Name: Rozwój embrionalny myszy w systemie hodowli całych zarodków bez surowicy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Poznaj metodę hodowli zarodków myszy w systemie bezsurowicowym z utlenianiem. Technika ta umożliwia badanie rozwoju embrionalnego przy zachowaniu integralności naczyń krwionośnych i minimalizacji zmiennych zewnętrznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Chcielibyśmy podziękować dr Julie Gordon i dr Nancy Manley za ich pomocne rady dotyczące techniki hodowli. Praca ta była wspierana przez Children's Glaucoma Foundation i Sharon-Stewart Aniridia Research Trust.

Hodowla embrionów myszy:
Wszystkie procedury eksperymentalne zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health zgodnie z protokołem # A2010 07-119, który został sprawdzony i zatwierdzony przez University of Georgia Institutional Animal Care and Use Committee, który utrzymuje ciągły nadzór regulacyjny.
1. Przygotowanie pożywek hodowlanych
<ol>
	<li>Przygotować pożywkę hodowlaną, używając dostępnych na rynku pożywek z komórek macierzystych i suplementów w następujących ilościach: KnockOut DMEM, KnockOut Serum Replacement (KSR) (10%), Suplement N-2 (1x), Albumina z surowicy bydlęcej (2%), Penicylina (50 IU/ml), Streptomycyna (50 μg/ml) i Amfoterycyna-B (1,25 μg/ml). Przygotowana pożywka hodowlana jest podobna do poprzednio opisanej15 z następującymi zmianami: dodanie środków przeciwgrzybiczych i użycie dwukrotnego stężenia antybiotyków (szczegółowe informacje na temat konkretnych odczynników i sprzętu znajdują się w Wykazie materiałów). 
	nuta: Stężenie antybiotyku zgodnie z poprzednio stosowanymi (Moore-Scott, et al.15) było wystarczające dla hodowli zarodków prowadzonych przez okres do 24 godzin. Jednak, gdy posiew był kontynuowany po 24 godzinach, doświadczyliśmy zanieczyszczenia hodowli i udało się to opanować poprzez podwojenie stężenia antybiotyku.</li>
	<li>Przechowuj elementy nośnika w temperaturze 4 °C lub -20 °C zgodnie z zaleceniami producenta. KSR i suplement N-2 należy przechowywać w porcjach w temperaturze -20 °C, aby uniknąć wielokrotnego zamrażania i rozmrażania. KnockOut DMEM po otwarciu należy zużyć w ciągu 30 dni zgodnie z zaleceniami producenta. Przed użyciem podgrzać elementy w łaźni wodnej do temperatury 37 °C.</li>
	<li>Przygotować podłoże w sterylnych warunkach. Zdezynfekuj powierzchnię całego sprzętu i butelek zawierających składniki pożywki 70% alkoholem w sprayu przed umieszczeniem ich w okapie hodowlanym.</li>
	<li>Składniki pożywki można mieszać w sterylnej zlewce lub bezpośrednio w systemie filtracyjnym (Corning). Najpierw dodaj albuminę w proszku do KnockOut DMEM. Dokładnie wymieszaj, delikatnie potrząsając, aż albumina całkowicie się rozpuści. Następnie dodać suplement N-2, KSR i antybiotyki i dokładnie wymieszać za pomocą pipetora. Następnie przefiltruj pożywkę za pomocą filtra o wielkości porów 0,22 μm z odsysaniem próżniowym. Dozować pożywkę do stożkowych probówek o pojemności 50 ml i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia. Raz przygotowane podłoże należy zużyć w ciągu 4-5 dni do hodowli.</li>
</ol>
2. Przygotowanie sprzętu do hodowli
<ol>
	<li>Wysterylizuj szklane butelki z kulturami i gumowe korki. Zawiń butelki hodowlane w folię aluminiową i umieść gumowe korki butelek w zlewce na wodę i sterylizuj w autoklawie.</li>
	<li>Wysterylizuj komorę hodowlaną (inkubator precyzyjny) 70% alkoholem w sprayu i rozgrzej do 37 °C przed rozpoczęciem hodowli. Komora hodowlana jest wyposażona w toczącą się tarczę pośrodku, w której znajdują się butelki z kulturami. Przepływ gazu do komory jest regulowany za pomocą manometru, a natężenie przepływu można regulować, obserwując odpływ pęcherzyków powietrza przez wodę w szklanej rurce na końcu. Ten aparat do hodowli w butelkach na kółkach jest zmodyfikowaną wersją oryginalnego aparatu wprowadzonego przez New i Cockroft17.</li>
	<li>Podłączyć butlę gazową zawierającą mieszaninę gazów o stężeniu 95%O2 / 5% CO2 do komory hodowlanej i dostosować przepływ gazu do "jednego pęcherzyka powietrza na sekundę", co daje natężenie przepływu 50 cm³/min i zapewnia odpowiedni dopływ tlenu do zarodków hodowlanych.</li>
</ol>
3. Pobieranie i przygotowanie zarodków myszy do hodowli
<ol>
	<li>Aby uzyskać zarodki myszy typu dzikiego, wykorzystaliśmy myszy z genetycznymi szczepami tła C57BL / 6J i CD-1 (Charles River Laboratories).</li>
	<li>Codziennie rano sprawdzaj samice myszy pod kątem zatyczek dopochwowych. Południe w dniu znalezienia czopa dopochwowego należy traktować jako E0,5 dpc (dni po stosunku).</li>
	<li>Zbierz zarodki myszy w E10,5 dpc poprzez eutanazję ciężarnych myszy zgodnie ze standardowymi protokołami. Myszy zostały poddane eutanazji za pomocą urządzenia do inhalacji CO2 zgodnie z wytycznymi Amerykańskiego Towarzystwa Lekarzy Weterynaryjnych (AVMA) dotyczącymi eutanazji zwierząt (2013). Aby zabezpieczyć się przed śmiercią, przeprowadzono zwichnięcie szyjki macicy po ekspozycji na CO2 .</li>
	<li>Rozpyl 70% etanolu na brzuszną powierzchnię brzucha, aby uniknąć przyklejania się włosów na brzuchu do instrumentów. Następnie otwórz jamę brzuszną brzusznie za pomocą ostrych, nożyczek operacyjnych i pary kleszczy do mikropreparowania 4-3/4 w celu zlokalizowania macicy. Za pomocą 4-calowych kleszczy do mikropreparacji podnieś całą macicę i oddziel ją od ciała, tnąc lekkimi nożyczkami operacyjnymi na trzonie macicy i na końcach rogów macicy.</li>
	<li>Szybko przepłucz całą macicę w 1x PBS podgrzanym do 37 °C, aby usunąć krew przyklejającą się do macicy i natychmiast umieść w DMEM ogrzanym do 37 °C na szalce Petriego. Przed dalszym użyciem wysterylizuj narzędzia za pomocą 70% etanolu w sprayu. 
	nuta: Zaleca się wstępne podgrzanie roztworów, w tym PBS, DMEM i pożywki hodowlanej, oraz utrzymywanie ich w temperaturze 37 °C podczas całej procedury.</li>
	<li>Pod mikroskopem preparacyjnym macicę należy wyciąć segmentowo za pomocą lekkich nożyczek operacyjnych. Powoduje to powstanie małych otworów po obu stronach segmentowanej macicy, przez które można delikatnie wprowadzić parę zmodyfikowanych (końców) pęset do mikrodysekcji, aby poszerzyć otwór. Pozwala to na odsłonięcie łożyska decydua, które można następnie usunąć, delikatnie rozrywając pęsetą do mikrodyspreparacji, aby odsłonić woreczek żółtkowy ciemieniowy (PYS) z błoną Reicherta. Za pomocą jednej krawędzi pęsety delikatnie przekłuj błonę Reicherta wraz z PYS i oddziel od leżącej poniżej warstwy trzewnego woreczka żółtkowego (VYS), aby odsłonić zarodki z nienaruszonym VYS. Stożek ektołożyskowy i pochodne trofoektodermy można usunąć albo za pomocą decydui łożyskowej, albo za pomocą błony Reicherta. Należy zachować ostrożność, aby uniknąć pęknięcia VYS, ponieważ zarodki natychmiast wyskakują.</li>
	<li>Zarodki z nienaruszonym VYS należy następnie przenieść na szalkę Petriego zawierającą pożywkę hodowlaną ogrzaną do temperatury 37 °C za pomocą plastikowej pipety do przenoszenia. 
	nuta: Przeniesienie na pożywkę hodowlaną natychmiast po oddzieleniu od macicy pomaga w lepszym rozwoju zarodka w hodowli.</li>
	<li>W woreczku żółtkowym należy wykonać mały otwór za pomocą pęsety do mikropreparacji, omijając główne naczynia krwionośne. Ostra pęseta może być użyta do wykonania otworu, delikatnie przekłuwając obszar przylegający do obszaru głowy. Alternatywnie można użyć dwóch par pęsety do przytrzymania woreczka żółtkowego i delikatnie rozerwać go, aby zrobić mały otwór. Następnie delikatnie poszerz otwór, rozszerzając go pęsetą do rozmiaru wystarczającego do dopasowania do głowy zarodka. Błonę owodniową, która ściśle owija zarodek, należy delikatnie odsunąć od ciała i rozerwać za pomocą pęsety. Głowa zarodka, a następnie cały zarodek powinny być delikatnie wyjęte z woreczka żółtkowego, zachowując integralność układu naczyniowego zarodka z unaczynieniem woreczka żółtkowego15, 
	nuta: Wszelkie uszkodzenia układu naczyniowego woreczka żółtkowego mogą potencjalnie wpływać na rozwój zarodka w hodowli. Takie zarodki z uszkodzonym unaczynieniem nie powinny być wykorzystywane do hodowli i mogą być wykorzystywane do oceny stopnia zarodków, które można później wyrzucić.</li>
	<li>Kryteria oceny zarodka: Zbadaj zarodki pod mikroskopem preparacyjnym i pogrupuj je według kryteriów morfologicznych, w tym wielkości ciała i głowy, morfologii kończyn i oczu oraz stadium zaawansowania, licząc liczbę somitów dla co najmniej dwóch zarodków z każdej grupy. 
	nuta: Zazwyczaj zarodki uzyskane z tego samego miotu wykazują różnice w rozwoju w macicy i różnią się wielkością ciała, cechami morfologicznymi i liczbą somitów. Okazało się jednak, że zarodki pogrupowane według naszych kryteriów morfologicznych zwykle wykazywały podobną liczbę somitową (±1). Z tego powodu nie jest wymagane liczenie somitów dla każdego zarodka, ponieważ opóźniłoby to czas rozpoczęcia hodowli. 
	nuta: Nie należy używać zarodków, które zostały użyte do policzenia somitów do hodowli. Policz somity po rozpoczęciu hodowli dla innych zarodków, aby uniknąć opóźnienia w rozpoczęciu hodowli. Zarodki, które zostały opóźnione do hodowli po oddzieleniu od macicy, zwykle wykazują słaby rozwój.</li>
	<li>Natychmiast przenieść zarodki na szalkę Petriego ze świeżą pożywką hodowlaną ogrzaną do temperatury 37 °C i przenieść ją do kaptura hodowlanego, gdzie zarodki powinny być ponownie przeniesione na szalkę Petriego ze sterylną pożywką hodowlaną przed włożeniem ich do butelek hodowlanych z pożywką w celu rozpoczęcia hodowli. 
	nuta: Wielokrotne transfery pożywek dla zarodków przed hodowlą pomagają w zapobieganiu zanieczyszczeniu, ponieważ różne etapy pobierania i sekcji zarodków były wykonywane pod mikroskopem preparacyjnym, który nie był zainstalowany w kapturze hodowlanym. 
	nuta: Gdy wielkość miotu jest duża (>12 zarodków), należy przetworzyć połowę zarodków i rozpocząć hodowlę lub umieścić je w naczyniu z pożywką hodowlaną i umieścić w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C. Gdy zarodki pozostawiono na zewnątrz na dłuższy czas (>35-40 min), zaobserwowaliśmy, że bicie serca zwalnia, co wpłynie na późniejszy rozwój hodowli.</li>
</ol>
4. Hodowla embrionów myszy
<ol>
	<li>Otwórz autoklawowane butelki z kulturami w kapturze hodowlanym i odpowiednio je oznacz. Przenieść 3 ml pożywki hodowlanej ogrzanej do temperatury 37 °C do każdej z butelek, a następnie zarodki myszy należy delikatnie przenieść do butelek hodowlanych za pomocą sterylnych plastikowych pipet do przenoszenia. Butelki hodowlane powinny być następnie zakryte gumowymi korkami do butelek, które pomagają utrzymać butelki hodowlane na dysku do toczenia w aparacie hodowlanym. 
	nuta: Butelki hodowlane z pożywką można przygotować i umieścić na dysku do toczenia aparatu hodowlanego przed eutanazją myszy. Skraca to czas transferu zarodków do butelek hodowlanych. 
	nuta: Zarodki myszy mogą być hodowane pojedynczo lub jako kokultury z dwoma lub trzema zarodkami w tej samej butelce hodowlanej.</li>
	<li>Butelki z kulturami powinny być przenoszone w asepcie do aparatu do hodowli w temperaturze 37 °C i szczelnie zaczepione o otwory w tarczy do toczenia za pomocą gumowych korków. Włącz tarczę do toczenia, aby obracała się ze stałą prędkością 35 obrotów na minutę (rpm), co umożliwia swobodne unoszenie się zarodków w pożywce, a także pomaga w swobodnej wymianie gazowej przez tkankę embrionalną. Gaz z butli podłączonej do komory hodowlanej przepływa przez tarczę do toczenia, a gumowe korki do butelek</li> hodowlanych.
	<li>Hoduj zarodki przez 16-40 godzin i regularnie sprawdzaj wypływ gazu i temperaturę w komorze hodowlanej. 
	nuta: Manipulacja zarodkami myszy w hodowli: Pozwól zarodkom przystosować się do warunków hodowli przez co najmniej 30 minut. Następnie zarodki, które osiągają słabe wyniki i wykazują słabe bicie serca, można odrzucić, a pozostałe zarodki można wykorzystać do dalszych badań manipulacyjnych. W tym czasie można wykonywać manipulacje zarodkami, takie jak elektroporacja5,9,16, mikroiniekcje18, implantacja koralików16, leczenie farmakologiczne i inne zabiegi. Z powodzeniem przeprowadziliśmy implantację kulek agarozy affi-gel traktowanych określonymi cząsteczkami sygnałowymi, aby zbadać ich rolę we wczesnym rozwoju oka. Zarodki po manipulacjach mogą być zwrócone z powrotem do świeżej pożywki i kontynuowane w hodowli.</li>
	<li>Zastąp pożywkę całkowicie nową pożywką w określonych odstępach czasu po 9-10 godzinach i 18-19 godzinach hodowli, gdy hodowla była kontynuowana przez 40 godzin. 
	nuta: Wymiana pożywki hodowlanej może nie być wymagana, jeśli hodowla zostanie zatrzymana po 16-18 godzinach.</li>
	<li>Miary sukcesu w hodowli: Przeżywalność zarodka w kulturze powinna być określana na podstawie widocznego bicia serca i krążenia krwi w organizmie, podczas gdy wzrost zarodka w kulturze powinien być oceniany na podstawie wzrostu wielkości ciała, liczby somitów i rozwoju morfologicznego głowy, kończyn, serca i oczu.</li>
	<li>Zarodki rozwijane in utero w temperaturze E11,0 dpc (~40-41 s) i E12,0 dpc (~49-50 s) powinny być używane jako kontrole do porównywania zarodków hodowanych odpowiednio przez 16-18 godzin i 38-40 godzin.</li>
	<li>Rozwój embrionalny w różnych punktach czasowych podczas hodowli i na etapie in utero można uchwycić pod mikroskopem preparacyjnym. Do uchwycenia obrazów wykorzystano oprogramowanie do obrazowania punktowego, a następnie przetworzono je za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu.</li>
</ol>

<ol><li>Behesti, H., Holt, J. K., Sowden, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+level+of+BMP4+signaling+is+critical+for+the+regulation+of+distinct+T-box+gene+expression+domains+and+growth+along+the+dorso-ventral+axis+of+the+optic+cup%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The level of BMP4 signaling is critical for the regulation of distinct T-box gene expression domains and growth along the dorso-ventral axis of the optic cup.</a> BMC Dev. Biol. 6, 62 (2006).</li>
<li>Gray, J., Ross, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+tube+closure+in+mouse+whole+embryo+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Neural tube closure in mouse whole embryo culture.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li>
<li>Tam, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postimplantation+mouse+development%3A+whole+embryo+culture+and+micro-manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Postimplantation mouse development: whole embryo culture and micro-manipulation.</a> Int. J. Dev. Biol. 42, 895-902 (1998).</li>
<li>Miura, S., Mishina, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-embryo+culture+of+E5.5+mouse+embryos%3A+development+to+the+gastrulation+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Whole-embryo culture of E5.5 mouse embryos: development to the gastrulation stage.</a> Genesis. 37, 38-43 (2003).</li>
<li>Osumi, N., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+cultured+mammalian+embryos+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation.</a> Methods. 24, 35-42 (2001).</li>
<li>Yokoo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mesenchymal+stem+cells+in+rodent+whole-embryo+culture+are+reprogrammed+to+contribute+to+kidney+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Human mesenchymal stem cells in rodent whole-embryo culture are reprogrammed to contribute to kidney tissues.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 3296-3300 (2005).</li>
<li>Sadler, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+early+somite+mouse+embryos+during+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Embryol.+Exp.+Morphol%22%5BJournal%5D)">Culture of early somite mouse embryos during organogenesis.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 49, 17-25 (1979).</li>
<li>Kitchin, K. T., Ebron, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+development+of+rodent+whole+embryo+culture%3A+solvent+toxicity+and+water+insoluble+compound+delivery+system%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Further development of rodent whole embryo culture: solvent toxicity and water insoluble compound delivery system.</a> Toxicology. 30, 45-57 (1984).</li>
<li>Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transferring+genes+into+cultured+mammalian+embryos+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Different%22%5BJournal%5D)">Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation.</a> Dev. Growth Different. 50, 485-497 (2008).</li>
<li>Cuthbertson, R. A., Beck, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postimplantation+whole+embryo+culture%3A+a+new+method+for+studying+ocular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Postimplantation whole embryo culture: a new method for studying ocular development.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 31, 1653-1656 (1990).</li>
<li>New, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+explanted+rat+embryos+in+circulating+medium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Embryol.+Exp.+Morphol%22%5BJournal%5D)">Development of explanted rat embryos in circulating medium.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 17, 513-525 (1967).</li>
<li>Chung, K. C., Park, J. H., Kim, C. H., Ahn, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor-alpha+and+phorbol+12-myristate+13-acetate+differentially+modulate+cytotoxic+effect+of+nitric+oxide+generated+by+serum+deprivation+in+neuronal+PC12+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor-alpha and phorbol 12-myristate 13-acetate differentially modulate cytotoxic effect of nitric oxide generated by serum deprivation in neuronal PC12 cells.</a> J. Neurochem. 72, 1482-1488 (1999).</li>
<li>Sasaoka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+functional+role+of+Shc+proteins+in+mitogenic+signaling+induced+by+insulin%2C+insulin-like+growth+factor-1%2C+and+epidermal+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Evidence for a functional role of Shc proteins in mitogenic signaling induced by insulin, insulin-like growth factor-1, and epidermal growth factor.</a> J. Biol. Chem. 269, 13689-13694 (1994).</li>
<li>Chotani, M. A., Mitra, S., Eid, A. H., Han, S. A., Flavahan, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+cAMP+signaling+pathways+differentially+regulate+alpha2C-adrenoceptor+expression%3A+role+in+serum+induction+in+human+arteriolar+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Distinct cAMP signaling pathways differentially regulate alpha2C-adrenoceptor expression: role in serum induction in human arteriolar smooth muscle cells.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 288, 69-76 (2005).</li>
<li>Moore-Scott, B. A., Gordon, J., Blackburn, C. C., Condie, B. G., Manley, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+serum-free+in+vitro+culture+technique+for+midgestation+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">New serum-free in vitro culture technique for midgestation mouse embryos.</a> Genesis. 35, 164-168 (2003).</li>
<li>Gordon, J., Moore, B. A., Blackburn, C. C., Manley, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum-Free+Culture+of+Mid-gestation+Mouse+Embryos%3A+A+Tool+for+the+Study+of+Endoderm-Derived+Organs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Serum-Free Culture of Mid-gestation Mouse Embryos: A Tool for the Study of Endoderm-Derived Organs.</a> Methods Mol. Biol. 1092, 183-194 (2014).</li>
<li>New, D. A., Cockroft, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rotating+bottle+culture+method+with+continuous+replacement+of+the+gas+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Experientia%22%5BJournal%5D)">A rotating bottle culture method with continuous replacement of the gas phase.</a> Experientia. 35, 138-140 (1979).</li>
<li>Cockroft, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+in+culture+of+rat+foetuses+explanted+at+12.5+and+13.5+days+of+gestation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Embryol.+Exp.+Morphol%22%5BJournal%5D)">Development in culture of rat foetuses explanted at 12.5 and 13.5 days of gestation.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 29, 473-483 (1973).</li>
<li>Zeeb, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+manipulation+of+blood+and+lymphatic+vascularization+in+ex+vivo-cultured+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Pharmacological manipulation of blood and lymphatic vascularization in ex vivo-cultured mouse embryos.</a> Nat. Protoc. 7, 1970-1982 (2012).</li>
<li>Wawersik, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP7+acts+in+murine+lens+placode+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">BMP7 acts in murine lens placode development.</a> Dev. Biol. 207, 176-188 (1999).</li>
<li>Thut, C. J., Rountree, R. B., Hwa, M., Kingsley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large-scale+in+situ+screen+provides+molecular+evidence+for+the+induction+of+eye+anterior+segment+structures+by+the+developing+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">A large-scale in situ screen provides molecular evidence for the induction of eye anterior segment structures by the developing lens.</a> Dev. Biol. 231, 63-76 (2001).</li>
<li>Greenfield, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+lowers+Alzheimer+beta-amyloid+generation+by+stimulating+trans-Golgi+network+vesicle+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Estrogen lowers Alzheimer beta-amyloid generation by stimulating trans-Golgi network vesicle biogenesis.</a> J. Biol. Chem. 277, 12128-12136 (2002).</li>
<li>Cheng, J., Dutra, A., Takesono, A., Garrett-Beal, L., Schwartzberg, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+generation+of+C57BL%2F6J+mouse+embryonic+stem+cells+in+a+defined+serum-free+media%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Improved generation of C57BL/6J mouse embryonic stem cells in a defined serum-free media.</a> Genesis. 39, 100-104 (2004).</li>
<li>Kim, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+of+human+neural+stem+cells+by+OCT4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming of human neural stem cells by OCT4.</a> Nature. 461, 649-643 (2009).</li>
<li>Totonchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder-+and+serum-free+establishment+and+expansion+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Feeder- and serum-free establishment and expansion of human induced pluripotent stem cells.</a> Int. J. Dev. Biol. 54, 877-886 (2010).</li>
</ol>

Nie mamy żadnych konkurencyjnych interesów finansowych.

Zarodki myszy w połowie ciąży hodowano w pożywce hodowlanej bez surowicy w atmosferze 95% O2 / 5% CO2 w aparacie do hodowli w butelce w temperaturze 37 °C. Rozwój zarodka ex utero był krytycznie zależny od wielu czynników na każdym etapie procedury, od momentu wyizolowania macicy od myszy poddanych eutanazji do zakończenia hodowli (ryc. 1). Najważniejszym czynnikiem, który wpłynął na rozwój, był czas potrzebny na rozpoczęcie uprawy. Inne krytyczne punkty podczas zabiegu, kt...

Metody hodowli in vitro wykorzystujące całe zarodki są dobrze przystosowane do badania mechanizmów sygnalizacyjnych związanych z organogenezą embrionalną, które są trudno dostępne w macicy. Całe zarodki zapewniają integralność tkanek i wsparcie odpowiednie dla interakcji tkankowych, które mają kluczowe znaczenie dla szybkiego wystąpienia mechanizmów sygnalizacyjnych niezbędnych dla różnych procesów komórkowych podczas organogenezy. Podczas gdy całe hodowle zarodków stanowią platformę dla wielu zastosowań, takich jak badania transplantacyjne, manipulacje genetyczne i tkankowe, badania implantacji koralików, badania toksykologiczne itp., obecnie stosowane systemy hodowli zarodków są głównie zależne od surowicy dla prawidłowego wzrostu i utrzymania zarodków w kulturze1-9.
Surowica została wykorzystana jako jeden z głównych składników od 10-100% pożywki hodowlanej 6-8,10,11. Jednak skład surowicy nie jest dobrze określony i może się różnić w zależności od zwierzęcia i za każdym razem, gdy surowica jest zbierana. Podczas gdy laboratoryjne przygotowanie surowicy jest czasochłonne i wiąże się z rygorystycznymi procedurami, surowica pozyskiwana komercyjnie wykazuje znaczną zmienność między różnymi partiami i podnosi koszty eksperymentalne. Ponadto surowica może zawierać nieznane czynniki, takie jak czynniki wzrostu, hormony lub inne białka, które mogą potencjalnie wpływać na wynik niektórych eksperymentów, zwłaszcza tych, które obejmują badanie cząsteczek sygnałowych ważnych w interakcjach tkankowych. Badania wykazały, że dodanie surowicy do hodowli może potencjalnie zmienić wewnątrzkomórkowe poziomy niektórych cząsteczek sygnałowych, takich jak cykliczny monofosforan adenozyny (cAMP) i białka zaangażowane w sygnalizację mitogenną oraz szlaki sygnałowe kinazy fosfoinozytolu 3 (PI 3)12-14. W przeciwieństwie do nich, system hodowli bez surowicy zapewnia zalety środowiska wolnego od antygenów, abstynencji od biologicznie aktywnych enzymów, które mogą zmieniać procesy komórkowe i umożliwia spójność między eksperymentami.
W obecnym badaniu, użyliśmy pożywki hodowlanej bez surowicy, przygotowanej z dostępnych na rynku suplementów pożywek komórek macierzystych, do hodowli całych zarodków w połowie ciąży w atmosferze 95% O2 / 5% CO2 w aparacie do hodowli w butelce w temperaturze 37 °C15,16. Zarodki myszy hodowane przez 16 do 40 godzin w tych określonych warunkach wykazywały postęp w rozwoju morfologicznym całego ciała embrionalnego i różne struktury, takie jak serce, kończyny, mózg i oczy, wskazują na odpowiedni poziom proliferacji komórek, migracji, różnicowania i interakcji tkankowych. Analiza molekularna rozwoju embrionalnego w hodowli jednego ze złożonych układów narządów, takich jak oko, wykazała, że rozwój oka jest zgodny z tym, który obserwuje się w tkance oka u zarodków rozwijających się w macicy (Kalaskar i Lauderdale, w przygotowaniu). W ten sposób pokazujemy, że zarodki myszy hodowane w połowie ciąży wykazują postępujący wzrost i rozwój morfologiczny porównywalny do obserwowanego u zarodków rozwijających się w macicy.

<table><tbody><tr><td>KnockOut DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>10829-018</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Zamiennik Surowicy</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>N-2 Suplement</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td>Stan magazynowy: 100x</td></tr><tr><td>Albumina, z Surowicy bydlęcej</td><td>Sigma</td><td>A9418-50G</td><td>Stan magazynowy: 100%</td></tr> <tr><td>Antybiotyk - Roztwór przeciwgrzybiczy</td><td>Cellgro</td><td>30-004-Cl</td><td>Zapasy: penicylina (10 000 j.m./ml); Streptomycyna (10 000 &mikro; g/ml; Amfoterycyna (250 &mikro; g/ml)&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM&nbsp; &nbsp;</td><td>Cellgro</td><td>15-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator precyzyjny</td><td>B.T.C. Engineering Milton Cambridge Anglia</td><td>Id.No. 840-374</td><td></td></tr><tr><td>Szklane butelki do jednostki obrotowej</td><td>B.T.C. Engineering</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Korek z gumy silikonowej</td><td>B.T.C. Engineering</td><td></td><td></td></tr><tr><td>95% O2/5% CO2 Butla</td><td>AirGas Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny Stemi SV11 Apo</td><td>Mikroskop Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stemi SV6</td><td>Zeiss</td> Inkubator z płaszczem <td></td><td></td></tr><tr><td>wodnym CO2</td><td>Forma naukowa</td><td>Model: 3110</td><td></td></tr><tr><td>Hood</td><td>Szafy bezpieczeństwa biologicznego Nuaire Klasa II Typ A2</td><td>Model: Nu-425-600</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel wodna</td><td>Fisher Scientific</td><td>Waga IsoTemp205</td><td></td></tr><tr><td>Probówka</td> wirówkowa <td>Mettler Toledo</td><td>AG285</td><td></td></tr><tr><td>, 50 ml</td><td>Corning</td><td>430291</td><td></td></tr><tr><td>Lekkie nożyczki operacyjne</td><td>Roboz</td><td>RS-6702</td><td></td></tr><tr><td>Operacyjne ostre-nożyczki&nbsp;</td><td>Kleszcze</td> do mikropreparacji <td>Roboz RS-6812</td><td></td></tr><tr><td>, 4 cale</td><td>Kleszcze</td> do mikropreparacji <td>Roboz RS-5211</td><td></td></tr><tr><td>- Hudson (cWALD), 4-3/4 cala</td> Pęseta do mikropreparacji <td>Roboz</td><td>RS-5237</td><td></td></tr><tr><td>(5/45)</td><td>Zmodyfikowany Roboz</td><td>RS-5005</td><td>- Ostre końce zostały</td></tr><tr><td>Pęseta do mikropreparacji (5)</td><td>Zmodyfikowana Roboz</td><td>RS-5060</td><td>- Ostre końce zostały</td></tr><tr><td>Pęseta do mikropreparacji (55)</td><td>Roboz</td><td>RS-5063</td><td>Zmodyfikowany - Ostre końce zostały</td></tr><tr><td>Taca na instrumenty</td><td>Roboz</td><td>RT-1401S</td><td></td></tr><tr><td>Pokrywa tacy na instrumenty</td><td>Roboz</td><td>RT-1401L</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego-100 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>087571Z</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego-60 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petriego-35 mm</td> System filtrów <td>Fisher Scientific</td><td>0875711YZ</td><td></td></tr><tr><td>( 0,22 i mikro; m Octan celulozy)-150 ml</td><td>Corning</td><td>431153</td><td></td></tr><tr><td>System filtracyjny (0,22 &mikro; m Octan celulozy)-250 ml</td><td>Corning</td><td>430756</td><td></td></tr><tr><td>System filtracyjny (0,22 &mikro; m Octan celulozy) -500 ml</td><td>Pipetor Corning</td><td>430758</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-aid Drummond</td><td>Scientific Co.</td><td>D57849</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serologiczna-10 ml</td><td>VWR</td><td>89130-898</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowa pipeta serologiczna-25 ml</td><td>Pipeta transferowa Corning</td><td>4251</td><td></td></tr><tr><td>- 7,7 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>202-20S</td><td></td></tr></tbody></table>

rozwój embrionalny myszy w systemie hodowli całych zarodków bez surowicy

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Embriony myszy w średnim stadium ciąży były hodowane przy użyciu pożywki hodowlanej bez surowicy, przygotowanej z dostępnych na rynku suplementów pożywki z komórek macierzystych w systemie hodowli w natlenionej butelce na kółkach. Zarodki myszy w E10.5 starannie wyizolowano z macicy z nienaruszonym woreczkiem żółtkowym i w procesie wymagającym precyzyjnego manewru chirurgicznego zarodki delikatnie wyprowadzono z woreczka żółtkowego, zachowując ciągłość naczyniową zarodka z woreczkiem żółtkowym. W porównaniu z zarodkami przygotowanymi z nienaruszonym woreczkiem żółtkowym lub z usuniętym woreczkiem żółtkowym, zarodki te wykazywały wyższy wskaźnik przeżywalności i progresji rozwoju, gdy były hodowane w podobnych warunkach. Wykazujemy, że te zarodki myszy, gdy są hodowane w określonym podłożu w atmosferze 95% O2 / 5% CO2 w aparacie do hodowli w butelce na kółkach w temperaturze 37 °C przez 16-40 godzin, wykazują wzrost i rozwój morfologiczny porównywalny z zarodkami rozwijającymi się w macicy. Wierzymy, że ta metoda będzie przydatna dla badaczy, którzy muszą wykorzystać całą kulturę zarodka do badania interakcji sygnalizacyjnych ważnych w organogenezie embrionalnej.

Rozwój embrionów myszy ex utero zależy od wielu czynników, począwszy od momentu izolacji macicy z organizmu, aż do czasu hodowli embrionów. Jak przedstawiono na Rysunku 1, procedura obejmuje szereg etapów, w tym: oddzielenie ciążnej macicy od ciała (Rysunek 1A), izolację embrionów z nienaruszonym pęcherzykiem żółtkowym (Rysunek 1B), wydobycie embrionów z pęcherzyka żółtkowego (Rysunek 1C) oraz hodowlę embrionów w pożywce bezsurowiczej w atmosfer...

Surowica stosowana w hodowlach embrionów zawiera nieznane składniki, które mogą wpływać na wynik eksperymentów, szczególnie w badaniach dotyczących interakcji sygnałowych. Tutaj wykorzystaliśmy system hodowli natlenionej bez surowicy i wykazaliśmy, że zarodki myszy w połowie ciąży hodowane przez 16-40 godzin wykazują rozwój morfologiczny porównywalny z zarodkami rozwijającymi się w macicy.

Rozwój embrionalny myszy w systemie hodowli całych zarodków bez surowicy

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

Ogólnym celem tej procedury jest wykorzystanie systemu hodowli natlenionej bez surowicy do badania i manipulowania określonymi aspektami rozwoju embrionalnego myszy. Osiąga się to poprzez najpierw odizolowanie macicy z zarodkami od matki myszy. Drugim krokiem jest oddzielenie zarodków nienaruszonym workiem żółtkowym od łożyska decidua po segmentowym rozwarstwieniu macicy.Następnie zarodki należy delikatnie usunąć z woreczka żółtkowego, zachowując integralność zarodkowego układu krwionośnego. Ostatnim krokiem jest hodowla zarodków w bezsurowicy, natlenionym aparacie do hodowli w butelce toczącej się w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez określony czas. Ostatecznie cały ten system hodowli zarodków, który wspiera rozwój różnych struktur zarówno na poziomie morfologicznym, jak i molekularnym, może być wykorzystany do badania rozwijających się zarodków myszy przy użyciu różnych technik.Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii rozwoju, takie jak rola różnych mechanizmów sygnalizacyjnych w specyfikacji siarczanów i morfogenezie tkanek w rozwijającym się zarodku ssaków. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ izolacja zarodków z nienaru

mouse-embryonic-development-serum-free-whole-embryo-culture

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszym artykule przedstawiamy prostą metodologię umożliwiającą długotrwałą hodowlę embrionów ptaków ex-ovo. Technika ta jest idealna do eksperymentów podłużnych, które wymagają pełnej dostępności optycznej i/lub sterylnego transportu embrionów ptaków.

System hodowli embrionów kurzych ex-ovo odpowiedni do obrazowania i zastosowań mikrochirurgicznych

Opisano metodę umożliwiającą bezpośrednią manipulację farmakologiczną embrionów myszy podczas neurulacji z pominięciem metabolizmu matczynego. Technikę tę można dostosować do badania różnych aspektów neurulacji poprzez zmianę punktu czasowego oraz zastosowanego czynnika farmakologicznego.

Zamykanie rurki neuralnej w kulturze całych embrionów myszy

Film opisuje procedurę tworzenia ciał embrionalnych wolnych od surowicy (SFEB) z komórek progenitorowych neuronów przy użyciu różnych pożywek różnicujących bez surowicy lub DM. DM-2 ułatwia dojrzewanie i układanie neuronów do tworzenia SFEB, podczas gdy DM-3 jest używany do dalszego utrzymania wzrostu.

Rozwój i utrzymanie ciał zarodkowych wolnych od surowicy

Hodowla całego zarodka ssaków (WEC) jest szeroko stosowana w teratologii i biologii rozwojowej. Natychmiast odwirowana surowica szczura jest powszechnie dostarczana jako pożywka zarówno dla myszy, jak i szczurów WEC. W tym filmie pokazujemy nasz standardowy protokół przygotowania wysokiej jakości surowicy szczurzej odpowiedniej dla WEC u ssaków.

Przygotowanie surowicy szczurzej odpowiedniej do hodowli całych zarodków ssaków

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę generowania neuronalnych komórek progenitorowych z embrionalnych komórek macierzystych przy użyciu metody monowarstwowej bez surowicy. Te progenitory mogą być wykorzystywane do uzyskiwania dojrzałych typów komórek nerwowych lub do badania procesu specyfikacji neuronalnej i są podatne na skalowanie w formacie wielodołkowym w celu przeprowadzenia badań przesiewowych związków.

Różnicowanie neuronalne embrionalnych komórek macierzystych myszy w hodowli jednowarstwowej bez surowicy

Ten protokół zapewnia metodę pobierania pożywki kondycjonowanej przez embrionalne komórki macierzyste myszy (mESC-CM) pochodzących z surowicy (płodowej surowicy bydlęcej, FBS) i karmowiska (mysie fibroblasty embrionalne, MEFs) dla podejścia wolnego od komórek. Może mieć zastosowanie w leczeniu starzenia się i chorób związanych ze starzeniem się.

Kolekcja pożywki kondycjonowanej komórkami macierzystymi myszy bez surowicy i karmy dla podejścia bezkomórkowego

Ulepszona platforma do hodowli całych zarodków umożliwia ciągły i solidny rozwój ex utero zarodków myszy po implantacji przez okres do sześciu dni, od etapów pregastrulacji do zaawansowanej organogenezy. W tym protokole szczegółowo opisujemy standardową procedurę udanej hodowli zarodków przy użyciu statycznych płytek i systemów obrotowych butelek.

Ex Utero Hodowla zarodków myszy od pregastrulacji do zaawansowanej organogenezy

Przedstawiamy szczegółowy protokół hodowli i obrazowania embrionów myszy, który umożliwia obrazowanie 3D + czasowe komórek progenitorowych serca. Ten zestaw narzędzi wideo omawia kluczowe umiejętności wymagane do skutecznego obrazowania na żywo, które w przeciwnym razie byłyby trudne do zdobycia z publikacji tekstowych.

Obrazowanie na żywo wczesnych progenitorów serca w zarodku myszy

Ten protokół opisuje metodologie tworzenia prostego i efektywnego modelu implantacji zarodków in vitro do oceny istotnych cząsteczek wpływających na proces implantacji zarodka.

Opracowanie modelu implantacji zarodka in vitro

Ten protokół opisuje procedury dotyczące in vitro dojrzewania oocytów mysich, in vitro zapłodnienia i późniejszej kultury embrionów do etapu blastocysty.

Dojrzewanie in vitro komórek jajowych myszy, zapłodnienie i hodowlą zarodków przedimplantacyjnych

Poznaj metodę hodowli zarodków myszy w systemie bezsurowicowym z utlenianiem. Technika ta umożliwia badanie rozwoju embrionalnego przy zachowaniu integralności naczyń krwionośnych i minimalizacji zmiennych zewnętrznych.

Rozwój embrionalny myszy w systemie hodowli całych zarodków bez surowicy

Przeglądaj więcej filmów