In vitro Test do oceny wpływu szlaków immunoregulacyjnych na funkcję efektora limfocytów T CD4 specyficznych dla HIV

Ogólnym celem tej procedury jest analiza wydzielania cytokin, transkrypcji i morfologicznego wpływu stymulowanych limfocytów T. Po pierwsze, użyj gradientu wywołania FI, aby wyizolować obwodowe CD osiem zubożonych komórek jednojądrzastych krwi od osób zakażonych wirusem HIV, inkubować komórki z kontrolą izotypu lub przeciwciałem blokującym, które jest przedmiotem zainteresowania. Następnie stymuluj komórki interesującym je antygenem.

Następnie odwirować hodowle komórkowe w celu zebrania supernatantów do pomiarów cytokin i granulek komórkowych do analizy fenotypowej lub analizy transkrypcyjnej, jeśli jest to pożądane. Dostosuj ten protokół, aby uwzględnić sortowanie poszczególnych typów komórek według wyników cytometrii przepływowej dotyczących wydzielania cytokin. Analiza fenotypowa lub transkrypcyjna może wykazać wpływ blokady szlaków hamujących przez przeciwciała na przywrócenie funkcji efektorowej specyficznych dla HIV limfocytów T CD 4.

Ten test in vitro może być skutecznie wykorzystany do ilościowego określenia poziomów cytokin przywróconych przez blokadę szlaków hamujących, do zbadania szerokiego panelu cząsteczek efektorowych, a także do oceny wpływu cytokin wytwarzanych przez C specyficzne dla HIV dla limfocytów T na inne podzbiory komórek. Megan Hart, technik badawczy z naszego laboratorium, zademonstruje teraz tę procedurę, Zuboż osiem dodatnich limfocytów T CD, dodając ludzki koktajl zubożenia CD osiem dodatnich w 50 mikrolitrach na mililitr krwi pełnej, dobrze wymieszaj i inkubuj przez 20 minut. W temperaturze pokojowej wymieszaj pełną krew z buforem Hanka.

Teraz ostrożnie ułóż krew na opakowaniu histo, a następnie odwiruj gradient przy 540 RCF przez 30 minut. Zbierz warstwę komórek jednojądrzastych krwi obwodowej. Przenieś ogniwa do nowej stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów i umyj dwukrotnie 45 mililitrami kompletnego RPMI 1640.

Ponownie zawieś umyte ogniwa w pełnym RPMI 1640. Następnie porcjować 500 mikrolitrów zawiesiny komórek na rurkę faksową. W zależności od badanego szlaku dodać przeciwciała blokujące.

Dodaj również kontrolki izotypu do odpowiednich probówek. Inkubować komórki przez 15 minut w inkubatorze do hodowli komórkowych. Następnie stymuluj komórki za pomocą puli peptydów HIV One Gag.

Uwzględnij również kontrolę braku stymulacji dla każdego warunku blokowania. Kontynuuj hodowlę komórek przez 48 godzin. Osadzaj komórki przez odwirowanie, a następnie bez naruszania osadu.

Przenieś dwukrotnie 225 mikrolitrów supernatantu do probówek EOR, aby matryce prędkości lumineksu dezaktywowały wirusa przy 25 mikrolitrach 0,5% PBS tween. Następnie zmierz pożądane stężenia cytokin za pomocą zestawu Millipore luminex zgodnie z protokołem producenta. Po umyciu komórek w trzech mililitrach barwnika PBS w celu zapewnienia żywotności, a następnie ponownie zawieś komórki w 100 mikrolitrach PBS zawierających 1% FBS w przypadku barwienia monocytów lub innych komórek prezentujących antygen w 1,4 mikrolitra wiru odczynnika blokującego FCR do wymieszania i inkubacji przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnie dodaj wir przeciwciał powierzchniowych i inkubuj przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności. Po jednym praniu w 200 mikrolitrach 4% para formaldehydu i inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut w ciemności. Po jednym praniu zawieszamy komórki w 250 mikrolitrach 1% FBS do analizy na wielolaserowym cytometrze przepływowym do ilościowego licytu R-T-P-C-R komórek w 300 mikrolitrach buforu kyogen, RLT zawierającego 1% izolatu etanolu keto Beamer RNA, przy użyciu zestawu do izolacji RNA zgodnie z protokołem producenta.

Teraz zsyntetyzuj CD NA z RNA za pomocą zestawu do syntezy CD NA i postępując zgodnie z protokołem producenta. Następnie utwórz mieszankę starterów dla każdego startera, w tym genów porządkowania, dodając startery do wody wolnej od nukleazy i trzymaj na lodzie. Do każdej głównej mieszanki amplifikacji dodaj 10,5 mikrolitra wody wolnej od nukleaz, 12,5 mikrolitra cyber green i jeden mikrolitr mieszanki startera na płytkę.

Cóż, teraz odpipetuj 24 mikrolitry wzorca do każdej reakcji. Cóż, dodaj również jeden mikrolitr CD NA do każdego, dobrze zgodnie z szablonem. Zakryj studzienki i odwiruj płytkę przez trzy minuty przy 1500 RCF.

Następnie uruchom płytkę na maszynie QRT PCR R w celu barwienia powierzchni komórek. Dodaj barwienia feldena i moniny na około sześć godzin przed barwieniem cytokin wewnątrzkomórkowych. Następnie umyj komórki 1% FBS w PBS i wybarwij cytokiny wewnątrzkomórkowe za pomocą zestawu roztworu do utrwalania przenikania i protokołu po umyciu komórek.

Po zawieszeniu granulek w 250 mikrolitrach 1% FBS, uruchom próbki na wielolaserowym cytometrze przepływowym 16 godzin po stymulacji barwienia pod kątem żywotności, używając zestawu żywych martwych, naprawialnych barwników martwych komórek. Zgodnie z protokołem producenta, po jednym praniu PBS, zawieszamy komórki w 100 mikrolitrach 1%FBS na powierzchni wiru przeciwciał, aby wymieszać i inkubować komórki na lodzie w ciemności przez 20 minut. Umyj ogniwa raz i zawieś je w 500 mikrolitrach zimnego uzupełnionego RPMI 1640.

Następnie media filtrują komórki przez nasadkę sitka do pięciomililitrowej rurki z okrągłym dnem z polistyrenu. Następnie po 200 mikrolitrach uzupełnionej pożywki RPMI 1640 do każdej probówki zbiorczej. Trzymanie wszystkich probówek na lodzie podczas sortowania na żywo, sortowanie interesujących podzbiorów komórek na instrumencie znajdującym się w obiekcie wyposażonym w hodowlę materiałów niebezpiecznych biologicznie.

Posortowane komórki przez żądany czas. Po analizie analiz luminex i PCR w tym eksperymencie, stymulacja PBMC CD osiem zubożoną pulą peptydów HIV V jeden gag powoduje medianę 800-krotnego wzrostu produkcji interferonu gamma. Poziom transkryptów interferonu gamma zwiększył się średnio dziesięciokrotnie po stymulacji.

W tym przypadku analiza in vitro funkcji komórek T CD four specyficznych dla HIV wskazuje na silną korelację między wydzielaniem białka interferonu gamma a poziomami mRNA interferonu gamma. Co ciekawe, stymulacja przez pulę peptydów HIV gag powoduje większe wydzielanie interferonu gamma niż antygeny bakteryjne tężca. Dalsze wyniki toksoidu z wydzielaniem IL 13 wskazują na różne profile cytokin odpowiedzi limfocytów T CD specyficznych dla HIV i tężca.

Blokada jednego szlaku PD na ogół nie ma znaczącego wpływu na wydzielanie cytokin bez stymulacji antygenem, ale zwiększa wydzielanie interferonu gamma i IL 2. Kiedy komórki są stymulowane wirusem HIV, gromadzi się jeden peptyd gag. Kiedy komórki CD 3 są wyczerpane z pbmc, nie ma interferonu gamma ani IL 2 wytwarzanego w odpowiedzi na stymulację antygenem.

Dane te wskazują, że wydzielanie interferonu gamma i IL 2 jest indukowane w odpowiedzi na specyficzną dla HIV stymulację limfocytów T CD four i antygenu. W tym eksperymencie wykorzystano zademonstrowany przepływ pracy przy użyciu posortowanych faktów limfocytów T CD czterech w celu zbadania wpływu pierwszej blokady PD na interferon gamma i IL 2. Kluczową zaletą tej metody jest możliwość oceny, w jaki sposób cząsteczki immunoregulacyjne regulują wzajemne oddziaływanie specyficznych dla wirusa HIV limfocytów T CD 4 z komórkami prezentującymi antygen.

W tym przypadku protokół został dostosowany do wykonywania wewnątrzkomórkowego barwienia cytokinami po 48 godzinach od stymulacji. Wyniki pokazują, że monocyty są głównym źródłem IL 12 po stymulacji pulami peptydów HIV One Gag. To eksperymentalne podejście in vitro umożliwia naukowcom zajmującym się immunologią komórek T zbadanie wpływu szlaków immunoregulacyjnych na regulację efektywnej funkcji limfocytów Addisona w próbkach ludzkich.