Badanie wrażliwości na antybiotyki wywołane stresem na chipie

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest szybkie określenie podatności bakterii na antybiotyki, które są przedmiotem zainteresowania. Osiąga się to poprzez unieruchomienie bakterii w fazie logarytmicznej na dnie kanału mikroprzepływowego. W drugim etapie pożywka zawierająca antybiotyk i żywą, martwą plamę fluorescencyjną jest następnie przepychana przez kanał z dużą szybkością przepływu, stresując bakterie i aktywując ich szlaki biochemiczne ukierunkowane na antybiotyk.

Obrazy kontrastowe i fluorescencyjne następnej fazy są automatycznie zbierane co dwie minuty przez godzinę w celu monitorowania żywotności bakterii, znormalizowane procenty śmierci bakterii są obliczane na podstawie uzyskanych obrazów w każdym punkcie czasowym eksperymentu. Ostatecznie fenotyp wrażliwości bakterii na antybiotyki określa się na podstawie wzrostu znormalizowanego procentu śmierci komórek w czasie. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami badania wrażliwości fenotypowej, takimi jak bulion, rozcieńczanie lub mikrohodowla, jest to, że nasza metoda nie wymaga monitorowania podziału bakterii.

Zamiast tego możemy uzyskać dostęp do ich profilu podatności bezpośrednio z istniejącej małej populacji. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku diagnozowania opornych infekcji bakteryjnych, ponieważ metoda jest szybka, można ją łatwo multipleksować i automatyzować Aby utworzyć warstwę PDMS, zacznij od odgazowania świeżo przygotowanej lepkiej mieszaniny PDMS w komorze próżniowej w temperaturze pokojowej po godzinie, użyj wagi, aby wypełnić aluminiową formę wstępnie zdefiniowaną masą mieszaniny PDMS DGA. Powoli wylej PDMS na środek formy, uważając, aby forma była wypoziomowana, a kołki odkryte.

Utwardź PDMS przez noc w piekarniku o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego ranka zwolnij górną płytkę formy i ostrożnie wyjmij utwardzony PDMS z formy, aby zmontować komórkę przepływową. Najpierw umieść szklane okienko w kieszeni komory przepływowej.

Następnie połóż szkiełko z powlekanego szkła na szklanym oknie wewnątrz kieszeni komory przepływowej aktywną stroną do góry. Świeżo utworzona warstwa PDMS z kanałami skierowanymi w dół na wierzchu, tak aby wejścia kanałów wyrównywały się z otworami przelotowymi w metalowej płycie. Delikatnie wypchnij powietrze spomiędzy warstw, a następnie odwróć zespół prowadnicy szklanej PDMS tak, aby PDMS był skierowany w stronę szklanej szyby.

Załóż wejścia kanału PDMS na otwory przelotowe w metalowej płycie, a następnie umieść płytę dociskową na górze i dokręć. Teraz umieść zmontowaną komórkę przepływową pod mikroskopem, ustaw powiększenie mikroskopu na 60 x i wstępnie wyrównaj pozycje kanałów, aby przygotować bakterie w fazie logarytmicznej do załadowania do komórki przepływowej zmieszanych 50 mikrolitrów interesującej nas kolonii bakteryjnej z nocnej hodowli w 50 mililitrach świeżego bulionu MH two. Inkubować przez trzy godziny z wytrząsaniem przy 250 obr./min i 37 stopniach Celsjusza, po tym jak subkultura odwirować 10 mililitrów kultury przez dwie minuty w temperaturze 1,650 razy G i temperaturze pokojowej.

Następnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze świeżej pożywki MH dwa. Następnie podłącz krótki odcinek rurki do jednomililitrowej strzykawki i przepłucz rurkę jednym mililitrem pożywki, pozostawiając niewielką ilość pożywki w rurce, aby uniknąć pęcherzyków powietrza podczas wciągania zawiesiny bakteryjnej. Następnie załaduj 0,7 mililitra bakterii do strzykawki i wypełnij dwa kanały komory przepływowej hodowlą komórek bakteryjnych.

Przezroczystość kanału zmienia się, gdy jest on wypełniony bakteriami. Następnie inkubuj komórkę przepływową przez 45 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby bakterie mogły przyczepić się do powierzchni szkiełka. Aby przygotować roztwory do eksperymentu.

Najpierw napełnij dwie 60-mililitrowe strzykawki świeżo przygotowanym roztworem kontrolnym i dwie 60-mililitrowe strzykawki świeżo przygotowanym roztworem antybiotyku. Przesuń strzykawki, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza, a następnie podłącz rurkę wejściową, przepychając odpowiednie roztwory przez koniec rurki. Roztwory należy przechowywać owinięte w folię aluminiową, aby uniknąć degradacji odczynników pod wpływem światła.

Teraz zamontuj strzykawki z roztworem eksperymentalnym na pompie, pojedynczo. W razie potrzeby ściśnij ich tłoki, aby dopasować je do pompy. Zablokować strzykawki za pomocą poprzeczki przytrzymującej strzykawkę.

Ustaw prędkość pompy na jeden mililitr na minutę, a objętość pompy na 60 mililitrów i przepłucz pompę, aż ze wszystkich strzykawek będzie widoczny stały przepływ cieczy. Teraz rozpocznij eksperyment od wyjęcia komory przepływowej z inkubatora i zamontowania jej na wstępnie nieprawidłowo ustawionym stoliku mikroskopowym. Następnie podłącz jedną rurkę wejściową wychodzącą ze strzykawki i jedną rurkę wyjściową prowadzącą do butelki na odpady do każdego z kanałów komórki przepływowej.

W tym momencie eksperyment jest w pełni skonfigurowany i gotowy do rozpoczęcia. Ustaw czas akwizycji kontrastu fazowego na 10 milisekund, a czas akwizycji fluorescencji na 1600 milisekund, a następnie uzyskaj obrazy kontrastu fazowego i fluorescencji dla każdej pozycji przed zainicjowaniem przepływu. Należy pamiętać, że przed rozpoczęciem obrazu przepływu skupienie się na dnie kanału może być nieosiągalne ze względu na duże zagęszczenie załadowanych bakterii w kanale.

Teraz rozpocznij przepływ cieczy. Natychmiast sprawdź, czy mikroskop jest skupiony na dnie kanałów. Następnie wykonaj zdjęcia kontrastu fazowego i fluorescencji obszarów docelowych w ciągu pierwszej minuty przepływu.

Obrazy należy pobierać co dwie minuty po pierwszym zestawie obrazów, aż do 60 minut przepływu. W razie potrzeby ponownie ustawiając ostrość, aby upewnić się, że eksperyment przebiega prawidłowo, można zbadać uzyskane dane dotyczące kontrastu fazowego i fluorescencji. W tej próbce danych podatny szczep został załadowany do kanałów pierwszego i drugiego, podczas gdy szczep oporny znajdował się w kanałach trzecim i czwartym.

Pod koniec eksperymentu uruchom cykl czyszczenia z sekwencyjnym nakładaniem wybielacza i wody. Napełnij cztery 20-mililitrowe strzykawki 10 mililitrami 10% roztworu wybielacza i cztery 60-mililitrowe strzykawki di wodą. Po usunięciu bąbelków podłącz strzykawki wypełnione wybielaczem do komory przepływowej i ustaw prędkość pompy na jeden mililitr na minutę, a objętość pompy na trzy mililitry.

Uruchom pompę na trzy minuty, monitoruj czyszczenie kanału na ekranie. Po trzech minutach zastrzykaj strzykawki z wybielaczem strzykawkami z wodą i pracuj przez 30 minut z prędkością jednego mililitra na minutę. Na koniec policz liczbę bakterii na każdym obrazie za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu.

Oblicz znormalizowany procent śmierci komórek bakteryjnych w funkcji czasu, korzystając z tego wzoru, gdzie NF jest równy liczbie martwych bakterii zliczonej w liczbie obrazów fluorescencyjnych. A NP równa się całkowitej liczbie bakterii określonej na podstawie obrazu kontrastu fazowego. Pokazane tutaj obrazy ilustrują zależną od czasu reakcję podatnego szczepu Staphylococcus aria na oksacylinę wewnątrz mikroprzepływowej komory przepływowej.

Ćwiartki te pokazują obrazy kontrastu fazowego uzyskane minutę po rozpoczęciu eksperymentu i po jednej godzinie z odpowiadającymi im obrazami fluorescencyjnymi pokazanymi tutaj. Pod koniec eksperymentu obserwuje się znaczny wzrost liczby bakterii fluorescencyjnych, co wskazuje na śmierć komórki w obrębie kanału i podatność szczepu na antybiotyk ze względu na stochastyczną niejednorodność poszczególnych szkiełek pokrytych żywicą epoksydową. W trakcie eksperymentu może dojść do utraty komórek bakteryjnych pod wpływem długotrwałego stresu, aby uwzględnić tę zmienność, każdy obraz fluorescencyjny populacji martwych komórek jest normalizowany za pomocą obrazu kontrastu fazowego nabytego co, co daje całkowitą populację komórek z dokładnością do jednej sekundy tego samego punktu czasowego.

Rozszerzenia te pokazują, że algorytm zliczania jest bardziej skuteczny w dokładnym zliczaniu pojedynczych bakterii na obrazach fluorescencyjnych niż w gęsto wypełnionych obrazach kontrastu fazowego. Barwienie martwych komórek daje wysoki kontrast fluorescencji dla poszczególnych martwych bakterii. Ponieważ liczba bakterii fluorescencyjnych rzadko przekracza 5% całkowitej liczby, każda bakteria jest bardzo jasna w porównaniu z tłem.

Dlatego bakterie fluorescencyjne można łatwo policzyć z dużą dokładnością. Na przykład w tym eksperymencie z 5 828 wszystkich wykrytych bakterii, zaznaczonych na czerwono, 174 zostały uznane za martwe. Znormalizowane dane MSSA i Mr.RSA dla trzech różnych eksperymentów są zilustrowane zgodnie z oczekiwaniami dla opornych szczepów, znormalizowana śmierć komórki jest niska i nie zmienia się w trakcie eksperymentu.

Wrażliwe szczepy wykazują jednak stały wzrost śmierci komórek i wyższą wartość większą niż 1% pod koniec eksperymentu. Inicjacja śmierci komórki u wrażliwych szczepów różni się nieznacznie w zależności od eksperymentu, ale zwykle następuje między 10 a 30 minutami. Nie zapominaj, że praca z patogenami opornymi na antybiotyki może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak technika septyczna.

Technika ta utoruje naukowcom drogę do zbadania, w jaki sposób bakterie reagują na stres i wpłynie na rozwój nowatorskiej szybkiej diagnostyki oraz odkrycie nowych leków.