Name: Testy do identyfikacji nowych leków przeciwwirusowych przeciwko wirusowi choroby niebieskiego języka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-11T23:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: Poznaj metody identyfikacji nowych leków przeciwwirusowych przeciwko wirusowi choroby niebieskiego języka (BTV) przy użyciu testów CPE, analizy dawkowo-odpowiedzi i ToA. Odkryj skuteczne związki o niskiej cytotoksyczności.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten projekt był wspierany przez granty 1R03MH08127-01 i 7R03MH08127-02 od NIH dla Q. Li, oraz przez fundusze IMPACT z Wydziału Medycyny UAB dla Q. Li. Wsparcie z Molette Fund i Auburn University jest mile widziane. Dziękujemy również za pomoc techniczną ze strony Pani Pulin Che i Pana Wołodymyra Musiienko w trakcie prac.

1. Komórki, wirus i związki przeciwwirusowe
<ol>
	<li>Utrzymuj komórki BSR, pochodną komórek nerki chomika (BHK)10, w zmodyfikowanym pożywce Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco zawierającej 5% płodowej surowicy cielęcej (FCS), 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny.</li>
	<li>Dla wszystkich trzech testów, komórki płytki w DMEM z 1% FCS, 100U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny, jak zoptymalizowano wcześniej5. To podłoże jest określane jako pożywka testowa dla wszystkich trzech testów.</li>
	<li>Inkubować wszystkie komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C, przy 5% CO2 i wilgotności 80-95%.</li>
	<li>Oczyszczanie płytki nazębnej i rozmnażanie BTV typu 10 (BTV-10), jak opisano wcześniej8. Rozcieńczyć BTV-10 w pożywce testowej dla każdego wyznaczonego testu.</li>
	<li>Rozpuścić wszystkie badane związki w DMSO, aby utworzyć materiał podstawowy o stężeniu 10 mM. Przechowywać zapasy w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Rozcieńczyć związki do pożądanych stężeń przy użyciu pożywki do oznaczania dla wyznaczonych testów2.</li>
</ol>
2. Test oparty na CPE przy użyciu zestawu KTG
<ol>
	<li>Wysiewaj komórki BSR na 384-dołkową mikropłytkę (; format 16 x 24) za pomocą dozownika MicroFlo select. Gęstość wysiewu wynosi 5,000 komórek/dołek, a objętość wysiewu wynosi 20 μl do analizy skuteczności przeciwwirusowej.</li>
	<li>Inkubuj komórki przez 2-3 godziny, aż komórki dokładnie przylgną do płytki.</li>
	<li>Do każdego dołka dodać związek przeciwwirusowy o końcowym stężeniu 10 μM. Całkowicie wymieszaj.</li>
	<li>Rozcieńczyć BTV do pożądanego miana i dodać 5 μl BTV z oznaczonym MOI do każdego dołka. Do studzienki kontrolnej dodać 5 μl pożywki do oznaczania. Inkubować zakażone komórki przez 72 godziny w temperaturze 37 °C, przy 5% CO2 i wilgotności 80-95%.</li>
	<li>W temperaturze 72 h.p.i. rozmrozić i zrównoważyć bufor CTG i liofilizowany substrat CTG do temperatury pokojowej przed użyciem. Rozpuść jednorodny roztwór odczynnika KTG, mieszając liofilizowany enzym/substrat i odczynnik buforowy zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Wyrównać płytki testowe do temperatury pokojowej przez 15 minut.</li>
	<li>Dodać równą objętość (25 μl) odczynników KTG do każdej studzienki za pomocą dozownika. Po inkubacji przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności zmierz sygnały luminescencji za pomocą czytnika wielomodowego o czasie integracji 0,1 sek.</li>
</ol>
3. Test dawka-odpowiedź
<ol>
	<li>Umieść komórki BSR na 384-dołkowej mikropłytce (czarnej; format 16 x 24) za pomocą dozownika, o gęstości wysiewu 5 000 komórek/basenik w objętości wysiewu odpowiednio 20 μl dla testu skuteczności przeciwwirusowej i 25 μl dla testu cytotoksyczności.</li>
	<li>Inkubować komórki przez 2-3 godziny w temperaturze 37 °C, przy 5% CO2 i wilgotności 80-95%, aż komórki będą dobrze przyczepione do płytki.</li>
	<li>Przeprowadzić test na ćwiartce obszaru płytki 384-dołkowej dla każdego związku (co odpowiada płytce 96-dołkowej), jak pokazano w tabeli 1. Przydzielić osiem powtórzeń dla każdego stężenia w jednym teście. Pierwszą kolumnę należy przypisać jako kontrolę pozytywną bez dodawania związku i wirusa, a ostatnią kolumnę (12.część) jako kontrolę ujemną poprzez dodanie samego wirusa bez związków.</li>
	<li>Rozcieńczyć związki do 50 μM w pożywce testowej i dodać do 2. kolumny w stężeniu 20 μl/basenik w celu oznaczenia skuteczności przeciwwirusowej. Wymieszaj związek pięciokrotnie za pomocą 8-kanałowej pipety półautomatycznej do stężenia 25 μM.</li>
	<li>Za pomocą 8-kanałowej pipety półautomatycznej przenieść mieszaninę 20 μl z 2. kolumny do następnej kolumny (3. kolumny), dobrze wymieszać, aby uzyskać stężenie 12,5 μM. Powtórzyć ten proces, przenosząc mieszaninę 20 μl z 3. kolumny do następnej kolumny (4. kolumny), aby utworzyć kolejne dwukrotne rozcieńczenie o stężeniu 6,25 μM. Powtórzyć to dwukrotne seryjne rozcieńczanie aż do 11. kolumny. Odessać i wyrzucić 20 μl mieszaniny do 11. kolumny po dodaniu i wymieszaniu związku.</li>
	<li>Dodać BTV-10, w oparciu o MOI 0,01, do każdego dołka od kolumny 2 do kolumny 11 o objętości 5 μl/basenik. Po dodaniu wirusa końcowe stężenie związku w każdej kolumnie powinno wynosić: 20 μM w kolumnie 2, 10 μM w kolumnie 3 i kontynuować dwukrotne rozcieńczenie do kolumny 11 o końcowym stężeniu 0,04 μM.</li>
	<li>Dodać 5 μl pożywki do kolumny 1 jako kontrolę tylko komórek (dodatnia) i 5 μl/basenik BTV do kolumny 12 jako kontrola tylko zakażenia BTV (ujemna).</li>
	<li>Rozcieńczyć związki do początkowego stężenia 200 μM do badania cytotoksyczności. Podobnie, dodać 25 μl/studzienkę związku do kolumny 2 i wymieszać 5x z 8-kanałową pipetą półautomatyczną do stężenia 100 μM. Nie dodawaj BTV.</li>
	<li>Przeprowadzić dwukrotne rozcieńczenie seryjne przez zasysanie 25 μl z kolumny 2 do sąsiedniej kolumny 3 i kontynuować do ostatniej kolumny (12μl). W kolumnie 12, po wymieszaniu, odessać i odrzucić 25 μl mieszaniny. Końcowe stężenie w kolumnie 2 powinno wynosić 100 μM, a w 12. kolumnie 0,2 μM. Kolumna 1 to formant tylko w komórce.</li>
	<li>Zarówno w przypadku testów skuteczności przeciwwirusowej, jak i cytotoksyczności, inkubować płytki w temperaturze 37 °C, z 5% CO2 i wilgotnością 80-95% przez 72 godziny po zabiegu. Zmierz żywotność komórek za pomocą zestawu KTG, jak opisano powyżej (kroki protokołu 2.5-2.7).</li>
</ol>
4. Test czasu dodania (ToA)
<ol>
	<li>Komórki BSR należy wysiać z kolumny 1-24 na mikropłytce 384-dołkowej (; format 16 x 24) przez dozownik przy 5 000 komórek/dołku, a objętość wysiewu wynosi 15 μl/dołek.</li>
	<li>Dla każdego związku wykorzystaj wszystkie dwadzieścia cztery kolumny z ośmioma replikami dla każdego punktu czasowego w połowie płytki 384-dołkowej (Tabela 2). Przypisz kolumnę 1 jako kontrolę tylko komórek, dodając 10 μl/dołek pożywki do oznaczania. Oznaczyć kolumnę 24 jako kontrolę tylko zakażenia wirusem BTV (kontrola ujemna) poprzez dodanie 5 μl/dostojnika i 5 μl/basenik wirusa w MOI 0,01 do końcowej objętości 25 μl/basenik.</li>
	<li>Wybierz kolumny parzyste z kolumn 2-22 jako kolumnę oceny skuteczności przeciwwirusowej w różnych godzinach po zakażeniu (hpi). W tych kolumnach należy zainfekować komórki 5 μl/dołek BTV przy MOI 0,01. Przy różnych h.p.i. dodaj również 5 μl / dobrze rozcieńczony związek do każdej studzienki, aby uzyskać końcową objętość 25 μl / studzienkę. Dla oznaczonych -2 i -1 h.p.i. dodać związek do komórek BSR przed zakażeniem BTV. Dla 0 hpi dodać związek i BTV do kultury jednocześnie.</li>
	<li>Równolegle oznacz kolumny o numerach nieparzystych z kolumny 3-23 jako kontrole tylko złożone, z których złożone zostały dodane w różnych punktach czasowych zgodnie z oznaczeniem (-2, -1, 0, 1, 2, 4, 8, 16, 24, 48 hpi). W tych kolumnach dodać 5 μl/basenik pożywki do oznaczania i 5 μl/dobrze rozcieńczony związek, aby uzyskać końcową objętość 25 μl/basenik.</li>
	<li>Po zabiegu inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przy wilgotności 80-95%.</li>
	<li>Określ żywotność ogniwa przy 72 h.p.i. za pomocą zestawu CellTiter-Glo, jak opisano wcześniej (kroki protokołu 2.5-2.7).</li>
</ol>
5. Analiza danych
<ol>
	<li>Najpierw przetwarzaj wszystkie dane za pomocą odpowiedniego oprogramowania opartego na sygnałach luminescencyjnych uzyskanych przez czytnik wielomodowy. Określić wartość średnią (średnią), odchylenie standardowe (STDEV) dla każdego zabiegu, jak również zmiany współczynnika (CV), które wymagają wartości nie większej niż 10%.</li>
	<li>Przenieś przetworzone dane z powyższego oprogramowania do biostatycznego i graficznego narzędzia programowego. Przeprowadzić analizę regresji nieliniowej w celu wyznaczenia wartości EC50 i CC50.</li>
</ol>

<ol><li>Hemati, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bluetongue+virus+targets+conventional+dendritic+cells+in+skin+lymph%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Bluetongue virus targets conventional dendritic cells in skin lymph.</a> J. Virol. 83, 8789-8799 (2009).</li>
<li>Gu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Virostatic+Agents+against+Bluetongue+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Novel Virostatic Agents against Bluetongue Virus.</a> PLoS ONE. 7, e43341(2012).</li>
<li>Meiswinkel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+2006+outbreak+of+bluetongue+in+northern+Europe--the+entomological+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Prev.+Vet.+Med%22%5BJournal%5D)">The 2006 outbreak of bluetongue in northern Europe--the entomological perspective.</a> Prev. Vet. Med. 87, 55-63 (2008).</li>
<li>Szmaragd, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mortality+and+case+fatality+during+the+recurrence+of+BTV-8+in+northern+Europe+in+2007%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.+Rec%22%5BJournal%5D)">Mortality and case fatality during the recurrence of BTV-8 in northern Europe in 2007.</a> Vet. Rec. 161, 571-572 (2007).</li>
<li>Li, Q., Maddox, C., Rasmussen, L., Hobrath, J. V., White, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+development+and+high+throughput+antiviral+drug+screening+against+Bluetongue+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">Assay development and high throughput antiviral drug screening against Bluetongue virus.</a> Antiviral Research. 83, 267-273 (2009).</li>
<li>Noah, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell-based+luminescence+assay+is+effective+for+high-throughput+screening+of+potential+influenza+antivirals%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Res%22%5BJournal%5D)">A cell-based luminescence assay is effective for high-throughput screening of potential influenza antivirals.</a> Antiviral Res. 73, 50-59 (2007).</li>
<li>Che, P., Wang, L., Li, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development%2C+optimization+and+validation+of+an+assay+for+high+throughput+antiviral+drug+screening+against+Dengue+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Clin.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">The development, optimization and validation of an assay for high throughput antiviral drug screening against Dengue virus.</a> Int. J. Clin. Exp. Med. 2, 363-373 (2009).</li>
<li>Li, Q., Li, H., Blitvich, B. J., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Aedes+albopictus+inhibitor+of+apoptosis+1+gene+protects+vertebrate+cells+from+bluetongue+virus-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Aedes albopictus inhibitor of apoptosis 1 gene protects vertebrate cells from bluetongue virus-induced apoptosis.</a> Insect Mol. Biol. 16, 93-105 (2007).</li>
<li>Petty, R. D., Sutherland, L. A., Hunter, E. M., Cree, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+MTT+and+ATP-based+assays+for+the+measurement+of+viable+cell+number%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biolumin.+Chemilumin%22%5BJournal%5D)">Comparison of MTT and ATP-based assays for the measurement of viable cell number.</a> J. Biolumin. Chemilumin. 10, 29-34 (1995).</li>
<li>Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+bovine+respiratory+syncytial+virus+%28BRSV%29+from+cDNA%3A+BRSV+NS2+is+not+essential+for+virus+replication+in+tissue+culture%2C+and+the+human+RSV+leader+region+acts+as+a+functional+BRSV+genome+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter.</a> J. Virol. 73, 251-259 (1999).</li>
<li>Phillips, T., Jenkinson, L., McCrae, C., Thong, B., Unitt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+high-throughput+human+rhinovirus+infectivity+cell-based+assay+for+identifying+antiviral+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of a high-throughput human rhinovirus infectivity cell-based assay for identifying antiviral compounds.</a> J. Virol. Methods. 173, 182-188 (2011).</li>
<li>Harvey, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetracycline-inducible+packaging+cell+line+for+production+of+flavivirus+replicon+particles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Tetracycline-inducible packaging cell line for production of flavivirus replicon particles.</a> J. Virol. 78, 531-538 (2004).</li>
<li>Puig-Basagoiti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+assays+using+a+luciferase-expressing+replicon%2C+virus-like+particles%2C+and+full-length+virus+for+West+Nile+virus+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">High-throughput assays using a luciferase-expressing replicon, virus-like particles, and full-length virus for West Nile virus drug discovery.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49, 4980-4988 (2005).</li>
<li>Puig-Basagoiti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triaryl+pyrazoline+compound+inhibits+flavivirus+RNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Triaryl pyrazoline compound inhibits flavivirus RNA replication.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 50, 1320-1329 (2006).</li>
<li>Duan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+protection+against+the+highly+pathogenic+H5N1+influenza+virus+by+an+antisense+phosphorothioate+oligonucleotide%5BTitle%5D)+AND+%22Antivir.+Ther%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo protection against the highly pathogenic H5N1 influenza virus by an antisense phosphorothioate oligonucleotide.</a> Antivir. Ther. 13, 109-114 (2008).</li>
<li>Ray, D., Shi, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+flavivirus+antiviral+drug+discovery+and+vaccine+development%5BTitle%5D)+AND+%22Recent+Pat.+Antiinfect.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Recent advances in flavivirus antiviral drug discovery and vaccine development.</a> Recent Pat. Antiinfect. Drug Discov. 1, 45-55 (2006).</li>
<li>Severson, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+of+a+100%2C000-compound+library+for+inhibitors+of+influenza+A+virus+%28H3N2%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening of a 100,000-compound library for inhibitors of influenza A virus (H3N2).</a> J. Biomol. Screen. 13, 879-887 (2008).</li>
<li>Severson, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+a+high-throughput+screen+for+inhibitors+of+SARS+CoV+and+its+application+in+screening+of+a+100%2C000-compound+library%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">Development and validation of a high-throughput screen for inhibitors of SARS CoV and its application in screening of a 100,000-compound library.</a> J. Biomol. Screen. 12, 33-40 (2007).</li>
<li>Bolken, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+potent+small+molecule+inhibitor+of+hemorrhagic+fever+New+World+arenaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Antivir.+Res%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of potent small molecule inhibitor of hemorrhagic fever New World arenaviruses.</a> Antivir. Res. 69, 86-97 (2006).</li>
<li>Van Loock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+high-throughput+cellular+screening+assay+for+the+discovery+of+HIV-1+integrase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel high-throughput cellular screening assay for the discovery of HIV-1 integrase inhibitors.</a> J. Virol. Methods. 179, 396-401 (2012).</li>
<li>Kampmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+silico+screening+of+small+molecule+libraries+using+the+dengue+virus+envelope+E+protein+has+identified+compounds+with+antiviral+activity+against+multiple+flaviviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Res%22%5BJournal%5D)">In silico screening of small molecule libraries using the dengue virus envelope E protein has identified compounds with antiviral activity against multiple flaviviruses.</a> Antiviral Res. 84, 234-241 (2009).</li>
<li>Kirchmair, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+anti-viral+agents+using+molecular+modeling+and+virtual+screening+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Disord.+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Development of anti-viral agents using molecular modeling and virtual screening techniques.</a> Infect. Disord. Drug Targets. 11, 64-93 (2011).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Jednym z kluczowych etapów odkrywania i opracowywania leków przeciwwirusowych jest opracowanie solidnych testów, które obejmują wybór mierzalnego markera, opracowanie prostego protokołu, uzyskanie wystarczającej liczby sygnałów i mniej niż 10% CV. Większość badań przesiewowych biochemicznych lub komórkowych jest zaprojektowana tak, aby zapewnić chemiczny punkt wyjścia oparty na najbardziej solidnym, prostym i niedrogim teście, ze względu na wymaganą odtwarzalność w procesie przesiewowym i potencjalnie dużą liczbę cząstec...

BTV to prototyp dwuniciowego wirusa RNA z rodzaju Orbivirus, rodziny Reoviridae. BTV jest jedną z najważniejszych chorób zwierząt gospodarskich, w tym owiec, kóz, bydła i innych zwierząt domowych, powodującą straty w wysokości 3 miliardów dolarów rocznie na całym świecie1,2. Egzotyczny serotyp BTV jest ważnym patogenem zwierzęcym wymienionym w raporcie USDA "Patogeny zwierząt gospodarskich o wysokiej konsekwencji". Ostatnio ponowne pojawienie się BTV spowodowało poważny wybuch epidemii choroby u bydła i owiec w kilku krajach Europy Północnej3,4. Ze względu na swoje znaczenie gospodarcze i jako system modelowy, wirus BTV stał się przedmiotem szeroko zakrojonych badań molekularnych, genetycznych i strukturalnych, w wyniku których opracowano kilka szczepionek. Jednak ze względu na brak odpowiednich testów do odkrywania leków przeciwwirusowych, nie ma dostępnych leków przeciwwirusowych przeciwko BTV.
W niedawnej kampanii wysokoprzepustowych badań przesiewowych (HTS) z wykorzystaniem BTV jako systemu modelowego, opracowaliśmy, zoptymalizowaliśmy i zwalidowaliśmy test oparty na CPE, aby zidentyfikować potencjalne leki przeciwwirusowe o szerokim spektrum działania przeciwko arbowirusom5. Test oparty na CPE jest dobrze uznanym testem, który został wykorzystany do odkrywania leków przeciwwirusowych przeciwko wielu wirusom, które wywołały szybką i obserwowalną CPE / apoptozę5-7. W naszym systemie, po zakażeniu BTV, CPE jest widoczne w komórkach kręgowców, w tym HeLa, BSR i HEK 293T8. CPE wywołane przez BTV można monitorować i oznaczać ilościowo za pomocą różnych metod wykrywania żywotności komórek, w tym zestawu odczynników żywotności komórek CellTiter Glo (zestaw KTG)9. Zestaw ten określa liczbę żywotnych komórek w hodowli na podstawie ilościowego oznaczenia przedstawionego komórkowego ATP, który sygnalizuje obecność metabolicznie aktywnych żywych komórek. W zoptymalizowanych warunkach, zaprezentowany tutaj test oparty na CPE wykazał swoją wykonalność dzięki jednoetapowemu protokołowi "mix and measure" oraz elastyczność dzięki stabilnym sygnałom luminescencyjnym. Tymczasem toksyczne związki zmniejszające żywotność komórek zostaną wykluczone w tym teście opartym na CPE. Test oparty na CPE wykazał swoją solidność i niezawodność w odkrywaniu leków przeciwwirusowych przeciwko BTV i został wykorzystany do badań przesiewowych NIH Molecular Libraries Small Molecule Repository (MLSMR), co prowadzi do identyfikacji sześciu nowych klastrów potencjalnych przeciwwirusowych związków ołowiowych5.
Gdy potencjalny związek przeciwwirusowy zostanie zidentyfikowany za pomocą testu opartego na CPE, będzie musiał zostać poddany testowi dawka-odpowiedź o dziesięciu stężeniach, aby określić zakres skuteczności przeciwwirusowej i cytotoksyczności2. Skuteczność przeciwwirusowa, reprezentowana jako 50% stężenie hamujące (IC50) lub 50% stężenie skuteczne (EC50), to stężenie leku, który hamuje CPE wywołane przez wirusa w połowie drogi między wartością wyjściową a maksymalną. Cytotoksyczność leków przeciwwirusowych, tj. 50% stężenie cytotoksyczności (CC50), to stężenie leku wywołujące 50% cytotoksyczności między wartością wyjściową a maksymalną. Wskaźnik selektywności (SI), oznaczany jako 50% SI (SI50) jest obliczany na podstawie CC50/IC50, który określa swoistość leku przeciwwirusowego wobec CPE wywołanego przez wirusa. Wartości IC50 (lub EC50), CC50 i SI50 są krytycznymi miarami pozwalającymi określić, czy związek przeciwwirusowy jest silny i selektywny do dalszego opracowywania leków.
Gdy lek przeciwwirusowy nie wykazywał jawnej toksyczności in vitro, a jednocześnie zapobiegał indukowanemu przez wirusa CPE i produktywnemu cyklowi życia wirusa, ważne jest scharakteryzowanie jego MoA2. Rozpoczęliśmy taką charakterystykę, przeprowadzając test ToA w celu określenia możliwych etapów cyklu życiowego wirusa, na który ma wpływ lek przeciwwirusowy. Ogólnie rzecz biorąc, związki przeciwwirusowe dodawano do komórek w różnym czasie przed lub po infekcji wirusowej. Gdyby leki przeciwwirusowe zostały dodane do zakażonych komórek po ich docelowym etapie w trakcie infekcji, skutkowałoby to niższą aktywnością w porównaniu z tym, który został dodany przed etapem. W związku z tym badanie ToA ma kluczowe znaczenie dla określenia skuteczności przeciwwirusowej związku i jego potencjalnego celu, zarówno w cyklu życiowym wirusa, jak i w maszynerii gospodarza zaangażowanej w cykl życia wirusa.
Dla wszystkich trzech testów, żywotność komórek została określona za pomocą zestawu KTG zgodnie z instrukcją producenta5. Ten system detekcji generuje odpowiednie sygnały luminescencyjne, które mogą być analizowane za pomocą różnych wewnętrznych programów. Każdy test został zwalidowany i przeprowadzony co najmniej w trzech egzemplarzach z ośmioma replikami. Dla wszystkich uzyskanych danych przeanalizowano trzy parametry, w tym wartość średnią (AVE), odchylenie standardowe (STDEV) i zmienność współczynnika (CV) w celu określenia wiarygodności testu. Po określeniu solidności testu, dane będą dalej analizowane i wykreślane przy użyciu różnych narzędzi biostatycznych i graficznych2.

<table><tbody><tr><td>Pożywka DMEM</td><td>Gibco</td><td>1134218</td><td>Do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>16000044</td><td>Do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>0,05% Trypsyna-EDTA</td><td>Gibco</td><td>1000185</td><td>Do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gbico</td><td>1049769</td><td>Do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Zestaw CellTiter-Glo (KTG)</td><td>Promega</td><td>TB288</td><td>Do pomiaru żywotności komórek</td></tr><tr><td>70% etanol</td><td>Fisher</td><td>S25309B</td><td>Rozcieńczony od 95%</td></tr> <tr><td>Przeciwwirusowe związki huashil</td><td>NIH MLSMR i synteza</td><td></td><td></td>de novo</tr><tr><td>BTV-10</td><td>ATCC</td><td>VR-187</td><td></td></tr><tr><td>BSR Opracowany</td><td>we własnym zakresie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>wielomodowy czytnik mikropłytek Synergy-II</td><td>BioTek</td><td></td><td>Do odczytu sygnału luminescencyjnego</td></tr><tr><td>Dozownik</td> <td>MicroFlo selectBioTek</td><td></td><td>Dodawanie komórek, wirusów i odczynników</td></tr><tr><td>384-dołkowa mikropłytka płaskodenna</td><td>CORNING</td><td>28908031</td><td>Do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Gen. 5 oprogramowanie</td><td>BioTek</td><td></td><td>Do analizy wyników odczytu z wielomodowego czytnika mikropłytek Synergy-II</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 5</td><td>GraphPad</td><td>Version 5</td><td>Do analizy biostatycznej i wykresu</td></tr></tbody></table>

testy do identyfikacji nowych leków przeciwwirusowych przeciwko wirusowi choroby niebieskiego języka

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

Aby zidentyfikować potencjalne leki przeciwwirusowe przeciwko BTV, opracowaliśmy, zoptymalizowaliśmy i zwalidowaliśmy trzy przedstawione tutaj testy. Test oparty na CPE był pierwszym testem opracowanym w celu oceny, czy związek wykazał jakąkolwiek skuteczność przeciwwirusową i został wykorzystany do badań przesiewowych dużej biblioteki związków. Tymczasem cytotoksyczność leków przeciwwirusowych można również ocenić za pomocą testu opartego na CPE. Test dawka-odpowiedź został zaprojektowany w celu określenia zakresu skuteczności wybranego leku przeciwwirusowego, tj. 50% stężenia hamującego (IC50) lub stężenia skutecznego (EC50), a także zakresu jego cytotoksyczności (CC50). Test ToA został wykorzystany we wstępnym badaniu MoA w celu określenia mechanizmu leżącego u podstaw nowych leków przeciwwirusowych podczas cyklu życia wirusa BTV lub możliwego wpływu na maszynerię komórkową gospodarza. Testy te mają zasadnicze znaczenie dla oceny skuteczności przeciwwirusowej w systemie hodowli komórkowej i zostały wykorzystane w naszych ostatnich badaniach, które doprowadziły do identyfikacji wielu nowych leków przeciwwirusowych przeciwko BTV.

1. Skuteczność przeciwwirusowa związku
Test CPE oparty na komórkach został opracowany, zoptymalizowany i zwalidowany in vitro przy użyciu zestawu KTG opartego na luminescencji do identyfikacji nowych leków przeciwwirusowych przeciwko BTV, jak opisano wcześniej2,5. Test odpowiedzi na dziesięć dawek zastosowano w celu odzwierciedlenia skuteczności przeciwwirusowej i cytotoksyczności zidentyfikowanego związku wiodącego poprzez pomiar liczby metabolicznie żywotnych komórek w hodow...

Trzy testy, w tym test oparty na działaniu cytopatycznym (CPE), test dawka-odpowiedź i test czasu dodania (ToA) zostały opracowane, zoptymalizowane, zatwierdzone i wykorzystane do identyfikacji nowych leków przeciwwirusowych przeciwko wirusowi choroby niebieskiego języka (BTV), a także do określenia możliwego mechanizmu działania (MoA) dla nowo zidentyfikowanych leków przeciwwirusowych.

Testy do identyfikacji nowych leków przeciwwirusowych przeciwko wirusowi choroby niebieskiego języka

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

Ogólnym celem tej procedury jest identyfikacja i charakterystyka małocząsteczkowych leków przeciwwirusowych przeciwko wirusowi niebieskiego języka lub BTV przy użyciu testu żywotności komórek opartego na CPE. Osiąga się to poprzez pierwsze badanie przesiewowe biblioteki związków przeciwwirusowych przy użyciu efektu cytopatycznego lub testu opartego na CPE z odczynnikiem świecenia miana komórek. Następnie potwierdza się skuteczność przeciwwirusową i ocenia się cytotoksyczność wybranych leków przeciwwirusowych za pomocą testu dawka-odpowiedź.Na koniec przeprowadza się test czasu dodawania w celu określenia możliwego etapu cyklu życia wirusa wybranych leków przeciwwirusowych, co prowadzi do możliwych mechanizmów działania. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują nowe leki przeciwwirusowe o silnym przeciwwirusowym CIE i niskiej cytotoksyczności w oparciu o test dawka-odpowiedź i test czasu dodawania. Tak więc główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak test TCI D 50 w teście płytki nazębnej, jest to, że technika ta zapewnia czułą, solidną i wysoce reprodukcyjną w mierzalnej metodzie badania przesiewowego i kategoryzacji programu antywirusowego przeciwko niektórym wirusom, w tym wirusowi glutenu, który indukuje mierzalne CP w zakażonych komórkach Przygotowując się do testu opartego na CPE z komórek BSR utrzymywanych w uzupełnionym DMEM, użyj dozownika wyboru mikroprzepływu, aby Wysiej 20 mikrolitrów komórek po 5 000 komórek na studzienkę do 384.Dobrze mikropłytka inkubuje komórki przez dwie do trzech godzin, aby mogły w pełni przylegać do płytki, a następnie dodać związki przeciwwirusowe o końcowym stężeniu 10 mikromolów do każdej studzienki i całkowicie wymieszać. Użyj pożywki testowej, aby rozcieńczyć oczyszczoną i rozmnożoną płytkę BTV do pożądanego miana i dodaj pięć mikrolitrów BTV z oznaczeniem MOI do każdej studzienki w celu kontroli. Dobrze dodaj pięć mikrolitrów pożywki testowej, włóż mokre pudełko zawierające płytkę testową do inkubatora i inkubuj zainfekowane komórki przez 72 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla i wilgotnością od 80 do 95%.Następnie wyjąć płytkę testową z inkubatora, następnie rozmrozić i zrównoważyć bufor KTG i liofilizowany substrat KTG do temperatury pokojowej. Następnie należy rozpuścić jednorodny roztwór odczynnika KTG, mieszając liofilizowany substrat enzymatyczny i odczynnik buforowy zgodnie z instrukcją producenta. Po wyrównaniu płytek testowych do temperatury pokojowej przez 15 minut, użyj dozownika, aby dodać 25 mikrolitrów odczynników KTG do każdej studzienki, inkubuj przez 15 minut w ciemności, a następnie użyj czytnika wielomodowego o czasie integracji 0,1 sekundy do pomiaru sygnałów luminescencyjnych zasiewu 5 000 komórek BSR na studzienkę w mikropłytce 384-dołkowej do testu dawka-odpowiedź przy użyciu 20 mikrolitrów do testu skuteczności przeciwwirusowej i 25 mikrolitrów do testu skuteczności przeciwwirusowej test cytotoksyczności.Po dwu-trzygodzinnej inkubacji przydzielić osiem powtórzeń dla każdego stężenia związku na test, jak pokazano tutaj. Pierwszą kolumnę należy przypisać jako kontrolę pozytywną bez dodawania związku lub wirusa, a ostatnią kolumnę jako kontrolę ujemną, dodając wirusa tylko w przypadku testu skuteczności przeciwwirusowej związki rozcieńczone do 50 mikromolów w pożywce do oznaczania, a do drugiej kolumny dodać 20 mikrolitrów na basenik. Korzystanie z ośmiokanałowej pipety półautomatycznej.Wymieszaj związek pięć razy do stężenia 25 mikromolowych. Następnie przenieść 20 mikrolitrów mieszaniny z drugiej kolumny do kolumny trzeciej i dobrze wymieszać, uzyskując stężenie 12,5 mikromola. Powtórz to dwukrotnie.Seryjne rozcieńczanie do 11. kolumny, która będzie miała końcowe stężenie 0,04 mikromola. Następnie dodać pięć mikrolitrów pożywki do kolumny pierwszej jako tylko kontrolę pozytywną komórki i pięć mikrolitrów na studzienkę BTV do kolumny 12 jako tylko zakażenie BTV. Kontrola ujemna dodać pięć mikrolitrów na studzienkę BTV od kolumny drugiej do kolumny 11 w celu oznaczenia cytotoksyczności, rozcieńczyć związek do początkowego stężenia 200 mikromolowych.Dodać 25 mikrolitrów związku na studzienkę do kolumny drugiej i wymieszać pięć razy, aby doprowadzić stężenie do 100 mikromolowych. Przeprowadzić dwukrotne rozcieńczenie seryjne, przenosząc 25 mikrolitrów z kolumny drugiej do sąsiedniej kolumny trzeciej i kontynuować przez kolumnę 12. Po wymieszaniu kolumny 12 odessać i wyrzucić 25 mikrolitrów mieszaniny.Kolumna pierwsza to jedyna komórka kontrolna zarówno dla testów przeciwwirusowych, jak i cytotoksycznych. Umieścić mokre pudełko zawierające płytkę do oznaczania w inkubatorze na 72 godziny, a następnie wyjąć płytkę. Następnie użyj zestawu CT G, aby zmierzyć żywotność komórek.Użyj oprogramowania biostatystycznego i graficznego, aby obliczyć średnią wartość, odchylenie standardowe, zmiany współczynnika i procent żywotności komórek dla każdego stężenia związku i przeprowadzić analizę regresji nieliniowej w celu określenia EC 50 i CC 50 każdego związku. Przygotuj się na czas dodawania lub testu TOA, wysiewając 5 000 komórek na studzienkę w 15 mikrolitrach w kolumnie od pierwszej do 24 z 384. Cóż, mikropłytka dla każdego związku.Wykorzystaj wszystkie 24 kolumny z ośmioma powtórzeniami dla każdego punktu czasowego. Przypisać kolumnę pierwszą jako kontrolę tylko komórek, dodając 10 mikrolitrów na studzienkę pożywki testowej oznaczyć kolumnę 24 tylko jako zakażenie BTV. Kontrola ujemna przez dodanie pięciu mikrolitrów na studzienkę pożywki testowej i pięciu mikrolitrów na studzienkę wirusa przy MOI 0,01.W końcowej objętości 25 mikrolitrów na studzienkę wybierz parzyste kolumny od drugiej do 22 jako kolumny oceny skuteczności przeciwwirusowej w różnych godzinach po zakażeniu lub HPI w tych kolumnach, zainfekuj komórki pięcioma mikrolitrami na studzienkę BTV przy MOI 0,01 przy różnych HPI, dodaj również pięć mikrolitrów na studzienkę rozcieńczonego związku o końcowej objętości 25 mikrolitrów na studzienkę dla oznaczonego minus dwa i minus jeden HPI. Dodaj związek do komórek BSR przed zakażeniem BTV dla zerowego HPI, dodaj związek i BTV do hodowli jednocześnie. Równolegle oznacz kolumny o numerach nieparzystych od trzech do 23 jako formanty tylko złożone odpowiadające różnym punktom czasu w tych kolumnach.Dodać pięć mikrolitrów na studzienkę pożywki testowej i pięć mikrolitrów na studzienkę rozcieńczonego związku w końcowej objętości 25 mikrolitrów na studzienkę. Po inkubacji komórek do 72 HPI w inkubatorze, wyjąć płytkę testową i użyć zestawu do świecenia mianem komórek w celu określenia żywotności komórek. Na koniec należy użyć oprogramowania, które przetwarza sygnały luminescencyjne uzyskane za pośrednictwem czytnika wielomodowego, aby określić wartość średnią.S-T-D-E-V CV i procent żywotności komórek ochronnych dla każdego leczenia przy użyciu testu CPE do ilościowego określenia komórkowego TP A w żywych komórkach, wcześniej zidentyfikowaliśmy kilka obiecujących związków wiodących o silnej skuteczności przeciwwirusowej, niskiej toksyczności i wysokiej selektywności. Na przykład ustalono, że związek 0 5 2 ma EC 50 0,27 plus minus 0,12 mikromola i CC 50 82,69 mikromola, oba wykazujące typowe krzywe regresywne. W ramach analizy regresji nieliniowej stwierdzono, że SI 50 C 0 5 2 306 na podstawie jego wartości EC 50 i CC 50 skuteczność przeciwwirusowa w skali nanomolowej, niska toksyczność, a co za tym idzie wysoka SI 50 wskazują, że C 0 5 2 może być silnym i selektywnym lekiem przeciwwirusowym przeciwko BTV, jak widać tutaj, komórki zostały zakażone BTV przy MOI 0,01 w obecności 10 różnych stężeń C 0, 5, 2, a żywotność komórek określono przy 72 HPI.Korzystając z zestawu KTG, każdy punkt danych reprezentuje średnie i SD z pięciu powtórzeń. Test TOA wykorzystano do określenia możliwych etapów cyklu życiowego wirusa, do którego ukierunkowane są związki. Po dodaniu C 0 5 2 na jedną lub dwie godziny przed zakażeniem BTV, skuteczność przeciwwirusowa utrzymywała się na poziomie nanomolowym, jak pokazano na tym rysunku.Ponadto żywotność komórek zmniejszyła się jeszcze bardziej, gdy C 0 5 2 został dodany przy 32 i 48 HPI, co wskazuje, że C 0 5 2 może działać poza wczesnym etapem cyklu życia wirusa, takim jak wnikanie wirusa. Ponieważ pierwszy cykl replikacji wirusa BTV jest zwykle zakończony w zakażonych komórkach w ciągu 24 HPI, nasze wyniki sugerują, że C 0 5 2 może działać na późnych etapach cyklu życiowego wirusa BTV, takich jak replikacja, pakowanie, dojrzewanie i wyjście wirusa. Tymczasem możliwe jest również, że C 0 5 2 działa na maszynerię komórkową gospodarza, która funkcjonuje na późniejszych etapach cyklu życia wirusa.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykorzystać najlepszy esej CPE do identyfikacji i kategoryzacji potencjalnego programu antywirusowego przeciwko wirusom, które wywołują mierzalne CPE po infekcji.

assays-for-identification-novel-antivirals-against-bluetongue

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opracowano prostą metodę slot blot do ilościowego oznaczania hemaglutyniny i neuraminidazy wirusa grypy przy użyciu uniwersalnych przeciwciał skierowanych przeciwko ich najbardziej konserwatywnym sekwencjom, zidentyfikowanym za pomocą analiz bioinformatycznych. To innowacyjne podejście może stanowić przydatną alternatywę dla ilościowego określania wszystkich hemaglutynin i neuraminidaz wirusowych.

Analizy ilościowe wszystkich hemaglutynin i neuraminidaz wirusa grypy typu A z wykorzystaniem uniwersalnych przeciwciał w prostych testach slot blot

Tutaj prezentujemy protokół, który bada konkretne etapy wejścia wirusa w celu identyfikacji i oceny nowych środków przeciwwirusowych.

Testy wczesnego wnikania wirusa w celu identyfikacji i oceny związków przeciwwirusowych

Tutaj prezentujemy protokoły identyfikacji 1) kodowanych przez wirusa immunomodulatorów, które promują replikację arbowirusa i 2) eukariotycznych czynników gospodarza, które ograniczają replikację arbowirusa. Te metody oparte na fluorescencji i luminescencji pozwalają naukowcom szybko uzyskać ilościowe odczyty replikacji arbowirusa w uproszczonych testach o niskim stosunku sygnału do szumu.

Zakażenia arbowirusem jako narzędzia przesiewowe do identyfikacji immunomodulatorów wirusa i czynników przeciwwirusowych gospodarza

Ten protokół wprowadza standardową procedurę laboratoryjną do testowania diagnostycznego antygenów wirusa lyssa u nietoperzy na Tajwanie.

Standardowa procedura operacyjna nadzoru populacji nietoperzy na Tajwanie pod kątem wirusa Lyssa

Reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją w pan-lyssavirus została opracowana w celu wykrywania wszystkich znanych lyssawirusów. Walidacja z wykorzystaniem próbek mózgu różnych gatunków zwierząt pod kątem wścieklizny wykazała, że metoda ta ma czułość i swoistość równoważną złotemu standardowi testu na przeciwciała fluorescencyjne i może być stosowana do rutynowej diagnostyki wścieklizny.

Ocena uniwersalnej zagnieżdżonej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją w celu wykrycia lyssawirusów

Tutaj opisujemy pośrednie wychwytywanie immunologiczne metodą ELISA w celu określenia zawartości immunogennej glikoproteiny w szczepionkach przeciwko wściekliźnie. Ten test wykorzystuje neutralizujące przeciwciało monoklonalne (mAb-D1) rozpoznające trimery glikoproteiny. Jest to alternatywa dla testu NIH in vivo w celu śledzenia spójności siły działania szczepionki podczas produkcji.

Test ELISA in vitro do oceny siły działania szczepionki przeciwko wściekliźnie

Ten RT-PCR w czasie rzeczywistym wykorzystujący barwnik interkalacyjny dsDNA jest odpowiedni do diagnozowania infekcji wirusem lyssa. Metoda rozpoczyna się od ekstrakcji RNA z próbek przedubojowych lub pośmiertnych z podejrzeniem wścieklizny, szczegółowo opisując przygotowanie mieszanki wzorcowej, dodanie RNA, ustawienie maszyny w czasie rzeczywistym i prawidłową interpretację wyników.

Pan-lyssavirus RT-PCR w czasie rzeczywistym do diagnozowania wścieklizny

Celem protokołu jest zilustrowanie różnych testów związanych z wnikaniem wirusa, które mogą być użyte do identyfikacji potencjalnych inhibitorów wnikania wirusa.

Wykorzystanie testów wnikania wirusa i molekularnej analizy dokowania do identyfikacji kandydatów na leki przeciwwirusowe przeciwko wirusowi Coxsackie A16

Przedstawiamy kompletny protokół do pośmiertnej diagnozy wścieklizny zwierząt w warunkach polowych przy użyciu szybkiego immunochromatograficznego testu diagnostycznego (RIDT), od pobrania próbki z biopsji mózgu do ostatecznej interpretacji. Opisujemy również dalsze zastosowania urządzenia do analizy molekularnej i genotypowania wirusów.

Terenowy pośmiertny szybki immunochromatograficzny test diagnostyczny wścieklizny do zastosowań o ograniczonych zasobach z dalszymi zastosowaniami molekularnymi

W tej pracy opisujemy protokoły używane w testach opartych na replikonie i enzymach wirusowych do badań przesiewowych na obecność inhibitorów replikacji wirusa Zika w formacie wysokoprzepustowych.

Wysokoprzepustowe testy przeciwwirusowe do badań przesiewowych w kierunku inhibitorów replikacji wirusa Zika

Niniejszy artykuł opisuje metodologię generowania cząstek pseudotypowanych przez SARS-CoV-2 przy użyciu systemu raportującego lucyferazę oraz jej zastosowanie do identyfikacji inhibitorów wejścia. Protokoły te zostały zademonstrowane przy użyciu dwóch różnych inhibitorów wejścia: rekombinowanego ludzkiego białka fuzyjnego ACE2-Fc oraz małopąsteczkowego związku arbidolu.

Procedury identyfikacji inhibitorów wejścia SARS-CoV-2 jako potencjalnych leków przeciwwirusowych przy użyciu pseudowirusów opartych na MLV

Poznaj metody identyfikacji nowych leków przeciwwirusowych przeciwko wirusowi choroby niebieskiego języka (BTV) przy użyciu testów CPE, analizy dawkowo-odpowiedzi i ToA. Odkryj skuteczne związki o niskiej cytotoksyczności.

Testy do identyfikacji nowych leków przeciwwirusowych przeciwko wirusowi choroby niebieskiego języka

Przeglądaj więcej filmów