% Tween 20) 3x po 5 minut każda.</li>
	<li>Dodać roztwór NBT/BCIP do buforu AP (bufor 200 μl/10 ml)</li>
	<li>Dodać 400-500 ml rozcieńczonego roztworu NBT/BCIP do każdego szkiełka, aby całkowicie pokryć wszystkie skrawki tkanki. Rozwijać w ciemnej, równej, nawilżonej komorze przez 4-5 godzin.</li>
</ol>
7. Montaż prowadnic
<ol>
	<li>Odwadniać sekcje w rosnących stężeniach etanolu (25%, 50%, 75%, 100%) przez 5 minut każda.</li>
	<li>Inkubować w ksylenie 5x w celu oczyszczenia skrawków.</li>
	<li>Zamontuj prowadnice w średnim roztworze montażowym Permount i wysusz przez noc.</li>
</ol>

<ol><li>Nagalakshmi, V. K., Ren, Q., Pugh, M. M., Valerius, M. T., McMahon, A. P., Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dicer+regulates+thedevelopment+of+nephrogenic+and+ureteric+compartments+in+the+mammalian+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Dicer regulates thedevelopment of nephrogenic and ureteric compartments in the mammalian kidney.</a> Kidney Int. 79 (3), 317-330 (2011).</li>
<li>Ho, J., Pandey, P., Schatton, T., Sims-Lucas, S., Khalid, M., Frank, M. H., Hartwig, S., Kreidberg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pro-apoptotic+protein+Bim+is+a+MicroRNA+target+in+kidney+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Neph%22%5BJournal%5D)">The pro-apoptotic protein Bim is a MicroRNA target in kidney progenitors.</a> J. Am. Soc. Neph. 22 (6), 1053-1063 (2011).</li>
<li>Tian, Z., Greene, A. S., Pietrusz, J. L., Matus, I. R., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-target+pairs+in+the+rat+kidney+identified+by+microRNA+microarray%2C+proteomic%2C+and+bioinformaticanalysis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-target pairs in the rat kidney identified by microRNA microarray, proteomic, and bioinformaticanalysis.</a> Genome Res. 18 (3), 404-411 (2008).</li>
<li>Mladinov, D., Liu, Y., Mattson, D. L., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+contribute+to+the+maintenance+of+cell-type-specific+physiological+characteristics%3A+miR-192+targets+Na%2B%2FK%2B-ATPase+%CE%B21%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs contribute to the maintenance of cell-type-specific physiological characteristics: miR-192 targets Na+/K+-ATPase β1.</a> Nucleic Acids Res. 41 (2), 1273-1283 (2013).</li>
<li>Liu, Y., Taylor, N. E., Lu, L., Usa, K., Cowley, A. W., Ferreri, N. R., Yeo, N. C., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+medullary+microRNAs+in+Dahl+salt-sensitive+rats%3A+miR-29b+regulates+several+collagens+and+related+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Renal medullary microRNAs in Dahl salt-sensitive rats: miR-29b regulates several collagens and related genes.</a> Hypertension. 55 (4), 974-982 (2010).</li>
<li>Kato, M., Zhang, J., Wang, M., Lanting, L., Yuan, H., Rossi, J. J., Natarajan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-192+in+diabetic+kidney+glomeruliand+its+function+in+TGF-b-induced+collagen+expression+via+inhibition+of+E-box+repressors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-192 in diabetic kidney glomeruliand its function in TGF-b-induced collagen expression via inhibition of E-box repressors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (4), 3432-3437 (2007).</li>
<li>Krupa, A., Jenkins, R., Luo, D. D., Lewis, A., Phillips, A., Fraser, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+microRNA-192+promotes+fibrogenesis+in+diabetic+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Neph%22%5BJournal%5D)">Loss of microRNA-192 promotes fibrogenesis in diabetic nephropathy.</a> J. Am. Soc. Neph. 21 (3), 438-447 (2010).</li>
<li>Wang, B., Herman-Edelstein, M., Koh, P., Burns, W., Jandeleit-Dahm, K., Watson, A., Saleem, M., Goodall, G. J., Twigg, S. M., Cooper, M. E., Kantharidis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-cadherin+expression+is+regulated+by+miR-192%2F215+by+a+mechanism+that+is+independent+of+the+profibrotic+effects+of+transforming+growth+factor-%CE%B2%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">E-cadherin expression is regulated by miR-192/215 by a mechanism that is independent of the profibrotic effects of transforming growth factor-β.</a> Diabetes. 59 (7), 1794-1802 (2010).</li>
<li>Kato, M., Arce, L., Wang, M., Putta, S., Lanting, L., Natarajan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microRNA+circuit+mediates+transforming+growth+factor-%CE%B21+autoregulation+in+renal+glomerular+mesangial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">A microRNA circuit mediates transforming growth factor-β1 autoregulation in renal glomerular mesangial cells.</a> Kidney Int. 80 (4), 358-368 (2011).</li>
<li>Gottardo, F., Liu, C. G., Ferracin, M., Calin, G. A., Fassan, M., Bassi, P., Sevignani, C., Byrne, D., Negrini, M., Pagano, F., Gomella, L. G., Croce, C. M., Baffa, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-RNA+profiling+in+kidney+and+bladder+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Urol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Micro-RNA profiling in kidney and bladder cancers.</a> Urol. Oncol. 25 (5), 387-392 (2007).</li>
<li>Juan, D., Alexe, G., Antes, T., Liu, H., Madabhushi, A., Delisi, C., Ganesan, S., Bhanot, G., Liou, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+microRNA+panel+for+clear-cell+kidney+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Urol%22%5BJournal%5D)">Identification of a microRNA panel for clear-cell kidney cancer.</a> Urol. 75 (4), 835-841 (2010).</li>
<li>Xu, X., Kriegel, A. J., Liu, Y., Usa, K., Mladinov, D., Liu, H., Fang, Y., Ding, X., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+ischemic+preconditioning+contributes+to+renal+protection+by+upregulation+of+miR-21%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Delayed ischemic preconditioning contributes to renal protection by upregulation of miR-21.</a> Kidney Int. 82 (11), 1167-1175 (2012).</li>
<li>Kriegel, A. J., Mladinov, D., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+study+of+microRNAs+and+its+application+in+kidney+disease+and+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Translational study of microRNAs and its application in kidney disease and hypertension.</a> 122 (10), 439-447 (2012).</li>
<li>Kloosterman, W. P., Wienholds, E., de Bruijn, E., Kauppinen, S., Plasterk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+miRNAs+in+animal+embryos+using+LNA-moidified+oligonucleotide+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">In situ detection of miRNAs in animal embryos using LNA-moidified oligonucleotide probes.</a> Nat. Methods. 3 (1), 27-29 (2006).</li>
<li>Nelson, P. T., Baldwin, D. A., Kloosterman, W. P., Kauppinen, S., Plasterk, R. H., Mourelatos, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAKE+and+LNA-ISH+reveal+microRNA+expression+and+localization+in+archival+human+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">RAKE and LNA-ISH reveal microRNA expression and localization in archival human brain tissue.</a> RNA. 12 (2), 187-191 (2006).</li>
<li>Obernosterer, G., Martinez, J., Alenius, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locked+nucleic+acid-based+in+situ+detection+of+microRNAs+in+mouse+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Locked nucleic acid-based in situ detection of microRNAs in mouse tissue sections.</a> Nat. Protocols. 2 (6), 1508-1514 (2007).</li>
<li>Kriegel, A. J., Liu, Y., Cohen, B., Usa, K., Liu, Y., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiR-382+targeting+of+kallikrein+5+contributes+to+renal+inner+medullary+interstitial+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Genomics%22%5BJournal%5D)">MiR-382 targeting of kallikrein 5 contributes to renal inner medullary interstitial fibrosis.</a> Physiol. Genomics. 44 (4), 259-267 (2012).</li>
</ol>

Nie ma nic do ujawnienia.

Celem tego artykułu było opisanie protokołu hybrydyzacji miRNA in situ , który dobrze sprawdza się w tkankach nerkowych utrwalonych w formalinie. Podczas opracowywania tego protokołu zidentyfikowano kilka ważnych źródeł artefaktów barwiących. Zwrócenie szczególnej uwagi na te punkty może pomóc uniknąć zabarwienia artefaktu i zwiększyć prawdopodobieństwo udanego przebiegu ISH.
Jedna z najłatwiejszych do uniknięcia przyczyn artefaktu barwienia może wystąpić, gdy skrawki tkanek wysychają...

MicroRNA to małe (około 22 nukleotydy długości) niekodujące RNA, które są wytwarzane endogennie. Na ogół działają w celu tłumienia ekspresji białek poprzez represję translacyjną lub degradację mRNA. miRNA wiążą się z celami mRNA z niepełną komplementarnością, dzięki czemu pojedynczy miRNA może tłumić wiele celów.
Zrozumienie, które typy komórek i struktury wyrażają miRNA, jest ważną częścią zrozumienia mechanizmów, poprzez które zmiany w ekspresji miRNA wpływają na fenotypy komórek i tkanek. Podczas gdy metody takie jak sekwencjonowanie miRNA, qPCR i Northern blotting mogą być stosowane do wykrywania miRNA w całych tkankach, takie podejście nie pozwala na określenie, z jakiego konkretnego typu komórek pochodzą w danej tkance. Sekcja składników komórkowych i strukturalnych przed analizą przy użyciu tych metod może być bardzo trudna, a warunki potrzebne do uzyskania odpowiednich izolacji mogą prowadzić do zmian w ekspresji genów lub degradacji RNA. Hybrydyzacja mikroRNA in situ to metoda stosowana do wizualizacji lokalizacji i poziomów ekspresji mikroRNA w tkankach. Technika ta jest szczególnie cenna w tkankach złożonych z niejednorodnych struktur, takich jak nerka.
Wykazano, że mikroRNA odgrywają rolę regulacyjną w rozwoju nerek2,3 i fizjologii4. Wykazano również, że zmiany w ekspresji mikroRNA są związane z patologią nerek, taką jak zwłóknienie5-10, nefropatia cukrzycowa7, rak nerki11,12 i ostre uszkodzenie nerek13. W naszych badaniach odkryliśmy, że optymalizacja hybrydyzacji in situ mikroRNA dla tkanek nerek była cenna dla określenia dokładnych lokalizacji strukturalnych ekspresji miRNA zarówno w zdrowiu, jak i chorobie14. Określenie kanalikowatej i komórkowej ekspresji różnych mikroRNA jest ważne, ponieważ ich regulacja celów może być zależna od funkcji komórkowych. W stanach chorobowych ważne jest również określenie, w jaki sposób zmiany w ekspresji miRNA mogą wpływać na funkcję.
Celem opisanej tutaj metody było rozwinięcie istniejących metodologii ISH opracowanych przez Kloostermana i wsp. 15, inni badacze16,17 i ci sugerowani przez Exiqon1 i optymalizują metodę dla tkanek nerkowych utrwalonych w formalinie. Z powodzeniem zastosowaliśmy tę metodę do identyfikacji wyraźnych regionalnych różnic w ekspresji nerkowego mikroRNA miR-382 z jednostronną niedrożnością moczowodu18. Takie podejście można zastosować również w przypadku innych tkanek, z dodatkową optymalizacją.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>pirowęglan dietylu</td><td>Sigma</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Ksyleny</td><td>Sigma</td><td>534056</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Ultra Pure</td><td>200CSPTP</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Life Technologie</td><td>15506-017</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C2536</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>J.T. Baker</td><td>4059-00</td><td></td></tr><tr><td>Kwas cytrynowy</td><td>Sigma</td><td>C2404</td><td></td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Sigma</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>Buffer Life Technologies</td><td>15557-044</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>SAGENT</td><td>25021-400-30</td><td></td></tr><tr><td>Drożdże RNA</td><td>Life Technologies</td><td>AM7118</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266-1004</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>J.T. Baker</td><td>4058-01</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Fermentas</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>3' DIG- sonda miRNA</td><td>Exiqon</td><td>miR dependent-05</td><td></td></tr><tr><td>3' DIG- Sonda miR z kodowaniem</td><td>Exiqon</td><td>99004-05</td><td></td></tr><tr><td>3' Sonda DIG-U6 miR</td><td>Exiqon</td><td>99002-05</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Digoxigenin-Ab Fab</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>NBT/BCIP</td><td>Roche</td><td>11681451001</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>Fisher</td><td>Dopasowane do rozmiaru</td><td></td></tr><tr><td>tkanki Microtom HM 355 S</td><td>Thermo Scientific</td><td>23-900-672</td><td></td></tr><tr><td>Wysuwany piec hybrydyzacyjny</td><td>Boekel</td><td>241000</td><td></td></tr><tr><td>Zespół tacy aluminiowej</td><td>Boekel</td><td>C2403973</td><td></td></tr><tr><td>Wkładka do stojaka ze stali nierdzewnej</td><td>Boekel</td><td>C2403754</td><td></td></tr></tbody></table>

hybrydyzacja in situ mikrorna dla tkanek nerek utrwalonych formaliną

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

W tym artykule opisujemy metodę kolorymetrycznego wykrywania miRNA w nerkach poprzez hybrydyzację in situ z sondami mikroRNA oznaczonymi digoksygeniną. Protokół ten, pierwotnie opracowany przez Kloostermana i współpracowników do szerokiego zastosowania z sondami miRNAExiqon 1, został zmodyfikowany w celu przezwyciężenia wyzwań związanych z analizą miRNA w tkankach nerkowych. Należą do nich takie kwestie, jak identyfikacja struktury i trudne do usunięcia resztki sondy i przeciwciała. Zastosowanie stosunkowo cienkich skrawków tkanek o grubości 5 mm pozwoliło na wyraźną wizualizację struktur nerkowych, przy jednoczesnym zachowaniu w komórkach silnego sygnału sondy. Ponadto zoptymalizowano koncentrację sondy i warunki inkubacji, aby ułatwić wizualizację ekspresji mikroRNA o niskim tle i niespecyficznym sygnale. W tym miejscu opisany jest zoptymalizowany protokół, obejmujący wstępne pobranie i przygotowanie tkanek poprzez montaż szkiełek na końcu zabiegu. Podstawowe składniki tego protokołu mogą być modyfikowane w celu zastosowania do innych tkanek i modeli kultur komórkowych.

Obszary przekroju tkanki, które wysychają podczas etapów hybrydyzacji, inkubacji lub przemywania, zazwyczaj wykazują ciemniejsze barwienie podczas procesu detekcji NBT/BCIP. Rysunek 1 przedstawia fragment przekroju nerki, w którym HybriSlip zsunął się z krawędzi tkanki, co doprowadziło do jej częściowego odwodnienia. Mimo rehydratacji i pokrycia w kolejnych etapach, sygnał w odwodnionej części jest sztucznie zawyżony.
Znaczenie kontrolowania czasu wywoływania NBT-BCIP zostało ...

Ten artykuł opisuje protokół hybrydyzacji in situ zoptymalizowany do kolormetrycznego wykrywania ekspresji mikroRNA w stałych odcinkach nerki z formaliną.

Hybrydyzacja in situ mikroRNA dla tkanek nerek utrwalonych formaliną

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA ...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest lokalizacja i ilościowe określenie ekspresji mikroRNA w tkankach nerek. Osiąga się to najpierw poprzez hybrydyzację sondy znakowanej digeksygeniną z określonym mikroRNA w tkance nerki. W drugim kroku tkankę inkubuje się z przeciwciałem przeciwko digeksygeninie, sprzężonym z fosfatazą alkaliczną.Następnie do tkanki dodaje się substrat N-B-T-B-C-I-P w celu wizualizacji lokalizacji mikroRNA poprzez powstanie niebieskiego produktu w miejscach hybrydyzacji sond mikroRNA; uzyskane wyniki pokazują, gdzie mikroRNA są ekspresowane w obszarach nerek i segmentach nefronów na podstawie hybrydyzacji komplementarnych sond mikroRNA. W tej procedurze wykorzystuje się utrwalone w formalinie i zatopione w parafinie przekroje nerek, naniesione na szkiełka mikroskopowe przy grubości 5 µm. Aby przygotować przekroje nerek do analizy, należy najpierw usunąć parafinę z tkanki poprzez trzykrotne przemycie w świeżym ksylenie przez 5 minut.Następnie należy rehydratować przekroje tkanek poprzez pięciominutowe inkubacje w malejących stężeniach etanolu w wodzie dwukrotnie destylowanej. Następnie preparaty na szkiełkach należy potraktować wystarczającą ilością dathylu, nadtlenku perkarbonianu lub desy, aby całkowicie pokryć przekroje tkankowe przez jedną minutę. Należy upewnić się, że tkanki nie wyschną.Wyjmij próbki z eksykatora i wypłucz preparaty na szkiełkach. Przemyj szkiełka traktowane w eksykatorze roztworem PBST dwukrotnie przez pięć minut. Upewnij się, że odpady z eksykatora zostaną zebrane w celu właściwej utylizacji.Od tego momentu wszystkie odczynniki powinny być traktowane jako potencjalnie zanieczyszczone. Aby usunąć RNA, dodaj proteinazę K do uprzednio ogrzanego buforu do proteinazy K do końcowego stężenia 10 µg/mL. Przykryj skrawki tkanki roztworem proteinazy K i inkubuj w temperaturze 37 °C przez pięć minut. Szybko usuń roztwór proteinazy K i dodaj 0,2% glicyny w PBST na 30 sekund.Przemyj preparaty na szkiełkach dwa razy w PBST traktowanym Desy, przez 30 sekund przy każdym płukaniu. Na koniec utrwal przekroje tkanek w świeżo przygotowanej 4%paraformaldehydzie przez 10 minut.Aby rozpocząć tę procedurę, należy dodać 50 µL buforu do hybrydyzacji na każdy przekrój tkanki i przykryć go szkiełkami do hybrydyzacji wolnymi od RNazy, które są nieco większe niż przekroje tkanki. Slajdy należy umieścić w komorze nawilżonej chusteczkami laboratoryjnymi nasączonymi w 50% formamidzie i 50% 5X SSC. Próbki poddaje się prehybrydyzacji, pozostawiając nawilżoną komorę przez dwie godziny w piecu w temperaturze hybrydyzacji określonej dla sondy znakowanej 3' digॉक्सigenem. Temperatura hybrydyzacji dla sondy to zazwyczaj temperatura topnienia DNA (TM) sondy pomniejszona o 21 °C.Na przykład temperatura hybrydyzacji dla sondy mere 3 82 wynosi 54 °C, ponieważ jej TM wynosi 75 °C. Przygotować sondę mikroRNA oraz kontrole pozytywną i negatywną, rozcieńczając każdą z nich do stężenia 40 nM w buforze do hybrydyzacji. Kontrolą pozytywną jest małe jądrowe RNA U6, a kontrolą negatywną jest sekwencja randomizowana (scrambled).Ogrzewaj sondę oraz kontrole w temperaturze 65 °C przez pięć minut. Wyjmij preparaty z pieca do hybrydyzacji. Usuń paski do hybrydyzacji oraz nadmiar buforu do hybrydyzacji z układu do prehybrydyzacji.Nanieś 75 µL sondy w buforze bezpośrednio na każdy przekrój tkanki. Przykryj je szkiełkami do hybrydyzacji, które powinny być jedynie na tyle duże, aby zakryć przekroje tkanki. Utrzymuj uchwyt do szkiełek w poziomie.Przenieś preparaty z powrotem do pieca do hybrydyzacji w odpowiedniej temperaturze. Inkubuj przez noc, przez około 16 godzin. Po zakończeniu hybrydyzacji wyjmij preparaty z pieca do hybrydyzacji.Dodaj 200 µL 2X SSC podgrzanego do temperatury hybrydyzacji tuż pod jedną krawędzią szkiełka cover slip, aby ułatwić oddzielenie go od tkanki. Usuń szkiełko cover slip, przechylając preparat. Po usunięciu szkiełek cover slip przemyj preparaty trzykrotnie w 200 µL roztworu zawierającego 50% formamidu i 2X SSC w określonej temperaturze hybrydyzacji, przez 30 minut podczas każdego przemywania.Przepłucz preparaty pięć razy w PBST w temperaturze pokojowej przez pięć minut każdy na wytrząsarce orbitalnej przy niskiej prędkości. Rozpocznij tę procedurę od inkubacji preparatów w buforze blokującym przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej przy niskiej prędkości. Po godzinie dodaj 100 µL fragmentów anti dig AP FAB do każdego przekroju tkanki i przykryj je szkiełkami hybrydowymi.Wyciąć fragmenty o wielkości wystarczającej do pokrycia przekroju. Inkubować preparaty w komorze wilgotnościowej w temperaturze 4 °C przez noc lub przez około 16 godzin następnego dnia. Przemyć preparaty siedmiokrotnie w PBST w temperaturze pokojowej przez pięć minut przy każdym myciu, używając wytrząsarki orbitalnej ustawionej na niskie obroty.Następnie przemyj preparaty na szkiełkach w buforze AP trzy razy po pięć minut. Przygotuj roztwór wywołujący N-B-T-B-C-I-P, dodając 200 µL roztworu N-B-T-B-C-I-P do 10 mL buforu AP. Na każde szkiełko nanieś od 400 do 500 µL rozcieńczonego roztworu N-B-T-B-C-I-P, aby całkowicie pokryć wszystkie przekroje tkanek.Inkubuj w ciemnej, nawilżonej komorze przez cztery do pięciu godzin w temperaturze pokojowej, aż do zakończenia detekcji chromometrycznej. Odwodnij przekroje w rosnącym stężeniu etanolu przez pięć minut w każdym kroku, a następnie przejrzyj przekroje poprzez pięć inkubacji w ksylenie przez pięć minut każdorazowo. Na koniec zamontuj preparaty na szkiełkach za pomocą medium montażowego PerMount i pozostaw do wyschnięcia na noc.Zapewnienie, aby przekrój tkanki nie wysychał, jest kluczowe dla powodzenia tego protokołu hybrydyzacji in situ. Lewa część tej ryciny przedstawia fragment przekroju nerki, w którym szkiełko hybrydyzacyjne przesunęło się poza krawędź tkanki, co doprowadziło do jej częściowego odwodnienia. Mimo rehydratacji i przykrycia w kolejnych krokach, sygnał w odwodnionej części jest sztucznie zawyżony w porównaniu z częścią, która pozostała przykryta szkiełkiem hybrydyzacyjnym.Pasek kalibracyjny na tym obrazie reprezentuje 100 mikronów. Znaczenie optymalizacji czasu trwania procesu ujawniania N-B-T-B-C-I-P zostało zademonstrowane na poniższych rycinach. Panel A pokazuje, że okresy ujawniania przekraczające cztery do pięciu godzin prowadzą do wyraźnego nieswoistego barwienia i zatarcia obrazu w tkankach nerek badanych z wykorzystaniem kontroli mikroRNA.Panel B pokazuje, że inkubacje trwające dłużej niż cztery do pięciu godzin nie prowadzą do dalszej poprawy sygnału podczas badania nerek pod kątem celów o wysokiej obfitości, takich jak kontrola U6 small nuclear RNA. Dane te, zaadaptowane z poprzedniego badania, potwierdzają przydatność tej metody hybrydyzacji in situ do wykrywania mikro RNA w tkance nerek. Panel A przedstawia reprezentatywne obrazy ekspresji miR-382 uzyskane za pomocą hybrydyzacji in situ w przekrojach nerek myszy z jednostronną obturacją moczowodu (UUO) lub bez niej, traktowanych odpowiednio anty-miR-382 lub anty-scrambled. UUO wywołało wzrost ekspresji miR-382, co objawia się ciemniejszym barwieniem w tkance UUO plus anty-scrambled w porównaniu do tkanki sham plus anty-scrambled.Wzrost ten został zablokowany poprzez zastosowanie przeciwciała anty-ME 3 82. Wykresy w panelu B przedstawiają ekspresję mere 3 82 u myszy z grupy sham oraz myszy traktowanych przeciwciałem scrambled jako procent średniej zintegrowanej gęstości optycznej. Pomiar intensywności pikseli wykazał, że UUO indukuje istotny wzrost ekspresji mere 3 82 w rdzeniu zewnętrznym i wewnętrznym, a anty-ME 3 82 blokuje ten proces.Wzrost ten można zwizualizować i zmierzyć za pomocą hybrydyzacji in situ mikroRNA. Wyniki te są również zgodne z wynikami qPCR, których nie przedstawiono tutaj, co wskazuje, że zastosowanie hybrydyzacji in situ do wykrywania ekspresji miR-382 w utrwalonej formaliną tkance nerki jest wystarczająco czułe, aby dostarczyć mierzalnych wyników odzwierciedlających analizę ekspresji opartą na qPCR. Dodatkowo, hybrydyzacja in situ pozwala na pomiar wyraźnych różnic regionalnych w ekspresji mikroRNA w obrębie nerki.

microrna-in-situ-hybridization-for-formalin-fixed-kidney-tissues

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

MikroRNA in situ hybrydyzacja dla formalinowo fiksowanych tkanek nerkowych

Niniejszy protokół hybrydyzacji in situ w preparatach całych określa krytyczne etapy zapewniające powtarzalne, wysokiej jakości wyniki w badaniach ekspresji genów w embrionach myszy w wieku od E8.5 do E11.5 dnia.

Hybrydyzacja in situ w całym preparacie zarodków myszy od E8.5 do E11.5

W niniejszej pracy opisujemy wydajną, wysokoprzepustową metodę hybrydyzacji in situ (ISH) służącą do wizualizacji wzorców ekspresji mRNA w przekrojach rozwijającej się tkanki prostaty zarodka myszy. Metodę tę można łatwo dostosować do wizualizacji wzorców ekspresji mRNA w innych tkankach myszy lub w tkankach innych gatunków.

Metoda wysokoprzepustowej hybrydyzacji in situ do charakteryzacji wzorców ekspresji mRNA w dolnym odcinku dróg moczowo-płciowych płodu myszy

Tutaj opisujemy uproszczony protokół analiz ekspresji mikroRNA (miRNA) w archiwalnych tkankach klinicznych z utrwalonym formaliną, parafiną (FFPE) lub świeżo mrożonym rakiem prostaty (PCa) z wykorzystaniem ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (RT-PCR) i hybrydyzacji in situ (ISH).

Analizy ekspresji miRNA w tkankach klinicznych raka gruczołu krokowego

Tutaj prezentujemy protokół do wykrywania ekspresji miRNA w próbkach pobranych od pacjentów z rakiem piersi za pomocą hybrydyzacji miRNA in situ.

Kliniczno-patologiczna analiza ekspresji miRNA w tkankach raka piersi przy użyciu hybrydyzacji miRNA in situ

mikro-RNA (miRNA) to krótkie i wysoce homologiczne sekwencje RNA, służące jako posttranskrypcyjne regulatory informacyjnych RNA (mRNA). Obecne metody wykrywania miRNA różnią się czułością i swoistością. Opisujemy protokół, który łączy hybrydyzację in situ i barwienie immunologiczne w celu jednoczesnego wykrywania cząsteczek miRNA i białka na odcinkach tkanki serca myszy.

Specyficzne tkankowo profilowanie ekspresji miRNA w wycinkach serca myszy przy użyciu hybrydyzacji in situ

Opisujemy protokół laserowej mikrodysekcji podsegmentów ludzkiej nerki, w tym kłębuszka nerkowego, kanalika proksymalnego, grubej kończyny wstępującej, przewodu zbiorczego i śródmiąższu. RNA jest następnie izolowane z uzyskanych przedziałów i przeprowadza się sekwencjonowanie RNA w celu określenia zmian w sygnaturze transkryptomicznej w każdym podsegmencie.

Zastosowanie mikrodysekcji laserowej do odkrycia regionalnej transkryptomiki w ludzkiej tkance nerkowej

Ten artykuł przedstawia protokół wykrywania ekspresji mikroRNA w nerkach mysiego modelu ostrego uszkodzenia nerek za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym. Protokół ten kładzie nacisk na mysi model niedokrwiennego uszkodzenia nerek i staranną ekstrakcję próbek mikroRNA.

Ilościowa metoda wykrywania mikroRNA w nerce mysiego modelu niedokrwiennego uszkodzenia nerki

Opisujemy metodę oceny ekspresji mikroRNA w nerkach myszy z jednostronną niedrożnością moczowodu (UUO) za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją. Protokół ten jest odpowiedni do badania profili ekspresji mikroRNA nerek u myszy z UUO oraz w kontekście innych stanów patologicznych.

Ilościowa ocena ekspresji mikroRNA PCR w czasie rzeczywistym w nerce myszy z jednostronną niedrożnością moczowodu

mikroRNA biorą udział w patogenezie nefropatii IgA. Opracowaliśmy niezawodną metodę wykrywania poziomów ekspresji mikroRNA w nerkach mysiego modelu nefropatii IgA (myszy HIGA). Ta nowa metoda ułatwi sprawdzenie udziału miRNA w nefropatii IgA.

Wykrywanie ekspresji mikroRNA w nerkach myszy nefropatycznych z immunoglobuliną A

Tutaj dostarczamy egzogenne, sztucznie syntetyzowane mimiki miRNA do nerki poprzez wstrzyknięcie do żyły ogonowej wektora niewirusowego i nanocząsteczek polietyleniminy w kilku modelach myszy z chorobą nerek. Doprowadziło to do znacznej nadekspresji docelowego miRNA w nerce, co spowodowało zahamowanie progresji choroby nerek w kilku modelach mysich.

Dostarczanie egzogennego, sztucznie syntetyzowanego miRNA naśladującego mimikę do nerki przy użyciu nanocząstek polietyleniminy w kilku mysich modelach choroby nerek

Protokół opisuje tandemowy test hybrydyzacji immunofluorescencji z tkanką formalinowo-zafiksowaną w parafinę, mającą na celu jednoczesne wykrywanie i ilościowe mikroRNA oraz multipleksowane białka.

Amplifikacja i rozpoznawanie mikroRNA poprzez hybrydyzację in situ z użyciem kwasów nukleinowych z zamkniętymi nukleinami jako nowatorska metoda wykrywania i ilościowania

Naucz się hybrydyzacji in situ mikroRNA w tkankach nerek utrwalonych formaliną. Ta metoda umożliwia lokalizację i ilościowe określenie ekspresji mikroRNA w różnych segmentach nefronu.

Hybrydyzacja in situ mikroRNA dla tkanek nerek utrwalonych formaliną

Przeglądaj więcej filmów