Name: Pomiar całkowitego wapnia w neuronach za pomocą mikroanalizy rentgenowskiej sondy elektronowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-20T17:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Poznaj metodę mikroanalizy rentgenowskiej sondy elektronowej do pomiaru wapnia w mitochondriach neuronów. Technika EPMA umożliwia ilościową analizę dystrybucji jonów w skali subkomórkowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Pani Christine A. Winters za doskonałą pomoc techniczną. Praca ta była wspierana przez Basic Neuroscience Program of the NINDS Intramural Research Program, NIH (Z01 NS002610).

Opisane tutaj podejście zostało opracowane przy użyciu konkretnych instrumentów, narzędzi i oprogramowania. Ponieważ laboratoria nie będą używać tej samej konfiguracji eksperymentalnej, podejście jest uogólnione tam, gdzie to możliwe.
1. Szybkie zamrażanie
Metoda analityczna, która ma być opisana, jest całkowicie zależna od metod kriogenicznych dla: 1) "kriofiksacji" komórek lub tkanek w sposób, który ilościowo zachowuje rozkład dyfuzyjnych składników tkankowych i pierwiastków chemicznych, tak jak były w żywych komórkach w momencie zamrażania; oraz 2) przygotowanie ultracienkich kriosekcji odpowiednich do obrazowania i analizy w TEM. Techniki te są pokrótce opisane tutaj, ale szczegóły niezbędne do odtworzenia tych procedur w innych laboratoriach wykraczają poza zakres tego artykułu. Zainteresowanych czytelników odsyłamy do znakomitych ostatnich artykułów9,14.
Uwaga: Ta sekcja opisuje użycie skroplonego etanu, który jest wysoce łatwopalny i potencjalnie wybuchowy; należy podjąć odpowiednie środki ostrożności. Operator musi również zapoznać się ze środkami ostrożności dotyczącymi ciekłego azotu (LN2), w tym ochronnym fartuchem laboratoryjnym, okularami i rękawicami krioodpornymi. Uwaga: W tym miejscu i w całym tekście wszystkie narzędzia (kleszcze itp.) używane do pracy z zamrożonymi próbkami muszą być przed użyciem wstępnie schłodzone w LN2, aby uniknąć przypadkowego rozmrożenia.
Hodowane komórki na szkiełkach nakrywkowych
<ol>
	<li>Przygotować urządzenie do zamrażania wgłębnego poprzez kondensację gazowego etanu w temperaturze -160 °C w studzience centralnej chłodzonej LN2. Napełnij do znaku i przykryj studzienkę obrotową aluminiową pokrywą, gdy nie jest używana.</li>
	<li>Za pomocą klinów bibuły filtracyjnej osuszyć plastikowe szkiełka nakrywkowe hodowanych komórek w doświadczalnie odpowiednich warunkach do uzyskania cienkiego filmu wodnego. Osusz od krawędzi, aby uniknąć dotykania tkanki; Idealna warstwa resztkowa, określona metodą prób i błędów, jest tak cienka, jak to możliwe, ale nie tak cienka, aby odparować i umożliwić wysuszenie powierzchni tkanki.</li>
	<li>Trzymając szkiełko nakrywkowe za krawędź za pomocą kleszczy zaciskowych, szybko zanurz je w ciekłym etanie, ręcznie lub za pomocą tłoka napędzanego grawitacyjnie.</li>
	<li>Umieść zamrożone szkiełko nakrywkowe w pobliskiej styropianowej misce LN2, wystarczająco dużej, aby manipulować żądaną liczbą szkiełek nakrywkowych w pojemnikach do długoterminowego przechowywania. Zalecane są aluminiowe puszki z zakrętką, które nie zacierają się pod LN2.</li>
</ol>
Szybkie zamrażanie wycinków mózgu z hodowli
<ol start="5">
	<li>Pod mikroskopem preparacyjnym obejrzyj i zorientuj organtypowy wycinek hipokampa, niezakłócony i nadal przymocowany do wkładki błony hodowlanej. Umieść znaki referencyjne na membranie w pobliżu krawędzi plastra za pomocą czarnego długopisu typu Sharpie i sfotografuj.</li>
	<li>Jeszcze pod mikroskopem wytnij ok. 5 x 5 mm kwadratów membranowych z pojedynczymi plasterkami wyśrodkowanymi na kwadratach. Unikaj dotykania plastra lub zginania membrany.</li>
	<li>Zamontuj plaster oparty na membranie, amortyzowany podkładką agarową o średnicy 1/4 cala, na specjalnie zaprojektowanym aluminiowym dysku dopasowanym do krioultramikrotomu (opisanego poniżej). Szybko zamroź plasterek, pneumatycznie dociskając go do szafirowego bloku chłodzonego LN2 za pomocą niestandardowego urządzenia do zamrażania "trzaskowego".</li>
	<li>Przenieś do magazynu zgodnie z opisem dla hodowanych komórek.</li>
</ol>
2. Kriosekcja
ZASTRZEŻENIE: Skuteczne wytwarzanie ciętych na sucho wstęg o ultracienkich sekcjach, choć proste i logiczne, wymaga treningu, cierpliwości i sporej praktyki.
<ol>
	<li>Upiecz krioultramikrotom wyposażony w nasadkę kriogeniczną i ostudź do -135 °C.</li>
	<li>Zamrożone szkiełka nakrywkowe pokroić w kwadraty o wymiarach ok. 3 x 3 mm za pomocą ostrego, wstępnie schłodzonego skalpela. Osadź kawałki z kulturami skierowanymi do góry w lepkim płynie "cryoglue" (mieszanina etanolu i 2-propanolu 11 w stosunku 1:6) na standardowych aluminiowych kołkach o średnicy 3 mm, zaprojektowanych tak, aby pasowały do uchwytu na próbki mikrotomu. Unikaj wyciekania krioglufu na powierzchnię hodowli. Zestalić kriogluj, obniżając temperaturę krioboxu do ≤ -160 °C.
	<ul class="lalpha">
		<li>W przypadku zamrożonych plastrów mózgu należy bezpiecznie przymocować krążki bezpośrednio do wykonanego na zamówienie uchwytu do próbek za pomocą kołnierza śrubowego.</li>
	</ul>
	</li>
	<li>Wybrane obszary zamrożonych próbek - np. bogate w komórki obszary kawałków szkiełka nakrywkowego lub zidentyfikowane obszary plastrów - do powierzchni bloku o wymiarach ok. 250 x 250 μm i głębokości ~100 μm za pomocą diamentowego narzędzia do przycinania.</li>
	<li>Cięcie na sucho cienkich odcinków w temperaturze ok. -160 °C za pomocą diamentowego noża kriogenicznego 35°, zasadniczo zgodnie z opisem w odniesieniach4,9. Prędkość skrawania i kąt przyłożenia noża są określane empirycznie; Dobrym punktem wyjścia jest 0,4-0,6 mm/s przy 9°. Grubość nominalna, tj. wysunięcie próbki, uwodnionych odcinków wynosi zwykle 80 nm, chociaż w rzeczywistości odcinki są 1,5-2,0 razy grubsze, głównie z powodu ściskania. Aby zapewnić zadowalające cięcie, niezbędne jest urządzenie antystatyczne. Umieść końcówkę jonizującą urządzenia w odległości 0,5-1 cm od krawędzi noża i dostosuj moc wyjściową, aż do uzyskania zadowalających wstęg sekcji.</li>
	<li>Przygotuj sondy do rzęs, przyklejając (żywicą epoksydową) rzęsy do drewnianych aplikatorów w sztyfcie. Za pomocą takiej sondy podnieś i przenieś sekcje z grzbietu noża na rozżarzone, pokryte węglem folie nośne pioloform, odlane na składanych miedzianych siatkach o oczkach 100 i spoczywające na półzłożonej kopercie z folii indowej na półce roboczej za nożem. Złóż górną połowę siatki i koperty, dociśnij za pomocą narzędzia do prasowania na zimno.</li>
	<li>Przenieś owinięte siatki do wygodnego pudełka na siatkę i przechowuj w aluminiowej puszce, jak opisano w kroku 1.4.</li>
</ol>
3. Kriotransfer próbek do mikroskopu elektronowego
Podstawowym instrumentem dla EPMA w tym laboratorium jest analityczny mikroskop elektronowy działający pod napięciem 120 kV i wyposażony do kriomikroskopii, to znaczy zaprojektowany z czystym odkurzaczem, antykontaminatorem do powierzchni próbki, kamerą cyfrową o wysokiej czułości 2k x 2k i uchwytem na próbki do kriotransferu. Sprawdź wcześniej ustawienie mikroskopu i warunki pracy zarówno w trybie małego, jak i dużego powiększenia i potwierdź zadowalające podciśnienie w kolumnie, najlepiej ≤10-7 Torr. Dostosuj w razie potrzeby.
<ol>
	<li>Upewnij się, że izolacja próżniowa elementu Dewara kriouchwytu jest zadowalająca. Pompuj w razie potrzeby.</li>
	<li>Schłodzić krioholder do minimalnej temperatury, co najmniej -160 °C, w warunkach wysokiej próżni w stoliku mikroskopu; odłączyć łączący uchwyt ze skrzynką sterowniczą. Przechyl goniometr o 45° zgodnie z ruchem wskazówek zegara przed zdjęciem uchwytu, aby zminimalizować rozlanie LN2 na powierzchnie operatora i mikroskopu.</li>
	<li>Przygotuj stołową stację kriogeniczną, schładzając zintegrowany izolowany kubek do ≤160 °C.</li>
	<li>Przenieś (szybko!) schłodzony krioholder z mikroskopu do kriostacji roboczej. Schowaj osłonę przeciwmrozową uchwytu.</li>
	<li>Wyjmij pod LN2 kanapkę z siatką z magazynu i umieść na stole roboczym stacji kriogenicznej. Na stole umieszczony jest również pierścień ustalający do studzienki na próbkę posiadacza.</li>
	<li>Otwórz kopertę indu i przesuń dołączoną siatkę składaną do dołka na próbkę kriouchwytu. Zabezpiecz kratkę za pomocą pierścienia ustalającego za pomocą dołączonego klucza i zamknij osłonę przeciwzamrożeniową.</li>
	<li>Szybko wyjmij krioholder ze stacji krioroboczej i włóż go do śluzy powietrznej mikroskopu i przejdź przez sekwencję pompowania tak szybko, jak to możliwe. Po włożeniu powinno nastąpić minimalne zakłócenie próżni w kolumnie.</li>
	<li>Przywróć goniometr do pochylenia 0°. Podłącz ponownie i ponownie zasil skrzynkę sterowniczą i upewnij się, że temperatura próbki wynosi ≤150 °C.</li>
	<li>Napełnij Dewara w uchwycie próbki i pozwól, aby próżnia i temperatura w pełni wróciły.</li>
</ol>
4. Wizualny przegląd przekrojów
<ol>
	<li>Cofnij osłonę przeciwszronową uchwytu, aby odsłonić próbkę i włączyć wiązkę elektronów.</li>
	<li>Oceń wizualnie próbkę przy małym powiększeniu, zwykle 250x, i przy słabym oświetleniu. Jak pokazano na rysunku 1, sekcje powinny być cienkie i gładkie, nie zagięte ani nie zachodzące na siebie, płaskie i dobrze przymocowane do folii nośnej i na ogół nie powinny być zasłonięte kratkami.</li>
	<li>Opcjonalnie sfotografuj wybrane sekcje. (UWAGA: Zminimalizuj ekspozycję wiązki, ponieważ zamrożone uwodnione sekcje są bardzo podatne na uszkodzenia wywołane wiązką.) Użyj zautomatyzowanego stolika goniometru cyfrowego do przechowywania współrzędnych wybranych sekcji.</li>
</ol>
5. Liofilizacja sekcji
<ol>
	<li>Sekcje liofilizowane poprzez zwiększenie temperatury uchwytu do ok. -100 °C przez ~30 min.</li>
	<li>Schłodzić uchwyt do temperatury -160 °C lub niższej.</li>
	<li>Przed obrazowaniem wyłącz jednostkę sterującą Cryoholder i fizycznie odłącz sterownika, aby uniknąć dryfu obrazu z powodu cykli termicznych i/lub zbierania wibracji.</li>
</ol>
6. Obrazowanie komórek i organelli
Obrazy strukturalne liofilizowanych odcinków są uzyskiwane w temperaturze ok. -160 °C jako obrazy o niskiej dawce, bez strat, rejestrowane cyfrowo za pomocą kamery CCD o wolnym skanowaniu 2k x 2k, kontrolowanej przez odpowiednie oprogramowanie.
<ol>
	<li>Aktywuj EM w trybie hi-mag.</li>
	<li>Wybierz i zobrazuj z ~2,000X (jako TIFF, patrz Rysunek 2) wybrane komórki i subkomórkowe obszary zainteresowania w wysokiej jakości sekcjach, których lokalizacje zostały wcześniej zarejestrowane i przechowywane. (UWAGA: Wysuszone sekcje są teraz znacznie mniej kruche i mniej podatne na uszkodzenia wiązką elektronów.</li>
	<li>Oceniaj obrazy w celu wybrania obszarów zainteresowania (ROI) do analizy rentgenowskiej. Ten krok można opcjonalnie wykonać w trybie off-line, w którym to przypadku EM można wyłączyć, a próbkę pozostawić do ogrzania do temperatury pokojowej.</li>
</ol>
7. Akwizycja widm rentgenowskich
Widma rentgenowskie mogą być rejestrowane za pomocą dowolnego z kilku komercyjnych lub specjalnie zaprojektowanych systemów analizy rentgenowskiej, minimalnie składających się z detektora rentgenowskiego z dyspersją energii (EDX), powiązanej elektroniki procesora impulsowego oraz kompatybilnego oprogramowania do akwizycji i wyświetlania. (System używany w tym laboratorium jest opisany w Tabeli 1.)
<ol>
	<li>Skonfiguruj EM do akwizycji promieniowania rentgenowskiego, wkładając detektor EDX do kolumny (jeśli to konieczne), wycofując aperturę obiektywu oraz wkładając i centrując wszelkie rozproszone otwory promieniowania. Ustawić krioholder na najniższą temperaturę, przy której unika się zanieczyszczenia próbki mrozem, ale co najmniej poniżej -100 °C.</li>
	<li>Przechyl uchwyt o 20° w kierunku czujnika.</li>
	<li>W warunkach obrazowania szerokokątnego i zakładając, że zamierza się przeanalizować matrycę poszczególnych mitochondriów, należy wybrać mitochondrium do analizy, przenieść je do środka pola i skupić się.</li>
	<li>Przejdź do trybu punktowego (w niektórych mikroskopach wystarczy zjednoczyć wiązkę za pomocą drugiego ogniskowania kondensora) i zwiększ prąd wiązki do ok. 3 nA (mierzonego za pomocą kubka Faradaya lub podobnego) do plamki 100 nm.</li>
	<li>Uruchom oprogramowanie do akwizycji widma i rozpocznij 100-sekundową akwizycję, którą można oglądać na żywo na monitorze. Zapisz nagrane widmo (rysunek 2). Preferowany jest standardowy format EMSA.</li>
	<li>Wyłącz EM i przenieś plik(i) z wieloma widmami do stacji roboczej do analizy (offline).</li>
</ol>
8. Analiza widm rentgenowskich
Analiza jakościowa
Widmo EDX (Rysunek 2, wstawka) to zasadniczo wykres x-y intensywności promieniowania rentgenowskiego w funkcji energii. Widma zawierają jakościowe i ilościowe informacje o składzie pierwiastkowym analizowanej objętości, w tym sensie, że "charakterystyczna" energia piku identyfikuje pierwiastek powodujący powstanie tego piku, podczas gdy intensywność odzwierciedla ilość tego pierwiastka. Charakterystyczne szczyty wznoszą się na powoli zmieniającym się tle, zwanym "kontinuum". (Legenda do rysunku 2 dalej omawia istotne szczegóły widm EDX.) Energia rozmaitości szczytowych dla całego układu okresowego pierwiastków jest definiowana przez dobrze znaną strukturę elektroniczną pierwiastków, stąd całe oprogramowanie EDX łączy się z bazą danych, która automatycznie identyfikuje składniki analitu. W kontekście fizjologicznym elementy interesu ogólnego, które dobrze nadają się do analizy EDX, obejmują Na (Kα przy 1,04 keV), P (2,01 keV), K (3,31 keV) i Ca (3,69 keV).
<ol>
	<li>Skorzystaj z dostępnej bazy danych oprogramowania i procedur dopasowywania pików, aby zidentyfikować główne pierwiastki w widmach. W próbce biologicznej spodziewaj się znaleźć piki dla Na, Mg, P, S, Cl, K i Ca. (UWAGA: dwa ostatnie elementy nakładają się na siebie!)</li>
</ol>
Analiza ilościowa
Analiza ilościowa widm EDX polega na wyodrębnieniu zintegrowanego obszaru zidentyfikowanych pików i przekształceniu tej wartości w stężenie. W przypadku analizy biologicznej przyjętym podejściem jest metoda piku Halla/kontinuum4,7,10, która wykorzystuje fakt, że intensywność kontinuum (zdefiniowanego powyżej i na rysunku 2) jest proporcjonalna do suchej masy analizowanej objętości. Zatem stosunek powierzchni piku do powierzchni kontinuum, w porównaniu z tym samym stosunkiem w widmach wzorców o znanym składzie, określa stężenie w docelowym kompartmencie komórkowym. Należy zauważyć, że podejście to zapewnia stężenia w jednostkach moli na masę, zwykle wyrażane jako mmol/kg suchej masy. Jednostka ta jest nietypowa i do interpretacji może wymagać dodatkowego przeliczenia na, na przykład, mmol/l mokrej masy lub mmol/mg białka, jak opisano w innym miejscu4,10.
<ol start="2">
	<li>Wyodrębnić powierzchnie pików (i oszacowania błędów) pierwiastków biologicznych między Z = 10-20 (0,5-4,0 keV), tj. Na, Mg, P, S, Cl, K i Ca, używając jednej z procedur dopasowania wbudowanych w oprogramowanie analityczne (patrz tabela 1, zwłaszcza przypis 4). W tym laboratorium używane jest dopasowanie jednostronne lub wielokrotne dopasowanie metodą najmniejszych kwadratów. Należy pamiętać, że to dopasowanie wymaga szczególnej uwagi w celu rozwiązania nakładania się pików K i Ca (patrz rysunek 2).</li>
	<li>Zintegruj kontinuum między 1,45-1,61 keV. Można zastosować alternatywne regiony wolne od zakłóceń.</li>
	<li>Oblicz stosunek pik/kontinuum, a następnie stężenia, porównując je z wzorcami. Propagowanie błędów w całej analizie.</li>
	<li>Korzystaj ze standardowych programów statystycznych i formuł, aby oszacować średnie, które odzwierciedlają zmienność biologiczną.</li>
</ol>

<ol><li>Aronova, M. A., Kim, Y. C., Pivovarova, N. B., Andrews, S. B., Leapman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+EFTEM+mapping+of+near+physiological+calcium+concentrations+in+biological+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Quantitative EFTEM mapping of near physiological calcium concentrations in biological specimens.</a> Ultramicroscopy. 109, 201-212 (2009).</li>
<li>Aronova, M. A., Leapman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elemental+mapping+by+electron+energy+loss+spectroscopy+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Elemental mapping by electron energy loss spectroscopy in biology.</a> Methods Mol. Biol. 950, 209-226 (2013).</li>
<li>Bezprozvanny, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+and+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling and neurodegenerative diseases.</a> Trends Mol. Med. 15, 89-100 (2009).</li>
<li>Fernandez-Segura, E., Warley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+probe+X-ray+microanalysis+for+the+study+of+cell+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Electron probe X-ray microanalysis for the study of cell physiology.</a> Methods Cell Biol. 88, 19-43 (2008).</li>
<li>Gibson, G. E., Starkov, A., Blass, J. P., Ratan, R. R., Beal, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cause+and+consequence%3A+Mitochondrial+dysfunction+initiates+and+propagates+neuronal+dysfunction%2C+neuronal+death+and+behavioral+abnormalities+in+age-associated+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Cause and consequence: Mitochondrial dysfunction initiates and propagates neuronal dysfunction, neuronal death and behavioral abnormalities in age-associated neurodegenerative diseases.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1802, 122-134 (2010).</li>
<li>Leapman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+techniques+in+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Novel techniques in electron microscopy.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 14, 591-598 (2004).</li>
<li>LeFurgey, A., Bond, M., Ingram, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frontiers+in+electron+probe+microanalysis%3A+application+to+cell+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Frontiers in electron probe microanalysis: application to cell physiology.</a> Ultramicroscopy. 24, 185-219 (1988).</li>
<li>Newbury, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+X-ray+mapping%3A+X-ray+spectrum+imaging+above+100+kHz+output+count+rate+with+the+silicon+drift+detector%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Microanal%22%5BJournal%5D)">The new X-ray mapping: X-ray spectrum imaging above 100 kHz output count rate with the silicon drift detector.</a> Microsc. Microanal. 12, 26-35 (2006).</li>
<li>Pierson, J., Vos, M., McIntosh, J. R., Peters, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+on+electron+cryotomography+of+vitreous+cryo-sections%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Electron+Microsc%22%5BJournal%5D)">Perspectives on electron cryotomography of vitreous cryo-sections.</a> J. Electron Microsc. 60, S93-S100 (2011).</li>
<li>Pivovarova, N. B., Hongpaisan, J., Andrews, S. B., Friel, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depolarization-induced+mitochondrial+Ca+accumulation+in+sympathetic+neurons%3A+spatial+and+temporal+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Depolarization-induced mitochondrial Ca accumulation in sympathetic neurons: spatial and temporal characteristics.</a> J. Neurosci. 19, 6372-6384 (1999).</li>
<li>Pivovarova, N. B., Nguyen, H. V., Winters, C. A., Brantner, C. A., Smith, C. L., Andrews, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitotoxic+calcium+overload+in+a+subpopulation+of+mitochondria+triggers+delayed+death+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Excitotoxic calcium overload in a subpopulation of mitochondria triggers delayed death in hippocampal neurons.</a> J. Neurosci. 24, 5611-5622 (2004).</li>
<li>Ritchie, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrum+simulation+in+DTSA-II%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Microanal%22%5BJournal%5D)">Spectrum simulation in DTSA-II.</a> Microsc. Microanal. 15, 454-468 (2009).</li>
<li>Stanika, R. I., Winters, C. A., Pivovarova, N. B., Andrews, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+NMDA+receptor-dependent+calcium+loading+and+mitochondrial+dysfunction+in+CA1+vs.+CA3+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Dis%22%5BJournal%5D)">Differential NMDA receptor-dependent calcium loading and mitochondrial dysfunction in CA1 vs. CA3 hippocampal neurons.</a> Neurobiol. Dis. 37, 403-411 (2010).</li>
<li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+receptor+arrays+in+frozen-hydrated+sections+and+plunge-frozen+specimens+of+E.+coli+engineered+to+overproduce+the+hemotaxis+receptor+Tsr%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of receptor arrays in frozen-hydrated sections and plunge-frozen specimens of E. coli engineered to overproduce the hemotaxis receptor Tsr.</a> J. Microsc. 216, 76-83 (2004).</li>
</ol>

Autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów.

Przedstawiona tutaj metoda analityczna oparta na mikroskopie elektronowym pozwala na wykrycie, identyfikację i ilościowe określenie kilku elementów o znaczeniu biologicznym, w tym Na, K, P, a zwłaszcza Ca. Analizy te mogą być przeprowadzane w rozdzielczości subkomórkowej, tj. wewnątrzorganellowej, dzięki możliwości lokalizacji i identyfikacji interesujących struktur na wysokiej jakości obrazach kriosekcji przygotowanych z szybko zamrożonych próbek. Należy zauważyć, że barwienie nie jest wymagane do zarejestrowan...

Jony wapnia są prawdopodobnie najważniejszą i najbardziej wszechstronną jednostką sygnalizacji komórkowej w biologii, odgrywając istotną rolę w normalnych procesach, tak różnorodnych, jak transmisja synaptyczna i ekspresja genów. Z drugiej strony wapń jest równie ważny w śmierci komórki. W szczególności deregulacja wapnia jest kluczowym czynnikiem uszkodzenia neuronów w udarze, chorobie Parkinsona, Alzheimera i innych chorobach neurodegeneracyjnych3,5. Dlatego niezwykle ważne jest zrozumienie ilościowo, w jaki sposób wapń jest rozprowadzany w komórkach i jak zmienia się on pod wpływem bodźców fizjologicznych lub patofizjologicznych. Cel ten komplikuje fakt, że wapń jest dynamicznie rozprowadzany między dwoma stanami fizycznymi - wolnym w roztworze lub związanym z substratem - oraz że stężenie wapnia w komórkach zmienia się na przestrzeni kilku rzędów wielkości w wyniku stymulacji.
Chociaż dostępnych jest kilka zaawansowanych metodologii analizy wolnego wewnątrzkomórkowego wapnia, określenie całkowitego stężenia wapnia w zdefiniowanych przedziałach wewnątrzkomórkowych jest realistycznie ograniczone do jednego podejścia, a mianowicie mikroanalizy sondy elektronowej (EPMA). EPMA to technika polegająca na sprzężeniu spektrometru rentgenowskiego z transmisyjnym mikroskopem elektronowym (TEM). Działo elektronowe TEM skupia stacjonarną, submikronową sondę elektronową na subkomórkowym obszarze zainteresowania, a specyficzne dla pierwiastka promienie rentgenowskie emitowane w wyniku bombardowania elektronami są zbierane i analizowane (patrz referencje7,4 dla szczegółowych przeglądów technicznych). Zalety EPMA obejmują rozdzielczość na poziomie pojedynczych organelli i czułość submilimolową. W praktyce jednak EPMA wymaga specjalistycznych kriotechnik i oprzyrządowania do przygotowania i analizy próbek. W tym miejscu opisano narzędzia, techniki i przyrządy odpowiednie do pomiarów wewnątrzkomórkowego wapnia za pomocą EPMA. Wapń wewnątrzmitochondrialny jest szczególnie interesujący ze względu na kluczową rolę, jaką mitochondrialne przeciążenie wapniem odgrywa w chorobach neurodegeneracyjnych.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><mocne>ODCZYNNIKI/MATERIAŁY</mocne></td></tr><tr><td>Thermanox plastikowe szkiełka nakrywkowe</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>72280</td><td></td></tr><tr><td>Wkładki hodowlane</td><td>BD Falcon</td><td>353090</td><td>Do płytek 6-dołkowych</td></tr><tr><td>Cryopins</td><td>Leica Microsystems</td><td>16701952</td><td>Aplikatory z drewna rowkowanego</td></tr><tr><td></td><td>EM Sciences</td><td>72300</td><td></td></tr><tr><td>Składane siatki EM</td><td>Ted Pella</td><td>4GC100/100</td><td>100 mesh</td></tr><tr><td>Folia indowa</td><td>Alfa Aesar</td><td>13982</td><td>Grubość</td></tr><tr> 0,25 mm<td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Urządzenie do zamrażania wgłębnego</td><td>Leica Microsystems</td><td>KF-80</td><td></td></tr><tr><td>Urządzenie do zamrażania Slam</td><td>LifeCell</td><td>CF-100</td><td></td></tr><tr><td>Ultramikrotom</td><td>Leica Microsystems</td><td>UC6</td><td></td></tr><tr><td>Krioprzystawka do mikrotomu</td><td>Leica Microsystems</td><td>FC6</td><td></td></tr><tr><td>Diamentowe narzędzie do kriotryminowania</td><td>Diatome</td><td>Cryotrim 45</td><td></td></tr><tr><td>Diamentowy nóż kriogeniczny</td><td>Diatome</td><td>Cryo 35</td><td></td></tr><tr><td>Urządzenie antystatyczne</td><td>Diatome</td><td>Hauf Static Line</td><td></td></tr><tr><td>Kriomikroskop elektronowy</td><td>Carl Zeiss Mikroskopia</td><td>EM912 Omega</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt na próbki kriogeniczne EM</td><td>Gatan</td><td>CT3500</td><td></td></tr><tr><td>Kamera CCD o wolnym skanowaniu, 2k x 2k</td><td>Troendle (TRS)</td> <td>Oprogramowanie</td><td></td></tr> do <tr><td>akwizycji obrazu</td> Detektor rentgenowski <td>Olympus SIS</td><td>iTEM suite</td><td></td></tr><tr><td>ED</td> Oxford <td>Instruments</td><td>Linksystem Procesor impulsowy Pentafet</td><td></td></tr> Oxford <tr><td></td><td>Instruments</td><td>XP-3</td><td></td></tr><tr><td>PCI backplane karta</td><td>4pi Systems</td><td>Spectral Engine II</td><td></td></tr><tr><td>Komputer stacjonarny</td><td>Apple</td><td>Dowolny model</td><td></td>kompatybilny z OS9</tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy rentgenowskiej</td><td>NIST</td><td>DTSA, DTSA II</td><td></td></tr><tr><td>Arkusz kalkulacyjny</td><td>Microsoft</td><td>Excel</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> <ol> <li>CF100 nie jest już sprzedawany komercyjnie, chociaż maszyna jest dostępna w wielu placówkach akademickich, oraz kompletne maszyny lub części można znaleźć on-line.</li> <li>Samouczek wideo dotyczący uchwytu do kriotransferu CT3500 jest dostępny pod adresem <a href="http://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4" target="_blank">http://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4</a>.</li> <li>SEII jest przestarzały; Universal Spectral Engine Jest nowszym, kompatybilnym z komputerem PC produktem o porównywalnej funkcjonalności. Firma 4pi zaprzestała produkcji i sprzedaży, ale nadal zapewnia wsparcie techniczne dla klientów. Używane systemy można często znaleźć w Internecie.</li> <li>Oryginalna DTSA jest już przestarzała. NIST oferuje w domenie publicznej zaktualizowanego następcę, DTSA II 12 (<a href="http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm" target="_blank">http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm</a>)</li> </ol> </td></tr></tbody></table>

pomiar całkowitego wapnia w neuronach za pomocą mikroanalizy rentgenowskiej sondy elektronowej

Measurement of Total Calcium in Neurons by Electron Probe X-ray Microanalysis

W tym artykule opisane są narzędzia, techniki i instrumenty odpowiednie do ilościowych pomiarów zawartości pierwiastków wewnątrzkomórkowych przy użyciu techniki znanej jako mikroanaliza sondy elektronowej (EPMA). Wapń wewnątrzmitochondrialny jest przedmiotem szczególnego zainteresowania ze względu na kluczową rolę, jaką mitochondrialne przeciążenie wapniem odgrywa w chorobach neurodegeneracyjnych. Metoda opiera się na analizie promieni rentgenowskich generowanych w mikroskopie elektronowym (EM) przez oddziaływanie wiązki elektronów z próbką. W celu utrzymania natywnego rozkładu elementów dyfuzyjnych w próbkach mikroskopii elektronowej, EPMA wymaga "kriofiksacji" tkanki, a następnie przygotowania ultracienkich kriosekcji. Szybkie zamrażanie hodowanych komórek lub organotypowych kultur warstwowych przeprowadza się odpowiednio przez zamrażanie wgłębne w ciekłym etanie lub zamrażanie uderzające o zimny metalowy blok. Kriosekcje o nominalnej grubości 80 nm są cięte na sucho nożem diamentowym w temperaturze ok. -160 °C, zamontowane na miedzianych siatkach pokrytych węglem/pioloformem i kriotransferowane do krio-EM za pomocą specjalistycznego uchwytu na kriopróbki. Po oględzinach i mapowaniu lokalizacji w temperaturze ≤-160 °C i niskiej dawce elektronów, zamrożone uwodnione kriosekcje są liofilizowane w temperaturze -100 °C przez ~30 min. Obrazy wysuszonych kriosekcji na poziomie organelli są rejestrowane, również w niskiej dawce, za pomocą kamery CCD o powolnym skanowaniu i subkomórkowych obszarów zainteresowania wybranych do analizy. Promienie rentgenowskie emitowane z ROI przez stacjonarną, zogniskowaną sondę elektronową o dużej intensywności są zbierane przez spektrometr rentgenowski z dyspersją energii (EDX), przetwarzane przez powiązaną elektronikę i przedstawiane jako widmo promieniowania rentgenowskiego, czyli wykres intensywności promieniowania rentgenowskiego w funkcji energii. Dodatkowe oprogramowanie umożliwia: 1) identyfikację składników elementarnych na podstawie ich "charakterystycznych" energii szczytowych i odcisku palca; oraz 2) analiza ilościowa poprzez wyodrębnienie obszarów pików/tła. Niniejszy artykuł kończy się dwoma przykładami, które ilustrują typowe zastosowania EPMA, w jednym z nich analiza mitochondrialnego wapnia dostarczyła krytycznego wglądu w mechanizmy uszkodzenia ekscytotoksycznego, a drugim, który ujawnił podstawy oporności na niedokrwienie.

Komórki mózgowe zazwyczaj ulegają uszkodzeniu ekscytotoksycznemu w wyniku patologicznego uwalniania neuroprzekaźników, do którego dochodzi w warunkach niedokrwienia. Metoda EPMA odegrała kluczową rolę w odkryciu, że zdolność mitochondriów neuronalnych do sekwestracji ogromnych ilości wapnia leży u podstaw mechanizmu uszkodzeń. Mikrograf elektronowy na Rysunku 3 ilustruje wygląd mitochondriów w liofilizowanych krioprzekrojach hodowli neuronów hipokampa, gwałtownie zamrożonych po 30 min ekspozycji na bodzi...

Ten artykuł opisuje zastosowanie krioanalitycznej mikroskopii elektronowej do ilościowego pomiaru całkowitej zawartości i dystrybucji wapnia w rozdzielczości subkomórkowej w fizjologicznie zdefiniowanych próbkach biologicznych.

Pomiar całkowitego wapnia w neuronach za pomocą mikroanalizy rentgenowskiej sondy elektronowej

In this article the tools, techniques, and instruments appropriate for quantitative measurements of intracellular elemental content using the technique ...

Ogólnym celem tej procedury jest wykorzystanie analitycznej mikroskopii elektronowej do ilościowego pomiaru stężenia ważnych biologicznie pierwiastków, takich jak wapń, w rozdzielczości subkomórkowej w hodowanych neuronach. Osiąga się to poprzez szybkie zamrożenie hodowli żywych komórek i przygotowanie ultracienkich skrawków kriogenicznych. Drugim krokiem jest przeniesienie skrawków kriogenicznych do analitycznego mikroskopu elektronowego i ich liofilizacja.Kolejne zdjęcia i widma rentgenowskie są wymagane z wybranych regionów subkomórkowych, w tym mitochondriów neuronalnych. Ostatnim krokiem jest ilościowa analiza widm rentgenowskich w celu określenia zlokalizowanych stężeń pierwiastków. Ostatecznie to podejście, znane jako EPMA, służy do ujawnienia zmian w stężeniach i dystrybucji wapnia, które leżą u podstaw wewnątrzkomórkowej sygnalizacji wapniowej.Główną przewagą tej techniki nad pokrewnymi metodami, takimi jak fluorescencja, mikroskopia, wychwyt radioizotopów lub fotometria płomieniowa, jest rozdzielczość na poziomie pojedynczych organelli i czułość submilimolowa. Procedurę zademonstruje dr Natalia pva, starszy pracownik naukowy w naszym laboratorium. Aby rozpocząć, przygotuj

measurement-total-calcium-neurons-electron-probe-x-ray

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Prezentujemy sposób jednoczesnego monitorowania zmian stężenia wewnątrzkomórkowego wolnego wapnia oraz skuteczności synaptycznej w preparacie zwojowym Aplysia. Obrazujemy wapń wewnątrzkomórkowy z wykorzystaniem barwnika fluorescencyjnego Calcium Orange, a transmisję synaptyczną indukujemy i monitorujemy za pomocą elektrod ostrych (wewnątrzkomórkowych).

Monitorowanie zmian wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia i skuteczności synaptycznej u mięczaka Aplysia

Ten film przedstawia koncepcje związane z obrazowaniem wapnia i zawiera przykładowy protokół obrazowania poklatkowego robaków znajdujących się w formowanych studzienkach agarozowych.

Obrazowanie wapnia: metoda wizualizacji aktywności neuronalnej u żywych C. elegans

Dzięki małemu, przezroczystemu ciału, dobrze udokumentowanej neuroanatomii i mnóstwu podatnych technik genetycznych i odczynników, C. elegans stanowi idealny organizm modelowy do obrazowania neuronów in vivo przy użyciu stosunkowo prostych, tanich technik. Tutaj opisujemy obrazowanie pojedynczego neuronu u nienaruszonych dorosłych zwierząt przy użyciu genetycznie kodowanych fluorescencyjnych wskaźników wapnia.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia neuronów u C. elegans

Procedury są opisane w celu jednoczesnego rejestrowania potencjału błonowego lub prądu oraz zmian wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia. Neurony jądra nadskrzyżowaniowego są wypełnione wskaźnikiem wapnia bis-fura-2 za pomocą elektrody patch clamp w konfiguracji patch clamp całej komórki.

Jednoczesny zapis elektrofizjologiczny i obrazowanie wapnia neuronów jądra nadskrzyżowaniowego

Prezentujemy metodę łączącą zapisy z całokomórkowego patch-clampu i obrazowania dwufotonowego w celu zarejestrowania stanów przejściowych Ca2+ w dendrytach neuronalnych w ostrych wycinkach mózgu.

Dwufotonowe obrazowanie wapnia w dendrytach neuronalnych w wycinkach mózgu

Prezentujemy dwuczęściowy protokół, który łączy fluorescencyjne obrazowanie wapnia z hybrydyzacją in situ, pozwalając eksperymentatorowi skorelować wzorce aktywności wapnia z profilami ekspresji genów na poziomie pojedynczej komórki.

Fluorescencyjne obrazowanie wapnia i późniejsza hybrydyzacja in situ w celu charakterystyki prekursorów neuronalnych u Xenopus laevis

Opisano dwie powiązane metody wizualizacji zdarzeń subkomórkowych wymaganych do transmisji synaptycznej. Protokoły te umożliwiają monitorowanie w czasie rzeczywistym dynamiki napływu presynaptycznego wapnia i fuzji błony pęcherzyków synaptycznych przy użyciu obrazowania żywych komórek neuronów hodowanych in vitro.

Fluorescencyjny pomiar funkcji synaptycznych w czasie rzeczywistym w modelach stwardnienia zanikowego bocznego

Protokół opisuje metodę ładowania fluorescencyjnego barwnika wapniowego przez przecięty nerw do zakończeń nerwu ruchowego myszy. Ponadto przedstawiono unikalną metodę rejestracji szybkich stanów przejściowych wapnia w zakończeniach nerwów obwodowych za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Rejestracja stanów przejściowych wapnia w mysim połączeniu nerwowo-mięśniowym z wysoką rozdzielczością czasową przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Obecne metody opisują nieratiometryczne podejście do wysokorozdzielczego, subkompartmentowego obrazowania wapnia in vivo u Caenorhabditis elegans przy użyciu łatwo dostępnych genetycznie kodowanych wskaźników wapnia.

Subkomórkowe obrazowanie neuronalnej obsługi wapnia in vivo

Proponowany protokół zakłada globalne podejście do oceny procesu tworzenia się kości w kontekście regeneracji kości za pomocą analiz multimodalnych. Ma on na celu dostarczenie jakościowych i ilościowych informacji na temat tworzenia się nowych kości, zwiększenie rygoru i trafności badań podstawowych i przedklinicznych.

Kompleksowa charakterystyka mineralizacji tkanek w modelu ex vivo

Poznaj metodę mikroanalizy rentgenowskiej sondy elektronowej do pomiaru wapnia w mitochondriach neuronów. Technika EPMA umożliwia ilościową analizę dystrybucji jonów w skali subkomórkowej.

Pomiar całkowitego wapnia w neuronach za pomocą mikroanalizy rentgenowskiej sondy elektronowej

Przeglądaj więcej filmów