Name: Luminometryczne badania elektrofizjologiczne oocytów drożdży i oocytów Xenopus molekularnej mechanowrażliwości TRPV4 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-31T13:15:00.000+00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: Poznaj luminometryczne i elektrofizjologiczne metody badania mechanowrażliwości kanału jonowego TRPV4 w drożdżach i oocytach Xenopus. Techniki te pozwalają analizować odpowiedź kanałów na bodźce mechaniczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Andrei Kremsreiter za doskonałą pomoc techniczną. Prace w naszym laboratorium są wspierane przez NIH GM096088 oraz Vilas Trust of the University of Wisconsin - Madison.

1. Metody luminometrii drożdży
Użyj szczepu BYYT z Saccharomyces cerevisiae. Jest to pochodna yvc1-tok1- BY4741 (MATa, ura3D0, his3D1, leu2D0, lys2D0, yvc1::HIS3, tok1::kanMX4). Przekształć komórki za pomocą selektywnego przez leu plazmidu eksprymującego aequorynę pEVP1 / Aeq i selektywnego przez szczura plazmidu p416GPDV4 z ekspresją TRPV4 wybieranego przez URA, zgodnie z opisem w Batiza i wsp.26 oraz Loukin i wsp.24 Stosować standardowe metody budowy i transformacji plazmidu27. Szczep drożdży i plazmidy są dostępne na życzenie.
<ol>
	<li>Hodowla 2 ml komórek drożdży przez noc do fazy postlogarytmicznej w wytrząsarce o temperaturze 30 °C w pożywce leu-ura-"DCD"dropout 28 (zubożony w siarczany wariant pożywki CMD-leu-ura29), uzupełnionej 1M sorbitolem. Zaszczepić 200 μl tych kultur w 1,8 ml świeżej pożywki uzupełnionej 2 μM koelenkterazyny lucyferyny. Rośnie w ciemności w temperaturze pokojowej przez kolejne 24 godziny bez wstrząsania.</li>
	<li>Zmierz osmolarność kultury (zwykle przy 1,400 mOsM) i innych roztworach (poniżej) za pomocą osmometru prężnego pary.</li>
	<li>Porcję 20 μl świeżej kultury do rurki luminometru o średnicy 12 mm dla luminometru jednoprobówkowego.</li>
	<li>W przypadku wstrząsu hipotonicznego dodać 200 μl roztworu zawierającego 25 mM NaEGTA (pH 7,2) lub NaMES (pH 7,2) i 500-100 mM NaCl (całkowita osmolarność 1,200-400 mOsM) w zależności od pożądanego stopnia wstrząsu. Stale monitorować luminescencję przed i co najmniej 120 sekund po osmotycznym wstrząsie zstępującym, przerywanym jedynie przez krótką operację rozcieńczania. Zarejestruj dane wyjściowe luminometru na komputerze stacjonarnym jako jednostki luminescencji względnej (RUL).</li>
</ol>
Chociaż nie do badania transgenicznego TRPV4, użyliśmy wariantu powyższego protokołu w zautomatyzowanym systemie do zbadania odpowiedzi dużej liczby szczepów drożdży. Badanie odpowiedzi na bodźce hipo-30 lub hiperosmotyczne31 deletomu drożdży (zbiór 4 906 deletantów jednogenowych drożdży) przy użyciu luminometru mikropłytkowego i analizowane za pomocą odpowiedniego oprogramowania zakończyło się sukcesem.
2. oraz 3. Metody elektrofizjologii oocytów
Elektrofizjologia korzysta z podstawowych metod32. PCR wzmacnia otwartą ramkę odczytu TRPV4 typu dzikiego lub zmutowanego przy użyciu polimerazy PfuUtra o wysokiej wierności i zintegrowanej z pGH19 33. Pociąga to za sobą precyzyjną insercję ORF między UTR 5' i 3' genu Xenopus β-globiny i za promotorem polimerazy RNA T7. Linearyzować konstrukt za 3' UTR i użyć go jako matryc w reakcji polimerazy T7 RNA in vitro. Stosuj standardowe techniki molekularno-biologiczne34.
Użyj oocytów V-VI stopnia od X. laevis. Hodowla zwierząt, częściowa owariektomia, defollikulacja i usunięcie otoczki witeliny przebiegają zgodnie ze standardowymi procedurami32,33,35. Wstrzyknij 2-40 ng roztworu cRNA na oocyt za pomocą automatycznego mikrowstrzykiwacza Drummond Nanoinject II. Wstrzyknij ~30 oocytów do każdego zestawu eksperymentów. Po wstrzyknięciu TRPV4-cRNA inkubować oocyty w pożywce ND96 z gentamycyną (100 μg/ml) i 1 μM czerwienią rutenową14.
2. Zacisk napięcia dwóch elektrod
<ol>
	<li>Pipety rejestrujące ze szkła borokrzemianowego należy pobierać indywidualnie z precyzyjnych jednorazowych mikropipet o pojemności 100 μl za pomocą ściągacza do pipet.</li>
	<li>Ciągnij zarówno elektrody do pipet mierzących napięcie, jak i do wstrzykiwania prądu, są ciągnięte tak, aby miały otwór na końcówkę o średnicy ~1 μm.</li>
	<li>Elektrody zasypkowe o wartości 2 M KCl dają rezystancję 0,1-0,2 mΩ. Zamontuj je na górnych stopniach HS2A, które wraz z wirtualnie uziemionym zaciskiem wanny VG-2Ax100 są podłączone do interfejsu wzmacniacza GeneClamp 500 za pomocą digitizera Digidata 1440. Pozyskiwanie danych za pomocą oprogramowania pClamp10. </li>
	<li>Umieść badany oocyt w kąpieli o pojemności 1 ml w preparowanej komorze z tworzywa sztucznego zamontowanej na stoliku mikroskopu preparacyjnego o 20-krotnym powiększeniu. Roztwór do kąpieli jest wirtualnie uziemiony przez mostek agarowy 3 M KCl i drut z chlorowanego srebra umieszczony w pobliżu oocytu i podłączony do wirtualnego stopnia naziemnego VG-2A.</li>
	<li>Zbuduj komorę do ciągłej perfuzji z plastikowymi rurkami jako wlotem i wylotem roztworu. Podłącz rurkę wlotową podłączoną do spreparowanego systemu perfuzyjnego, który jest kolektorem składającym się z sześciu obudów strzykawek o pojemności 50 ml, z których każda jest wypełniona innym roztworem. Szybkość podawania grawitacyjnego dowolnego roztworu jest kontrolowana do ~2-3 ml / min za pomocą zacisków rampowych "Keck" na rurkach.</li>
	<li>Zamontuj obie elektrody wraz z ich głowicami na mikromanipulatorach. Wykonaj penetracje elektrod w oocycie za pomocą mikromanipulacji.</li>
</ol>
3. Badanie bezpośredniej mechanowrażliwości za pomocą zacisku płatkowego
Podstawowe metody zaciskania krostek, w tym przygotowanie pipet, tworzenie uszczelnień GΩ i tworzenie trybów on-cell lub wyciętych, są te opisane w Hamill et al.36 i Conn32.
<ol>
	<li>Napełnij pipety ze szkła borokrzemianowego otworem o średnicy ~1 μm na końcówce (pęcherzyk nr 5-6) 98 mM KCl, 1 mM MgCl2 i 10 mM K+-HEPES, pH 7,2.</li>
	<li>Podłączyć pipetę z zaciskiem krosowym przez plastikową rurkę do strzykawki o pojemności 5 ml i przez trójnik również do manometru. Użyj komputera do obsługi zarówno wyjść elektrody, jak i manometru. Zbieraj dane z częstotliwością 10 kHz, a następnie odtwarzaj je przez ośmiobiegunowy filtr Bessela z częstotliwością 1 kHz w celu analizy.</li>
	<li>Z tego samego oocytu można wielokrotnie wycinać różne plastry. Praktyka ta sprawia, że badanie aktywności molekularnej TRPV4 jest bardziej wydajne i wiarygodne.</li>
</ol>

<ol><li>Ramsey, I. S., Delling, M., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+TRP+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">An introduction to TRP channels.</a> Annu. Rev. Physiol. 68, 619-647 (2006).</li>
<li>Nilius, B., Owsianik, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transient+receptor+potential+family+of+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">The transient receptor potential family of ion channels.</a> Genome Biol. 12, 218 (2011).</li>
<li>Everaerts, W., Nilius, B., Owsianik, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vallinoid+transient+receptor+potential+channel+Trpv4%3A+From+structure+to+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Biophys.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The vallinoid transient receptor potential channel Trpv4: From structure to disease.</a> Prog. Biophys. Mol. Biol. , (2009).</li>
<li>Nilius, B., Voets, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+puzzle+of+TRPV4+channelopathies%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep.%22%5BJournal%5D)">The puzzle of TRPV4 channelopathies.</a> EMBO Rep.. , (2013).</li>
<li>Liedtke, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vanilloid+receptor-related+osmotically+activated+channel+%28VR-OAC%29%2C+a+candidate+vertebrate+osmoreceptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Vanilloid receptor-related osmotically activated channel (VR-OAC), a candidate vertebrate osmoreceptor.</a> Cell. 103, 525-535 (2000).</li>
<li>Strotmann, R., Harteneck, C., Nunnenmacher, K., Schultz, G., Plant, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OTRPC4%2C+a+nonselective+cation+channel+that+confers+sensitivity+to+extracellular+osmolarity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">OTRPC4, a nonselective cation channel that confers sensitivity to extracellular osmolarity.</a> Nat. Cell Biol. 2, 695-702 (2000).</li>
<li>Wissenbach, U., Bodding, M., Freichel, M., Flockerzi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trp12%2C+a+novel+Trp+related+protein+from+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Trp12, a novel Trp related protein from kidney.</a> FEBS Lett. 485, 127-134 (2000).</li>
<li>Delany, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+novel+human+vanilloid+receptor-like+protein%2C+VRL-2%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Genomics%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a novel human vanilloid receptor-like protein, VRL-2.</a> Physiol. Genomics. 4, 165-174 (2001).</li>
<li>Rock, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gain-of-function+mutations+in+TRPV4+cause+autosomal+dominant+brachyolmia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Gain-of-function mutations in TRPV4 cause autosomal dominant brachyolmia.</a> Nat. Genet. 40, 999-1003 (2008).</li>
<li>Krakow, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+gene+encoding+the+calcium-permeable+ion+channel+TRPV4+produce+spondylometaphyseal+dysplasia%2C+Kozlowski+type+and+metatropic+dysplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in the gene encoding the calcium-permeable ion channel TRPV4 produce spondylometaphyseal dysplasia, Kozlowski type and metatropic dysplasia.</a> Am. J. Hum. Genet. 84, 307-315 (2009).</li>
<li>Camacho, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dominant+TRPV4+mutations+in+nonlethal+and+lethal+metatropic+dysplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Med.+Genet.+A%22%5BJournal%5D)">Dominant TRPV4 mutations in nonlethal and lethal metatropic dysplasia.</a> Am. J. Med. Genet. A. 152, 1169-1177 (2010).</li>
<li>Voets, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+determinants+of+permeation+through+the+cation+channel+TRPV4%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular determinants of permeation through the cation channel TRPV4.</a> J. Biol. Chem. 277, 33704-33710 (2002).</li>
<li>Watanabe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+TRPV4+gating+by+intra-+and+extracellular+Ca2%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Modulation of TRPV4 gating by intra- and extracellular Ca2.</a> Cell Calcium. 33, 489-495 (2003).</li>
<li>Loukin, S., Zhou, X., Su, Z., Saimi, Y., Kung, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wild-type+and+brachyolmia-causing+mutant+TRPV4+channels+respond+directly+to+stretch+force%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Wild-type and brachyolmia-causing mutant TRPV4 channels respond directly to stretch force.</a> J. Biol. Chem. 285, 27176-27181 (2010).</li>
<li>Gao, X., Wu, L., O'Neil, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-modulated+diversity+of+TRPV4+channel+gating%3A+activation+by+physical+stresses+and+phorbol+ester+derivatives+through+protein+kinase+C-dependent+and+-independent+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Temperature-modulated diversity of TRPV4 channel gating: activation by physical stresses and phorbol ester derivatives through protein kinase C-dependent and -independent pathways.</a> J. Biol. Chem. 278, 27129-27137 (2003).</li>
<li>Watanabe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anandamide+and+arachidonic+acid+use+epoxyeicosatrienoic+acids+to+activate+TRPV4+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Anandamide and arachidonic acid use epoxyeicosatrienoic acids to activate TRPV4 channels.</a> Nature. 424, 434-438 (2003).</li>
<li>Vriens, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+swelling%2C+heat%2C+and+chemical+agonists+use+distinct+pathways+for+the+activation+of+the+cation+channel+TRPV4%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Cell swelling, heat, and chemical agonists use distinct pathways for the activation of the cation channel TRPV4.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 396-401 (2004).</li>
<li>Vincent, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+novel+TRPV4+modulators%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of novel TRPV4 modulators.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 389, 490-494 (2009).</li>
<li>Willette, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+activation+of+the+transient+receptor+potential+vanilloid+subtype+4+channel+causes+endothelial+failure+and+circulatory+collapse%3A+Part+2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Systemic activation of the transient receptor potential vanilloid subtype 4 channel causes endothelial failure and circulatory collapse: Part 2.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 326, 443-452 (2008).</li>
<li>Thorneloe, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+orally+active+TRPV4+channel+blocker+prevents+and+resolves+pulmonary+edema+induced+by+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">An orally active TRPV4 channel blocker prevents and resolves pulmonary edema induced by heart failure.</a> Sci. Transl. Med. 4, (2012).</li>
<li>Kang, S. S., Shin, S. H., Auh, C. K., Chun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skeletal+dysplasia+caused+by+a+constitutive+activated+transient+receptor+potential+vanilloid+4+%28TRPV4%29+cation+channel+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Human skeletal dysplasia caused by a constitutive activated transient receptor potential vanilloid 4 (TRPV4) cation channel mutation.</a> Exp. Mol. Med. 44, 707-722 (2012).</li>
<li>Lamande, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+TRPV4+cause+an+inherited+arthropathy+of+hands+and+feet%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in TRPV4 cause an inherited arthropathy of hands and feet.</a> Nat. Genet. 43, 1142-1146 (2011).</li>
<li>Loukin, S., Su, Z., Kung, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+Basal+Activity+Is+a+Key+Determinant+in+the+Severity+of+Human+Skeletal+Dysplasia+Caused+by+TRPV4+Mutations%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Increased Basal Activity Is a Key Determinant in the Severity of Human Skeletal Dysplasia Caused by TRPV4 Mutations.</a> PLoS One. 6, (2011).</li>
<li>Loukin, S. H., Su, Z., Kung, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypotonic+shocks+activate+rat+TRPV4+in+yeast+in+the+absence+of+polyunsaturated+fatty+acids%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Hypotonic shocks activate rat TRPV4 in yeast in the absence of polyunsaturated fatty acids.</a> FEBS Lett. 583, 754-758 (2009).</li>
<li>Loukin, S., Su, Z., Zhou, X., Kung, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+genetic+analysis+reveals+multiple+gating+mechanisms+of+TRPV4%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Forward genetic analysis reveals multiple gating mechanisms of TRPV4.</a> J. Biol. Chem. 285, 19884-19890 (2010).</li>
<li>Batiza, A. F., Schulz, T., Masson, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+respond+to+hypotonic+shock+with+a+calcium+pulse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Yeast respond to hypotonic shock with a calcium pulse.</a> J. Biol. Chem. 271, 23357-23362 (1996).</li>
<li>Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAmberg%2C+DC+%22Methods+in+Yeast+Genetics%3A+a+Cold+Spring+Harbor+Laboratory+Course+Manual%22">Methods in Yeast Genetics: a Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2005).</li>
<li>Loukin, S., Zhou, X., Kung, C., Saimi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+survey+suggests+an+osmoprotective+role+for+vacuolar+Ca2%2B+release+in+cell+wall-compromised+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">A genome-wide survey suggests an osmoprotective role for vacuolar Ca2+ release in cell wall-compromised yeast.</a> FASEB J. 22, 2405-2415 (2008).</li>
<li>Denis, V., Cyert, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internal+Ca%282%2B%29+release+in+yeast+is+triggered+by+hypertonic+shock+and+mediated+by+a+TRP+channel+homologue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Internal Ca(2+) release in yeast is triggered by hypertonic shock and mediated by a TRP channel homologue.</a> J. Cell. Biol. 156, 29-34 (2002).</li>
<li>Loukin, S. H., Kung, C., Saimi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+perturbations+sensitize+osmotic+down-shock+activated+Ca2%2B+influx%2C+a+yeast+%26%2334%3Bdeletome%26%2334%3B+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Lipid perturbations sensitize osmotic down-shock activated Ca2+ influx, a yeast &#34;deletome&#34; analysis.</a> FASEB J. 21, 1813-1820 (2007).</li>
<li>Loukin, S. H., Zhou, X. -L., Kung, C., Saimi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+survey+suggests+an+osmo-protective+role+for+vacuolar+Ca2%2B+release+in+cell-wall-compromized+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">A genome-wide survey suggests an osmo-protective role for vacuolar Ca2+ release in cell-wall-compromized yeast.</a> FASEB J. 22, 2405-2415 (2008).</li>
<li>Conn, P. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aConn%2C+PM+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. 294, Academic Press. (1999).</li>
<li>Iverson Rudy, L. E. Methods in Enzymology. 207, Harcourt Brace Jovanovich. 279-298 (1992).</li>
<li>Loukin, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Random+mutagenesis+reveals+a+region+important+for+gating+of+the+yeast+K%2B+channel+Ykc1%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Random mutagenesis reveals a region important for gating of the yeast K+ channel Ykc1.</a> EMBO J. 16, 4817-4825 (1997).</li>
<li>Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+recording+of+ion+channels+expressed+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Patch clamp recording of ion channels expressed in Xenopus oocytes.</a> J. Vis. Exp. , (2008).</li>
<li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).</li>
<li>Maroto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPC1+forms+the+stretch-activated+cation+channel+in+vertebrate+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">TRPC1 forms the stretch-activated cation channel in vertebrate cells.</a> Nat. Cell Biol. 7, 179-185 (2005).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Jak stwierdzono we Wprowadzeniu, metody powszechnie stosowane do badania funkcji TRPV4 czasami prowadziły do niespójności i kontrowersji. Opisane tutaj dwa zestawy metod mają pewne zalety i mogą uzupełniać istniejące metody. Chociaż opisujemy tylko badania nad TRPV4, metody mogą zostać rozszerzone o badanie również innych kanałów jonowych.
1. Metody luminometrii drożdży
Pączkujące drożdże mają natywną odpowiedź napływu Ca2 + na szok hipoosmotyczny, który je...

TRP (przejściowe potencjały receptorowe) składają się z siedmiu podrodzin kanałów kationowych, które pełnią funkcje sensoryczne1,2. U ssaków TRPV, waniloidowa podrodzina TRP, ma sześć odmian. TRPV4 (typ 4)3,4 reaguje na ciepło, niektóre chemikalia, pęcznienie osmotyczne lub naprężenia ścinające. Gen TRPV4 był wielokrotnie izolowany przez klonowanie genu kandydującego i/lub ekspresji5-8. Ta ostatnia metoda była zgodna z reakcją produktu genu na hipoosmolarność. TRPV4 ulega ekspresji w prawie wszystkich narządach i funkcjach w rozwoju, fizjologii lub patologii wielu różnych typów komórek3,4.
Uderzające są >50 ludzkich autosomalnych dominujących mutacji >TRPV4, powodujących neuropatie obwodowe i/lub dysplazje szkieletowe (nieprawidłowości w rozwoju szkieletu)9-11. Dysplazje szkieletowe wahają się od łagodnej brachyomii typu 3 (karłowatość typu 3), dysplazji kręgowo-przynasadowej typu Kozłowskiego do ciężkich dysplazji, z których niektóre powodują śmierć noworodków lub zarodków. Chociaż wszystkie rodzaje mechanizmów wydają się możliwe, żaden z nich nie wyjaśnia różnorodności, złożoności, zmienności i sporadycznego nakładania się tych chorób.
Podobnie jak inne kanały TRP1, TRPV4 jest tetramerem. W TRPV4 szczura lub człowieka każda podjednostka składa się z 871 reszt. Jego centralnym elementem jest sześć transbłonowych helis A (S1-S6), które są prawdopodobnie ułożone w sposób podobny do kanałów bramkowanych napięciem K+. Tam S1 do S4 tworzą domenę peryferyjną, a S5 i S6 tworzą domenę porów przenikania. Pomiędzy S5 i S6 TRPV4 znajduje się helisa o krótkich porach, po której następuje sekwencja LDLFKLTIGMGDL, z których cztery prawdopodobnie zbiegają się, tworząc filtr kationowy. N-końcowy segment cytoplazmatyczny z 470 resztami zawiera 6 powtórzeń ankyryny, o których wiadomo, że wiążą białka lub małe ligandy. C-końcowy segment cytoplazmatyczny ze 152 resztami zawiera sekwencję wiążącą kalmodulinę wśród innych możliwych miejsc, które wiążą inne pierwiastki3.
TRPV4 to kanał kationowy, który zasadniczo wyklucza aniony1. Podczas gdy jego funkcją fizjologiczną jest przekazywanie bodźców do napływu Ca2 +, jest również przepuszczalny dla innych kationów z sekwencją przepuszczalności Eisenmana IV, faworyzując dwuwartościowy w PCa : PNa ~ 7 12. Przewodność jednokanałowa prostuje przy ~90 pS na zewnątrz i ~40 pS do wewnątrz6,13,14. Prąd wyrażony heterologicznie (poniżej) może być aktywowany przez pęcznienie hipoosmotyczne, naprężenie ścinające lub ciepło15. Jest również aktywowany przez wielonienasycone kwasy tłuszczowe16,17 i syntetyczny ester forbalu 4αPDD 18. Obecnie najsilniejszym agonistą jest GSK1016790A 19, a antagonistą jest GSK2193874, skuteczny w 10-9 do 10-8 M 20, oba wykryte za pomocą wysokoprzepustowych, małocząsteczkowych badań przesiewowych.
Dwa kluczowe obszary badań nad TRPV4 pozostają niejasne: (1) Mimo że TRPV4 jest głównie badany pod kątem jego mechanowrażliwości, jego molekularne podstawy są kontrowersyjne. Jeden z modeli opisuje hipo-osmolarność w jakiś sposób aktywuje fosfolipazę A2 (PLA2) do produkcji wielonienasyconego kwasu tłuszczowego (PUFA) kwasu arachidonowego (AA), który jest przekształcany w kwas epoksyeikozatrienowy (EET) przez epoksydazę, a wiązanie EET aktywuje TRPV4 16,17. Jednak wykazano, że sam TRPV4 bezpośrednio reaguje na rozciąganie błony14 (poniżej), co zapewnia prostsze wyjaśnienie. (2) Patologie mutacji TRPV4 są oszałamiające. W fundacji trzeba wiedzieć, czy choroby są spowodowane utratą, zmniejszeniem czy wzrostem aktywności kanału. Nawet w tym przypadku literatura jest daleka od jasności. Podczas gdy donoszono, że mnogie allele dysplazji szkieletowej mają wyższą aktywność (przyrost funkcji, GOF)4,21, kilka z nich miało zmniejszoną aktywność (utrata funkcji, LOF)10,22. Systematyczne badanie 14 alleli wykazało, że wszystkie są mutacjami GOF (poniżej)23. Twierdzenie, że niektóre z nich są LOF, wydaje się być sprzeczne z fenotypem myszy z nokautem trpV4-/-, które są żywotne lub płodne, z niewielkimi wadami, pomimo całkowitej utraty funkcji TRPV4.
Część tych kontrowersji ma pochodzenie metodologiczne. Laboratoria stosują różne metody lub warianty jednej metody i stosują różne standardy oceny. Najczęściej TRPV4 ulega przejściowej ekspresji w hodowanych komórkach ssaków (HEK, CHO, HeLa), a wzrost wewnętrznego [Ca2+] po stymulacji agonistycznej lub hipotonicznej jest rejestrowany za pomocą wrażliwego na Ca2+ barwnika fluorescencyjnego, Fura-2. Nadmierne poleganie na tym teście fluorometrycznym zostało skrytykowane1. Poziom ekspresji w różnych populacjach, jego rozmieszczenie, a także efektywne stężenie barwnika muszą być kontrolowane i dokumentowane. Bardziej wiarygodne są bezpośrednie badania elektrofizjologiczne. Nawet to, jak powszechnie się praktykuje, również nie jest pozbawione problemów. Ponieważ poziomy ekspresji w poszczególnych hodowanych komórkach są trudne do kontrolowania, prądy w całych komórkach mają duże różnice. Co więcej, ponieważ prądy są małe, wiarygodne statystyki będą musiały opierać się na dużych rozmiarach próbek, co często nie jest praktyczne. Badania typu patch-clamp były rzadko wykonywane. Niektóre z takich nagrań pokazują skupiska wybuchów aktywności, które sprawiają, że ocena statystyczna jest trudna16,17.
Aby lepiej zrozumieć mechanowrażliwość molekularną, opracowaliśmy dwa dodatkowe systemy do badania TRPV4. (1) Aby wyizolować TRPV4 z dala od jego zwykłych partnerów ssaków, wyraziliśmy TRPV4 szczura w pączkujących drożdżach24. Funkcjonalna ekspresja TRPV4 w tym ewolucyjnie odległym kontekście wykazała, że może on nadal reagować na siłę osmotyczną bez swoich zwykłych partnerów. Ponieważ drożdże nie wytwarzają PUFA, takich jak AA lub EET, a ich genom nie ma genów PLA2 ani epoksydazy, to wyrażenie pokazuje również, że nie są one wymagane, aby TRPV4 wyczuwał siłę. Posiadanie TRPV4 w biologicznie najbardziej podatnych molekularnie eukariontach pozwala również na skuteczne manipulacje genetyczne do przodu lub do tyłu25. (2) W celu dogłębnych analiz biofizycznych TRPV4 ulegliśmy ekspresji TRPV4 w oocytach Xenopus. W przeciwieństwie do hodowanych komórek, które wytwarzają prądy sub-nA do nA (10-10 do 10-9 A), oocyt wyraża prądy w μA (10-6 do 10-4 A). Znacznie większy sygnał w stosunku do szumu pozwala na lepszą kwantyfikację i pewniejsze porównanie. TRPV4, wyrażony w ten sposób, może być również badany jako pojedyncze cząsteczki za pomocą patch clamp. Pojedynczy oocyt umożliwia wielokrotne pobieranie próbek plastrów, co ponownie zwiększa wiarygodność oceny ilościowej. Takie badania wykazały, że sam kanał TRPV4 może być bezpośrednio aktywowany przez siłę rozciągającą błonę14. Analizy wykazały również, że 14 reprezentatywnych alleli dysplazji szkieletowej to mutacje wynikające ze wzmocnienia funkcji. Co więcej, stopień tego składowego wycieku Ca2 + jest równoległy do ciężkości chorób układu kostnego23.
Ze względu na ich nowatorstwo i użyteczność, szczegółowe procedury tych dwóch metod są tutaj zebrane, aby umożliwić replikacje w przyszłych badaniach nad TRPV4 lub podobnymi kanałami.

<table><tbody><tr><td>Oscylometr ciśnienia pary</td><td>Wescor</td><td>Wescor 5500</td><td>Logan, UT, USA</td></tr><tr><td>Luminometr jednorurkowy Sirius&nbsp;</td><td>Titertek-Berhold</td><td>Sirius</td><td>Huntsville, LA, Stany Zjednoczone</td></tr><tr><td>Luminometr mikropłytkowy</td><td>Titertek-Berthold</td><td>Mithras LB940</td><td>Huntsville, LA, Stany</td></tr><tr><td>Zjednoczone Oprogramowanie do luminometrii</td><td>Titertek-Berthold</td><td>MikroWin2000</td><td>Huntsville, LA, USA</td></tr><tr><td>Zacisk krosowy i oprogramowanie</td><td>Scena czołowa Axon Instrument</td><td>HS2A, wirtualny zacisk kąpielowy VG-2Ax100, wzmacniacz GeneClamp 500, digitizer digidata 1440, Oprogramowanie pClamp10</td><td>Union City, CA, Stany Zjednoczone</td></tr><tr><td>Manometr</td><td>Bio-Tec</td><td></td><td>Winooski, VT, Stany</td></tr><tr><td>Zjednoczone Ściągacz do pipet</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>Model P-97</td><td>Novata, CA, USA</td></tr><tr><td>Mikrowstrzykiwacz</td><td>Drummond Scientific</td><td>Nanoinject II</td><td>Broomall, PA, Stany Zjednoczone</td></tr><tr><td>Lucyferyna coelenterazine</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Carlsbad, CA, USA</td></tr><tr><td>T7 Polimeraza RNA reakcja</td><td>Ambion</td><td>mMessage mMachine</td><td>Austin, TX, USA</td></tr><tr><td>Gentamycyna</td><td>Sigma</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ruten czerwony&nbsp;</td><td>Sigma</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikropipety&nbsp;</td><td>Mikropipety Drummond</td><td>100 mikrolitrów</td><td>Broomall, PA, Stany Zjednoczone</td></tr><tr><td>Polimeraza PfuUtra o wysokiej wierności&nbsp;</td><td>Stratagene</td><td></td><td>La Jolla, Kalifornia, Stany Zjednoczone</td></tr></tbody></table>

luminometryczne badania elektrofizjologiczne oocytów drożdży i oocytów xenopus molekularnej mechanowrażliwości trpv4

Yeast Luminometric and Xenopus Oocyte Electrophysiological Examinations of the Molecular Mechanosensitivity of TRPV4

TRPV4 (Transient Receptor Potentials, rodzina waniloidów, typ 4) jest szeroko wyrażany w tkankach kręgowców i jest aktywowany przez kilka bodźców, w tym przez siły mechaniczne. Niektóre mutacje TRPV4 powodują złożone dziedziczne patologie kości lub neuronów u ludzi. Transgeny TRPV4 typu dzikiego lub zmutowanego są powszechnie ulegane ekspresji w hodowanych komórkach ssaków i badane za pomocą fluorometrii Fura-2 i elektrod. Jeśli chodzi o mechanizm mechanowrażliwości i molekularne podstawy chorób, obecna literatura jest zagmatwana i kontrowersyjna. Aby uzupełnić istniejące metody, opisujemy dwie dodatkowe metody badania właściwości molekularnych TRPV4. (1) Szczurzy TRPV4 i transgen aequoryny są przekształcane w pączkujące drożdże. Wstrząs hipoosmtyczny populacji transformantów daje sygnał luminometryczny dzięki połączeniu aequoryny z Ca2+, uwalnianej przez kanał TRPV4. Tutaj TRPV4 jest izolowany ze swoich zwykłych białek partnerskich ssaków i ujawnia swoją własną mechanowrażliwość. (2) cRNA TRPV4 wstrzykuje się do oocytów Xenopus. Po odpowiednim okresie inkubacji makroskopowy prąd TRPV4 jest badany za pomocą dwuelektrodowych cęgów napięciowych. Wzrost prądu po usunięciu obojętnego osmoticum z kąpieli oocytów wskazuje na mechanowrażliwość. Prądy mikroamperowe (10-6 do 10-4 A) z oocytów są znacznie większe niż prądy subnano- do nanoamperowe (10-10 do 10-9 A) z hodowanych komórek, co daje jaśniejsze dane ilościowe i bardziej wiarygodne oceny. Prądy mikroskopowe odzwierciedlające aktywność poszczególnych białek kanałowych mogą być również rejestrowane bezpośrednio pod klamrą krosową, w trybie on-cell lub po wycięciu. Ten sam oocyt dostarcza wiele próbek plastrów, co pozwala na lepszą replikację danych. Ssanie zastosowane do plastrów może aktywować TRPV4 w celu bezpośredniej oceny wrażliwości mechanologicznej. Metody te powinny być również przydatne w badaniu innych typów kanałów TRP.

W typowym eksperymencie luminometrycznym zakres hipotonicznych szoków w przedziale 400-1,200 mOsM uzyskuje się poprzez dodanie 200 μl roztworów szokowych o różnej niskiej osmolarności do 20 μl hodowli o stężeniu 1,400 mOsM. Aktywność TRPV4 jest widoczna, gdy RLU próbki doświadczalnej porównuje się z RLU dwóch kontroli negatywnych: komórek drożdży transformowanych pustym plazmidem p416GPDV4 lub plazmidem zawierającym gen TRPV4 z mutacją w filtrze jonowym (Rycina 1)24.
<p class="jov...

Aby uzupełnić powszechnie stosowane metody badania TRPV4, opisano dwie metody: Jego mechanowrażliwość może być badana za pomocą luminometrii Ca2+-aequorin w transgenicznych drożdżach po prowokacji hypo-osmotycznej. Można go również badać w oocytach Xenopus z wstrzyknięciem TRPV4-RNA za pomocą dwuelektrodowego zacisku napięciowego całej komórki lub zacisku krosowego w trybie on-cell lub wyciętym.

Luminometryczne badania elektrofizjologiczne oocytów drożdży i oocytów Xenopus molekularnej mechanowrażliwości TRPV4

TRPV4 (Transient Receptor Potentials, vanilloid family, type 4) is widely expressed in vertebrate tissues and is activated by several stimuli, including ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zbadanie czułości mechanicznej kanału jonowego V four. Można to osiągnąć poprzez transformację komórek drożdży za pomocą genu podróży V cztery i zbadanie hipotetycznie indukowanego wnikania wapnia przez transgeniczne ciało obce za pomocą luminometru. Można to również zbadać za pomocą podejścia elektrofizjologicznego.Trip V four CRNA jest najpierw generowany i wstrzykiwany do cytów xenopus po inkubacji. Cyty są badane za pomocą dwóch zacisków napięciowych elektrod po hipotonicznym prowokacji. Aby zbadać czułość mechano na poziomie pojedynczego kanału, zasysanie jest stosowane do łat błonowych wyciętych z cytów.Nazywam się profesor Jin Kung. Wcześniej, aktywność czterech kanałów jonowych TRIP B była w dużej mierze wykazywana przez URA do opracowanego tutaj mitu fluorescencji, który dostarcza potężnych i ilościowych alternatyw do badania mechanicznej wrażliwości tripu B cztery. Pierwszą metodą, którą przyjęliśmy przy użyciu lum lum, jest transgeniczna woda w celu zbadania mechanicznej wrażliwości Trip V four w pączkujących drożdżach.W drugiej metodzie z podejściem elektrofizjologicznym badane są właściwości Trip V four trafnej ekspresji tribu

yeast-luminometric-xenopus-oocyte-electrophysiological-examinations

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Metoda "cut-open Vaseline gap" służy do uzyskiwania niskoszumowych zapisów prądów jonowych i bramkujących z zależnych od napięcia kanałów jonowych wyrażonych w oocytach Xenopus z wysoką rozdzielczością kinetyki szybkich kanałów. Przy niewielkich modyfikacjach fluorometria cęgów napięciowych może być sprzężona z protokołem rozcięcia oocytów.

Technika zacisku napięciowego z otwartą szczeliną wazelinową Xenopus z fluorometrią

Ostre mikroelektrody umożliwiają dokładną elektrofizjologiczną charakterystykę fotoreceptorów i wizualnych interneuronów u żyjących Drosophila. Tutaj pokazujemy, jak wykorzystać tę metodę do rejestrowania wysokiej jakości odpowiedzi napięciowych poszczególnych komórek na kontrolowaną stymulację światłem. Ta metoda jest idealna do badania przetwarzania informacji neuronalnych w oczach złożonych owadów.

Elektrofizjologiczna metoda rejestracji wewnątrzkomórkowych odpowiedzi napięciowych fotoreceptorów i interneuronów Drosophila na bodźce świetlne in vivo

Badanie kanałów jonowych za pomocą heterologicznie wyrażającego systemu stało się podstawową techniką w badaniach biomedycznych. W tym manuskrypcie przedstawiamy efektywną czasowo metodę osiągania ściśle kontrolowanej ekspresji kanału jonowego poprzez przeprowadzanie transfekcji przejściowej pod kontrolą indukowalnego promotora.

Kontrolowana ekspresja kanału jonowego poprzez indukowalną transfekcję przejściową

Ten artykuł opisuje ulepszenie konwencjonalnej fluorometrii zaciskowej (VCF), gdzie zamiast barwników maleimidowych stosuje się fluorescencyjne nienaturalne aminokwasy (fUAA), aby badać strukturalne przegrupowania w kanałach jonowych. Procedura obejmuje iniekcję DNA oocytów Xenopus, koiniekcję RNA/fUAA oraz jednoczesne pomiary prądu i fluorescencji.

Fluorometria zaciskowa napięcia w oocytach Xenopus przy użyciu fluorescencyjnych nienaturalnych aminokwasów

Zapisy całokomórkowe z fotoreceptorów Drosophila melanogaster umożliwiają pomiar spontanicznych ciemnych guzków, wybrzuszeń kwantowych, makroskopowych reakcji na światło i zależności prąd-napięcie w różnych warunkach. W połączeniu z narzędziami manipulacji genetycznej D. melanogaster, metoda ta umożliwia badanie wszechobecnego szlaku sygnałowego inozytol-lipid i jego celu, czyli kanału TRP.

Metoda elektrofizjologiczna dla zapisów cęgów napięcia w całej komórce z fotoreceptorów Drosophila

Ten artykuł opisuje konkretne metody uzyskiwania biochemicznych ilości TRPV1 rozpuszczonego w detergentach do analizy spektroskopowej. Połączone protokoły zapewniają narzędzia biochemiczne i biofizyczne, które można dostosować w celu ułatwienia badań strukturalnych i funkcjonalnych kanałów jonowych ssaków w środowisku kontrolowanym przez błonę.

Oczyszczanie i rekonstytucja TRPV1 do analizy spektroskopowej

Tutaj opisujemy optyczne pozyskiwanie i charakterystykę potencjałów czynnościowych z indukowanych pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych za pomocą szybkiego modułowego systemu fotometrycznego.

Pomiar potencjału czynnościowego optycznego pojedynczej komórki w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych

Tutaj prezentujemy protokół opisujący transdukcję wirusa w dyskretnych obszarach mózgu za pomocą konstruktów optogenetycznych, które umożliwiają specyficzną dla synaps charakterystykę elektrofizjologiczną w ostrych wycinkach mózgu gryzoni.

Ex vivo Badanie optogenetyczne transmisji synaptycznej dalekiego zasięgu i plastyczności od przyśrodkowej kory przedczołowej do bocznej kory śródwęchowej

Protokół pokazuje, że przeprowadzając mikroprzeszczepy błon synaptycznych do oocytów Xenopus laevis, można rejestrować spójne i niezawodne odpowiedzi receptorów kwasu α-amino-3-hydroksy-5-metylo-4-izoksazopropionowego i kwasu γ-aminomasłowego.

Mikrotransplantacja błon synaptycznych w celu reaktywacji ludzkich receptorów synaptycznych do badań funkcjonalnych

Elektrofizjologia to złoty standard w badaniu aktywności kanałów jonowych. Istnieje jednak wiele alternatywnych podejść, w tym metod optycznych. W tym miejscu opisujemy metodę monitorowania aktywności bogatego w leucynę powtórzenia zawierającego 8-kanałowe (LRRC8) kanały anionowe utworzone przy użyciu metody opartej na rezonansowym transferze energii Förstera (FRET) między podjednostkami.

Monitorowanie aktywności powtórzeń bogatych w leucynę zawierających 8 kanałów (LRRC8/VRAC) przy użyciu transferu energii rezonansowej Förstera z emisją uczuloną (SE-FRET)

Do badania reakcji komórek pobudliwych in vitro, protokół opisuje optyczne monitorowanie zmian w generowaniu potencjału czynnościowego przez elektroporację na prostym pobudliwym modelu komórkowym genetycznie modyfikowanych komórek HEK z tet-on, jak również zmian napięcia transbłonowego z automatyczną ekstrakcją odpowiednich parametrów.

Monitorowanie wywołanych przez elektroporację zmian w generowaniu potencjału czynnościowego w genetycznie modyfikowanych ogniwach HEK Tet-On Spiking

Poznaj luminometryczne i elektrofizjologiczne metody badania mechanowrażliwości kanału jonowego TRPV4 w drożdżach i oocytach Xenopus. Techniki te pozwalają analizować odpowiedź kanałów na bodźce mechaniczne.

Luminometryczne badania elektrofizjologiczne oocytów drożdży i oocytów Xenopus molekularnej mechanowrażliwości TRPV4

Przeglądaj więcej filmów