Name: In vitro Test do oceny wpływu szlaków immunoregulacyjnych na funkcję efektora limfocytów T CD4 specyficznych dla HIV (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-15T17:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Poznaj metodę in vitro do badania wpływu szlaków immunoregulacyjnych na funkcję limfocytów T CD4 specyficznych dla HIV. Technika obejmuje izolację komórek mononuklearnych krwi obwodowej i blokadę przeciwciałami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Gordonowi Freemanowi za dostarczenie przeciwciała blokującego anty-PD-L1. Dziękujemy personelowi klinicznemu i laboratoryjnemu Massachusetts General Hospital oraz wszystkim uczestnikom badania za ich nieocenioną rolę w tym projekcie.
To badanie było wspierane przez Narodowy Instytut Alergii i Chorób Zakaźnych Narodowych Instytutów Zdrowia (PO1 AI-080192; D.E.K), National Heart, Lung and Blood Institute of the National Institutes of Health (RO1 HL-092565; D.E.K.). D.E.K jest wspierany przez Research Scholar Career Award przyznawaną przez Quebec Health Research Fund (FRQS). FP jest wspierany przez grant stypendialny Komitetu Wykonawczego ds. Badań Massachusetts General Hospital oraz Harvard Global Health Institute (HGHI).

1. Zubożenie i izolacja PBMC poprzez separację Ficoll
<ol>
	<li>Zuboż limfocyty T CD8 +, dodając ludzki koktajl zubożenia CD8 + w 50 μl / ml pełnej krwi.</li>
	<li>Dobrze wymieszać i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej (18-25 °C).</li>
	<li>Po inkubacji wymieszaj krew pełną z HBSS (Zbilansowany roztwór soli Hanka bez Ca2+ lub Mg2+) i nałóż warstwę na histopakę. Kręć z prędkością 340 rcf przez 30 minut (bez hamulca, powolne przyspieszanie).</li>
	<li>Zbierz PBMC i przenieś do nowego stożka o pojemności 50 ml. Przemyć 2x 45 ml RPMI 1640 uzupełnionym 50 IU penicyliny, 50 μg/ml streptomycyny, 2 mM L-glutaminy i 1% HEPES, wirując przez 10 minut przy 340 rcf.</li>
</ol>
2. Blokada przeciwciał i specyficzna dla antygenu stymulacja komórek
<ol>
	<li>Ponownie zawieś komórki w 2x106 na warunek w RPMI 1640 zawierającym 10% ludzkiej surowicy uzupełnionej 50 IU penicyliny, 50 μg/ml streptomycyny, 2 mM L-glutaminy i 1% HEPES, co daje 500 μl na stan.</li>
	<li>Podwielokrotność 500 μl zawiesiny komórek na probówkę FACS.</li>
	<li>W zależności od badanego szlaku dodać przeciwciała blokujące PD-L1, IL-10Rα i/lub kontrole izotypu w stężeniu 10 μg/ml i inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
	<li>Stymuluj komórki za pomocą puli peptydów HIV-1 Gag o końcowym stężeniu 1 μg/ml/peptyd. Uwzględnij również kontrolę "bez stymulacji" dla każdego warunku blokowania. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 48 godzin.</li>
</ol>
3. Zbieranie i analiza supernatantu
<ol>
	<li>Po 48 godzinach odwiruj rurki FACS przez 7 minut przy 340 rcf.</li>
	<li>Ostrożnie zebrać 2 x 225 μl supernatantu w probówkach Eppendorf do układów kulek Luminex, nie naruszając przy tym osadu.</li>
	<li>Inaktywować wirusa w pobranym supernatancie za pomocą 25 μl 0,5% PBS-Tween, aby uzyskać końcowe stężenie 0,05% PBS-Tween.</li>
	<li>Zebrane supernatanty należy przechowywać w zamrażarce o temperaturze -80 °C, które nie są natychmiast używane.</li>
	<li>Zmierz pożądane stężenia cytokin za pomocą zestawu Millipore Luminex zgodnie z protokołem producenta.</li>
</ol>
4. Pobieranie i analiza fenotypowa komórek za pomocą cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Po zebraniu supernatantu umyj komórki w 3ml PBS. Wiruj komórki przez 7 minut przy 340 rcf i zdekantuj nadmiar prania.</li>
	<li>Barwienie pod kątem żywotności za pomocą zestawu LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Myć komórki w PBS przez 7 minut w temperaturze 340 rcf i w temperaturze 4 °C. Zawiesić ponownie w 100 μl PBS 1% FBS.</li>
	<li>W przypadku barwienia w poszukiwaniu monocytów lub innych komórek prezentujących antygen, zablokuj receptory Fc, dodając 1,4 μl odczynnika blokującego FcR i wir do mieszania.</li>
	<li>Inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Dodać przeciwciała powierzchniowe, odwirować i inkubować przez 20 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.</li>
	<li>Umyj komórki PBS 1% FBS, zdekantuj nadmiar prania i dodaj 200 μl 4% paraformaldehydu. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut w ciemności.</li>
	<li>Przemyć komórki PBS 1% FBS, ponownie zawiesić w 250 μl PBS 1% FBS i pobrać na wielolaserowym cytometrze przepływowym (np. BD LSRII lub Fortessa).</li>
</ol>
5. Analiza komórek za pomocą qRT-PCR
<ol>
	<li>W przypadku komórek, które nie były analizowane za pomocą cytometrii przepływowej: po zebraniu supernatantu komórki należy poddać lizie komórki w 300 μl buforu Qiagen RLT zawierającego 1% beta-merkaptoetanolu. Jeśli protokół nie będzie kontynuowany, komórki można zamrozić w temperaturze -80 °C po tym punkcie.</li>
	<li>Wyizoluj RNA za pomocą zestawu do izolacji RNA zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Zsyntetyzuj cDNA z RNA za pomocą zestawu do syntezy cDNA zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Wykonaj ilościowy PCR przy użyciu technologii SYBR Green.</li>
	<li>Stwórz mieszankę starterów dla każdego użytego startera, w tym geny porządkowe (np. IL-13, IL-10, IFN-γ, GAPDH), dodając startery do wody wolnej od nukleaz, aby uzyskać końcowe stężenie 10 μM. Trzymaj na lodzie.</li>
	<li>Utwórz mieszankę wzorcową dla każdego podkładu, dodając 10,5 μl wody wolnej od nukleaz, 12,5 μl zieleni SYBR i 1 μl mieszanki startera na dołek na płytkę. Trzymaj na lodzie.</li>
	<li>Odpipetować 24 μl mieszanki wzorcowej do każdego dołka płytki, która będzie używana.</li>
	<li>Dodaj 1 μl cDNA do każdej studzienki zgodnie z szablonem.</li>
	<li>Zakryj studzienki i płytkę wirówkową przez 3 minuty przy 800 rcf.</li>
	<li>Uruchomić płytkę na maszynie qRT-PCR, np. instrumencie Stratagene MX3005P.</li>
</ol>
6. Adaptacja do wewnątrzkomórkowego barwienia cytokin po 48 godzinach
Dodaj Brefeldin i Monensin 6 godzin przed wewnątrzkomórkowym barwieniem cytokin. Brefeldin dodaje się w stężeniu 10 μg/ml, natomiast Monenzynę dodaje się zgodnie z instrukcjami producenta. Dla wygody Brefeldin można dodać 12 godzin przed barwieniem w stężeniu 5 μg/ml.
<ol>
	<li>Po zabarwieniu powierzchni umyj komórki PBS 1% FBS i wybarwić cytokiny wewnątrzkomórkowe, takie jak IL-12, IFN-γ i TNF-α za pomocą zestawu i protokołu roztworu do utrwalania/przepuszczalności.</li>
	<li>Umyć komórki, ponownie zawiesić w 250 μl PBS 1% FBS i uruchomić na wielolaserowym cytometrze przepływowym (np. BD LSR II lub Fortessa).</li>
</ol>
7. Adaptacja do sortowania komórek
<ol>
	<li>16 godzin po stymulacji, zabarwić pod kątem żywotności za pomocą zestawu LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit zgodnie z protokołem producenta. Utrzymuj komórki na lodzie podczas całej procedury.</li>
	<li>Myć komórki PBS przez 7 minut w temperaturze 340 rcf i w temperaturze 4 °C. Zawiesić ponownie w 100 μl PBS 1% FBS.</li>
	<li>Dodaj przeciwciała powierzchniowe, wiruj do wymieszania i inkubuj komórki na lodzie w ciemności przez 20 minut.</li>
	<li>Umyj komórki PBS 1% FBS w temperaturze 340 rcf i w temperaturze 4 °C i ponownie zawieś w 500 μl zimnego RPMI 1640 zawierającego 10% płodowej surowicy bydlęcej uzupełnionej 50 IU penicyliny, 50 μg/ml Streptomycyny, 2 mM L-glutaminy i 1% HEPES.</li>
	<li>Przefiltruj komórki za pomocą 5 ml polistyrenowej probówki z okrągłym dnem z nasadką sitkową</li>.
	<li>Przygotuj probówki do sortowania, dodając do każdej probówki 200 μl RPMI 1640 zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej uzupełnionej 50 j.m. penicyliny, 50 μg/ml streptomycyny, 2 mM L-glutaminy i 1% HEPES. Podczas sortowania utrzymuj wszystkie probówki na lodzie.</li>
	<li>Sortowanie na żywo interesujących nas podzbiorów komórek na urządzeniu (np. BD FACS Aria II) znajdującym się w obiekcie wyposażonym w materiały niebezpieczne biologicznie.</li>
	<li>Po posortowaniu komórek umieść je z powrotem w inkubatorze na żądany czas, a następnie wykonaj pobieranie supernatantu/analizę Luminex i zbieranie osadów komórkowych/analizę PCR.</li>
</ol>

<ol><li>Zajac, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+immune+evasion+due+to+persistence+of+activated+T+cells+without+effector+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Viral immune evasion due to persistence of activated T cells without effector function.</a> J. Exp. Med. 188, 2205-2213 (1998).</li>
<li>Wherry, E. J., Blattman, J. N., Murali-Krishna, K., vander Most, R., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+persistence+alters+CD8+T-cell+immunodominance+and+tissue+distribution+and+results+in+distinct+stages+of+functional+impairment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Viral persistence alters CD8 T-cell immunodominance and tissue distribution and results in distinct stages of functional impairment.</a> J. Virol. 77, 4911-4927 (2003).</li>
<li>Kwon, D. S., Kaufmann, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+and+detrimental+roles+of+IL-10+in+HIV+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Cytokine+Netw%22%5BJournal%5D)">Protective and detrimental roles of IL-10 in HIV pathogenesis.</a> Eur. Cytokine Netw. 21, 208-214 (2010).</li>
<li>Porichis, F., Kaufmann, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+PD-1+in+HIV+pathogenesis+and+as+target+for+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+HIV%2FAIDS+Rep%22%5BJournal%5D)">Role of PD-1 in HIV pathogenesis and as target for therapy.</a> Curr. HIV/AIDS Rep. 9, 81-90 (2012).</li>
<li>Wherry, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+exhaustion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat%22%5BJournal%5D)">T cell exhaustion.</a> Nat. 12, 492-499 (2011).</li>
<li>Trautmann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upregulation+of+PD-1+expression+on+HIV-specific+CD8%2B+T+cells+leads+to+reversible+immune+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Upregulation of PD-1 expression on HIV-specific CD8+ T cells leads to reversible immune dysfunction.</a> Nat. Med. 12, 1198-1202 (2006).</li>
<li>Day, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1+expression+on+HIV-specific+T+cells+is+associated+with+T-cell+exhaustion+and+disease+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">PD-1 expression on HIV-specific T cells is associated with T-cell exhaustion and disease progression.</a> Nature. 443, 350-354 (2006).</li>
<li>Brockman, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-10+is+up-regulated+in+multiple+cell+types+during+viremic+HIV+infection+and+reversibly+inhibits+virus-specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">IL-10 is up-regulated in multiple cell types during viremic HIV infection and reversibly inhibits virus-specific T cells.</a> Blood. 114, 346-356 (2009).</li>
<li>Barber, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoring+function+in+exhausted+CD8+T+cells+during+chronic+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronic viral infection.</a> Nature. 439, 682-687 (2006).</li>
<li>Zhang, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1+up-regulation+is+correlated+with+HIV-specific+memory+CD8%2B+T-cell+exhaustion+in+typical+progressors+but+not+in+long-term+nonprogressors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">PD-1 up-regulation is correlated with HIV-specific memory CD8+ T-cell exhaustion in typical progressors but not in long-term nonprogressors.</a> Blood. 109, 4671-4678 (2007).</li>
<li>Ndhlovu, Z. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-dimensional+immunomonitoring+models+of+HIV-1-specific+CD8+T-cell+responses+accurately+identify+subjects+achieving+spontaneous+viral+control%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">High-dimensional immunomonitoring models of HIV-1-specific CD8 T-cell responses accurately identify subjects achieving spontaneous viral control.</a> Blood. 121, 801-811 (2013).</li>
<li>Porichis, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responsiveness+of+HIV-specific+CD4+T+cells+to+PD-1+blockade%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Responsiveness of HIV-specific CD4 T cells to PD-1 blockade.</a> Blood. 118, 965-974 (2011).</li>
<li>Kwon, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+CD25%2B+regulatory+T+cells+impair+HIV-1-specific+CD4+T+cell+responses+by+upregulating+interleukin-10+production+in+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">CD4+ CD25+ regulatory T cells impair HIV-1-specific CD4 T cell responses by upregulating interleukin-10 production in monocytes.</a> 86, 6586-6594 (2012).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Kolekcja Supernatant jest nieodzowną częścią tego eksperymentalnego projektu. Podczas zbierania supernatantów do testu Luminex wytwarzano podwielokrotności i utrzymywano je w temperaturze -80 °C, aby zapobiec degradacji białek w wyniku cykli zamrażania i rozmrażania. Zamrażanie i rozmrażanie może być trudnymi procesami dla białek, a minimalizując zamrażanie i rozmrażanie, sygnał zostanie zmaksymalizowany w testach. Dlatego łatwiej jest uzyskać powtarzalne i dokładniejsze dane podczas pracy z podwielokrotnościami, które z...

Podczas uporczywych infekcji wirusowych, specyficzne dla wirusa komórki T nabywają funkcjonalne defekty w procesie znanym jako wyczerpanie limfocytów T. Wczesne badania in vivo na mysim modelu LCMV przewlekłej infekcji wirusowej wykazały, że wyczerpane limfocyty T specyficzne dla wirusa mają zmniejszoną funkcję cytolityczną wobec komórek zakażonych wirusem, tracą zdolność do proliferacji i mają zmniejszoną zdolność do wytwarzania cytokin, takich jak IL-2, TNF-α i IFN-γ1,2. Złożona sieć szlaków immunoregulacyjnych, takich jak PD-1 i IL-10, jest regulowana w górę podczas przewlekłych infekcji i przyczynia się do dysfunkcji limfocytów T (przegląd w3,4). Podanie in vivo przeciwciał blokujących przeciwko tym szlakom hamującym w mysim modelu LCMV przywróciło funkcję wyczerpanych limfocytów T specyficznych dla wirusa i zwiększyło klirens wirusa, co wskazuje, że wyczerpanie limfocytów T jest zjawiskiem częściowo odwracalnym (przegląd w 5).
Wyniki modelu LCMV zostały szybko rozszerzone na przewlekłe infekcje wirusowe u ludzi, takie jak HBV, HCV i HIV5. W przewlekłym zakażeniu HIV-1 szlaki PD-1 i IL-10 są regulowane w górę u osób zakażonych i korelują z parametrami progresji choroby, bezpośrednio z wiremią i odwrotnie z liczbą CD46-8. Blokada przeciwciał szlaków PD-1 lub IL-10 in vitro przywróciła proliferację limfocytów T CD4 i CD8 specyficznych dla HIV, co wskazuje, że podobnie jak w modelu mysim LCMV, wyczerpanie limfocytów T u ludzi jest zjawiskiem częściowo odwracalnym. Jednak ze względu na delikatny charakter eksperymentów na próbkach ludzkich, a także ograniczenia w czułości testów in vitro, uderzający jest brak dokładnych badań profili odbudowy funkcjonalnej osiągniętych dzięki tym interwencjom. Testy proliferacji były do tej pory jedynymi wiarygodnymi testami in vitro testowanymi w większości badań, jednak istnieje znaczący brak dowodów na wpływ tych interwencji na: 1) zdolność zabijania cytotoksycznych limfocytów T, 2) przeciwwirusowe działanie limfocytów T na replikację wirusa, 3) profil wydzielania cytokin i 4) wpływ na pomoc limfocytów T CD4 na inne podzbiory komórek.
Wewnątrzkomórkowe barwienie cytokin (ICS) jest bardzo użytecznym i szeroko stosowanym testem opartym na cytometrii przepływowej, który służy do wykrywania produkcji cytokin w różnych typach komórek zarówno u myszy, jak i u ludzi. Został również wykorzystany do zbadania wpływu blokady przeciwciał na szlaki hamujące. W testach ICS wydzielanie cytokin jest blokowane przez dodanie Brefeldiny i (lub) Monenzyny. Cytokiny uwięzione w komórkach są następnie wykrywane za pomocą przeciwciał fluorescencyjnych za pomocą polichromatycznej cytometrii przepływowej. Czas trwania testu jest zwykle ograniczony do 6 lub 12 godzin po stymulacji antygenem, ponieważ zarówno Brefeldin, jak i Monensin, które są zwykle dodawane w ciągu 2 godzin od dodania antygenu, są toksyczne dla komórek. Test ICS jest potężną techniką, która okazała się przydatna w badaniu wpływu podawania in vivo na interwencję przeciwciał blokujących u myszy, u których komórki zostały wyekstrahowane po pewnym czasie po ekspozycji na przeciwciała9. Istnieje jednak kilka ograniczeń w stosowaniu tego eksperymentalnego podejścia do oceny wpływu blokady receptorów hamujących w próbkach ludzkich. Podczas wykonywania interwencji przeciwciałami szlaków hamujących w 6 lub 12-godzinnej stymulacji in vitro (zwykle w przypadku próbek ludzkich), blokada receptorów hamujących w większości przypadków nie zmienia częstotliwości odpowiedzi limfocytów T specyficznych dla antygenu, mierzonej za pomocą standardowych testów ICS6, 7 . Pomiary produkcji cytokin na komórkę mierzone średnią lub medianą intensywności fluorescencji dały niespójne wyniki6, 7, 10. Z drugiej strony, gdy ICS jest wykonywany w późnym punkcie czasowym po stymulacji (tj. sześć dni), można zaobserwować zmiany w liczbie komórek wydzielających cytokiny. Różnice są połączonym efektem zmienionej proliferacji, przeżycia i zmian w funkcji efektora, które kumulują się w określonym czasie6. Jednym ze sposobów częściowego przezwyciężenia tych ograniczeń jest inkubacja przez dłuższy czas (np. 36 godzin, 60 godzin itp.) z antygenem przed dodaniem blokera wydzielania cytokin bez czekania na proliferację. Z powodzeniem zastosowaliśmy tę metodę do określenia kinetyki wydzielania cytokin przez specyficzne dla HIV limfocyty T CD4 i CD811,12; Jednak takie podejście nie jest w stanie wykryć małych odpowiedzi i nie da zintegrowanego wyniku całkowitego wydzielania cytokin występującego od czasu stymulacji. W związku z tym ICS nie jest wystarczająco czułą metodą do wykrywania wpływu blokady szlaków hamujących na ilość cytokin wytwarzanych przez aktywowane limfocyty T w porównaniu z kwantyfikacją mRNA cytokin lub pomiarami wydzielania cytokin w supernatancie w tych samych punktach czasowych. Ponadto większość cytokin wytwarzanych przez aktywowane limfocyty T działa w sposób autokrynny, przyczyniając się do pętli dodatniego lub ujemnego sprzężenia zwrotnego poprzez interakcję z komórkami prezentującymi antygen. Dlatego dodanie Brefeldyny lub Monenzyny podczas testu ICS zapobiega wydzielaniu cytokin, a tym samym stymulacja limfocytów T nie jest optymalna. Wreszcie, wykrywanie wielu cytokin za pomocą ICS jest ograniczone dostępnością i czułością przeciwciał do wykrywania cytokin za pomocą cytometrii przepływowej, a także ograniczeniami liczby fluorochromów, które mogą być używane jednocześnie w danym panelu.
Opracowaliśmy bardzo czułe eksperymentalne podejście in vitro, aby ocenić wpływ szlaków immunoregulacyjnych na regulację wydzielania cytokin przez limfocyty T CD4 specyficzne dla HIV, a następnie pomoc CD4 w komórkach prezentujących antygen (APC) i komórkach NK (komórki NK). Metoda ta może być również stosowana do oceny wpływu blokady cząsteczek hamujących na funkcję limfocytów T CD8 poprzez zubożenie limfocytów T CD4 z PBMC lub poprzez stymulację optymalnymi peptydami, które są rozpoznawane tylko przez limfocyty T CD8. W przeciwieństwie do wewnątrzkomórkowych testów barwienia cytokin, zdecydowaliśmy się nie ingerować w wydzielanie cytokin przez limfocyty T CD4 specyficzne dla HIV, aby móc: 1) przeprowadzić dokładniejszą kwantyfikację wytwarzanych cytokin; 2) zbadać szerszy panel cytokin lub cząsteczek efektorowych; oraz 3) ocenić wpływ cytokin wytwarzanych przez limfocyty T CD4 specyficzne dla HIV na inne podzbiory komórek. Stymulujemy PBMC zubożone w CD8 pulą peptydów HIV-1 Gag w obecności przeciwciał blokujących dla interesującego szlaku immunoregulacyjnego. Po pożądanym czasie inkubacji, zwykle 48 godzin, zbieramy supernatanty w celu zmierzenia wydzielania cytokin za pomocą układów kulek i zbieramy osady komórkowe do analizy fenotypowej różnych podzbiorów komórek lub do analizy transkrypcyjnej. Warto zauważyć, że w tym 48-godzinnym punkcie czasowym nie wykrywamy znaczącej populacji proliferujących limfocytów T12. Jest to elastyczne podejście i można zastosować kilka adaptacji tego projektu w celu uwzględnienia różnych hipotez. Na przykład poszczególne podzbiory komórek (takie jak limfocyty T CD4 specyficzne dla HIV lub limfocyty T PD-1 o wysokiej zawartości CD4 itp.) można sortować po 12 godzinach inkubacji przed dalszą inkubacją przez 36 godzin, a następnie zbierać supernatanty i osady komórkowe w celu dokładniejszego zbadania wpływu interwencji blokujących na wydzielanie cytokin przez określone subpopulacje PBMC.

<table><tbody><tr><td>Hanks Zrównoważony roztwór soli bez Ca2+ lub Mg2+</td><td>Sigma</td><td>H9394</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Sigma</td><td>R0883</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque-1077</td><td>Sigma</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>Surowica ludzka AB</td><td>Gemini BioProducts</td><td>100-512</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Mediatech</td><td>30 001 CI</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Mediatech</td><td>25 005 CI</td><td></td></tr><tr><td>Bufor HEPES</td><td>Mediatech</td><td>25060CI</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik blokujący FcR, ludzki</td><td>Miltenyi</td><td>130-059-901</td><td></td></tr><tr><td>RosetteSep Ludzka komórka macierzysta koktajlu CD8 + </td><td></td><td>15663</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Zestaw do naprawy barwników martwych komórek, do wzbudzenia UV</td><td>Invitrogen</td><td>L23105</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Improm-II System odwrotnej transkrypcji</td><td>Promega</td><td>A3800</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant II SYBR qPCR Low Rox Master Mix</td><td>Agilent</td><td>600830</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm Zestaw roztworów do utrwalania/permeabilizacji</td><td>BD</td><td>554714</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher</td><td>BP337100</td><td></td></tr><tr><td>IFN-&#947; Podkład</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>FOR: CGAGATGACTTCGAAAAGCTGA REV: TCTTCGACCTCGAAACAGCA</td></tr><tr><td>GAPDH primer</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>FOR: TCATCATCTCTGCCCCCTCT REV: AGTGATGGCATGGACTGTGG</td></tr></tbody></table>

in vitro test do oceny wpływu szlaków immunoregulacyjnych na funkcję efektora limfocytów t cd4 specyficznych dla hiv

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

Wyczerpanie limfocytów T jest głównym czynnikiem nieudanego usuwania patogenów podczas przewlekłych infekcji wirusowych. Szlaki immunoregulacyjne, takie jak PD-1 i IL-10, są regulowane w górę po tej ciągłej ekspozycji na antygen i przyczyniają się do utraty proliferacji, zmniejszonej funkcji cytolitycznej i upośledzonej produkcji cytokin przez limfocyty T CD4 i CD8. W mysim modelu zakażenia LCMV podanie przeciwciał blokujących przeciwko tym dwóm szlakom zwiększyło odpowiedź limfocytów T. Jednak obecnie nie ma testu in vitro, który mierzyłby wpływ takiej blokady na wydzielanie cytokin w komórkach z próbek ludzkich. Nasz protokół i podejście eksperymentalne umożliwiają nam dokładne i skuteczne ilościowe określenie przywrócenia produkcji cytokin przez specyficzne dla HIV limfocyty T CD4 od osób zakażonych wirusem HIV.
Tutaj przedstawiamy eksperymentalny projekt in vitro, który umożliwia pomiary wydzielania cytokin przez limfocyty T CD4 specyficzne dla HIV i ich wpływ na inne podzbiory komórek. Limfocyty T CD8 zubożono z krwi pełnej, a pozostałe PBMC wyizolowano metodą rozdzielania Ficoll. PBMC zubożone w CD8 inkubowano następnie z przeciwciałami blokującymi przeciwko PD-L1 i/lub IL-10Rα, a po stymulacji pulą peptydów HIV-1 Gag komórki inkubowano w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Po 48 godzinach supernatant pobrano do analizy cytokin za pomocą układów kulek, a osady komórkowe pobrano do analizy fenotypowej za pomocą cytometrii przepływowej lub analizy transkrypcyjnej za pomocą qRT-PCR. W celu bardziej szczegółowej analizy uzyskano różne populacje komórek przez selektywne zubożenie podzbiorów z PBMC lub przez sortowanie za pomocą cytometrii przepływowej przed oceną w tych samych testach. Metody te zapewniają bardzo czułe i specyficzne podejście do określania modulacji produkcji cytokin przez specyficzne dla antygenu limfocyty T pomocnicze oraz do określania funkcjonalnych interakcji między różnymi populacjami komórek odpornościowych.

Podczas pomiarów cytokin z wykorzystaniem tego systemu in vitro niezbędne jest rozróżnienie odpowiedzi swoistych dla antygenu w porównaniu z kontrolą bez stymulacji. Generalnie za odpowiedzi dodatnie uznawaliśmy wszelkie wartości stymulacji antygenowej, które dawały co najmniej trzykrotny wzrost poziomu cytokin w porównaniu z kontrolą bez stymulacji i mieściły się w zakresie liniowym testu. Stosujemy wysokoczułe testy bead array, które mogą wykrywać stężenia cytokin tak niskie jak 0,16 pg/ml, co pozwala nam obse...

Opracowaliśmy test in vitro, aby zbadać rolę szlaków immunoregulacyjnych w regulacji wydzielania cytokin przez limfocyty T CD4 specyficzne dla HIV.

In vitro Test do oceny wpływu szlaków immunoregulacyjnych na funkcję efektora limfocytów T CD4 specyficznych dla HIV

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

Ogólnym celem tej procedury jest analiza wydzielania cytokin, transkrypcji i morfologicznego wpływu stymulowanych limfocytów T. Po pierwsze, użyj gradientu wywołania FI, aby wyizolować obwodowe CD osiem zubożonych komórek jednojądrzastych krwi od osób zakażonych wirusem HIV, inkubować komórki z kontrolą izotypu lub przeciwciałem blokującym, które jest przedmiotem zainteresowania. Następnie stymuluj komórki interesującym je antygenem.Następnie odwirować hodowle komórkowe w celu zebrania supernatantów do pomiarów cytokin i granulek komórkowych do analizy fenotypowej lub analizy transkrypcyjnej, jeśli jest to pożądane. Dostosuj ten protokół, aby uwzględnić sortowanie poszczególnych typów komórek według wyników cytometrii przepływowej dotyczących wydzielania cytokin. Analiza fenotypowa lub transkrypcyjna może wykazać wpływ blokady szlaków hamujących przez przeciwciała na przywrócenie funkcji efektorowej specyficznych dla HIV limfocytów T CD 4.Ten test in vitro może być skutecznie wykorzystany do ilościowego określenia poziomów cytokin przywróconych przez blokadę szlaków hamujących, do zbadania szerokiego panelu cząsteczek efektorowych, a także do oceny wpływu cytokin wytwarzanych przez C specyficzne dla HIV dla limfocytów T na inne podzbiory komórek. Megan Hart, technik badawczy z naszego laboratorium, zademonstruje teraz tę procedurę, Zuboż osiem dodatnich limfocytów T CD, dodając ludzki koktajl zubożenia CD osiem dodatnich w 50 mikrolitrach na mililitr krwi pełnej, dobrze wymieszaj i inkubuj przez 20 minut. W temperaturze pokojowej wymieszaj pełną krew z buforem Hanka.Teraz ostrożnie ułóż krew na opakowaniu histo, a następnie odwiruj gradient przy 540 RCF przez 30 minut. Zbierz warstwę komórek jednojądrzastych krwi obwodowej. Przenieś ogniwa do nowej stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów i umyj dwukrotnie 45 mililitrami kompletnego RPMI 1640.Ponownie zawieś umyte ogniwa w pełnym RPMI 1640. Następnie porcjować 500 mikrolitrów zawiesiny komórek na rurkę faksową. W zależności od badanego szlaku dodać przeciwciała blokujące.Dodaj również kontrolki izotypu do odpowiednich probówek. Inkubować komórki przez 15 minut w inkubatorze do hodowli komórkowych. Następnie stymuluj komórki za pomocą puli peptydów HIV One Gag.Uwzględnij również kontrolę braku stymulacji dla każdego warunku blokowania. Kontynuuj hodowlę komórek przez 48 godzin. Osadzaj komórki przez odwirowanie, a następnie bez naruszania osadu.Przenieś dwukrotnie 225 mikrolitrów supernatantu do probówek EOR, aby matryce prędkości lumineksu dezaktywowały wirusa przy 25 mikrolitrach 0,5% PBS tween. Następnie zmierz pożądane stężenia cytokin za pomocą zestawu Millipore luminex zgodnie z protokołem producenta. Po umyciu komórek w trzech mililitrach barwnika PBS w celu zapewnienia żywotności, a następnie ponownie zawieś komórki w 100 mikrolitrach PBS zawierających 1% FBS w przypadku barwienia monocytów lub innych komórek prezentujących antygen w 1,4 mikrolitra wiru odczynnika blokującego FCR do wymieszania i inkubacji przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnie dodaj wir przeciwciał powierzchniowych i inkubuj przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności. Po jednym praniu w 200 mikrolitrach 4% para formaldehydu i inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut w ciemności. Po jednym praniu zawieszamy komórki w 250 mikrolitrach 1% FBS do analizy na wielolaserowym cytometrze przepływowym do ilościowego licytu R-T-P-C-R komórek w 300 mikrolitrach buforu kyogen, RLT zawierającego 1% izolatu etanolu keto Beamer RNA, przy użyciu zestawu do izolacji RNA zgodnie z protokołem producenta.Teraz zsyntetyzuj CD NA z RNA za pomocą zestawu do syntezy CD NA i postępując zgodnie z protokołem producenta. Następnie utwórz mieszankę starterów dla każdego startera, w tym genów porządkowania, dodając startery do wody wolnej od nukleazy i trzymaj na lodzie. Do każdej głównej mieszanki amplifikacji dodaj 10,5 mikrolitra wody wolnej od nukleaz, 12,5 mikrolitra cyber green i jeden mikrolitr mieszanki startera na płytkę.Cóż, teraz odpipetuj 24 mikrolitry wzorca do każdej reakcji. Cóż, dodaj również jeden mikrolitr CD NA do każdego, dobrze zgodnie z szablonem. Zakryj studzienki i odwiruj płytkę przez trzy minuty przy 1500 RCF.Następnie uruchom płytkę na maszynie QRT PCR R w celu barwienia powierzchni komórek. Dodaj barwienia feldena i moniny na około sześć godzin przed barwieniem cytokin wewnątrzkomórkowych. Następnie umyj komórki 1% FBS w PBS i wybarwij cytokiny wewnątrzkomórkowe za pomocą zestawu roztworu do utrwalania przenikania i protokołu po umyciu komórek.Po zawieszeniu granulek w 250 mikrolitrach 1% FBS, uruchom próbki na wielolaserowym cytometrze przepływowym 16 godzin po stymulacji barwienia pod kątem żywotności, używając zestawu żywych martwych, naprawialnych barwników martwych komórek. Zgodnie z protokołem producenta, po jednym praniu PBS, zawieszamy komórki w 100 mikrolitrach 1%FBS na powierzchni wiru przeciwciał, aby wymieszać i inkubować komórki na lodzie w ciemności przez 20 minut. Umyj ogniwa raz i zawieś je w 500 mikrolitrach zimnego uzupełnionego RPMI 1640.Następnie media filtrują komórki przez nasadkę sitka do pięciomililitrowej rurki z okrągłym dnem z polistyrenu. Następnie po 200 mikrolitrach uzupełnionej pożywki RPMI 1640 do każdej probówki zbiorczej. Trzymanie wszystkich probówek na lodzie podczas sortowania na żywo, sortowanie interesujących podzbiorów komórek na instrumencie znajdującym się w obiekcie wyposażonym w hodowlę materiałów niebezpiecznych biologicznie.Posortowane komórki przez żądany czas. Po analizie analiz luminex i PCR w tym eksperymencie, stymulacja PBMC CD osiem zubożoną pulą peptydów HIV V jeden gag powoduje medianę 800-krotnego wzrostu produkcji interferonu gamma. Poziom transkryptów interferonu gamma zwiększył się średnio dziesięciokrotnie po stymulacji.W tym przypadku analiza in vitro funkcji komórek T CD four specyficznych dla HIV wskazuje na silną korelację między wydzielaniem białka interferonu gamma a poziomami mRNA interferonu gamma. Co ciekawe, stymulacja przez pulę peptydów HIV gag powoduje większe wydzielanie interferonu gamma niż antygeny bakteryjne tężca. Dalsze wyniki toksoidu z wydzielaniem IL 13 wskazują na różne profile cytokin odpowiedzi limfocytów T CD specyficznych dla HIV i tężca.Blokada jednego szlaku PD na ogół nie ma znaczącego wpływu na wydzielanie cytokin bez stymulacji antygenem, ale zwiększa wydzielanie interferonu gamma i IL 2. Kiedy komórki są stymulowane wirusem HIV, gromadzi się jeden peptyd gag. Kiedy komórki CD 3 są wyczerpane z pbmc, nie ma interferonu gamma ani IL 2 wytwarzanego w odpowiedzi na stymulację antygenem.Dane te wskazują, że wydzielanie interferonu gamma i IL 2 jest indukowane w odpowiedzi na specyficzną dla HIV stymulację limfocytów T CD four i antygenu. W tym eksperymencie wykorzystano zademonstrowany przepływ pracy przy użyciu posortowanych faktów limfocytów T CD czterech w celu zbadania wpływu pierwszej blokady PD na interferon gamma i IL 2. Kluczową zaletą tej metody jest możliwość oceny, w jaki sposób cząsteczki immunoregulacyjne regulują wzajemne oddziaływanie specyficznych dla wirusa HIV limfocytów T CD 4 z komórkami prezentującymi antygen.W tym przypadku protokół został dostosowany do wykonywania wewnątrzkomórkowego barwienia cytokinami po 48 godzinach od stymulacji. Wyniki pokazują, że monocyty są głównym źródłem IL 12 po stymulacji pulami peptydów HIV One Gag. To eksperymentalne podejście in vitro umożliwia naukowcom zajmującym się immunologią komórek T zbadanie wpływu szlaków immunoregulacyjnych na regulację efektywnej funkcji limfocytów Addisona w próbkach ludzkich.

in-vitro-assay-to-evaluate-impact-immunoregulatory-pathways-on-hiv

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Komórki Treg są potężnymi supresorami układu odpornościowego. Brakuje unikalnych markerów powierzchniowych pozwalających na ich zdefiniowanie, dlatego definicje Treg opierają się przede wszystkim na ich funkcji. W niniejszej pracy opisujemy zoptymalizowany test in vitro, który umożliwia identyfikację zaburzeń równowagi immunologicznej u osób zagrożonych rozwojem cukrzycy typu 1 (T1D).

Supresja ludzkich komórek in vitro jako narzędzie przesiewowe do rozpoznawania wczesnego stanu niezrównoważenia immunologicznego

Ten film prezentuje test apoptozy w komórkach nowotworowych indukowany przez wstępnie aktywowane efektorowe limfocyty T. Poprzez kokulturację tych komórek z komórkami rakowymi oznaczonymi jądrami fluorescencyjnymi, dodaje się substrat fluorogenny rozszczepialny przez kaspazę. Apoptotyczne komórki rakowe będą miały inny kolor w swoich jądrach, co prowadzi do podwójnej fluorescencji. Ta podwójna fluorescencja wskazuje na to, że komórki rakowe ulegają apoptozie.

Test in vitro do badania cytotoksyczności wstępnie aktywowanych limfocytów T CD8 + wobec komórek rakowych

Limfocyty T regulatorowe CD4+ są silnymi modulatorami immunologicznymi i pełnią ważne funkcje w homeostazie immunologicznej. Niedobór tych komórek we krwi obwodowej sprawia, że badania funkcjonalne są trudne, szczególnie w kontekście zakażenia HIV-1. Opisujemy tutaj metodę izolowania i namnażania funkcjonalnych limfocytów Treg CD4 + z krwi obwodowej od osób zakażonych wirusem HIV-1.

Nowe narzędzia do ekspansji limfocytów T regulatorowych od osób zakażonych wirusem HIV-1

Nowatorskie generacje testów funkcjonalnych, takich jak interferon gamma (IFN-γ) ELISpot, które wykrywają produkcję cytokin na poziomie pojedynczej komórki i zapewniają zarówno ilościową, jak i jakościową charakterystykę odpowiedzi limfocytów T, mogą być używane do oceny komórkowych odpowiedzi immunologicznych skierowanych przeciwko wirusowi ospy wietrznej i półpaśca (VZV).

Opracowanie testu ELISpot IFN-γ do oceny odporności komórkowej specyficznej dla wirusa ospy wietrznej i półpaśca po przeszczepieniu krwi pępowinowej

Tutaj opisujemy test wysokiej wydajności chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas (HPLC-MS/MS) do ilościowego oznaczania immunosupresyjnego takrolimusu w wysuszonych plamach krwi przy użyciu prostego ręcznego etapu wytrącania białka i ekstrakcji kolumnowej online.

Oznaczanie ilościowe takrolimusu działającego immunosupresyjnie na wysuszonych plamkach krwi za pomocą LC-MS/MS

Ten protokół opisuje metody konstruowania humanizowanego modelu myszy szpiku kostnego/wątroby/grasicy z opartą na komórkach macierzystych odpornością na zakażenie wirusem HIV.

Zmodyfikowana odporność na zakażenie wirusem HIV oparta na komórkach macierzystych w humanizowanym modelu myszy

Tutaj opisujemy protokół analizy fenotypu limfocytów regulatorowych T (T reg) wyizolowanych od naiwnych i przewlekłych myszy zakażonych wirusem limfocytarnego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych. Ponadto zapewniamy proces oceny aktywności supresyjnej limfocytówT reg.

Analiza fenotypowa i funkcjonalna aktywowanych limfocytów T regulatorowych wyizolowanych od myszy zakażonych wirusem przewlekłego limfocytarnego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych

Tutaj prezentujemy protokół indukcji tolerancji w transplantacji i oceniamy in vitro i in vivo zdolność tłumienia różnych podzbiorów komórek od biorcy oraz status immunologiczny biorcy wobec dawcy lub egzogennych antygenów.

Ocena in vitro i in vivo aktywności supresyjnej komórek T, B i mieloidalnych oraz odpowiedzi humoralnych u biorców przeszczepów

Opisujemy tutaj test zabijania in vivo oparty na cytometrii przepływowej, który umożliwia badanie dominacji immunologicznej w odpowiedziach cytotoksycznych limfocytów T (CTL) na modelowy antygen nowotworowy. Podajemy przykłady, w jaki sposób ten elegancki test może być wykorzystany do badań mechanistycznych i do testowania skuteczności leków.

Dostosowywanie testów cytotoksyczności in vivo do badania immunodominacji w odpowiedziach limfocytów T CD8 + specyficznych dla nowotworu

Opisujemy procedurę oceny zdolności środków farmakologicznych do generowania tolerogennych komórek dendrytycznych z naiwnych komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów in vitro i walidacji ich siły poprzez autologiczne generowanie regulatorowych limfocytów T.

Prosta i skuteczna metoda testowania środków immunomodulujących do wytwarzania tolerogennych komórek dendrytycznych z ludzkich monocytów CD14+

Ten protokół zapewnia in vitro strategię współhodowli do badania wpływu komórek T regulatorowych na proliferację i różnicowanie komórek T efektorowych.

In Vitro analiza funkcjonalna komórek T regulatorowych: skupienie na proliferacji i różnicowaniu

Poznaj metodę in vitro do badania wpływu szlaków immunoregulacyjnych na funkcję limfocytów T CD4 specyficznych dla HIV. Technika obejmuje izolację komórek mononuklearnych krwi obwodowej i blokadę przeciwciałami.

In vitro Test do oceny wpływu szlaków immunoregulacyjnych na funkcję efektora limfocytów T CD4 specyficznych dla HIV

Przeglądaj więcej filmów