Name: Badanie wrażliwości na antybiotyki wywołane stresem na chipie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 41 s
Description: Poznaj szybką metodę testowania wrażliwości bakterii na antybiotyki przy użyciu platformy mikrofluidycznej. Technika umożliwia ocenę żywotności komórek w czasie rzeczywistym bez konieczności monitorowania podziałów bakteryjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy inżynierom i studentom z Centrum Fraunhofera ds. Innowacji w Produkcji. Za pomoc w projektowaniu, obróbce i automatyzacji systemu eksperymentalnego dziękujemy Andreasowi Prinzenowi, Holgerowi Wirzowi, Dougowi Fossowi, Davidowi Charginowi i dr Sudong Shu. Dziękujemy Julii Kuckartz, Melanie Zimmermann, Niko Kraetzmarowi, Timowi Gumbelowi, Joshowi Villanuevie, Minori Shimizu i Katarzynie Kulidze za pomoc w testowaniu protokołów eksperymentalnych i zbieraniu danych. Dziękujemy doktorom Anne E. Carpenter i Markowi-Anthony'emu Brayowi z Imaging Platform w Broad Institute of Harvard i MIT za pomoc w opracowaniu procedury analizy obrazu w CellProfiler. Opisany projekt był częściowo wspierany przez nagrody R21AI079474 i 1R01AI101446 z Narodowego Instytutu Alergii i Chorób Zakaźnych. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy Narodowego Instytutu Alergii i Chorób Zakaźnych lub Narodowych Instytutów Zdrowia. Projekt był również wspierany przez Fraunhofer USA.

1. Przygotowanie warstwy PDMS (Rysunek 1)
<ol>
	<li>Intensywnie wymieszać PDMS i utwardzacz w stosunku 10:1. Aby usunąć pęcherzyki powietrza, odgazować gęstą mieszaninę w komorze próżniowej przez 1 hr w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wylewać powoli PDMS na formę aluminiową, kontrolując masę na wadze. Wlewać od środka, utrzymując formę w poziomie. Należy upewnić się, że piny pozostają niezakryte. Przerwać wlewanie po osiągnięciu docelowej masy. 
	Nasza forma wymaga 4 g PDMS i 0,4 g odczynnika utwardzającego.</li>
	<li>Wyrównać formę wewnątrz piekarnika i utwardzać w temperaturze 37 °C przez noc. 
	Alternatywne czasy utwardzania to 2 hr w 60 °C lub 1 hr w 90 °C.</li>
	<li>Naciąć utwardzoną warstwę PDMS wzdłuż krawędzi formy i ostrożnie oddzielić ją od powierzchni formy za pomocą pęsety. Oczyścić powierzchnię formy przy użyciu 70% etanolu i patyczka higienicznego.</li>
</ol>
2. Złożyć komorę przepływową zgodnie z rysunkiem 2
Standardowy montaż PDMS z szkiełkami przedmiotowymi wykonuje się poprzez traktowanie obu powierzchni plazmą tlenową, co zapewnia szczelne połączenie pomiędzy PDMS a szkiełkiem mikroskopowym. W przedstawionym protokole traktowanie plazmą zniszczyłoby powłokę chemiczną na szkiełku. Dlatego szkiełko jest uszczelniane ciśnieniowo zamiast być poddawane działaniu plazmy.
<ol>
	<li>Włóż szklane okno do gniazda celi przepływowej.</li>
	<li>Połóż powleczone szkiełko przedmiotowe na szklanym oknie wewnątrz gniazda celi przepływowej stroną aktywną do góry, a następnie umieść na nim warstwę PDMS z kanałami skierowanymi w dół. Usetuj szkiełko PDMS w taki sposób, aby wloty kanałów pokrywały się z otworami przelotowymi w metalowej płytce. Ostrożnie wypchnij powietrze spomiędzy warstw.</li>
	<li>Obróć zespół PDMS/szkiełko przedmiotowe tak, aby warstwa PDMS stykała się z szklanym oknem. Dopasuj wloty kanałów PDMS do otworów przelotowych w metalowej płytce.</li>
	<li>Nałóż płytę dociskową i dokręć śruby.</li>
	<li>Umieść zmontowaną celę przepływową pod mikroskopem. Ustaw powiększenie mikroskopu na 60X i dokonaj wstępnego wyrównania pozycji kanałów.</li>
</ol>
3. Przygotowanie bakterii w fazie logarytmicznej
<ol>
	<li>Dzień przed eksperymentem: Zaszczepić kolonię bakterii do 50 ml pożywki Mueller Hinton zawierającej 2% NaCl (MH2). Inkubować przez noc w wytrząsarku przy 250 rpm w temperaturze 37 °C. 
	W opisanej konfiguracji w jednym eksperymencie można badać jeden lub dwa szczepy bakteryjne.</li>
	<li>Przed eksperymentem: Wprowadzić 50 µl nocnej hodowli bakterii do 50 ml pożywki MH2. Inkubować w wytrząsarku przy 250 rpm przez 3 h w temperaturze 37 °C, aby zapewnić, że bakterie znajdują się w fazie logarytmicznej.</li>
</ol>
4. Podgrzewaj składniki roztworu eksperymentalnego przez co najmniej 10 minut przed ich użyciem
<ol>
	<li>Rozmrozić barwnik fluorescencyjny (roztwór stokowy 5 mM) oraz lysostafinę (roztwór stokowy 10 µg/ml) w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Doprowadzić proszek oksacyliny do temperatury pokojowej.</li>
</ol>
5. Przygotowanie i nałożenie zawiesiny bakteryjnej
<ol>
	<li>Po zakończeniu 3 h subkultury: pobrać 10 ml kultury bakterii i wirować przy 1,650 x g przez 2 min.</li>
	<li>Usunąć supernatant i resuspendować bakterie w 1 ml świeżej pożywki MH2.</li>
	<li>Do strzykawki Luer lock o pojemności 1 ml dołączyć krótki odcinek rurki. Przepłukać rurkę strzykawki 1 ml pożywki. Pozostawić niewielką ilość pożywki w rurce, aby uniknąć powstania pęcherzyków powietrza podczas pobierania zawiesiny bakteryjnej.</li>
	<li>Nabrać 0,7 ml bakterii typu 1 do strzykawki. Wypełnić dwa kanały komory przepływowej bakteriami typu 1. Obserwować, aż ciecz pojawi się po drugiej stronie kanału po przepłynięciu ca. 150 µl. 
	Przezroczystość kanału zmienia się w miarę jego wypełniania bakteriami.</li>
	<li>W przypadku eksperymentów z wieloma typami bakterii, powtórzyć procedurę ładowania dla bakterii typu 2 w dwóch pozostałych kanałach komory przepływowej.</li>
	<li>Umieścić komorę przepływową w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 45 min, aby umożliwić osiadanie bakterii i ich przytwierdzenie do powierzchni szkiełka.</li>
</ol>
6. Przygotowanie i nałożenie roztworów eksperymentalnych
<ol>
	<li>Przygotować 140 µl roztworu barwnika fluorescencyjnego o stężeniu 0,5 mM, mieszając 14 µl roztworu stokowego barwnika fluorescencyjnego (5 mM) oraz 126 µl podłoża MH2.</li>
	<li>Rozpuścić 10 mg oksacyliny w 40 ml podłoża MH2, aby uzyskać końcowe stężenie 250 µg/ml oksacyliny.</li>
	<li>Przygotować 130 ml roztworu kontrolnego o końcowych stężeniach 0,25 µM barwnika fluorescencyjnego i 0,7 ng/ml lizostafiny. W tym celu zmieszać 65 µl barwnika fluorescencyjnego (0,5 mM), 9,12 µl roztworu stokowego lizostafiny (10 µg/ml) oraz 130 ml podłoża MH2.</li>
	<li>Przygotować 130 ml roztworu z antybiotykiem o końcowych stężeniach 0,25 µM barwnika fluorescencyjnego, 0,7 ng/ml lizostafiny i 50 µg/ml oksacyliny. W tym celu zmieszać 65 µl barwnika fluorescencyjnego (0,5 mM), 9,12 µl roztworu stokowego lizostafiny (10 µg/ml), 26 ml oksacyliny (250 µg/ml) oraz 104 ml podłoża MH2.</li>
	<li>Napełnić dwie strzykawki 60 ml roztworem kontrolnym i dwie strzykawki 60 ml roztworem z antybiotykiem. Przechowywać roztwory owinięte w folię aluminiową, aby zapobiec degradacji odczynników pod wpływem światła. 
	Napełnić strzykawki z nadmiarem, aby uwzględnić straty podczas płukania rurek.</li>
	<li>Usunąć pęcherzyki powietrza ze strzykawek poprzez delikatne potrząsanie. Podłączyć i napełnić rurkę doprowadzającą do końcówki roztworem eksperymentalnym.</li>
	<li>Zamontować strzykawki na pompie. Najpierw umieścić strzykawkę o najmniejszej objętości, a następnie zablokować pozycję tłoka. Zamontować pozostałe strzykawki na pompie, dociskając tłoki w razie potrzeby.</li>
	<li>Ustawić prędkość pompy na 1 ml/min oraz objętość pompowania na 60 ml. Przepłukać układ za pomocą pompy, aż ze wszystkich strzykawek zacznie wypływać jednostajny strumień cieczy.</li>
</ol>
7. Przygotowanie celi przepływowej pod mikroskopem
<ol>
	<li>Wyjmij celę przepływową z wirówki i zamocuj ją na stoliku mikroskopu (Rysunek 3).</li>
	<li>Podłącz przewody doprowadzające i odprowadzające do każdego z kanałów celi przepływowej (jeden wlot i jeden wylot na kanał). 
	Zbieranie cieczy wylotowej do czterech oddzielnych pojemników umożliwia pomiar objętości wypływu z każdego kanału z osobna.</li>
</ol>
8. Przeprowadzenie 60-minutowego eksperymentu
<ol>
	<li>Sprawdzić pozycje wstępnie wyrównane w kroku 2.5. Jeśli pole widzenia mikroskopu nie jest wycentrowane na kanale i/lub jest nieostre, należy skorygować ustawienia i zapisać nowe pozycje. 
	Precyzyjne ustawienie ostrości może być niemożliwe przed rozpoczęciem przepływu ze względu na wysoką gęstość załadowanych bakterii.</li>
	<li>Ustawić czas akwizycji obrazu w kontraście fazowym na 10 msec oraz czas akwizycji fluorescencji na 1 600 msec.</li>
	<li>Uzyskać obrazy w kontraście fazowym i fluorescencyjne dla każdej pozycji przed zainicjowaniem przepływu. 
	Pozwala to na jakościową ocenę gęstości załadowanych bakterii.</li>
	<li>Rozpocząć przepływ cieczy i natychmiast sprawdzić, czy mikroskop jest ustawiony ostro na dno kanałów.</li>
	<li>Wykonać obrazy w kontraście fazowym i fluorescencyjne obszarów docelowych w ciągu pierwszej minuty przepływu.</li>
	<li>Pozyskiwać obrazy co 2 min po wykonaniu pierwszego zestawu zdjęć, aż do upływu 60 min przepływu. W razie potrzeby ponownie ustawić ostrość.</li>
</ol>
9. Dezynfekcja celi przepływowej
<ol>
	<li>Przygotuj 10% roztwór wybielacza w zlewce (100 ml). Napełnij 4 strzykawki o pojemności 20 ml po 10 ml mieszaniny. Usuń pęcherzyki powietrza ze strzykawek i podłącz je do celi przepływowej. 
	Oczyszczenie kanałów z bakterii zajmie około 1-2 min.</li>
	<li>Ustaw prędkość pompy na 1 ml/min, a objętość pompowania na 3 ml. Uruchom proces na 3 min.</li>
	<li>Napełnij 4 strzykawki o pojemności 60 ml po 60 ml wody DI. Usuń pęcherzyki powietrza ze strzykawek i podłącz je do celi przepływowej.</li>
	<li>Ustaw prędkość pompy na 1 ml/min, a objętość pompowania na 30 ml. Uruchom proces na 30 min.</li>
	<li>Monitoruj czyszczenie kanałów pod mikroskopem.</li>
	<li>Zdemontuj celę przepływową. Wyrzuć zużyte szkiełko epoksydowe. Moczyć elementy celi przepływowej w wodzie DI przez 20 min. Pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.</li>
</ol>
10. Analiza obrazów i generowanie danych
<ol>
	<li>Policz liczbę bakterii na każdym obrazie. 
	Do przetwarzania serii obrazów wykorzystano oprogramowanie open access CellProfiler16. Ogólny schemat procedury w programie CellProfiler przedstawiono w Tabeli 1. Liczba bakterii widocznych na obrazie w kontraście fazowym (Np) określa całkowitą liczbę bakterii. Liczba bakterii widocznych na obrazie fluorescencyjnym (Nf) określa liczbę bakterii martwych.</li>
	<li>Oblicz znormalizowany procent śmierci komórek bakteryjnych jako funkcję czasu.
	<ol>
		<li>Zaimportuj wartości Nf i Np dla poszczególnych obrazów do oprogramowania do analizy danych.</li>
		<li>Oblicz ułamek martwych bakterii w każdym kanale w określonym punkcie czasowym, korzystając z ułamka (Nf / Np) dla t = T.</li>
		<li>Odejmij ułamek martwych bakterii obecnych na początku eksperymentu (t = 1 min) zarówno dla kanału kontrolnego, jak i eksperymentalnego.</li>
		<li>Odejmij ułamek martwych bakterii w kanale kontrolnym od ułamka w kanale eksperymentalnym dla każdego punktu czasowego, stosując poniższe równanie: 
		 
		<img alt="Schemat analizy śmierci komórek bakteryjnych; obecność kontra brak antybiotyku; zliczenia fluorescencyjne." fo:content-width="6in" height="217" src="/files/ftp_upload/50828/Data_analysis_equation.png" width="620" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie analizy danych"></li>
		 
		<li>Przedstaw na wykresie zależność DPnorm od t w czasie trwania eksperymentu. 
		Należy pamiętać, że próbkę z procentem śmierci komórek przekraczającym 1% uznaje się za wrażliwą, natomiast śmierć poniżej 0,5% wskazuje na oporność. Wartości procentowe mieszczące się między tymi dwoma punktami odcięcia uznaje się za niejednoznaczne i próbka musi zostać przetestowana ponownie.</li>
		<li>Użyj arkusza kalkulacyjnego, aby podsumować i przeanalizować wyniki z różnych eksperymentów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Mairhofer, J., Roppert, K., Ertl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+systems+for+pathogen+sensing%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors%22%5BJournal%5D)">Microfluidic systems for pathogen sensing: a review.</a> Sensors. 9, 4804-4823 (2009).</li>
<li>Yager, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+diagnostic+technologies+for+global+public+health%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Microfluidic diagnostic technologies for global public health.</a> Nature. 442, 412-418 (2006).</li>
<li>Boedicker, J. Q., Li, L., Kline, T. R., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+bacteria+and+determining+their+susceptibility+to+antibiotics+by+stochastic+confinement+in+nanoliter+droplets+using+plug-based+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Detecting bacteria and determining their susceptibility to antibiotics by stochastic confinement in nanoliter droplets using plug-based microfluidics.</a> Lab Chip. 8, 1265-1272 (2008).</li>
<li>Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncovering+toxicological+complexity+by+multi-dimensional+screenings+in+microsegmented+flow%3A+modulation+of+antibiotic+interference+by+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Uncovering toxicological complexity by multi-dimensional screenings in microsegmented flow: modulation of antibiotic interference by nanoparticles.</a> Lab Chip. 12, 474-484 (2012).</li>
<li>Chen, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+susceptibility+testing+using+high+surface-to-volume+ratio+microchannels%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial susceptibility testing using high surface-to-volume ratio microchannels.</a> Anal. Chem. 82, 1012-1019 (2010).</li>
<li>Churski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+screening+of+antibiotic+toxicity+in+an+automated+microdroplet+system%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Rapid screening of antibiotic toxicity in an automated microdroplet system.</a> Lab Chip. 12, 1629-1637 (2012).</li>
<li>Eun, Y. J., Utada, A. S., Copeland, M. F., Takeuchi, S., Weibel, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulating+bacteria+in+agarose+microparticles+using+microfluidics+for+high-throughput+cell+analysis+and+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Encapsulating bacteria in agarose microparticles using microfluidics for high-throughput cell analysis and isolation.</a> ACS Chem. Biol. 6, 260-266 (2011).</li>
<li>Kim, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+monitoring+of+antibiotic+susceptibility+of+bacterial+biofilms+in+a+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">In situ monitoring of antibiotic susceptibility of bacterial biofilms in a microfluidic device.</a> Lab Chip. 10, 3296-3299 (2010).</li>
<li>Peitz, I., van Leeuwen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+bacteria+growth+monitoring+by+automated+DEP-facilitated+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Single-cell bacteria growth monitoring by automated DEP-facilitated image analysis.</a> Lab Chip. 10, 2944-2951 (2010).</li>
<li>Kalashnikov, M., Lee, J. C., Campbell, J., Sharon, A., Sauer-Budge, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+platform+for+rapid%2C+stress-induced+antibiotic+susceptibility+testing+of+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfluidic platform for rapid, stress-induced antibiotic susceptibility testing of Staphylococcus aureus.</a> Lab Chip. 12, 4523-4532 (2012).</li>
<li>McDonald, J. C., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28dimethylsiloxane%29+as+a+material+for+fabricating+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">Poly(dimethylsiloxane) as a material for fabricating microfluidic devices.</a> Acc. Chem. Res. 35, 491-499 (2002).</li>
<li>Roth, B. L., Poot, M., Yue, S. T., Millard, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+viability+and+antibiotic+susceptibility+testing+with+SYTOX+green+nucleic+acid+stain%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial viability and antibiotic susceptibility testing with SYTOX green nucleic acid stain.</a> Appl. Environ. Microbiol. 63, 2421-2431 (1997).</li>
<li>Francius, G., Domenech, O., Mingeot-Leclercq, M. P., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+Staphylococcus+aureus+cell+wall+digestion+by+lysostaphin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Direct observation of Staphylococcus aureus cell wall digestion by lysostaphin.</a> J. Bacteriol. 190, 7904-7909 (2008).</li>
<li>Jordan, S., Hutchings, M. I., Mascher, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+envelope+stress+response+in+Gram-positive+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Cell envelope stress response in Gram-positive bacteria.</a> FEMS Microbiol. Rev. 32, 107-146 (2008).</li>
<li>Koch, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+wall+as+target+for+attack%3A+past%2C+present%2C+and+future+research%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Bacterial wall as target for attack: past, present, and future research.</a> Clin. Microbiol. Rev. 16, 673-687 (2003).</li>
<li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler%3A+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7, R100 (2006).</li>
<li>Kohanski, M. A., Dwyer, D. J., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+antibiotics+kill+bacteria%3A+from+targets+to+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">How antibiotics kill bacteria: from targets to networks.</a> Nat. Rev. Microbiol. 8, 423-435 (2010).</li>
<li>Kohanski, M. A., Dwyer, D. J., Hayete, B., Lawrence, C. A., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+common+mechanism+of+cellular+death+induced+by+bactericidal+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A common mechanism of cellular death induced by bactericidal antibiotics.</a> Cell. 130, 797-810 (2007).</li>
</ol>

Metoda mikroprzepływowa jest zgłoszona do opatentowania: Sauer-Budge A, Sharon A, Kalashnikov M, Wirz H, wynalazcy; Metoda i urządzenie do szybkiego wykrywania oporności/wrażliwości bakterii na antybiotyki, patent PCT/US10/33523.

Przedstawiony protokół został zwalidowany i zoptymalizowany w zestawie doświadczeń z wrażliwymi na metycylinę i opornymi na metycylinę szczepami Staphylococcus aureus 10. W związku z tym protokół ten bez modyfikacji powinien mieć bezpośrednie zastosowanie do innych szczepów S. aureus i innych antybiotyków, których mechanizmy działania wpływają na biosyntezę ściany komórkowej bakterii. Typy bakterii inne niż S. aureus mogą wymagać zmiany parametrów stresu: naprężeń rozpuszczalnych (en...

Wzrost oporności bakterii zwiększa potrzebę szybkich testów wrażliwości na antybiotyki opartych na fenotypie w celu zabezpieczenia naszych leków ostatniej szansy. Standardowe testy wrażliwości opierają się na hamowaniu wzrostu bakterii w obecności antybiotyków, które trwają wiele (8-24) godzin. Opracowaliśmy nowatorski test wrażliwości na antybiotyki na platformie mikroprzepływowej, który opiera się na aktywacji stresu szlaków biosyntezy w celu przyspieszenia działania antybiotyków.
Testy wrażliwości na antybiotyki w skali mikroprzepływowej mają tę zaletę, że są efektywnym wykorzystaniem próbek, ponieważ wymagają niewielkiej liczby bakterii. Dodatkowo, urządzenia mikroprzepływowe mogą być multipleksowane w celu testowania wielu próbek w różnych warunkach1,2. W ostatnim czasie opisano szereg metod mikroprzepływowych do badania wrażliwości na antybiotyki3-9. W tych metodach bakterie są hodowane wewnątrz nano- i pikolitrowych kropelek3,7, w pełnej objętości kanału mikroprzepływowego4-6,8 lub jako pojedyncze bakterie elektrycznie zlokalizowane na dolnej powierzchni kanału9. Chociaż testy te są przeprowadzane w kanałach mikroprzepływowych, wszystkie monitorują wzrost drobnoustrojów w obecności i bez antybiotyków, podobnie jak tradycyjne metody. Pomiary wzrostu są wykonywane za pomocą gęstości optycznej, barwników wrażliwych na pH lub kontrastu jasnego pola/fazy lub obrazów fluorescencyjnych. Chociaż niektóre z tych testów są szybsze niż tradycyjne metody, każda z nich pasywnie wykrywa oporność na antybiotyki. Innymi słowy, metody te nadal wymagają od użytkownika oczekiwania na rozwój bakterii jako ostateczny odczyt.
Przeciwnie, opracowaliśmy metodę, która wykorzystuje kombinację ścinania i stresu enzymatycznego do aktywacji wrażliwych na antybiotyki szlaków biochemicznych10. Rzucenie wyzwania zestresowanym bakteriom za pomocą tych antybiotyków tworzy szybszy test wrażliwości. Bakterie, które są odporne na antybiotyk, są w stanie wytrzymać stresujące warunki. Z drugiej strony wrażliwe bakterie są szybko zabijane przez połączone stresy. Procent śmierci komórki po jednej godzinie, mierzony za pomocą mikroskopii przy użyciu fluorescencyjnego barwienia martwych komórek, określa fenotyp bakterii (oporne vs. podatne).
Aby pomyślnie wdrożyć naszą metodę, bakterie muszą być unieruchomione na dolnej powierzchni kanału mikroprzepływowego. W ten sposób bakterie mogą być poddawane różnym stresom i jednocześnie obrazowane pod mikroskopem w jednej płaszczyźnie. Powlekane szkiełko mikroskopowe służy do unieruchamiania bakterii. Szkiełko jest wstępnie pokryte przez producenta grupami epoksydowymi do niespecyficznego wiązania białek. Niespecyficzne wiązanie tych epoksydów z białkami powierzchniowymi bakterii kowalencyjnie wiąże bakterie z powierzchnią szkiełka.
Szczepy są testowane w identycznych warunkach (ścinanie + stres enzymatyczny) przy braku (kontrola) i obecności (eksperyment) antybiotyku. Zdjęcia z każdego kanału z kontrastu fazowego i mikroskopu fluorescencyjnego są wykonywane automatycznie co dwie minuty przez jedną godzinę. Oznaczenia oporności są następnie dokonywane poprzez porównanie procentu martwych bakterii w kanale eksperymentalnym z tymi obecnymi w kanale kontrolnym. Po godzinie próbka o odsetku śmierci komórki większym niż 1% jest uważana za podatną, podczas gdy mniej niż 0,5% śmierci wskazuje na oporność. Wartości procentowe, które mieszczą się między tymi dwoma punktami odcięciami, są uważane za nieokreślone i próbka musi zostać ponownie przetestowana.
Kanały mikroprzepływowe są zdefiniowane w PDMS, który jest materiałem wybieranym dla urządzeń mikroprzepływowych11. PDMS jest optycznie przezroczysty w szerokim zakresie długości fal, biokompatybilny, obojętny, przepuszczalny dla gazów i ma niską przepuszczalność dla cieczy; Dlatego dobrze nadaje się do tych eksperymentów.
Naprężenie mechaniczne/ścinające jest wytwarzane przez przepływ mediów o temperaturze pokojowej nad unieruchomionymi bakteriami. (Uwaga: Podgrzanie pożywki do 37 °C nie ma znaczącego wpływu na wynik testu.) Zautomatyzowane pompy strzykawkowe tłoczą pożywkę (zawierającą barwnik z martwych komórek +/- antybiotyk, a także opcjonalne stresory enzymatyczne) przez kanały mikroprzepływowe (200 μm x 400 μm) z natężeniem przepływu 1 ml/min, co daje 6,25 kPa siły ścinającej lub szybkość ścinania 6 000 sec-1. Szybkość ta jest równa lub przewyższa wcześniej badane naprężenia ścinające na gronkowce.
Enzym, lizostafina, został wybrany do wstępnych eksperymentów, ponieważ powoduje bezpośrednie uszkodzenie ściany komórkowej Staphylococcus. Stężenie lizostafiny (0,7 ng/ml) było wystarczające, aby spowodować uszkodzenie ściany komórkowej bakterii, ale nie było wystarczające, aby spowodować śmierć komórek bakteryjnych bez antybiotyku w czasie eksperymentu. Lizostafina nie jest wymagana do prawidłowego oznaczenia podatności bakterii, ale zwiększa wynik, prowadząc do zwiększonej śmierci komórek w podatnych szczepach. Natomiast naprężenie ścinające ma kluczowe znaczenie dla funkcji testu. Gdy wrażliwe na metycylinę szczepy Staphylococcus aureus są traktowane lizostafiną i oksacyliną przy braku przepływu, w trakcie eksperymentu nie rejestruje się śmierci komórek.
Żywotność komórek jest monitorowana za pomocą fluorescencyjnego barwienia martwych komórek12. Wybór barwnika opierał się na jego zdolności do selektywnego barwienia tylko uszkodzonych komórek, jego nietoksyczności dla żywych komórek oraz niskiej fluorescencji tła, co pozwoliło na jego bezpośrednie dodanie do pożywki komórkowej bez dodatkowych etapów. Dobór barwnika fluorescencyjnego o stężeniu 0,25 μM miał na celu osiągnięcie akceptowalnych poziomów sygnału w czasie 1,6 sekundy ekspozycji na światło wzbudzające fluorescencję.
Beta-laktam, oksacylina, była używana w naszych wstępnych badaniach. Oporne na metycylinę gatunki S. aureus (MRSA) są oporne na oksacylinę i nie wykażą żadnej znaczącej śmierci komórki w czasie trwania eksperymentu. W badaniach wstępnych oznaczono stężenie 50 μg/ml. Niższe stężenia antybiotyku dawały mniejszą separację między szczepami opornymi i podatnymi, podczas gdy wyższe stężenia nie powodowały znaczącej różnicy w wynikach eksperymentalnych.
Wcześniej informowaliśmy o udanym rozwoju testu, który łączy mechaniczne i enzymatyczne naprężenia, które bezpośrednio wpływają na ścianę komórkową bakterii13, z antybiotykiem, który hamuje biosyntezę ściany komórkowej14,15. Te eksperymenty potwierdzające słuszność zasady przeprowadzono na panelu MRSA i wrażliwego na metycylinę S. aureus (MSSA). Jednak przy doborze odpowiednich parametrów eksperymentalnych, nasza metoda powinna mieć zastosowanie do wielu gatunków bakterii i wielu klas antybiotyków.

<table><tbody><tr><td>SYTOX Green</td><td>Invitrogen Corporation</td><td>S7020</td><td>Barwienie fluorescencyjne martwych komórek</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma Aldrich, Inc</td><td>A9418-5G</td><td>Używany do przechowywania lizostafiny</td></tr><tr><td>Octan sodu</td><td>Sigma Aldrich, Inc</td><td>S8750-500G</td><td>Używany do przechowywania lizostafiny</td></tr><tr><td>Lizostafina&nbsp;</td><td>Cell Sciences</td><td>CRL309A</td><td>Występuje w postaci 1 mg ciała stałego. Do przechowywania: Rozpuścić w 20 mM octanu sodu. Mieszać z roztworem BSA do końcowego stężenia 1% BSA i 100 &mikro; g/ml &nbsp; lizostafina do przechowywania&nbsp;</td></tr><tr><td>Sól oksacyliny</td><td>Sigma Aldrich, Inc</td><td>28221-1G</td><td>Antybiotyk</td></tr><tr><td>Mueller Hinton Bulion</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0757-17-6</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma Aldrixh</td><td>S3014-500G</td><td>2% dodany do bulionu Mueller-Hilton przed autoklawowaniem</td></tr><tr><td>1 ml, strzykawka Luer-lock&nbsp;</td><td>BD (Beckton, Dickinson i Comp.)</td><td>14-823-2F</td><td></td></tr><tr><td>2 uncje, strzykawka Luer-lock</td><td>BD (Beckton, Dickinson i Comp.)</td><td>309653 - 60 ml</td><td>Nadmiar do ~65 ml</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop z odwróconą fluorescencją Olympus IX-70</td><td>Cambridge Scientific</td><td>9349</td><td></td></tr><tr><td>60X, obiektyw z kontrastem fluorescencji/fazy</td><td>Olympus Corp.</td><td>LCPlan F1 60x/0.70 Ph2</td><td></td></tr><tr><td>Retiga 12-bitowa monochromatyczna kamera CCD</td><td>QImaging</td><td>RET-4000R-F-M-12-C</td><td></td></tr><tr><td>Automatyzacja</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mikroskopu Migawki kontrast fazowy/fluorescencja</td><td>PRIOR Scientific</td><td>H204/H202</td><td></td></tr><tr><td>X/Y Stage&nbsp;</td><td>PRIOR Scientific</td><td>H107AENN</td><td></td></tr><tr><td>Silnik ostrości</td><td>PRIOR Scientific</td><td>H122</td><td></td></tr><tr><td>Joystick do sterowania XYZ</td><td>PRIOR Scientific CS152EF</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proscan Controller</td><td>PRIOR Scientific</td><td>H3-XY2</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do akwizycji obrazu</td><td>Fraunhofer CMI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flow Cell Assembly i PDMS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flow Cell</td><td>BU Scientific Instruments Facility/Fraunhofer CMI</td><td>3333-1044</td><td>Rysunki techniczne zostały wykonane przez Fraunhofer CMI</td></tr><tr><td>Glass window</td><td>Fraunhofer CMI</td><td>3333-1054</td><td>Szklane okno zostało przycięte do odpowiedniego rozmiaru w Fraunhofer CMI</td></tr><tr><td>BOROFLOAT Window 50 mm x 50 mm</td><td>Edmund Optics Inc.</td><td>NT48-543</td><td></td></tr><tr><td>Płyta uszczelniająca</td><td>BU Scientific Instruments Facility</td><td>3333-1045</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko ze szkła epoksydowego</td><td>Arrayit Corporation</td><td>SuperEpoxy 2</td><td></td></tr><tr><td>PDMS master</td><td>Fraunhofer CMI</td><td>3333-1053</td><td>Master obrabiany z aluminium lub mosiądzu za pomocą UPM-0005 (ultrapresicion fly-cutting machine)</td></tr> <tr><td>PDMS slide design</td><td>Fraunhofer CMI</td><td>3333-1053</td><td></td></tr><tr><td>Nakrętka</td><td></td><td></td><td></td>do rurek</tr><tr><td>, Super bezkołnierzowa Tinytight, bez łba, 1/16 cala, PEEK, zielony&nbsp;</td><td>IDEX Health Science</td><td>M-644-03</td><td>Wejścia/wyjścia komórek przepływowych są gwintowane dla tej tulejki</td></tr><tr><td>Tulejka, Tinytight, 1/16 cala, 6-40, .030 cala TH, PEEK z pierścieniem blokującym SS,</td><td>IDEX Health Science</td><td>M-657</td><td></td></tr><tr><td>Nakrętka, Super bezkołnierzowa Tinytight, bez głowy, 1/16-1/32 cala, 1/4-28, PEEK, naturalna</td><td>IDEX Health Science</td><td>P-255</td><td></td></tr><tr><td>Skuwka, Super Falngeless, 1/16 cala, Tefzel (ETFE), żółta</td><td>IDEX Health Science</td><td>P-259</td><td>Pasuje do wężyka adaptera Luer-lock</td></tr><tr><td>, teflon FEP, .030 in x 1/16 cala x 20 ft, zielony&nbsp;</td><td>IDEX Health Science</td><td>1520G</td><td></td></tr><tr><td>Adapter z szybkozłączką żeński Luer na żeński 1/4-28, PEEK, czerwony&nbsp;</td><td>IDEX Nauka o Zdrowiu</td><td>P-658</td><td></td></tr></tbody></table>

badanie wrażliwości na antybiotyki wywołane stresem na chipie

Stress-induced Antibiotic Susceptibility Testing on a Chip

Opracowaliśmy szybką metodę mikroprzepływową do testowania wrażliwości na antybiotyki w środowisku opartym na stresie. Płyn jest przepuszczany z dużą prędkością przez bakterie unieruchomione na dnie kanału mikroprzepływowego. W obecności stresu i antybiotyku wrażliwe szczepy bakterii szybko giną. Jednak oporne bakterie przetrwają te stresujące warunki. Hipoteza stojąca za tą metodą jest nowa: aktywacja stresowa szlaków biochemicznych, które są celem antybiotyków, może przyspieszyć badanie wrażliwości na antybiotyki. W porównaniu ze standardowymi metodami badania wrażliwości antybiotyków, podczas stosowania antybiotyku pomija się etap ograniczający szybkość - wzrost bakterii. Techniczna implementacja metody polega na połączeniu standardowych technik i innowacyjnych podejść. Standardowe części metody obejmują protokoły hodowli bakteryjnej, definiowanie kanałów mikroprzepływowych w polidimetylosiloksanach (PDMS), monitorowanie żywotności komórek za pomocą fluorescencji oraz przetwarzanie obrazu partii w celu zliczania bakterii. Innowacyjne elementy tej metody polegają na wykorzystaniu przepływu pożywki hodowlanej do stosowania naprężeń mechanicznych, wykorzystaniu enzymów do uszkadzania, ale nie zabijania bakterii, oraz wykorzystaniu substratów mikromacierzy do przyczepiania bakterii. Opracowana platforma może być wykorzystywana do opracowywania i testowania leków związanych z antybiotykami i nieantybiotykami. W porównaniu ze standardowymi eksperymentami z zawiesiną bakteryjną, działanie leku może być włączane i wyłączane wielokrotnie w kontrolowanych okresach czasu. Możliwa jest powtarzalna obserwacja tej samej populacji bakterii w trakcie tego samego eksperymentu.

Dane przedstawione na Rysunku 4 pokazują odpowiedź podatnego szczepu Staphylococcus aureus w czasie w kanale mikrofluidycznym zawierającym antybiotyk. Obrazy w kontraście fazowym uzyskane w 1 min oraz na koniec 1-godzinnego eksperymentu przedstawiono na Rysunkach 4A i B. Przeanalizowane dane z 1 h pokazano na Rysunku 4C, gdzie bakterie zaznaczono kolorem czerwonym (łącznie 5 828). Odpowiednie obrazy fluorescencyjne przedstawiono na <str...

Opracowaliśmy platformę mikroprzepływową do szybkiego testowania wrażliwości na antybiotyki. Płyn jest przepuszczany z dużą prędkością przez bakterie unieruchomione na dnie kanału mikroprzepływowego. W obecności stresu i antybiotyku wrażliwe szczepy bakterii szybko giną. Jednak oporne bakterie mogą przetrwać te stresujące warunki.

Badanie wrażliwości na antybiotyki wywołane stresem na chipie

We have developed a rapid microfluidic method for antibiotic susceptibility testing in a stress-based environment. Fluid is passed at high speeds over ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest szybkie określenie podatności bakterii na antybiotyki, które są przedmiotem zainteresowania. Osiąga się to poprzez unieruchomienie bakterii w fazie logarytmicznej na dnie kanału mikroprzepływowego. W drugim etapie pożywka zawierająca antybiotyk i żywą, martwą plamę fluorescencyjną jest następnie przepychana przez kanał z dużą szybkością przepływu, stresując bakterie i aktywując ich szlaki biochemiczne ukierunkowane na antybiotyk.Obrazy kontrastowe i fluorescencyjne następnej fazy są automatycznie zbierane co dwie minuty przez godzinę w celu monitorowania żywotności bakterii, znormalizowane procenty śmierci bakterii są obliczane na podstawie uzyskanych obrazów w każdym punkcie czasowym eksperymentu. Ostatecznie fenotyp wrażliwości bakterii na antybiotyki określa się na podstawie wzrostu znormalizowanego procentu śmierci komórek w czasie. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami badania wrażliwości fenotypowej, takimi jak bulion, rozcieńczanie lub mikrohodowla, jest to, że nasza metoda nie wymaga monitorowania podziału bakterii.Zamiast tego możemy uzyskać dostęp do ich profilu podatności bezpośrednio z istniejącej małej populac

stress-induced-antibiotic-susceptibility-testing-on-a-chip

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opracowanie prostego, jednodniowego schematu przepływu pracy w diagnostyce patogenów bakteryjnych umożliwia szybkie rozpoznanie zakażeń krwi. Uwzględnienie ośmiu istotnych klinicznie celów bakteryjnych oraz ich profili oporności na antybiotyki dostarcza lekarzowi wstępnych informacji tego samego dnia, co może prowadzić do zastosowania bardziej odpowiedniej terapii.

Jednodniowy schemat przepływu pracy dla wykrywania patogenów bakteryjnych i badania oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe z posiewów krwi

Źródło: Liu, P. C., et al. Zaprojektowanie i zastosowanie niedrogiego, zautomatyzowanego morbidostatu do adaptacyjnej ewolucji bakterii przy doborze antybiotyków. J. Vis. Exp. (2016)Ten film demonstruje zastosowanie chipa mikroprzepływowego do wizualizacji i porównania wzrostu i morfologii szczepów E. coli typu dzikiego i opornych na trimetoprim w warunkach stresu związanego z antybiotykiem trimetoprimu.

Wzrost bakterii na chipie mikroprzepływowym w celu zbadania antybiotykooporności

Źródło: Zhang, M. i in., Szybkie testy podatności na środki przeciwdrobnoustrojowe poprzez stymulowane obrazowanie rozpraszania Ramana inkorporacji deuteru w pojedynczej bakterii. J. Vis. Exp. (2022)Ten film pokazuje zastosowanie stymulowanej mikroskopii rozpraszającej Ramana do oceny podatności na antybiotyki poprzez śledzenie aktywności metabolycznej oznaczanej deuterem. Poprzez monitorowanie sygnałów węgla–deuteru metoda umożliwia szybkie wykrywanie populacji bakterii odpornych i podatnych.

Wykrywanie podatności na antybiotyki bakteryjne za pomocą stymulowanego mikroskopu rozpraszającego Ramana

Ten film demonstruje test biosensoryczny konduktometryczny do badania interakcji przeciwciała z docelowym antygenem unieruchomionym na chipie przetwornika. Bioczujnik został zaprojektowany tak, aby zawierał dwufunkcyjne białko chimeryczne – enzym β-laktamazy z funkcjonalnym miejscem katalitycznym połączonym z nanolitem w celu związania się z unieruchomionym antygenem docelowym. Po związaniu katalityczna hydroliza substratu antybiotykowego przez enzym β-laktamazę generuje sygnał elektryczny –...

Test biosensoryczny konduktometryczny na bazie β-laktamazy do interakcji białko-białko

Opisujemy tani, konfigurowalny morbidostat, który umożliwia charakterystykę oporności na antybiotyki poprzez dynamiczne dostosowywanie stężenia leku. Urządzenie można zintegrować z multipleksowaną platformą mikroprzepływową. Podejście to można rozszerzyć na potrzeby laboratoryjnych badań nad opornością na antybiotyki.

Opracowanie i zastosowanie niedrogiego, zautomatyzowanego morbidostu do adaptacyjnej ewolucji bakterii pod wpływem doboru antybiotyków

Testy synergii przeciwdrobnoustrojowej są używane do oceny efektu dwóch lub więcej antybiotyków stosowanych w połączeniu i zazwyczaj są wykonywane za pomocą jednej z dwóch metod: szachownicy lub testu zabijania czasu. W tym miejscu przedstawiamy zautomatyzowaną, wspomaganą drukarką atramentową technikę synergii tablicy szachownicowej oraz klasyczne badanie synergii zabijania czasu.

Testowanie synergii przeciwdrobnoustrojowej za pomocą zautomatyzowanej tablicy szachownicy wspomaganej drukarką atramentową i ręcznej metody zabijania czasu

Ten protokół przedstawia szybki test wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe (AST) w ciągu 2,5 godziny poprzez stymulowane pojedynczymi komórkami obrazowanie metabolizmu D2O. Metoda ta ma zastosowanie do bakterii w moczu lub środowisku krwi pełnej, które są transformujące dla szybkiego jednokomórkowego fenotypowego AspAT w klinice.

Szybkie badanie wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe za pomocą obrazowania stymulowanego rozpraszania Ramana indukcji deuteru w pojedynczej bakterii

Ten protokół opisuje projekt i użycie chipa izolacyjnego (iChip) do hodowli in situ opornych mikrobów glebowych w ich naturalnym środowisku. Opisano w nim również hodowlę in situ bakterii glebowych wytwarzających środki przeciwdrobnoustrojowe. Protokół można dostosować do odzyskiwania bakterii z różnych nisz o innych pożądanych właściwościach.

In Situ Izolacja i hodowla opornych bakterii glebowych za pomocą chipa izolacyjnego (iChip)

Niniejszy protokół opisuje w pełni zintegrowaną metodę LAMP opartą na chipie mikroprzepływowym, umożliwiającą w ciągu jednej godziny wykrycie w punkcie opieki (point-of-care) 15 patogenów wywołujących infekcje dolnych dróg oddechowych u pacjentów na oddziałach intensywnej terapii.

Szybka detekcja w miejscu opieki (point-of-care) patogenów wywołujących zakażenia dolnych dróg oddechowych u pacjentów na oddziałach intensywnej terapii

Zaprezentowano bezsoczewkową platformę do fluorescencyjnej mikroskopii na chipie, która umożliwia obrazowanie obiektów fluorescencyjnych w bardzo szerokim polu widzenia, np. &gt;0,6-8 cm2, z rozdzielczością &lt;4μm, przy użyciu algorytmu dekodującego opartego na próbkowaniu kompresyjnym. Taka kompaktowa modalność obrazowania fluorescencyjnego na chipie z szerokim polem widzenia może być cenna w cytometrii wysokoprzepustowej, badaniach rzadkich komórek oraz analizach mikromacierzy.

Bezosobnikowa mikroskopia fluorescencyjna na chipie

Poznaj szybką metodę testowania wrażliwości bakterii na antybiotyki przy użyciu platformy mikrofluidycznej. Technika umożliwia ocenę żywotności komórek w czasie rzeczywistym bez konieczności monitorowania podziałów bakteryjnych.

Badanie wrażliwości na antybiotyki wywołane stresem na chipie

Przeglądaj więcej filmów