Name: Wykorzystanie chemii kliknięć do pomiaru wpływu infekcji wirusowej na syntezę RNA komórki gospodarza (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Poznaj metodę chemii kliknięć do pomiaru zmian w transkrypcji komórek gospodarza po zakażeniu wirusem RVFV MP-12. Technika umożliwia wizualizację nowo syntetyzowanego RNA za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub cytometrii przepływowej bez użycia izotopów promieniotwórczych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy R.B. Teshowi za dostarczenie mysiej poliklonalnej surowicy anty-RVFV oraz M. Griffinowi z UTMB Flow Cytometry Core Facility za pomoc w cytometrii przepływowej. Praca ta była wspierana przez 5 AI057156 U54 za pośrednictwem Western Regional Center of Excellence, grant NIH R01 AI08764301, a finansowanie z Sealy Center for Vaccine Development w UTMB.B.K. było wspierane przez James W. McLaughlin Fellowship Fund w UTMB.O.L. było wspierane przez Maurice R. Hilleman Early-Stage Career Investigator Award.

Analiza transkrypcji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej
1. Infekuj komórki MP-12 i oznaczaj powstające RNA za pomocą EU
<ol>
	<li>Umieścić okrągłe szkiełka nakrywkowe o średnicy 12 mm na 12-dołkowej płytce do hodowli tkankowej, po jednym szkiełku nakrywkowym na dołek.</li>
</ol>
Uwaga: Jeśli komórki mają problemy z przyleganiem do szkiełek nakrywkowych, pokryj je poli-L-lizyną (MW ≥ 70 000) przed umieszczeniem w studzienkach. W tym celu zanurzyć szkiełka nakrywkowe w sterylnym roztworze o stężeniu 0,1 mg/ml wH2Opoli-L-lizyny na 5 minut. Szkiełka nakrywkowe płukać sterylnymH2Oi suszyć na powietrzu przez co najmniej 2 godziny.
<ol start="2">
	<li>Aby wysiać 293 komórki na szkiełka nakrywkowe, dodaj 5 x 104 komórki w 1 ml pożywki wzrostowej (DMEM zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej, 100 U/ml penicyliny i 100 mg/ml streptomycyny) na studzienkę. Inkubować w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 O/N.</li>
	<li>Zainfekuj komórki MP-12 przy wielokrotności infekcji (m.o.i.) wynoszącej 3. Uwzględnij co najmniej dwie niezakażone studzienki: jedna z dwóch studzienek będzie służyć jako niezakażona kontrola, druga będzie traktowana aktynomycyną D (ActD) na etapie 1.5 jako kontrola supresji transkrypcji. Usunąć pożywkę wzrostową i rozcieńczyć zapas wirusa tak, aby całkowita objętość dodana do każdej studzienki wynosiła 200 ml. Inkubować przez 1 godzinę w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
</ol>
Uwaga: Zamiast infekować komórki, komórki mogą być również transfekowane plazmidowym DNA lub syntetyzowanym in vitro RNA kodującym specyficzne białko wirusowe. W tym celu należy przetransfekować komórki odpowiednim odczynnikiem do transfekcji chemicznej zgodnie z instrukcjami producenta i przejść do kroku 1.5 po 16 godzinach od transfekcji. Wskazane jest zoptymalizowanie warunków transfekcji i czasu inkubacji przed znakowaniem i utrwalaniem RNA.
<ol start="4">
	<li>Usuń inokulum i dodaj 1 ml świeżej pożywki do dołka. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 godzin.</li>
</ol>
Uwaga: Jeśli dostosowujesz ten protokół do użycia z innym wirusem, zaleca się przeprowadzenie eksperymentu z biegiem czasu, aby określić optymalny punkt czasowy dla znakowania i fiksacji RNA. Ustaw ten przebieg czasowy tak, aby czasy infekcji były rozłożone w czasie, a wszystkie próbki mogły być etykietowane, utrwalane i barwione w tym samym czasie.
<ol start="5">
	<li>Po 15 godzinach od zakażenia (h.p.i.) zastąp pożywkę wzrostową pożywką zawierającą 1 mM EU. Do jednej z pozorowanych zainfekowanych studzienek dodać również 5 μg/ml ActD. Będzie to służyć jako kontrola supresji transkrypcji, ponieważ ActD hamuje syntezę RNA zależną od DNA. Zwróć komórki do inkubatora.</li>
	<li>W temperaturze 16 h.p.i. usunąć pożywkę i przemyć szkiełka nakrywkowe raz 1 ml PBS (KCl 0,20 g/L, KH2PO4 0,20 g/L, NaCl 8,00 g/L, Na2HPO4 1,15 g/L, pH 7,4) na studzienkę. Utrwalić komórki, dodając 1 ml 4% paraformaldehydu (PFA) na studzienkę i inkubując przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
Uwaga: Aby przygotować 4% roztwór utrwalający PFA, rozpuść 10 g paraformaldehydu w 150 ml H2O podgrzanym do 60 °C mieszadle magnetycznym. Dodać 500 μl 1M NaOH i kontynuować mieszanie, aż roztwór stanie się klarowny. Przefiltrować roztwór PFA przez filtr papierowy w celu usunięcia cząstek stałych i dodać 62,5 ml buforu fosforanowego (77 mM NaH2PO4, 287 mM Na2HPO4, pH 7,4). DodaćH2Odo całkowitej objętości 250 ml. Zamrażać w temperaturze -20 °C w podwielokrotnościach jednorazowego użytku.
<ol start="7">
	<li>Przemyć raz 1 ml PBS na studzienkę. Nie jest wymagany czas inkubacji dla tego i wszystkich kolejnych etapów mycia. Przejdź od razu do kroku 2.</li>
</ol>
Uwaga: Ważne jest, aby natychmiast przystąpić do reakcji kliknięcia, ponieważ RNA ulega degeneracji, jeśli jest przechowywane na tym etapie przez dłuższy czas; utratę sygnału fluorescencji RNA można już zaobserwować, jeśli komórki są przechowywane przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. Podobnie, jeśli wykonujesz eksperyment z biegiem czasu, pamiętaj, aby oznaczyć, naprawić i wybarwić wszystkie próbki w tym samym czasie.
2. Kliknij Reakcja, aby wykryć oznaczone RNA
<ol>
	<li>Przepuszczalność komórek poprzez dodanie 1 ml 0,2% Triton X-100 do PBS. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
Uwaga: Wszystkie roztwory użyte w krokach od 2.1 do 2.3 muszą być wolne od nukleaz.
<ol start="2">
	<li>Przemyć trzy razy 1 ml PBS na studzienkę.</li>
	<li>Usunąć szkiełka nakrywkowe z płytki 12-dołkowej i przenieść do wilgotnej komory. Przykryj każde szkiełko nakrywkowe 50 - 100 μl roztworu barwiącego (100 mM Tris pH 8,5, 1 mM CuSO4, 20 μM azydek fluorescencyjny [maksimum wzbudzenia/emisji: 590/617 nm], 100 mM kwasu askorbinowego) każdy. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
</ol>
Uwaga: Aby zmontować wilgotną komorę, wyłóż dno hodowli komórkowej lub szalki Petriego o średnicy 10 cm plastikową folią parafinową. Wyłóż wnętrze krawędzi naczynia wilgotnymi ręcznikami papierowymi. Umieść szkiełka nakrywkowe na plastikowej folii parafinowej.
Uwaga: Uważaj, aby nie dopuścić do wyschnięcia szkiełek nakrywkowych podczas tego lub innego kroku w protokole. Najlepiej jest dodawać roztwór barwiący do każdego szkiełka nakrywkowego bezpośrednio po umieszczeniu go w wilgotnej komorze.
Uwaga: Przygotuj świeżo roztwór do barwienia kliknięć bezpośrednio przed tym krokiem. Roztwory podstawowe 1,5 M Tris pH 8,5, 100 mMCuSO4 i 500 mM kwasu askorbinowego można przechowywać w temperaturze 4 °C. Należy jednak wyrzucić wszelki roztwór podstawowy kwasu askorbinowego, który zmienił kolor na żółty.
Uwaga: Upewnij się, że wybrałeś fluorofor, który pasuje do filtrów w Twoim mikroskopie fluorescencyjnym.
<ol start="4">
	<li>Usunąć szkiełka nakrywkowe z wilgotnej komory i umieścić w świeżej 12-dołkowej płytce i przemyć trzykrotnie 1 ml PBS na studzienkę.</li>
</ol>
Uwaga: Jeśli nie jest pożądane wykrycie białek wirusowych, po tym kroku można zamontować i zobrazować szkiełka nakrywkowe (przejdź do kroku 3.3).
3. Immunofluorescencja do wykrywania ekspresji białek wirusowych
<ol>
	<li>Dodać 1 ml buforu blokującego (3% (w/v) albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w PBS) do każdego dołka i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
	<li>Usunąć szkiełka nakrywkowe z płytki 12-dołkowej, przenieść do wilgotnej komory i przykryć 50 - 100 μl przeciwciała pierwszorzędowego (anty-RVFV, miły prezent od dr R.B. Tesh, UTMB) rozcieńczonego w buforze blokującym (1:500). Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
</ol>
Uwaga: Dostosowując ten protokół do użycia z innym wirusem, najpierw określ optymalne rozcieńczenie dla swojego głównego przeciwciała.
Uwaga: Alternatywnie, ten krok można wykonać O/N przy 4 °C w ciemności.
<ol start="3">
	<li>Wyjmij szkiełka nakrywkowe z wilgotnej komory i umieść je z powrotem na płytce 12-dołkowej i przemyj trzy razy 1 ml PBS na studzienkę.</li>
	<li>Wyjąć szkiełka nakrywkowe z 12-dołkowego miejsca, umieścić w wilgotnej komorze i przykryć 50 - 100 μl przeciwciała drugorzędowego (anty-mysie IgG sprzężonego z barwnikiem fluorescencyjnym [maksimum wzbudzenia/emisji: 495/519 nm]) rozcieńczonego w buforze blokującym (1:500). Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
</ol>
Uwaga: Upewnij się, że wybrałeś przeciwciało drugorzędowe, które rozpozna twoje przeciwciało pierwszorzędowe i pasuje do filtrów w twoim mikroskopie fluorescencyjnym.
Uwaga: Jeśli jest to pożądane, 200 ng/ml DAPI można dodać do rozcieńczenia przeciwciał wtórnych, aby uwidocznić jądra.
<ol start="5">
	<li>Wyjmij szkiełka nakrywkowe z wilgotnej komory i umieść je z powrotem na płytce 12-dołkowej i przemyj trzy razy 1 ml PBS na studzienkę.</li>
	<li>Zamontuj szkiełka nakrywkowe, umieszczając jedną kroplę (ok. 15 μl) Fluoromount-G na szkiełku mikroskopowym. Zanurz szkiełko nakrywkowe wH2O, usuń nadmiarH2O, dotykając stroną ręcznika papierowego, a następnie umieść stronę komórkową do dołu w kropli Fluoromount-G. Suszyć na powietrzu przez 5 min.</li>
</ol>
Uwaga: Jeśli obrazujesz na mikroskopie odwróconym, pozwól Fluoromount-G zastygnąć w temperaturze 4 °C O/N lub przymocuj szkiełka nakrywkowe do szkiełka mikroskopowego, uszczelniając krawędź przezroczystym lakierem do paznokci.
Uwaga: Slajdy mogą być natychmiast zobrazowane lub przechowywane w temperaturze 4 °C w ciemności przez okres do tygodnia.
4. Pozyskiwanie danych
<ol>
	<li>Obraz za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.</li>
</ol>
Uwaga: Upewnij się, że wybrałeś odpowiednie fluorofory, które można zobrazować za pomocą mikroskopu. Dla porównania, poniżej przedstawiono fluorofory i zestawy filtrów używane do pozyskiwania obrazów przedstawionych w tej publikacji.
DAPI : 
Filtr wzbudzenia: BP 330 - 385 
Lustro dwuchromatyczne: DM 400 
Filtr spalinowy: LP 420
Fluorofor o maksymalnej wartości wzbudzenia/emisji 495/519: 
Filtr wzbudzenia: BP 460 - 490 
Lustro dwuchromatyczne: DM 505 
Filtr emisyjny: LP 510
Fluorofor o maksymalnej wartości wzbudzenia/emisji 590/617: 
Filtr wzbudzenia: BP 545 - 580 
Lustro dichromatyczne: DM 600 
Filtr spalinowy: LP 610
Analiza transkrypcji za pomocą cytometrii przepływowej
5. Zainfekuj komórki MP-12 i oznacz powstające RNA za pomocą EU
<ol>
	<li>Wysiewaj 293 komórki na 6-dołkową płytkę do hodowli tkankowej w pożywce wzrostowej (DMEM zawierający 10% płodowej surowicy bydlęcej, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny). Inkubować w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 , aż komórki osiągną zlewność 80 - 100%.</li>
	<li>Zainfekuj komórki MP-12 przy m.o.i. wynoszącym 3. Uwzględnij co najmniej dwie niezainfekowane studzienki: jedna z dwóch studzienek będzie służyć jako niezainfekowana kontrola, druga zostanie potraktowana ActD w kroku 5.4. Usunąć pożywkę wzrostową i rozcieńczyć zapas wirusa tak, aby całkowita objętość dodana do każdej studzienki wynosiła 400 μl. Inkubować przez 1 godzinę w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Usuń inokulum i dodaj 2 ml świeżej pożywki do dołka. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 12 godzin.</li>
</ol>
Uwaga: Jeśli dostosowujesz ten protokół do użycia z innym wirusem, zaleca się przeprowadzenie eksperymentu z biegiem czasu, aby określić optymalny punkt czasowy do etykietowania i zbierania. Ustaw ten przebieg czasowy tak, aby czasy infekcji były rozłożone w czasie, a wszystkie próbki mogły być etykietowane, zbierane i barwione w tym samym czasie.
<ol start="4">
	<li>Przy 12 h.p.i. zastąp pożywkę wzrostową pożywką zawierającą 0,5 mM EU. Do jednej z pozorowanych zainfekowanych studzienek dodać również 5 μg/ml ActD. Będzie to służyć jako kontrola supresji transkrypcji, ponieważ ActD hamuje syntezę RNA zależną od DNA. Zwróć komórki do inkubatora.</li>
	<li>Przy 13 h.p.i. umyj komórki raz PBS i zbierz przez trypsynizację komórek. Zebrane komórki przemyć trzykrotnie PBS zawierającym 1 mM EDTA (PBS-EDTA).</li>
</ol>
Uwaga: Podczas tego i następnych kroków, nie wiruj komórek szybciej niż 500 - 1,000 x g, aby zapobiec ich rozpadowi. Odwirować komórki przez 1 - 2 minuty do osadu.
Uwaga: Jeśli planowane jest immunologiczne barwienie powierzchni po reakcji kliknięcia, zbierz za pomocą gumowego policjanta lub jednorazowego skrobaczki do komórek.
<ol start="6">
	<li>Utrwalić komórki poprzez ponowne zawieszenie ich w 1 ml 4% PFA i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Patrz krok 1.6, aby uzyskać instrukcje dotyczące przygotowania 4% PFA.</li>
	<li>Przemyć raz 1 ml PBS-EDTA na studzienkę. Przejdź od razu do kroku 6.</li>
</ol>
Uwaga: Ważne jest, aby natychmiast przystąpić do reakcji kliknięcia, ponieważ RNA ulega degeneracji, jeśli jest przechowywane na tym etapie przez dłuższy czas. Podobnie, jeśli wykonujesz eksperyment w czasie, pamiętaj, aby oznaczyć, naprawić i zabarwić wszystkie próbki w tym samym czasie.
6. Kliknij Reakcję, aby wykryć oznakowane RNA
<ol>
	<li>Przepuszczalność komórek poprzez ponowne zawieszenie w 0,5 ml 0,2% Triton X-100 w PBS. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
Uwaga: Wszystkie roztwory użyte w krokach od 6.1 do 6.3 muszą być wolne od nukleaz.
Uwaga: Jeśli komórki nie osadzają się prawidłowo podczas tego kroku, zwiększ czas wirowania do 5 minut. Zachowanie sedymentacji poprawi się, gdy komórki zostaną zawieszone w buforze FACS (krok 6.4).
<ol start="2">
	<li>Przemyć raz 1 ml PBS.</li>
</ol>
Uwaga: Nie używaj EDTA w tym kroku, ponieważ spowoduje to chelatowanie jonów Cu2+ niezbędnych do reakcji kliknięcia.
<ol start="3">
	<li>Zawieś komórki w 200 μl roztworu barwiącego (100 mM Tris pH 8,5, 1 mM CuSO4, 200nM azydek znakowany barwnikiem fluorescencyjnym [maksimum wzbudzenia/emisji: 650/665 nm], 100 mM kwasu askorbinowego). Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
</ol>
Uwaga: Przygotuj świeżo roztwór do barwienia kliknięć bezpośrednio przed tym krokiem. Roztwory podstawowe 1,5 M Tris pH 8,5, 100 mMCuSO4 i 500 mM kwasu askorbinowego można przechowywać w temperaturze 4 °C. Należy jednak wyrzucić wszelki roztwór podstawowy kwasu askorbinowego, który zmienił kolor na żółty.
Uwaga: Jeśli komórki zlepią się ze sobą podczas tego kroku, ponownie zawieś przez kilka razy pipetowanie w górę i w dół.
Uwaga: Upewnij się, że wybrałeś fluorofor, który może być wykryty przez twój cytometr przepływowy.
Uwaga: Przygotuj również jedną próbkę zainfekowanych komórek, które nie są poddawane procedurze barwienia za pomocą kliknięcia; będą one potrzebne do kalibracji cytometru przepływowego. Użyj połowy zainfekowanych komórek lub dołącz dodatkową zainfekowaną studzienkę w kroku 5.2. Te komórki kontrolne zostaną wybarwione immunologicznie w kroku 7.1.
<ol start="4">
	<li>Przemyć dwukrotnie buforem FACS (PBS zawierający 1 mM EDTA i 0,5% (w/v) BSA).</li>
</ol>
Uwaga: Jeśli nie jest pożądane barwienie immunologiczne białek wirusa, komórki mogą być natychmiast analizowane (przejdź do kroku 8).
7. Immunofluorescencja do wykrywania ekspresji białek wirusowych
<ol>
	<li>Zawiesić komórki w 200 μl przeciwciała pierwszorzędowego (anty-RVFV) rozcieńczonego w buforze FACS (1:10 000) i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
</ol>
Uwaga: Alternatywnie, ten krok można wykonać O/N przy 4 °C w ciemności.
Uwaga: Przygotuj również jedną próbkę niezainfekowanych komórek, które zostały poddane procedurze barwienia za pomocą kliknięcia, ale nie będą wybarwione immunologicznie, będą one potrzebne do kalibracji cytometru przepływowego. Użyj połowy pozorowanych zainfekowanych komórek lub dołącz dodatkową niezainfekowaną studzienkę w kroku 5.2.
Uwaga: Dostosowując ten protokół do użycia z innym wirusem, najpierw określ optymalne rozcieńczenie dla swojego głównego przeciwciała.
<ol start="2">
	<li>Umyj komórki dwukrotnie w buforze FACS.</li>
	<li>Zawiesić komórki w 200 μl przeciwciała drugorzędowego (anty-mysie IgG sprzężone z barwnikiem fluorescencyjnym [maksimum wzbudzenia/emisji: 495/519 nm]) rozcieńczonego w buforze FACS (1:1,000) i inkubować przez 1 godzinę w RT w ciemności.</li>
	<li>Umyj komórki raz w buforze FACS.</li>
</ol>
Uwaga: W tym momencie komórki mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C w ciemności.
8. Pozyskiwanie danych
<ol>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w buforze FACS o pojemności 500 μl, przenieść do probówek polistyrenowych o pojemności 5 ml i przeanalizować za pomocą cytometru przepływowego. Użyj komórek zainfekowanych MP-12 (brak reakcji kliknięcia, tylko barwienie anty-RVFV) i pozorowanych zainfekowanych komórek (tylko reakcja kliknięcia), aby skalibrować instrument.</li>
</ol>
Uwaga: Upewnij się, że wybrałeś odpowiednie fluorofory, które mogą być wykryte przez twój instrument. Dla porównania, poniżej przedstawiono linie laserowe i zestawy filtrów używane do pozyskiwania danych przedstawionych w tej publikacji.
Fluorofor o widmie wzbudzenia/emisji 495/519: 
Laser: 488 nm 
Filtr: 530/30
Fluorofor o widmie wzbudzenia/emisji 650/665: 
Laser: 640 nm 
Filtr: 670/20

<ol><li>Fakan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+support+for+RNA+synthesis+in+the+cell+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Achiev.+Exp.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Structural support for RNA synthesis in the cell nucleus.</a> Methods Achiev. Exp. Pathol. 12, 105-140 (1986).</li>
<li>Jensen, P. O., Larsen, J., Christiansen, J., Larsen, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+measurement+of+RNA+synthesis+using+bromouridine+labelling+and+bromodeoxyuridine+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric measurement of RNA synthesis using bromouridine labelling and bromodeoxyuridine antibodies.</a> Cytometry. 14, 455-458 (1993).</li>
<li>Jao, C. Y., Salic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+RNA+transcription+and+turnover+in+vivo+by+using+click+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 15779-15784 (2008).</li>
<li>Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stepwise+huisgen+cycloaddition+process%3A+copper%28I%29-catalyzed+regioselective+%22ligation%22+of+azides+and+terminal+alkynes%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes.</a> Angew Chem. Int. Ed. Engl. 41, 2596-2599 (2002).</li>
<li>Tornoe, C. W., Christensen, C., Meldal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidotriazoles+on+solid+phase%3A+%5B1%2C2%2C3%5D-triazoles+by+regiospecific+copper%28i%29-catalyzed+1%2C3-dipolar+cycloadditions+of+terminal+alkynes+to+azides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Org.+Chem%22%5BJournal%5D)">Peptidotriazoles on solid phase: [1,2,3]-triazoles by regiospecific copper(i)-catalyzed 1,3-dipolar cycloadditions of terminal alkynes to azides.</a> J. Org. Chem. 67, 3057-3064 (2002).</li>
<li>Kalveram, B., Lihoradova, O., Ikegami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NSs+protein+of+rift+valley+fever+virus+promotes+posttranslational+downregulation+of+the+TFIIH+subunit+p62%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">NSs protein of rift valley fever virus promotes posttranslational downregulation of the TFIIH subunit p62.</a> J. Virol. 85, 6234-6243 (2011).</li>
<li>Kalveram, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus+NSs+inhibits+host+transcription+independently+of+the+degradation+of+dsRNA-dependent+protein+kinase+PKR%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus NSs inhibits host transcription independently of the degradation of dsRNA-dependent protein kinase PKR.</a> Virology. , (2012).</li>
<li>Head, J. A., Kalveram, B., Ikegami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+Rift+Valley+fever+virus+NSs+encoding+a+partial+truncation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of Rift Valley fever virus NSs encoding a partial truncation.</a> PLoS One. 7, e45730(2012).</li>
<li>Lihoradova, O. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Rift+Valley+Fever+Virus+MP-12+Strain+Encoding+NSs+of+Punta+Toro+Virus+or+Sandfly+Fever+Sicilian+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Characterization of Rift Valley Fever Virus MP-12 Strain Encoding NSs of Punta Toro Virus or Sandfly Fever Sicilian Virus.</a> PLoS Negl Trop Dis. 7, e2181(2013).</li>
<li>Kalveram, B., Ikegami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toscana+Virus+NSs+Protein+Promotes+Degradation+of+Double-Stranded+RNA-Dependent+Protein+Kinase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Toscana Virus NSs Protein Promotes Degradation of Double-Stranded RNA-Dependent Protein Kinase.</a> J. Virol. , (2013).</li>
<li>Schmaljohn, C., Nichol, S. In Fields Virology. Knipe, D. M., et al. , Lippincott Williams and Wilkins. 1741-1789 (2007).</li>
<li>Le May, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TFIIH+transcription+factor%2C+a+target+for+the+Rift+Valley+hemorrhagic+fever+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TFIIH transcription factor, a target for the Rift Valley hemorrhagic fever virus.</a> Cell. 116, 541-550 (2004).</li>
<li>Caplen, H., Peters, C. J., Bishop, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagen-directed+attenuation+of+Rift+Valley+fever+virus+as+a+method+for+vaccine+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Mutagen-directed attenuation of Rift Valley fever virus as a method for vaccine development.</a> J. Gen. Virol. 66, 2271-2277 (1985).</li>
<li>Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+infectious+Rift+Valley+fever+virus+entirely+from+cDNA%2C+analysis+of+virus+lacking+the+NSs+gene%2C+and+expression+of+a+foreign+gene%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Rescue of infectious Rift Valley fever virus entirely from cDNA, analysis of virus lacking the NSs gene, and expression of a foreign gene.</a> J. Virol. 80, 2933-2940 (2006).</li>
<li>Vyboh, K., Ajamian, L., Mouland, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+viral+RNA+by+fluorescence+in+situ+hybridization+%28FISH%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Detection of viral RNA by fluorescence in situ hybridization (FISH).</a> J. Vis. Exp. , e4002(2012).</li>
<li>Reich, E., Goldberg, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actinomycin+and+nucleic+acid+function%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Nucleic+Acid+Res.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Actinomycin and nucleic acid function.</a> Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 3, 183-234 (1964).</li>
<li>Holmes, K. L., Lantz, L. M., Russ, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjugation+of+fluorochromes+to+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Cytom%22%5BJournal%5D)">Conjugation of fluorochromes to monoclonal antibodies.</a> Curr. Protoc. Cytom. Chapter 4 (Unit 4 2), (2001).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Dostarczony protokół opisuje metodę pomiaru wpływu infekcji wirusowej na transkrypcję komórek gospodarza poprzez włączenie analogu urydyny UE do powstającego RNA. Ta metoda ma kilka zalet w porównaniu z poprzednimi metodami: jest szybka, czuła i nie opiera się na użyciu izotopów promieniotwórczych. Ponadto metodę można dostosować do uzyskiwania danych jakościowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub danych ilościowych za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu zasadniczo tych samych odczynników. W połączeniu z ...

Tradycyjnie, aktywność transkrypcyjna była mierzona poprzez włączenie radioaktywnych (3H-urydyna)1 lub halogenowanych (BrU)2 nukleozydów do powstającego RNA. Te analogi urydyny są wychwytywane przez komórki, przekształcane w trifosforan urydyny (UTP) przez szlak ratunkowy nukleozydów, a następnie włączane do nowo zsyntetyzowanego RNA. 3H-urydynę można wykryć za pomocą autoradiografii, która może być czasochłonna, lub zliczania scyntylacyjnego, które wymaga specjalistycznego sprzętu. Ponadto stosowanie izotopów promieniotwórczych może być niepraktyczne w wielu warunkach laboratoryjnych, w tym w laboratoriach o wysokim stopniu hermetyczności. BrU można wykryć poprzez barwienie immunologiczne przeciwciałami anty-BrU, które mogą wymagać ostrej przepuszczalności w celu zapewnienia dostępu przeciwciała do jądra lub częściowej denaturacji RNA, ponieważ drugorzędowa struktura RNA może być steryczną przeszkodą w wiązaniu przeciwciał.
Opisany tutaj protokół wykorzystuje niedawno opracowaną chemię kliknięć3 do pomiaru aktywności transkrypcyjnej w komórkach zakażonych szczepem MP-12 RVFV. Chemia kliknięć opiera się na wysoce selektywnej i wydajnej reakcji cykloaddycji katalizowanej miedzią(I) między alkinem a ugrupowaniem azydkowym4,5. W tym protokole powstające RNA w zakażonych komórkach jest najpierw znakowane poprzez włączenie analogu urydyny EU. W drugim etapie włączone EU jest wykrywane w reakcji z fluorescencyjnym azydkiem. Główne zalety tej metody to (1) brak konieczności stosowania izotopów promieniotwórczych oraz (2) brak konieczności ostrej przepuszczalności lub denaturacji RNA. Przy masie cząsteczkowej mniejszej niż 50 Da dostęp azydku fluorescencyjnego nie jest utrudniony przez niewystarczającą przepuszczalność lub drugorzędową strukturę RNA. Co więcej, naukowcy nie są ograniczeni w wyborze przeciwciał pierwotnych, łącząc wykrywanie RNA z klasycznym barwieniem immunologicznym białek wirusowych.
W tym protokole opisane są dwie różne metody: jedna do wizualizacji transkrypcji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (kroki 1-4), a druga do ilościowego określania transkrypcji za pomocą cytometrii przepływowej (kroki 5-8). Obie te metody łączą znakowanie powstającego RNA z wewnątrzkomórkowym barwieniem immunologicznym białek wirusowych, co pozwala na korelację między aktywnością transkrypcyjną a infekcją wirusową na podstawie komórki po komórce.
Autorzy z powodzeniem wykorzystali opisany tutaj protokół do określenia aktywności transkrypcyjnej w komórkach zakażonych szczepem RVFV MP-126, komórkach zakażonych różnymi mutantami MP-127,8, 9 i komórkach zakażonych wirusem Toscana (TOSV)10. Opisany tutaj protokół może być łatwo dostosowany do stosowania z różnymi wirusami i może zostać zmodyfikowany w celu uwzględnienia barwienia immunofluorescencyjnego określonych białek wirusowych lub komórkowych.

<table><tbody><tr><td>5-etynylo-urydyna</td><td>Berry Associates</td><td>PY 7563</td><td>rozpuszcza się w DMSO dla 100 mM zapasów</td></tr><tr><td>12-milimetrowe okrągłe szkiełka nakrywkowe</td><td>Fisherbrand</td><td>12-545-82</td><td></td></tr><tr><td>Probówki polistyrenowe 5 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>Actinomycin D (ActD)</td><td>Sigma</td><td>9415</td><td>rozpuszcza się w DMSO dla 10 mM zapas</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 kozia anty-mysia IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A-11029</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA) </td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2323</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4</td><td>Sigma</td><td>C-8027</td><td>rozpuszczać w H2O dla 100 mM zapasu</td></tr><tr><td>DAPI </td><td>Sigma</td><td>D-9542</td><td>rozpuszczać w H2O dla 5 mg/ml zapasu</td></tr><tr><td>DMEM </td><td>Invitrogen</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>azydek fluorescencyjny (Alexa Fluor 594-sprzężony)</td><td>Invitrogen</td><td>A10270</td><td></td></tr><tr><td>azydek fluorescencyjny (Alexa Fluor 657-sprzężony)</td><td>Invitrogen</td><td>A10277</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Kwas L-askorbinowy</td><td>Sigma</td><td>A-5960</td><td>rozpuszcza się w H2O przez 500 mM </td></tr><tr><td>filtr papierowy</td><td>VWRbrand</td><td>28333-087</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehyd </td><td>Sigma</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>poli-L-lizyna (MW &#8805; 70000)</td><td>Sigma</td><td>P1274</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T-8787</td><td></td></tr><tr><td>Baza Trizma</td><td>Sigma</td><td>T-1503</td><td>rozpuścić w H2O dla 1,5 M bulionu</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>, pH 8,5 Trypsyna-EDTA Invitrogen 25200056 <td></td></tr><tr><td>mikroskop fluorescencyjny</td><td>np. </td>Cytometr przepływowy Olympus IX71e.g. BD Biosciences LSRII Fortessa <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wykorzystanie chemii kliknięć do pomiaru wpływu infekcji wirusowej na syntezę rna komórki gospodarza

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Wiele wirusów RNA rozwinęło zdolność do hamowania transkrypcji komórek gospodarza jako sposób na obejście zabezpieczeń komórkowych. W celu zbadania tych wirusów ważne jest zatem, aby dysponować szybkim i wiarygodnym sposobem pomiaru aktywności transkrypcyjnej w zakażonych komórkach. Tradycyjnie, transkrypcję mierzono albo przez włączenie radioaktywnych nukleozydów, takich jak 3H-urydyna, a następnie wykrycie za pomocą autoradiografii lub zliczania scyntylacyjnego, albo włączenie fluorowcowanych analogów urydyny, takich jak 5-bromourydyna (BrU), a następnie wykrycie za pomocą barwienia immunologicznego. Stosowanie izotopów promieniotwórczych wymaga jednak specjalistycznego sprzętu i nie jest możliwe w wielu warunkach laboratoryjnych, a wykrywanie BrU może być kłopotliwe i może mieć niską czułość.
Niedawno opracowana chemia kliknięć, która obejmuje katalizowaną miedzią formację triazolu z azydku i alkinu, teraz stanowi szybką i bardzo czułą alternatywę dla tych dwóch metod. Chemia typu click to dwuetapowy proces, w którym powstające RNA jest najpierw znakowane przez włączenie analogu urydyny 5-etynylurydyny (EU), a następnie wykrywanie znacznika za pomocą fluorescencyjnego azydku. Azydki te są dostępne jako kilka różnych fluoroforów, co pozwala na szeroki zakres opcji wizualizacji.
Ten protokół opisuje metodę pomiaru supresji transkrypcji w komórkach zakażonych wirusem gorączki doliny Rift (RVFV) szczepem MP-12 za pomocą chemii kliknięć. Jednocześnie ekspresja białek wirusowych w tych komórkach jest determinowana przez klasyczne wewnątrzkomórkowe barwienie immunologiczne. Kroki od 1 do 4 szczegółowo opisują metodę wizualizacji supresji transkrypcji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, podczas gdy kroki od 5 do 8 szczegółowo opisują metodę ilościowego określania supresji transkrypcji za pomocą cytometrii przepływowej. Ten protokół można łatwo dostosować do użytku z innymi wirusami.

Białko NSs wirusa RVFV (rodzina Bunyaviridae, rodzaj Phlebovirus) 11 hamuje ogólną transkrypcję komórek gospodarza poprzez dwa odrębne mechanizmy: (i) poprzez sekwestrację podjednostki p44 podstawowego czynnika transkrypcyjnego TFIIH11 oraz (ii) poprzez promowanie degradacji proteasomalnej podjednostki p62 TFIIH 6. Do eksperymentów opisanych w niniejszym protokole wykorzystano szczep szczepionkowy RVFV MP-12 13, ponieważ szczep MP-12 może być przetwarzany w la...

Ta metoda opisuje użycie chemii kliknięć do pomiaru zmian w transkrypcji komórek gospodarza po zakażeniu wirusem gorączki doliny Rift (RVFV) szczepem MP-12. Wyniki można wizualizować jakościowo za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub uzyskiwać ilościowo za pomocą cytometrii przepływowej. Ta metoda można dostosować do użytku z innymi wirusami.

Wykorzystanie chemii kliknięć do pomiaru wpływu infekcji wirusowej na syntezę RNA komórki gospodarza

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest analiza aktywności transkrypcyjnej w komórkach zainfekowanych wirusem. W pierwszej kolejności zainfekuj komórki 293 wirusem gorączki doliny Rift, szczep MP-12. Następnie znakuj komórki analogiem urydyny, 5-etynylurydyną, która ulega wbudowaniu do nowo powstającego RNA. W kolejnym kroku połącz wbudowaną 5-etynylurydynę z fluorescencyjnym azotkiem, aby zwizualizować nowo syntetyzowane RNA. Na podstawie uzyskanych wyników oceń różnice w ilości nowo syntetyzowanego RNA pomiędzy komórkami zainfekowanymi a niezakazięnymi, wykorzystując mikroskopię fluorescencyjną lub cytometrię przepływową.W przeciwieństwie do znakowania tritiated-uridine lub 5-bromo uridine, to podejście oparte na chemii klik nie wymaga użycia izotopów promieniotwórczych. Jest ono również szybsze i bardziej czułe niż immunobarwienie przeciwciałami przeciwko 5-bromo uridine. Pomysł na tę metodę wynikał z potrzeby opracowania szybkiego i niezawodnego sposobu pomiaru supresji transkrypcji w komórkach zainfekowanych różnymi szczepami wirusa gorączki doliny Rift, MP-12.W każdym dołku 12-dołkowej płytki do hodowli tkankowej umieść okrągłe szkiełka podstawowe o średnicy 12 mm. Następnie wysiej komórki 293 w 1 mm kompletnego medium DMEM. Inkubuj komórki w inkubatorze z nawilżaniem w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez noc. Zgodnie z planem eksperymentu, rozcieńcz zapas wirusa tak, aby infekcja komórek szczepem MP-12 odbywała się przy wielokrotności infekcji (MOI) wynoszącej 3 w całkowitej objętości 200 µL na dołek. Jeden dołek wyznacz jako kontrolę nieinfekowaną, a inny jako kontrolę supresji transkrypcyjnej. Następnie usuń medium wzrostowe. Dodaj inokulum wirusowe i inkubuj przez jedną godzinę w inkubatorze z nawilżaniem. Odessaj inokulum. Do każdego dołka dodaj 1 mL świeżego medium wzrostowego i inkubuj w temperaturze 37 °C. W 15. godzinie po infekcji zastąp medium wzrostowe medium zawierającym 1 mM analogu urydyny, 5-etynylo-urydyny. Do jednego z dołków z infekcją pozorowaną dodaj również 5 µg/mL aktynomycyny-D, inhibitora zależnej od DNA syntezy RNA. Przenieś komórki z powrotem do inkubatora. W 16. godzinie po infekcji usuń medium i wypłucz szkiełka podstawowe raz, używając 1 mL PBS na dołek. Utrwal komórki, dodając 1 mL 4% paraformaldehydu na dołek. Przepłucz raz 1 mL PBS na dołek.Aby przygotować komorę wilgotną, wyłóż dno naczynia do hodowli komórkowej lub szalki Petriego o średnicy 10 centymetrów folią parafinową. Wewnętrzną krawędź naczynia wyłóż wilgotnymi ręcznikami papierowymi. Następnie, aby przeprowadzić permeabilizację komórek, dodaj jeden mililitr 0,2% Triton X-100 w PBS. Inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po trzech przemyciach w PBS przenieś szkiełka podstawowe do komory wilgotnej. Aby przeprowadzić reakcję click w celu wykrycia znakowanego RNA, pokryj każde szkiełko od 50 do 100 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu do barwienia click. Inkubuj przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności.Do dołków nowej płytki 12-dołkowej dodaj jeden mililitr PBS, a następnie przenieś szkiełka nakrywkowe do dołków. Przemyj je jeszcze dwukrotnie, używając jednego mililitra PBS na dołek. Aby zamontować komórki do mikroskopii fluorescencyjnej, nanieś jedną kroplę medium Fluoromount-G na szkiełko przedmiotowe. Zanurz szkiełko nakrywkowe w wodzie i usuń nadmiar wody. Połóż szkiełko nakrywkowe stroną z komórkami do dołu na kropli Fluoromount-G i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez pięć minut.Zgodnie z planem doświadczenia, zainfekuj komórki 293 szczepem MP 12 przy MOI równym trzy. Usuń pożywkę wzrostową, dodaj rozcieńczony stok wirusa i inkubuj przez jedną godzinę w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Zastąp inokulum dwiema mililitrami świeżej pożywki wzrostowej na każdą studzienkę i inkubuj w temperaturze 37 °C przez czas optymalny dla znakowania i zbioru wirusa. Następnie, w jednej z kontrolnych studzienek (mock), zastąp pożywkę wzrostową pożywką zawierającą 0,5 mM 5-etynylourydyny. Dodaj również 5 µg/mL aktynomycyny-D. Przenieś komórki z powrotem do inkubatora na jedną godzinę. Po jednym przemyciu PBS, zbierz komórki poprzez trypsynizację. Przemyj zebrane komórki trzykrotnie w PBS zawierającym 1 mM EDTA. Aby utrwalić komórki, resuspenduj osad w 1 ml 4% PFA i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Przemyj raz 1 ml PBS-EDTA na probówkę. Następnie permeabilizuj komórki w 0,5 ml 0,2% Triton X-100 w PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Przemyj raz 1 ml PBS wolnego od nukleaz. W celu przeprowadzenia reakcji click, resuspenduj osad komórkowy w 200 µl roztworu do barwienia click zawierającego barwnik fluorescencyjny. Jeśli komórki tworzą agregaty, resuspenduj je za pomocą pipetowania. Inkubuj przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności. Przemyj dwukrotnie buforem FACS.W tym eksperymencie komórki 293 zainfekowano szczepem MP-12 oraz wirusem z mutacją delecyjną, który utracił zdolność do supresji transkrypcji komórki gospodarza. W komórkach z grupy kontrolnej (mock) jądra wykazują jasnoczerwoną fluorescencję ze względu na zachodzącą transkrypcję. Ponieważ komórki były znakowane EU przez zaledwie jedną godzinę, a następnie natychmiast utrwalone, większość cząsteczek RNA pozostaje w jądrze. W przeciwieństwie do tego, gdy komórki zostały poddane działaniu aktynomycyny D w celu farmakologicznego zahamowania transkrypcji, fluorescencja czerwona jąder jest wyraźnie zredukowana. Podobna redukcja fluorescencji występuje, gdy komórki są zainfekowane szczepem MP-12, ale nie dzieje się tak w przypadku mutanta delecyjnego, który nie supresuje transkrypcji gospodarza. W tym przypadku zamiast infekcji żywym wirusem zastosowano transfekcję mRNA syntetyzowanego in vitro. Czerwony sygnał fluorescencyjny w jądrach wskazuje, że w porównaniu z komórkami nietransfekowanymi, komórki transfekowane mRNA kodującym zielone białko fluorescencyjne nie zmieniły aktywności transkrypcyjnej. Tylko transfekcja mRNA kodującym czynnik wirulencji NSs wirusa gorączki Rift Valley prowadzi do zmniejszenia czerwonej fluorescencji. Po ilościowym oznaczeniu, dane uzyskane z cytometrii przepływowej można przedstawić w formie wykresów rozrzutu, gdzie na osi Y naniesiono sygnał fluorescencyjny dla wbudowania EU w nowo powstałe RNA, a na osi X sygnał barwienia przeciwciałami przeciwko wirusowi gorączki Rift Valley. Bramki kwadrantów ustawiono tak, aby większość komórek z grupy kontrolnej znajdowała się w górnym lewym kwadrancie. Większość komórek traktowanych aktynomycyną D znajdowała się w dolnym lewym kwadrancie, a większość komórek zainfekowanych w prawej połowie wykresu. W przypadku infekcji szczepem MP-12, 81,5% wszystkich komórek lub 93% komórek dodatnich pod kątem przeciwciał przeciwko wirusowi gorączki Rift Valley wykazało obniżoną aktywność transkrypcyjną. Z kolei przy infekcji szczepem MP-12, klon 13-type, 91,6% wszystkich komórek lub 97% komórek dodatnich pod kątem przeciwciał przeciwko wirusowi gorączki Rift Valley wykazało aktywność transkrypcyjną porównywalną z komórkami z grupy kontrolnej. Dane te można również przedstawić w formie histogramu dla fluorescencyjnego znakowania RNA z wbudowaniem EU.Następnie można przeprowadzić inne metody, takie jak wewnątrzkomórkowe barwienie immunocytochemiczne, aby zwizualizować ekspresję białka wirusowego w tych komórkach. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat wykorzystania chemii klikalnej do wizualizacji aktywności transkrypcyjnej w zainfekowanych wirusem komórkach, zarówno za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, jak i cytometrii przepływowej.Pamiętaj, że praca z wirusami zakaźnymi może być niezwykle niebezpieczna, dlatego należy stosować środki ostrożności, takie jak noszenie odpowiednich środków ochrony indywidualnej (PPE) oraz unikanie wdychania aerozoli.

using-click-chemistry-to-measure-effect-viral-infection-on-host-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Zastosowanie chemii kliknięcia do pomiaru wpływu infekcji wirusowej na syntezę RNA komórki gospodarza

Cząsteczki adenowirusów są modyfikowane tak, aby zawierały albo nienaturalny analog aminokwasu azydohomoalaninę, albo azydocukier O-GlcNAz. Grupa azydowa każdego z nich jest chemoselektywnie łączona za pomocą reakcji chemii „click” w celu modyfikacji powierzchni wirusa.

Chemoselektywna modyfikacja powierzchni wirusów za pomocą bioortogonalnej chemii klik

Source: Scarborough, R. J., et al. Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates a reverse transcriptase (RT) assay to assess the effect of a test RNA on virus-like particle (VLP) production. Cells are co-transfected with plasmids, and RT activity is measured as a quantitative indicator of VLP output. A decrease in RT activity reflects suppression of viral gene expression by the test RNA.

Reverse Transcriptase Activity as a Marker for Virus-Like Particle Production

Source: Manocheewa, S., et al. Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses. J. Vis. Exp. (2015)The video demonstrates the procedure for a growth competition assay to measure the relative replication fitness of two viral strains by comparing their replication in human immune cells.

An Assay for Measuring the Relative Replication Fitness of Viral Strains

Ten film demonstruje test do oceny środków przeciwwirusowych, które są ukierunkowane na określone etapy wnikania wirusa do komórek gospodarza i fuzji z endosomem. Komórki są inkubowane w niskiej temperaturze, a następnie zakażone HCV. Niska temperatura umożliwia wiązanie wirusa z komórkami gospodarza, ale hamuje internalizację poprzez endocytozę. Dodaje się testowy związek przeciwwirusowy, a komórki inkubuje się w temperaturze fizjologicznej. To przejście do wyższej temperatury ułatwia wnikanie...

Test do oceny wpływu badanych związków na wnikanie wirusa i fuzję w komórkach gospodarza

Testy in vitro do pomiaru replikacji wirusa zostały znacznie ulepszone dzięki rozwojowi rekombinowanych wirusów RNA wyrażających lucyferazy lub inne enzymy zdolne do bioluminescencji. W tym miejscu szczegółowo opisujemy wysokoprzepustową linię badań przesiewowych, która łączy takie rekombinowane szczepy wirusów odry i chikungunya w celu wyizolowania leków przeciwwirusowych o szerokim spektrum działania z bibliotek chemicznych.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe w kierunku chemicznych inhibitorów wirusów RNA o szerokim spektrum działania

Opisujemy użycie fluorescencyjnego wirusa krowianki reporterowej, który umożliwia pomiar zakaźności wirusa i ekspresji genów w czasie rzeczywistym poprzez specyficzną dla etapu ekspresję spektralnie odrębnych fluoroforów reporterowych. Szczegółowo opisujemy metodę opartą na płytkach do dokładnej identyfikacji etapu, na którym replikacja wirusa jest zaburzona w odpowiedzi na hamowanie małych cząsteczek.

Wirusy reporterowe krowianki do ilościowego określania funkcji wirusa na wszystkich etapach ekspresji genów

Tutaj przedstawiono protokół tworzenia zakaźnego bakteryjnego sztucznego chromosomu zawierającego pełnowymiarowe cDNA pozytywnej nici genomowego RNA wirusa japońskiego zapalenia mózgu. Protokół ten może być wykorzystany do skonstruowania funkcjonalnego cDNA innych wirusów o dodatniej nici RNA, co czyni go potężnym narzędziem genomicznym do badania biologii wirusów.

Sztuczne chromosomy bakteryjne: funkcjonalne narzędzie genomiczne do badania wirusów o dodatniej nici RNA

Opisano metody oceny skuteczności i toksyczności cząsteczek RNA ukierunkowanych na etapy postintegracyjne cyklu replikacji HIV-1. Metody te są przydatne do badań przesiewowych nowych cząsteczek i optymalizacji formatu istniejących.

Ocena skuteczności i toksyczności RNA ukierunkowanych na produkcję HIV-1 do stosowania w terapii genowej lub lekowej

Tutaj prezentujemy protokoły identyfikacji 1) kodowanych przez wirusa immunomodulatorów, które promują replikację arbowirusa i 2) eukariotycznych czynników gospodarza, które ograniczają replikację arbowirusa. Te metody oparte na fluorescencji i luminescencji pozwalają naukowcom szybko uzyskać ilościowe odczyty replikacji arbowirusa w uproszczonych testach o niskim stosunku sygnału do szumu.

Zakażenia arbowirusem jako narzędzia przesiewowe do identyfikacji immunomodulatorów wirusa i czynników przeciwwirusowych gospodarza

Ilościowa analiza łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym w połączeniu z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR) jest szeroko stosowana do pomiaru poziomu infekcji wirusem RNA. W tym miejscu przedstawiamy bezpośredni test RT-qPCR, który nie wymaga etapu oczyszczania RNA, opracowany do oznaczania ilościowego kilku wirusów RNA, w tym wirusa dengi.

Pomiar RNA wirusa dengi w supernatancie hodowli zakażonych komórek za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym

Opisujemy metodę generowania i amplifikacji genetycznie modyfikowanych syncytialnych wirusów oddechowych (RSV) oraz zoptymalizowany test płytki nazębnej dla RSV. Ilustrujemy ten protokół, tworząc dwa rekombinowane wirusy, które odpowiednio umożliwiają ilościowe określenie replikacji RSV i analizę na żywo ciał inkluzyjnych RSV i dynamiki granulek związanych z ciałami inkluzyjnymi.

Wytwarzanie, amplifikacja i miareczkowanie rekombinowanych syncytialnych wirusów oddechowych

Poznaj metodę chemii kliknięć do pomiaru zmian w transkrypcji komórek gospodarza po zakażeniu wirusem RVFV MP-12. Technika umożliwia wizualizację nowo syntetyzowanego RNA za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub cytometrii przepływowej bez użycia izotopów promieniotwórczych.

Wykorzystanie chemii kliknięć do pomiaru wpływu infekcji wirusowej na syntezę RNA komórki gospodarza

Przeglądaj więcej filmów