Name: Transfekcja fosforanu wapnia pierwotnych neuronów hipokampa (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-12T18:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Poznaj metodę transfekcji fosforanem wapnia pierwotnych neuronów hipokampa szczura. Protokół ten jest prosty, ekonomiczny i skuteczny, osiągając wydajność do 50% w badaniach neurobiologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca jest wspierana przez NS065183 grantów NIH i fundusze na rozpoczęcie działalności z Rutgers Robert Wood Johnson Medical School.

1. Przygotowanie hodowli astrocytów szczurów do pożywek kondycjonowanych i kokultur astrocytów i neuronów.
<ol>
	<li>Przygotować bufor do preparacji (BSS, przepis znajduje się w Tabeli 1) i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu przygotowania do użycia.</li>
	<li>Znieczulenie nowonarodzonych szczeniąt szczurów (P0-P2) izofluranem w zlewce o pojemności 500 ml.</li>
	<li>Kiedy szczenięta są nieruchome, spryskaj je 70% etanolem i odetnij głowę.</li>
	<li>Usuń mózg.
	<ol>
		<li>Przytrzymaj mocno głowę za pomocą kleszczy Dumont #5 i użyj cienkich nożyczek, aby wykonać nacięcie w linii środkowej przez skórę i czaszkę.</li>
		<li>Odsłoń mózg, odbijając czaszkę na boki, i wyjmij mózg do naczynia zawierającego zimny BSS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oddziel półkule mózgowe od międzymózgowia i pnia mózgu pod zakresem preparacji. Ostrożnie usuń wszystkie opony mózgowe, stabilizując tkankę jedną parą kleszczy i delikatnie odciągając opony mózgowe inną parą kleszczy.</li>
	<li>Zbierz wszystkie półkule w jednej naczyniu o średnicy 60 mm. Za pomocą małych nożyczek zmiel tkankę tak drobno, jak to możliwe. Następnie przenieś zmieloną tkankę do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Dodać 1,5 ml 1% DNazy I i 1,5 ml 2,5% trypsyny i 12 ml BSS (całkowita objętość 15 ml) do mózgu. Inkubować w wytrząsającej łaźni wodnej przez 15 minut w temperaturze 37 °C. Aby zapewnić dobre wymieszanie, probówkę obraca się ręcznie co 5 minut.</li>
	<li>Przenieść supernatant przez sitko o średnicy 70 μm przez nową stożkową probówkę o pojemności 50 ml. Dodać 3 ml FBS do tego supernatantu.</li>
	<li>Do pozostałych kawałków dodać 13,5 ml BSS i 1,5 ml 2,5% trypsyny i inkubować w wytrząsającej łaźni wodnej przez kolejne 15 minut.</li>
	<li>Przenieść pozostały supernatant przez sitko do komórek i połączyć z supernatantem z kroku 1.8.</li>
	<li>Wirować z prędkością 1,000 obr./min przez 5 minut, aby granulować komórki.</li>
	<li>Zawiesić osady w 5 ml pożywki glejowej. Supernatant można ponownie odwirować w celu osadzenia pozostałych komórek.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru.</li>
	<li>Komórki płytkowe o gęstości 1 x 107 na 150 cm2 kolba.</li>
	<li>Zmień pożywkę na świeżą pożywkę glejową następnego dnia po posiewie. Następnie karmić komórki dwa razy w tygodniu pożywką glejową.</li>
	<li>Gdy komórki osiągną konfluencję >80% (około 10 dni po posiewie), zamroź komórki w 90% surowicy końskiej i 10% DMSO i utrzymuj zapasy w ciekłym azocie. Komórki zamraża się w dawce 2 x 106 na fiolkę. Z każdej kolby można zamrozić około 5 fiolek.</li>
	<li>Około 10-14 dni przed założeniem hodowli hipokampa komórki glejowe są siane z zamrożonych zapasów. Zwykle nakładamy pięć 6-dołkowych płytek, co wystarcza do podtrzymania wzrostu 90 szkiełek nakrywkowych neuronów hipokampa (trzy okrągłe szkiełka nakrywkowe o średnicy 15 mm na dołek). Nakładamy również dodatkowe osiem do dziesięciu 60-milimetrowych szalek komórek glejowych, które służą do kondycjonowania pożywek N2.1 do transfekcji. Dzień przed hodowlą neuronów komórki powinny być karmione pożywką NB27. Idealnie byłoby, gdyby astrocyty były w tym momencie zlewające się w >90%. Odkryliśmy, że zamrażanie znacznie zmniejsza liczbę mikrogleju w kulturach astrogleju. Ponieważ zwiększoną neurotoksyczność obserwuje się, gdy mikroglej jest obecny w kulturach astrogleju, zawsze używamy kultury astroglejowej przygotowanej z zamrożonych materiałów do kokultury z neuronami.</li>
</ol>
2. Hodowla neuronów
<ol>
	<li>Szkiełka nakrywkowe należy oczyścić, najpierw spłukując je w wodzie miliQ 2x. Następnie moczy się je w stężonym kwasie azotowym przez 24 godziny i spłukuje wodą miliQ co najmniej pięć razy w ciągu łącznie 2 godzin. Szkiełka nakrywkowe są suszone i sterylizowane przez pieczenie w piekarniku w temperaturze 225 °C przez 6 godzin.</li>
	<li>Przenieś szkiełka nakrywkowe na szalki o średnicy 60 mm po sterylizacji. Umieść cztery kropki sterylnej parafiny w pobliżu zewnętrznej krawędzi każdego szkiełka nakrywkowego, aby oddzielić neurony od komórek glejowych podczas kokultury.</li>
	<li>Szkiełka nakrywkowe pokryć 1 mg/ml poli-L-lizyny w 0,1 M buforze boranowym przez noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Następnego dnia spłucz szkiełka nakrywkowe dwukrotnie w sterylnej wodzie miliQ przez co najmniej 15 minut każde. Następnie są one inkubowane przez noc w pożywkach galwanicznych w inkubatorze o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Eutanazja ciężarnego szczura (E18) za pomocą znieczulenia izofluranem, a następnie odma opłucnowa, a eutanazja zarodków szczurów przez dekapitację. Usuń mózgi i wypreparuj półkule mózgowe, jak opisano powyżej.</li>
	<li>Wypreparuj hipokampy z półkuli mózgowej. Umieść wszystkie hipokampy w stożkowej probówce o pojemności 15 ml i trawić z 0,25% trypsyną (0,5 ml 2,5% trypsyny, 4,5 ml BSS) w temperaturze 37 °C przez 15 minut.</li>
	<li>Strawione hipokampy są płukane w BSS 3x przez 5 minut każdy. Następnie są one rozcierane szklaną pipetą Pasteura, a gęstość komórek określa się za pomocą hemocytometru. Neurony są następnie wysiewane w gęstości 2 x 105 komórek na 60 mm szalki.</li>
	<li>Około 2-4 godziny po posiewie przenieś szkiełka nakrywkowe z dołączonymi neuronami do szalek zawierających komórki astroglejowe, z neuronami skierowanymi w dół w kierunku gleju. W DIV3 dodaj arabinozyd cytozyny do komórek w końcowym stężeniu 5 μM, aby zatrzymać proliferację gleju.</li>
</ol>
3. Transfekcja wapnia
<ol>
	<li>Warunek N2.1 pożywka na gleju w dniu poprzedzającym transfekcję.</li>
	<li>W dniu transfekcji należy zdjąć kondycjonowaną pożywkę N2.1 z gleju i przenieść do nowej potrawy. Przenieś szkiełka nakrywkowe z neuronami do kondycjonowanego podłoża N2.1. Pozostaw do zrównoważenia w inkubatorze przez 10-30 minut.</li>
	<li>Do jednego zestawu sterylnych probówek połącz 1-4 μg DNA, 12,5 μl 2 M CaCl2 i sterylnego H2O, aby uzyskać całkowitą objętość 100 μl. Do drugiego zestawu probówek dodaj 100 μl 2x HBS.</li>
	<li>Dodawać jednorazowo 1/8 objętości 2x HBS (12,5 μl) do probówki zawierającej mieszaninę CaCl2/DNA, za każdym razem wirując przez kilka sekund. Pozostaw probówki na 15 minut.</li>
	<li>Po 15 minutach inkubacji dodawać mieszaninę transfekcji kroplami do komórek. Inkubować przez 1-1,5 godziny. Warstwa osadów przypominających piasek powinna być widoczna pod mikroskopem przy użyciu obiektywu 10X.</li>
	<li>Po inkubacji dwukrotnie przepłukać szkiełka nakrywkowe ciepłym buforem do płukania HBS.</li>
	<li>Włóż szkiełka nakrywkowe do oryginalnych naczyń z glejem, dodaj kwas kynureninowy do końcowego stężenia 0,5 mM.</li>
	<li>Transfekowane neurony mogą być obrazowane na żywo lub przetwarzane pod kątem immunocytochemii już następnego dnia. Neurony mogą przetrwać do trzech tygodni po transfekcji.</li>
</ol>

<ol><li>Karra, D., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+techniques+for+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Transfection techniques for neuronal cells.</a> J. Neurosci. 30, 6171-6177 (2010).</li>
<li>Zeitelhofer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+transfection+of+mammalian+neurons+via+nucleofection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">High-efficiency transfection of mammalian neurons via nucleofection.</a> Nat. Protoc. 2, 1692-1704 (2007).</li>
<li>Janas, J., Skowronski, J., Van Aelst, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+delivery+of+RNAi+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Method+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Lentiviral delivery of RNAi in hippocampal neurons.</a> Method Enzymol. 406, 593-605 (2006).</li>
<li>Graham, F. L., vander Eb, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+technique+for+the+assay+of+infectivity+of+human+adenovirus+5+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA.</a> Virology. 52, 456-467 (1973).</li>
<li>Craig, A. M. Transfecting cultured neurons. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCraig%2C+AM+%22Culturing+Nerve+Cells%22">Culturing Nerve Cells</a>. Banker, G. aG. K. , 2nd edition, MIT Press. Cambridge, MA. (1998).</li>
<li>Alavian, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl-xL+regulates+metabolic+efficiency+of+neurons+through+interaction+with+the+mitochondrial+F1FO+ATP+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Bcl-xL regulates metabolic efficiency of neurons through interaction with the mitochondrial F1FO ATP synthase.</a> Nat. Cell Biol. 13, 1224-1233 (2011).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+synaptic+function+by+VAC14%2C+a+protein+that+regulates+the+phosphoinositides+PI%283%2C5%29P%282%29+and+PI%285%29P%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Modulation of synaptic function by VAC14, a protein that regulates the phosphoinositides PI(3,5)P(2) and PI(5)P.</a> EMBO J. 31, 3442-3456 (2012).</li>
<li>Dudek, H., Ghosh, A., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+phosphate+transfection+of+DNA+into+neurons+in+primary+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Calcium phosphate transfection of DNA into neurons in primary culture.</a> Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 3, Unit 3 11(2001).</li>
<li>Goslin, K. A. H., Banker, G. Rat Hippocampal Neurons in Low-Density Culture. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGoslin%2C+KAH+%22Culturing+Nerve+Cells%22">Culturing Nerve Cells</a>. Banker, G. aG. K. , MIT Press. Cambridge, MA. (1998).</li>
<li>Kohrmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast%2C+convenient%2C+and+effective+method+to+transiently+transfect+primary+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Fast, convenient, and effective method to transiently transfect primary hippocampal neurons.</a> J. Neurosci. Res. 58, 831-835 (1999).</li>
<li>Jiang, M., Chen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Ca2%2B-phosphate+transfection+efficiency+in+low-density+neuronal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">High Ca2+-phosphate transfection efficiency in low-density neuronal cultures.</a> Nat. Protoc. 1, 695-700 (2006).</li>
<li>Goetze, B., Grunewald, B., Baldassa, S., Kiebler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+controlled+formation+of+a+DNA%2Fcalcium+phosphate+coprecipitate%3A+application+for+transfection+of+mature+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Chemically controlled formation of a DNA/calcium phosphate coprecipitate: application for transfection of mature hippocampal neurons.</a> J. Neurobiol. 60, 517-525 (2004).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Istnieje kilka kluczowych parametrów, które muszą być dokładnie kontrolowane, aby transfekcje były konsekwentnie udane10,11. Najbardziej krytycznym parametrem dla transfekcji fosforanu wapnia jest wartość pH 2x HBS, która w naszych rękach zwykle waha się w granicach 7,10-7,15. Zalecamy wykonanie trzech partii zapasów z wartościami pH w krokach co 0,05, aby uwzględnić różnicę między pH-metrami. Alternatywnie, zestaw do transfekcji ssaków Clontech zapewnia 2x HBS, który konsekwentnie zapewnia dobrą wydajność. Na...

Pierwotne neurony są jednym z najtrudniejszych typów komórek do transfekcji, ponieważ są postmitotyczne i są bardzo wrażliwe na zmiany mikrośrodowiska. Istnieją cztery powszechnie stosowane typy metod ekspresji genów egzogennych i krótkich RNA (shRNA) w tych komórkach1. Każdy ma swoje zalety i wady. Na przykład elektroporacja jest zwykle wykonywana na świeżo wyizolowanych neuronach2, ponieważ komórki muszą być przenoszone do kuwet w celu transfekcji. Infekcja wirusowa może zwykle osiągnąć bardzo wysoką skuteczność3, ale jest bardziej pracochłonna i ryzykowna dla operatorów. Na rynku dostępnych jest wiele odczynników do transfekcji za pośrednictwem lipidów, z różnym stopniem powodzenia w neuronach i różnymi poziomami cytotoksyczności.
Transfekcja fosforanu wapnia stanowi wygodną i ekonomiczną metodę wprowadzania obcych genów do neuronów. Metoda ta została po raz pierwszy zastosowana do wprowadzenia DNA adenowirusa do komórek ssaków przez Grahama i Van Der Eba (1973)4. Transfekcję przeprowadzono przez zmieszanie chlorku wapnia z rekombinowanym DNA w buforze fosforanowym. Pozwala to na tworzenie się osadów DNA/fosforanu wapnia, które po stopniowym upuszczeniu na monowarstwę komórek przylegają do powierzchni komórki, są pobierane przez endocytozę i ostatecznie dostają się do jądra5. Proces ten doprowadziłby do ekspresji wprowadzonych obcych genów w komórce docelowej. Typowa wydajność transfekcji fosforanu wapnia waha się między 0,5-5%6-8. Jednak dzięki starannej optymalizacji i konsekwentnej realizacji protokołu eksperymentalnego możliwe jest osiągnięcie wydajności transfekcji na poziomie prawie 50%. Tutaj opisujemy nasz szczegółowy protokół transfekcji fosforanu wapnia pierwotnych neuronów hipokampa, które są hodowane wspólnie z komórkami astrogleju w formacie kanapkowym9.

<table><tbody><tr><td>Kleszcze Dumont #5</td><td>Narzędzia do nauki o wysokiej</td> jakości <td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Drobne nożyczki</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-09</td><td>proste / ostre 8,5 cm</td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe Vannas-Tubinger</td><td>Fine Science Tools</td><td>15008-08</td><td>kątowe / ostre / krawędź tnąca 8,5 cm / 5 mm</td></tr><tr><td>Kleszcze o standardowym wzorze</td><td>Narzędzia do nauki o</td> wysokiej jakości <td>11000-16</td><td></td></tr><tr><td>Student chirurgiczny nożyczki</td><td>Fine Science Tools</td><td>91401-14</td><td>/ 14,5 cm</td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe</td><td>Fine Science Tools</td><td>15006-09</td><td>kątowe na bok / krawędź tnąca 9 cm / 10 mm</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Webster Veterinary</td><td>14043-225-06</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lizyna</td><td>Sigma</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Sigma</td><td>M2279</td><td></td></tr><tr><td>100 mM Pirogronian sodu</td><td>Sigma</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>10x HBSS</td><td>Sigma</td><td>H4385</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES, pH 7,3</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Neurobaseal Media</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>21130-049</td><td></td></tr><tr><td>B27 Suplement (50x)</td><td>Gibco/ Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>N2 Suplement</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Albumina jaja kurzego</td><td>Sigma</td><td>A5503</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>2,5% Trypsyna</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>DNaza I</td><td>Sigma</td><td>DN-25</td><td></td></tr><tr><td>Cytozyna arabinozyd</td><td>Calbiochem/EMD Millipore</td><td>251010</td><td></td></tr><tr><td>Kwas kynureninowy</td><td>Sigma</td><td>K3375</td><td></td></tr></tbody></table>

transfekcja fosforanu wapnia pierwotnych neuronów hipokampa

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Wytrącanie fosforanu wapnia jest wygodną i ekonomiczną metodą transfekcji hodowanych komórek. Dzięki optymalizacji możliwe jest zastosowanie tej metody na trudnych do transfekcji komórkach, takich jak neurony pierwotne. Tutaj opisujemy nasz szczegółowy protokół transfekcji fosforanu wapnia neuronów hipokampa hodowanych wspólnie z komórkami astrogleju.

Gdy poszczególne parametry transfekcji są zoptymalizowane i starannie kontrolowane z eksperymentu na eksperyment, możliwe jest uzyskanie wydajności transfekcji do 50%. Rysunek 1 przedstawia pole neuronów poddanych transfekcji GFP w 4. dniu in vitro (DIV4). W polu znajduje się łącznie 28 neuronów, z czego 16 zostało poddanych transfekcji. Odpowiada to wydajności powyżej 50%. Próbkowanie innych pól na tej samej szkiełku nakrywkowym wykazuje, że całkowita wydajność wynosi około 50% (dane niepokazane). W sys...

Transfekcja fosforanu wapnia pierwotnych neuronów hipokampa

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Ogólnym celem tej procedury jest wprowadzenie genów i krótkich RNA spinki do włosów do hodowanych neuronów. Osiąga się to poprzez najpierw ustanowienie kultur astrogleju od nowonarodzonych szczurów, aby wspierać wzrost neuronów. Neurony hipokampa szczurów E 18 są następnie hodowane wspólnie z komórkami glejowymi.Następnym krokiem jest transfekcja neuronów hipokampa za pomocą metody wytrącania fosforanu wapnia, transfekowane neurony są następnie wizualizowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Korzystając z tych metod, skuteczność transfekcji może wynosić do 50%Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami jest to, że jest stosunkowo prosta, ekonomiczna i bardzo wydajna. Chociaż nasz protokół koncentruje się na transfekcji hodowanych neuronów hipokampa, można go również zastosować do innych trudnych do transfekcji linii komórkowych.Dla tego protokołu przygotuj gotowy do użycia bufor rozwarstwiający BSS o temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odcięciu głowy szczeniakowi mocno chwyć głowę parą kleszczy numer pięć i użyj cienkich nożyczek, aby wykonać nacięcie w linii środkowej przez skórę i czaszkę. Odsłoń mózg, odbijając czaszkę na boki.Następnie wyjmij mózg do nac

calcium-phosphate-transfection-of-primary-hippocampal-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Wyizolowanie i hodowla komórek z konkretnego obszaru mózgu ułatwia badanie parametrów komórkowych i fizjologicznych. Opisujemy metodę pierwotnej hodowli komórek, która pozwala na uzyskanie kultur wzbogaconych w neurony w środowisku bezsurowiczym.

Hodowla pierwotna neuronów hipokampa z noworodków szczurów w dniu P0

Obrazowanie żywych komórek jest szczególnie użyteczne podczas badania dynamiki transportu organelli. W niniejszym materiale opisujemy protokół obrazowania na żywo pęcherzyków o gęstym rdzeniu w hodowlach neuronów z wykorzystaniem szerokopolowej mikroskopii fluorescencyjnej. Protokół ten jest elastyczny i może zostać dostosowany do obrazowania innych organelli, takich jak mitochondria, endosomy i peroksysomy.

Obrazowanie na żywo pęcherzyków o gęstym rdzeniu w pierwotnych hodowlach neuronów hipokampa

Niniejszy protokół opisuje etapy niezbędne do wyizolowania, transfekcji metodą elektroporacji oraz hodowli neuronów hipokampa i kory mózgu myszy. Hodowle krótkoterminowe mogą być wykorzystywane do badań nad wzrostem i prowadzeniem aksonów, natomiast hodowle długoterminowe mogą służyć do badań nad synaptogenezą i analizy kolców dendrytycznych.

Nuklefekcja i hodowla pierwotna embrionalnych neuronów hipokampa i kory myszy

Źródło: Calvo-Rodríguez, et al. Obrazowanie fluorescencyjne i bioluminescencyjne subkomórkowego Ca2+ w starzejących się neuronach hipokampa. J. vis. exp. (2015).  Ten film demonstruje zastosowanie obrazowania fluorescencyjnego do pomiaru poziomu cytozolowego wapnia w krótko- i długoterminowych hodowlach hipokampa szczurów. Porównując młode i starzejące się neurony, podkreśla, w jaki sposób zwiększona gęstość kanałów wapniowych bramkowanych napięciem typu L i przedłużona aktywacja w starzejących...

Obrazowanie wapnia in vitro w krótko- i długoterminowych hodowlach hipokampa szczurów

Kultury o niskiej gęstości pierwotnych neuronów hipokampa zazwyczaj wymagają warstwy zasilającej glej, aby dostarczyć czynników neurotroficznych i utrzymać długowieczność. Opisujemy tutaj uproszczoną metodę hodowli neuronów o ultra niskiej gęstości na szklanych szkiełkach nakrywkowych w obecności warstwy zasilającej neurony o dużej gęstości, co ułatwia badanie specyficznych mechanizmów neuronalno-autonomicznych.

Uproszczona metoda długoterminowej hodowli pierwotnych neuronów hipokampa o bardzo niskiej gęstości

Tutaj przedstawiono procedurę selektywnej aktywacji białka neuronalnego za pomocą krótkiego impulsu światła poprzez genetyczne kodowanie fotoreaktywnego nienaturalnego aminokwasu do docelowego białka neuronalnego wyrażanego w neuronach w hodowli lub in vivo.

Optyczna kontrola białka neuronalnego za pomocą genetycznie kodowanego nienaturalnego aminokwasu w neuronach

Ten artykuł opisuje protokół hodowli pierwotnych neuronów hipokampa o niskiej gęstości rosnących na szklanych szkiełkach nakrywkowych odwróconych na monowarstwie glejowej. Warstwy neuronów i glejowe są oddzielone kulkami wosku parafinowego. Neurony wyhodowane tą metodą nadają się do obrazowania optycznego o wysokiej rozdzielczości i testów funkcjonalnych.

Pierwotna hodowla neuronów hipokampa o niskiej gęstości

Endocytoza pęcherzyków synaptycznych jest wykrywana za pomocą mikroskopii świetlnej pHluoryny połączonej z białkiem pęcherzyków synaptycznych oraz za pomocą mikroskopii elektronowej wychwytu pęcherzyków.

Pomiar endocytozy pęcherzyków synaptycznych w hodowanych neuronach hipokampa

Tutaj opisaliśmy protokół ilościowego badania montażu i struktury początkowych segmentów aksonów (AIS) neuronów hipokampa, które nie mają wstępnie zmontowanego AIS z powodu braku gigantycznej ankyryny-G.

Wykorzystanie pierwotnych hodowanych neuronów hipokampa do badania składania początkowych segmentów aksonów

Tutaj pokazujemy, jak połączyć transfekcję pierwotnych neuronów gryzoni hipokampa z obrazowaniem konfokalnym żywych komórek, aby przeanalizować patologiczne efekty wywołane przez białka na transport aksonalny i zidentyfikować szlaki mechanistyczne pośredniczące w tych efektach.

Wykorzystanie obrazowania żywych komórek do pomiaru wpływu patologicznych białek na transport aksonalny w pierwotnych neuronach hipokampa

Poznaj metodę transfekcji fosforanem wapnia pierwotnych neuronów hipokampa szczura. Protokół ten jest prosty, ekonomiczny i skuteczny, osiągając wydajność do 50% w badaniach neurobiologicznych.

Transfekcja fosforanu wapnia pierwotnych neuronów hipokampa

Przeglądaj więcej filmów