Rezonans magnetyczny in vivo ¹⁹F do śledzenia komórek

Ogólnym celem tej procedury jest zobrazowanie i ilościowe określenie liczby 19 komórek znakowanych F in vivo przy użyciu 19 FMRI. Można to zrobić w warunkach klinicznych lub przedklinicznych. Osiąga się to poprzez uprzednie znakowanie komórek odpowiednim środkiem 19 F.

Najczęściej odbywa się to ex vivo. Drugim krokiem jest ilościowe określenie zawartości 19 F na komórkę, co można zrobić przy użyciu 19 F i MR ze znanym odniesieniem. Zakłada się, że zawartość 19 F na komórkę pozostaje stała podczas doświadczenia, w przeciwnym razie należy obliczyć współczynniki korygujące.

Następnie badany jest obrazowany in vivo przy użyciu jednego H i 19 FMRI w celu zlokalizowania przeniesionych znakowanych komórek. Znane odniesienie i odpowiednie parametry obrazowania są niezbędne do ilościowego określenia na podstawie danych obrazowych. Ostatnim krokiem jest przetworzenie danych obrazu w celu obliczenia liczby komórek.

Tam, gdzie to możliwe, można zastosować histologię ex vivo lub inne techniki w celu potwierdzenia danych. Ostatecznie, 19 FMRI do śledzenia komórek in vivo można wykorzystać do badania przeniesionych komórek pod względem ich lokalizacji i liczby w odpowiednim czasie, przy założeniu pewnych założeń przedstawionych w tekście. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak HMRI wykorzystująca super paramagnetyczne etykiety komórek, jest to, że nie ma mylącego sygnału tła i że liczbę komórek można określić bezpośrednio na podstawie danych obrazu.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie terapii komórkowej, takie jak to, gdzie znajdują się komórki i ile jest ich obecnych w różnych punktach czasowych. Aby rozpocząć ten protokół, najpierw dodaj etykietę 19 F do niedojrzałych komórek dendrytycznych w stężeniu czterech miligramów na 1 milion komórek w dwóch mililitrach pożywki. Następnie delikatnie zamieszaj, aby wymieszać.

Następnie inkubuj komórki dendrytyczne z etykietą przez trzy dni przed dojrzewaniem i zbiorem. Następnie zbierz komórki i usuń nadmiar etykiety, myjąc co najmniej trzy razy. W przypadku zliczania PBS powstałe komórki są następnie ponownie zawieszane w niewielkiej objętości PBS w celu wstrzyknięcia lub dalszych testów.

Należy pamiętać, że opisany tutaj protokół jest odpowiedni dla tych konkretnych komórek dendrytycznych i etykiety. W związku z tym protokół dla innego typu komórek będzie musiał zostać znaleziony w literaturze lub zoptymalizowany przez badacza. Umieść znaną liczbę oznakowanych komórek w probówce NMR.

Następnie dodaj 10 mikrolitrów 5% tri fluoru lub kwasu kwaśnego lub TFA. Jeśli częstotliwość rezonansowa TFA jest nieodpowiednia ze względu na nakładanie się na etykietę, należy użyć alternatywnego związku rozpuszczalnego. Umieścić próbkę w spektrometrze NMR i uzyskać widmo fluoru 19.

Następnie należy obliczyć względne pola powierzchni pod pikami wzorca i próbki lub głównego piku próbki, a następnie obliczyć średnią liczbę fluorów na komórkę w próbce. Należy pamiętać, że cały ten proces należy powtórzyć średnio, aby osiągnąć istotność statystyczną. Można to również zrobić za pomocą spektroskopii bezpośrednio na skanerze MRI.

Należy również zauważyć, że ta procedura ujawnia tylko średnie obciążenie fluorem 19 dla dużej liczby komórek, a nie zmienność między komórkami. Sprawdzenie jednorodności wychwytu komórkowego wymaga obecności składnika fluorescencyjnego ze środkiem 19 F. W tym przypadku tylko scenariusz trzeci pokazuje jednorodne znakowanie komórek, chociaż zawsze zakłada się to w obliczeniach, można to zweryfikować za pomocą technik uzupełniających, takich jak mikroskopia przygotowana do obrazowania, umieszczając w pełni znieczuloną mysz w kołysce i unieruchamiając ją, aby zapobiec ruchowi podczas skanowania.

Podłącz także kontrolę temperatury i oddechu w celu monitorowania fizjologicznego podczas skanowania. W razie potrzeby umieść zewnętrzne odniesienie obok zwierzęcia, zarówno odniesienie, jak i obszar zainteresowania powinny znajdować się na środku cewki. Rozpocznij akwizycję od konwencjonalnego skanu MRI protonowego jako anatomicznego odniesienia dla obrazowania 19 F.

Następnie dostrój system do częstotliwości 19 F markera komórkowego i przeprowadź skan 19 FMRI. Idealnie byłoby, gdyby skan 19 FMRI miał takie samo pole widzenia i wybór wycinka jak konwencjonalny rezonans magnetyczny, choć prawdopodobnie z niższą rozdzielczością. Następnie określ wzmocnienie impulsu referencyjnego 19 F za pomocą wzoru pokazanego tutaj i uzyskaj widmo 19 FNMR, aby określić częstotliwość 19 F.

Oszacuj czynnik C zależny od cewki o częstotliwości radiowej w oddzielnym doświadczeniu in vitro. Zastosowanie cewki o częstotliwości radiowej o jednorodnym profilu B-one, takiej jak cewka powierzchniowa, może utrudnić kwantyfikację danych 19 F. Ponieważ sygnał zależy nie tylko od stężenia 19 F, ale także od odległości od cewki.

W związku z tym należy uzyskać jedną mapę B na jednym kanale H, aby retrospektywnie skorygować dane 19 F. Wymaga to, aby jeden profil cewki H i 19 F był identyczny, z wyjątkiem współczynnika proporcjonalności C i aby zapewniona była wystarczająca ilość sygnału tła H w obszarach 19 F. Tutaj widzimy mapy kąta odwrócenia rur z TFA w wodzie uzyskane w jednym kanale H i 19 F. Aby skorygować dane 19 F, najpierw uzyskaj mapę kąta odwrócenia jednej godziny za pomocą metody dwóch kątów odwrócenia.

Użyj skanowania echa gradientowego z bardzo długim TR wynoszącym ponad trzy razy więcej niż jeden HT z szacowanym kątem odwrócenia nieco poniżej 90 stopni w pobliżu cewki. Następnie wykonaj drugi skan echa gradientowego z dwukrotnie większym kątem odwrócenia niż w pierwszym skanowaniu. Oblicz kąt odwrócenia alfa jednej H przy vle X, Y, Z za pomocą sygnału i sensu pierwszego i drugiego skanu gradientu ECHO.

Kąt odwrócenia 19 F będzie identyczny, z wyjątkiem współczynnika jeden C, ze względu na proporcjonalne profile B, tłumienie intensywności sygnału 19 F z sekwencji echa spinowego z wzbudzeniem, kątem odwrócenia alfa, kątem odwrócenia zmiany ostrości, dwoma alfami podczas odbioru sygnału, jest widoczne na ekranie tutaj. Tłumienie spowodowane niedoskonałym wzbudzeniem jest widoczne tutaj. Następnie można obliczyć tłumienie całkowite.

Zwróć uwagę, że jest on znormalizowany do jednego w przypadku idealnego kąta odwrócenia 90 stopni, wzbudzenia 180 stopni, kąta odwrócenia ponownego ogniskowania B skorygowanego 19 F intensywności sygnału obrazu SI 19 F są obliczane za pomocą tego wzoru, aby utworzyć jeden obraz nakładki H i 19 F. Wyeksportuj dane obrazu i otwórz pliki w programie do przetwarzania obrazu, takim jak obraz J, w razie potrzeby zastosuj dopasowania obrazu, upewniając się, że dopasowania są takie same dla wszystkich obrazów. Następnie wyrenderuj 19 obrazów F w fałszywych kolorach, a następnie nałóż je na odpowiednie obrazy One H.

Aby zlokalizować sygnał, wybierz obraz o jasności 19 F z odpowiednimi komórkami i widocznym odniesieniem, narysuj ROI nad odpowiednimi komórkami, odniesieniem i obszarem poza obiektem dla wartości szumu, jak pokazano w próbce. Zwróć uwagę, że tutaj pokazano jeden skan anatomiczny H dla jasności. Prosta proporcjonalność i wartość 19 F na ogniwo mogą być następnie wykorzystane do oszacowania liczby ogniw w ROI.

Obrazy te pochodzą z typowych wyników protokołu obejmującego transfer 19 komórek znakowanych F do drenującego węzła chłonnego. Tutaj widzimy spektrum 19 FNMR 1 miliona znakowanych komórek przy użyciu odniesienia A TFA, a tutaj widzimy reprezentatywny przetworzony obraz do obrazowania in vivo. Odniesienie składające się z zapieczętowanego pojemnika o tej samej etykiecie, co w przypadku komórek, umieszczono między łapami myszy.

Stosując opisany protokół, obliczyliśmy liczbę komórek około 1,2 miliona na podstawie surowego obrazu o jasności 19 F. Obraz 19 F jest nałożony w fałszywych kolorach na skalę szarości, anatomiczny obraz protonowy. Podczas przygotowywania nowego eksperymentu ważne jest, aby zweryfikować fluor.

Wyniki rezonansu magnetycznego z histologią, obrazowaniem optycznym lub innymi metodami. Na przykład ważne jest, aby pamiętać, że etykieta fluorowa może pozostać w tkance, gdy komórki umierają i prowadzić do fałszywie dodatniego sygnału.