Name: Ratowanie rekombinowanego wirusa rzekomego pomoru drobiu z cDNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-11T23:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Poznaj metodę ratowania rekombinowanego wirusa rzekomego pomoru drobiu z cDNA poprzez infekcję komórek ssaczych wirusem pomocniczym i transfekcję plazmidów. Technika ta umożliwia rozwój wektorów szczepionkowych i terapeutycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować byłym i obecnym członkom laboratoriów dr Petera Palese i Adolfo García-Sastre za rozwój technik odwróconej genetyki NDV i za pomoc techniczną. Badania nad wirusem rzekomego pomoru drobiu w laboratorium AG-S są częściowo finansowane z grantu NIAD R01AI088770 oraz przez Centrum Doskonałości ds. Pojawiających się i Odzwierzęcych Chorób Zwierząt Departamentu Bezpieczeństwa Wewnętrznego (CEEZAD, numer nagrody 2010-ST-061-AG001). Badania w laboratorium LM-S są finansowane przez granty NIH RO1 AI077719, R21NS075611-01, R03AI099681-01A1, NIAID Centers of Excellence for Influenza Research and Surveillance (HHSN266200700008C) oraz The University of Rochester Center for Biodefense Immune Modeling (HHSN272201000055C).

1. Przygotowanie komórek ssaków (Rysunek 4A, Dzień 1)
Podziel komórki HEp-2 lub A549 dzień przed transfekcją na płytki 6-dołkowe. Gęstość komórek powinna osiągnąć 80-90% zbieżności następnego dnia. Zwykle zlewającą się naczynie o średnicy 100 mm można podzielić na 8 dołków (około 1 x 106 komórek na studzienkę). Dla każdego wirusa, który ma zostać uratowany, należy uwzględnić 2-4 różne studzienki, a także 2 dodatkowe studzienki do kontroli pCAGGs-GFP i pCITE-GFP18, mające na celu monitorowanie odpowiednio skuteczności transfekcji i infekcji MVA-T7.
2. Zakażenie komórek ssaków rekombinowanym zmodyfikowanym wirusem krowianki Ankara wykazującym ekspresję polimerazy bakteriofaga T7 RNA (MVA-T7) (Figura 4A, Dzień 2)
<ol>
	<li>Rozgrzej PBS 1x/BA/PS i podłoże w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Przemyć komórki dwukrotnie 1 ml PBS 1x/BA/PS.</li>
	<li>Zakażone hodowane komórki ssaków wirusem MVA-T7 przy wielokrotności infekcji (moi) wynoszącej 1 pfu/komórkę w końcowej objętości 200 μl w PBS/BA/PS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Podczas inkubacji infekcji wirusowej należy przygotować mieszankę transfekcyjną zgodnie z opisem w punkcie 3.</li>
</ol>
3. Transfekcja komórek ssaków (Rysunek 4A, Dzień 2)
<ol>
	<li>Przygotowanie lipopektaminy: Wymieszać 1-2 μg LPF2000 z 250 μl OptiMEM przy każdej próbie ratunkowej i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotowanie DNA: Przygotuj koktajl plazmidowy dla każdego uratowanego pacjenta w 50 μl OptiMEM. Dodać 0,4 μg pTM1-NP, 0,2 μg pTM1-P i 0,2 μg pTM1-L na probówkę. Dodać 1 μg pełnowymiarowego klonu cDNA NDV, który ma zostać uratowany, do każdej probówki. Przygotuj również dwie transfekcje kontrolne, jedną z 2 μg pCAGGs-GFP (w celu sprawdzenia skuteczności transfekcji), a drugą z 2 μg pCITE-GFP (w celu sprawdzenia ekspresji sterowanej polimerazą T7 przez MVA-T7).</li>
	<li>Po wstępnej inkubacji roztworu LPF2000-OptiMEM przez 5 minut (etap 3.1) dodać 250 μl roztworu do probówek DNA (etap 3.2) i inkubować przez 20-30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Po inkubacji z MVA-T7 usunąć inokulum wirusa przez aspirację i zastąpić mieszanką transfekcji DNA-LPF2000 (krok 3.3).</li>
	<li>Dodaj 1 ml DMEM 10% FBS/PS do każdego dania.</li>
	<li>Inkubować zakażone/transfekowane komórki przez 6-8 godzin (lub przez noc) w temperaturze 37 °C, 5% CO2 , a następnie zastąpić pożywkę do transfekcji 1,5 ml świeżego DMEM 10% FBS/PS.</li>
	<li>Po 24 godzinach od transfekcji studzienki kontrolne można obserwować pod mikroskopem fluorescencyjnym w celu oceny skuteczności transfekcji (pCAGGs-GFP) i aktywności polimerazy T7 (pCITE-GFP) (ryc. 5A). Kontynuuj kohodowlę zakażonych/transfekowanych komórek z ptasimi fibroblastami, jak opisano poniżej.</li>
</ol>
4. Współhodowla komórek ssaków z komórkami ptaków (Rysunek 4A, Dzień 3)
Zazwyczaj, na dwie transfekowane studzienki używa się 100-milimetrowego naczynia do hodowli tkankowej z fibroblastów zarodków kurczaka (CEF) lub kaczki (DEF). Pamiętaj, aby wcześniej przygotować wystarczającą ilość 100 mm naczyń do hodowli tkankowych komórek ptaków na wszystkie próby ratowania. W celu skutecznego uratowania wirusa, pożywkę DMEM 10% FBS/PS uzupełnia się 5% płynu omoczniowego i 30 mM MgCl2. W tym momencie, po 24 godzinach p.i., komórki ssaków mogą zacząć wykazywać efekt cytopatyczny (CPE) z powodu infekcji MVA-T7, co jest widoczne na rycinie 5A.
<ol>
	<li>Rozgrzej PBS 1x i pożywkę do temperatury 37 °C.</li>
	<li>Umyj komórki ssaków, 2x, 1 ml PBS 1x.</li>
	<li>Trypsynizować komórki ssaków 0,2 ml EDTA-trypsyny, aż do ich odłączenia. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml DMEM 10% FBS/PS, 5% płynu omoczniowego, 30 mM MgCl2 i przenieść do 100 mm naczynia do hodowli tkankowej. Dodać 3 ml tego samego podłoża.</li>
	<li>Umyć komórki ptaków dwukrotnie 4 ml PBS 1x.</li>
	<li>Trypsynizować komórki ptasie za pomocą 1 ml EDTA-trypsyny i inkubować przez 1-2 minuty w temperaturze 37 °C, aż komórki się odłączą. Zawiesić komórki, dodając 8 ml DMEM 10% FBS/PS, 5% płynu omoczniowego, 30 mM MgCl2 i dodać 4 ml komórek trypsynizowanych do komórek ssaków w kokulturowanym naczyniu do hodowli tkankowej o średnicy 100 mm na łączną objętość 8 ml (4 ml komórek ssaków, 4 ml komórek ptaków).</li>
	<li>Delikatnie wstrząsnąć ręcznie współhodowanymi komórkami w naczyniu o średnicy 100 mm w celu uzyskania równomiernego rozkładu, a następnie umieścić je w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 3-4 dni. Kryteria zakażenia jaj 3 lub 4 dni po wspólnej hodowli komórek ssaków i ptaków zależą od tego, jak duży efekt cytopatyczny (zaokrąglenie komórek, śmierć, oderwanie od powierzchni itp.) obserwuje się w zakażeniu wirusem MVA-T7.</li>
</ol>
5. Zakażenie jaj zarodkowych kurcząt (Rysunek 4A, dni 6-7)
<ol>
	<li>Po 3-4 dniach kohodowli komórek ssaków i ptaków należy pobrać 1 ml supernatantu z hodowli tkankowej i dodać do probówki Eppendorfa.</li>
	<li>Odwirować supernatant kultur tkankowych przez 1 minutę przy 12 000 obr./min w wirówce stołowej w celu usunięcia resztek komórkowych.</li>
	<li>Świeczić jajka za pomocą lekkiego pudełka do świecowania, aby zobaczyć granicę faz między workiem powietrznym a jamą omocznikową. Zaznacz na granicy interfejsu, unikając lokalizacji naczyń krwionośnych. Rozpyl jaja 70% etanolem, aby stworzyć sterylne warunki. Delikatnie zrobić otwór w skorupce jajka w zaznaczonym miejscu i zaszczepić 500 μl supernatantu za pomocą strzykawki insulinowej (1 ml), kierując igłę pionowo i bezpośrednio do jamy omocznikowej. (Rysunek 4B).</li>
	<li>Uszczelnij nacięcie w skorupce jajka roztopionym woskiem lub parafiną.</li>
	<li>Inkubować jaja przez 2-3 dni w temperaturze 37 °C.</li>
</ol>
6. Pobieranie płynu omoczniowego z zakażonych jaj zarodków kurzych (Rysunek 4A, dni 8-10)
<ol>
	<li>Zakażone jaja należy inkubować przez 2-4 godziny lub przez noc w temperaturze 4 °C w celu zabicia zarodka kurczaka i skrzepnięcia krwi.</li>
	<li>Spryskaj jajka 70% etanolem (w celu utrzymania sterylnych warunków).</li>
	<li>Ostrożnie postukaj łyżką w wierzchołkową część jajka nad jamą powietrzną. Po pęknięciu skorupki jajka usuń fragmenty kleszczami i całkowicie odsłonij błonę omocznikową.</li>
	<li>Odsłonić jamę omocznikową, wycinając błonę omocznikową kleszczami i nożyczkami, unikając uszkodzenia naczyń krwionośnych i żółtka.</li>
	<li>Ostrożnie dociśnij zarodek szpatułką i zbierz płynący płyn omoczniowy (8-12 ml na jajo) za pomocą pipety o pojemności 10 ml. Unikaj uszkadzania błony żółtkowej. Przenieś płyn omoczniowy do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml na lodzie (użyj jednej probówki na jajko).</li>
	<li>Sklarować płyn omoczniowy, wirując przez 5 minut przy 1 500 obr./min. Przenieść supernatant do świeżej probówki, nie naruszając osadu.</li>
	<li>Próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 tygodnia, do czasu sprawdzenia ich na obecność NDV za pomocą testu hemaglutynacji.</li>
</ol>
7. Test hemaglutynacji (HA)
Obecność wirusa w płynie omocznikowym z zakażonych jaj można określić makroskopowo na podstawie ich zdolności do hemaglutynacji czerwonych krwinek indyka (RBC). W przypadku NDV potrzeba około 106 jednostek tworzących płytkę miażdżycową (pfu) na ml, aby dać pozytywny sygnał w teście HA. Testy HA przeprowadza się na 96-dołkowych płytkach z dnem w kształcie litery V. Ujemne (PBS 1x, niezakażony płyn omoczniowy), jak również dodatnie (płyn omoczniowy z dowolnego wirusa NDV) próbki kontrolne powinny być zawsze włączone do każdego testu HA w celu jego walidacji. Aby wykonać test HA:
<ol>
	<li>Odpipetować 50 μl PBS 1x na dołek w 96-dołkowej płytce z dnem w kształcie litery V.</li>
	<li>Pobrać pipetą 50 μl próbek płynu omoczniowego do studzienek na pierwszej kolumnie płytki. Wykonać 2-krotne seryjne rozcieńczenia przez pozostałą część płytki i wyrzucić ostatnie, dodatkowe 50 μl z dołków w ostatniej kolumnie.</li>
	<li>Dozować 50 μl 0,5% erytrocytów z indyka w PBS 1x na dołek. Delikatnie potrząśnij talerzem, stukając.</li>
	<li>Inkubować płytkę w temperaturze 4 °C (lub lodu) przez 30-45 minut lub do momentu, gdy w studzienkach kontroli ujemnej utworzy się klarowna osadka.</li>
</ol>

<ol><li>Lamb, R. A., Parks, G. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLamb%2C+RA+%22Fields+Virology%22">Fields Virology</a>. Howley, P. H., Knipe, D. M. , Lippincott Williams & Wilkins. 1647-1689 (2007).</li>
<li>Schnell, M. J., Mebatsion, T., Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectious+rabies+viruses+from+cloned+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Infectious rabies viruses from cloned cDNA.</a> EMBO J. 13, 4195-4203 (1994).</li>
<li>Peeters, B. P., de Leeuw, O. S., Koch, G., Gielkens, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+Newcastle+disease+virus+from+cloned+cDNA%3A+evidence+that+cleavability+of+the+fusion+protein+is+a+major+determinant+for+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Rescue of Newcastle disease virus from cloned cDNA: evidence that cleavability of the fusion protein is a major determinant for virulence.</a> J. Virol. 73, 5001-5009 (1999).</li>
<li>Romer-Oberdorfer, A., Mundt, E., Mebatsion, T., Buchholz, U. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+recombinant+lentogenic+Newcastle+disease+virus+from+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Generation of recombinant lentogenic Newcastle disease virus from cDNA.</a> J. Gen. Virol. 80 (Pt 11), 2987-2995 (1999).</li>
<li>Nakaya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+Newcastle+disease+virus+as+a+vaccine+vector%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Recombinant Newcastle disease virus as a vaccine vector.</a> J. Virol. 75, 11868-11873 (2001).</li>
<li>Zamarin, D., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncolytic+Newcastle+disease+virus+for+cancer+therapy%3A+old+challenges+and+new+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Oncolytic Newcastle disease virus for cancer therapy: old challenges and new directions.</a> Future Microbiol. 7, 347-367 (2012).</li>
<li>Park, M. S., Garcia-Sastre, A., Cros, J. F., Basler, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newcastle+disease+virus+V+protein+is+a+determinant+of+host+range+restriction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Newcastle disease virus V protein is a determinant of host range restriction.</a> J. Virol. 77, 9522-9532 (2003).</li>
<li>Park, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newcastle+disease+virus+%28NDV%29-based+assay+demonstrates+interferon-antagonist+activity+for+the+NDV+V+protein+and+the+Nipah+virus+V%2C+W%2C+and+C+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Newcastle disease virus (NDV)-based assay demonstrates interferon-antagonist activity for the NDV V protein and the Nipah virus V, W, and C proteins.</a> J. Virol. 77, 1501-1511 (2003).</li>
<li>Zamarin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+oncolytic+properties+of+recombinant+newcastle+disease+virus+through+antagonism+of+cellular+innate+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Enhancement of oncolytic properties of recombinant newcastle disease virus through antagonism of cellular innate immune responses.</a> Mol. Ther. 17, 697-706 (2009).</li>
<li>Vigil, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+reverse+genetics+to+enhance+the+oncolytic+properties+of+Newcastle+disease+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Use of reverse genetics to enhance the oncolytic properties of Newcastle disease virus.</a> Cancer Res. 67, 8285-8292 (2007).</li>
<li>Swayne, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+paramyxovirus+type+1-avian+influenza-H7+virus+as+a+vaccine+for+protection+of+chickens+against+influenza+and+Newcastle+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Avian+Dis%22%5BJournal%5D)">Recombinant paramyxovirus type 1-avian influenza-H7 virus as a vaccine for protection of chickens against influenza and Newcastle disease.</a> Avian Dis. 47, 1047-1050 (2003).</li>
<li>Park, M. S., Steel, J., Garcia-Sastre, A., Swayne, D., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+viral+vaccine+constructs+with+dual+specificity%3A+avian+influenza+and+Newcastle+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Engineered viral vaccine constructs with dual specificity: avian influenza and Newcastle disease.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 8203-8208 (2006).</li>
<li>Carnero, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+human+immunodeficiency+virus+gag+expression+by+newcastle+disease+virus+vectors+for+the+induction+of+potent+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Optimization of human immunodeficiency virus gag expression by newcastle disease virus vectors for the induction of potent immune responses.</a> J. Virol. 83, 584-597 (2009).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+type+I+interferon+secretion+through+recombinant+Newcastle+disease+virus+expressing+measles+virus+hemagglutinin+stimulates+antibody+secretion+in+the+presence+of+maternal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Induction of type I interferon secretion through recombinant Newcastle disease virus expressing measles virus hemagglutinin stimulates antibody secretion in the presence of maternal antibodies.</a> J. Virol. 85, 200-207 (2011).</li>
<li>DiNapoli, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newcastle+disease+virus%2C+a+host+range-restricted+virus%2C+as+a+vaccine+vector+for+intranasal+immunization+against+emerging+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Newcastle disease virus, a host range-restricted virus, as a vaccine vector for intranasal immunization against emerging pathogens.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 9788-9793 (2007).</li>
<li>Martinez-Sobrido, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+against+respiratory+syncytial+virus+by+a+recombinant+Newcastle+disease+virus+vector%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Protection against respiratory syncytial virus by a recombinant Newcastle disease virus vector.</a> J. Virol. 80, 1130-1139 (2006).</li>
<li>Bukreyev, A., Collins, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newcastle+disease+virus+as+a+vaccine+vector+for+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Newcastle disease virus as a vaccine vector for humans.</a> Curr. Opin. Mol. Ther. 10, 46-55 (2008).</li>
<li>Martinez-Sobrido, L., Zuniga, E. I., Rosario, D., Garcia-Sastre, A., de la Torre, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+the+type+I+interferon+response+by+the+nucleoprotein+of+the+prototypic+arenavirus+lymphocytic+choriomeningitis+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of the type I interferon response by the nucleoprotein of the prototypic arenavirus lymphocytic choriomeningitis virus.</a> J. Virol. 80, 9192-9199 (2006).</li>
<li>Jennings, S., Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A., Weber, F., Kochs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thogoto+virus+ML+protein+suppresses+IRF3+function%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Thogoto virus ML protein suppresses IRF3 function.</a> Virology. 331, 63-72 (2005).</li>
<li>Kochs, G., Garcia-Sastre, A., Martinez-Sobrido, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+anti-interferon+actions+of+the+influenza+A+virus+NS1+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Multiple anti-interferon actions of the influenza A virus NS1 protein.</a> J. Virol. 81, 7011-7021 (2007).</li>
<li>Munoz-Jordan, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+alpha%2Fbeta+interferon+signaling+by+the+NS4B+protein+of+flaviviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of alpha/beta interferon signaling by the NS4B protein of flaviviruses.</a> J. Virol. 79, 8004-8013 (2005).</li>
<li>Cardenas, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ebola+virus+VP35+protein+binds+double-stranded+RNA+and+inhibits+alpha%2Fbeta+interferon+production+induced+by+RIG-I+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Ebola virus VP35 protein binds double-stranded RNA and inhibits alpha/beta interferon production induced by RIG-I signaling.</a> J. Virol. 80, 5168-5178 (2006).</li>
<li>Mibayashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+retinoic+acid-inducible+gene+I-mediated+induction+of+beta+interferon+by+the+NS1+protein+of+influenza+A+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of retinoic acid-inducible gene I-mediated induction of beta interferon by the NS1 protein of influenza A virus.</a> J. Virol. 81, 514-524 (2007).</li>
<li>Kopecky-Bromberg, S. A., Martinez-Sobrido, L., Frieman, M., Baric, R. A., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus+open+reading+frame+%28ORF%29+3b%2C+ORF+6%2C+and+nucleocapsid+proteins+function+as+interferon+antagonists%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Severe acute respiratory syndrome coronavirus open reading frame (ORF) 3b, ORF 6, and nucleocapsid proteins function as interferon antagonists.</a> J. Virol. 81, 548-557 (2007).</li>
<li>Rose, K. M., Elliott, R., Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A., Weiss, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+coronavirus+delays+expression+of+a+subset+of+interferon-stimulated+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Murine coronavirus delays expression of a subset of interferon-stimulated genes.</a> J. Virol. 84, 5656-5669 (2010).</li>
<li>Roth-Cross, J. K., Martinez-Sobrido, L., Scott, E. P., Garcia-Sastre, A., Weiss, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+the+alpha%2Fbeta+interferon+response+by+mouse+hepatitis+virus+at+multiple+levels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of the alpha/beta interferon response by mouse hepatitis virus at multiple levels.</a> J. Virol. 81, 7189-7199 (2007).</li>
<li>Andersson, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crimean-Congo+hemorrhagic+fever+virus+delays+activation+of+the+innate+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Virol%22%5BJournal%5D)">Crimean-Congo hemorrhagic fever virus delays activation of the innate immune response.</a> J. Med. Virol. 80, 1397-1404 (2008).</li>
<li>Lawson, N. D., Stillman, E. A., Whitt, M. A., Rose, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+vesicular+stomatitis+viruses+from+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Recombinant vesicular stomatitis viruses from DNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 4477-4481 (1995).</li>
<li>Kato, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+Sendai+virus+multiplication+from+transfected+cDNA+or+RNA+with+negative+or+positive+sense%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cells%22%5BJournal%5D)">Initiation of Sendai virus multiplication from transfected cDNA or RNA with negative or positive sense.</a> Genes Cells. 1, 569-579 (1996).</li>
<li>Durbin, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+infectious+human+parainfluenza+virus+type+3+from+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Recovery of infectious human parainfluenza virus type 3 from cDNA.</a> Virology. 235, 323-332 (1997).</li>
<li>Zhao, H., Peeters, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+Newcastle+disease+virus+as+a+viral+vector%3A+effect+of+genomic+location+of+foreign+gene+on+gene+expression+and+virus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Recombinant Newcastle disease virus as a viral vector: effect of genomic location of foreign gene on gene expression and virus replication.</a> J. Gen. Virol. 84, 781-788 (2003).</li>
<li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((At+least+six+nucleotides+preceding+the+AUG+initiator+codon+enhance+translation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">At least six nucleotides preceding the AUG initiator codon enhance translation in mammalian cells.</a> J. Mol. Biol. 196, 947-950 (1987).</li>
<li>Calain, P., Roux, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rule+of+six%2C+a+basic+feature+for+efficient+replication+of+Sendai+virus+defective+interfering+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">The rule of six, a basic feature for efficient replication of Sendai virus defective interfering RNA.</a> J. Virol. 67, 4822-4830 (1993).</li>
<li>Wyatt, L. S., Moss, B., Rozenblatt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-deficient+vaccinia+virus+encoding+bacteriophage+T7+RNA+polymerase+for+transient+gene+expression+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Replication-deficient vaccinia virus encoding bacteriophage T7 RNA polymerase for transient gene expression in mammalian cells.</a> Virology. 210, 202-205 (1995).</li>
<li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li>
<li>Moss, B., Elroy-Stein, O., Mizukami, T., Alexander, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Product+review.+New+mammalian+expression+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Product review. New mammalian expression vectors.</a> Nature. 348, 91-92 (1990).</li>
<li>Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+genetics+of+mononegavirales%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top.+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Reverse genetics of mononegavirales.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 283, 1-41 (2004).</li>
</ol>

Adolfo García-Sastre jest wynalazcą patentów na rekombinowane wirusy rzekomego pomoru drobiu, które są własnością Icahn School of Medicine w Mount Sinai.

Aby osiągnąć dobre wyniki podczas ratowania NDV, należy wziąć pod uwagę kilka czynników. Po pierwsze, konstrukt cDNA o pełnej długości, który ma być użyty, musi zostać zaprojektowany tak, aby umożliwić funkcjonalną inkorporację nowych transgenów/modyfikacji do genomu NDV. Oznacza to, jak stwierdzono powyżej, że (i) w razie potrzeby należy dodać odpowiednie sekwencje końca genu (GE), międzygenowe (IG) i początek genu (GS); (ii) nie ma przypuszczalnych sekwencji GE lub GS w obcym genie, oraz (iii) pełny rekombinowany genom...

Wirus rzekomego pomoru drobiu (NDV), ptasi paramyksowirus należący do rodzaju Avulavirus 1, jest istotnym z ekonomicznego punktu widzenia, a tym samym szeroko badanym i nadzorowanym czynnikiem odzwierzęcym, który może poważnie wpłynąć na hodowlę drobiu na całym świecie. Chociaż NDV nie jest ludzkim patogenem, został również dokładnie przebadany poza dziedziną weterynarii, zarówno jako modelowy paramyksowirus, jak i ze względu na jego bardzo interesujące, naturalne właściwości onkolityczne6. Badania nad NDV przyniosły ogromne korzyści z rozwoju technik genetyki odwrotnej dla jednoniciowych, niesegmentowanych wirusów RNA o ujemnym sensie, po raz pierwszy opisanych dla wirusa wścieklizny przez Conzelmanna i współpracowników2. Od tego czasu szeroko badane są różne genetycznie zmodyfikowane NDV, przenoszące obce geny lub modyfikacje ich genomu typu dzikiego. Praca z tymi rekombinowanymi wirusami miała kluczowe znaczenie dla scharakteryzowania różnych czynników wirulencji, nie tylko NDV, ale także innych istotnych patogenów ludzkich, takich jak wirus grypyA 7 - lub pojawiający się wirus Nipah8. Ponadto w wielu różnych badaniach analizowano zastosowanie tych technik w celu poprawy wrodzonej aktywności przeciwnowotworowej NDV6,9,10, głównie poprzez wzmocnienie właściwości immunostymulujących wirusa. Innym istotnym obszarem badań nad rekombinowanymi NDV było opracowanie potencjalnych szczepionek przeciwko innym chorobom wirusowym, takim jak grypa5,11,12, HIV13, odra14, SARS15 lub choroba wywoływana przez wirusa sincytialnego układu oddechowego (RSV)16. Wśród różnych godnych uwagi zalet zapewnianych przez NDV jest brak wcześniej istniejącej odporności w populacjach ludzkich, stabilność obcych insercji genetycznych, brak aktywności rekombinacyjnej i ogólnie wysoki profil bezpieczeństwa w połączeniu z wyżej wymienionymi naturalnymi właściwościami immunostymulującymi17. Warto również zwrócić uwagę na potencjalne zastosowanie rekombinowanych szczepionek dwuwalentnych u drobiu, chroniących zarówno przed NDV, jak i wysoce zjadliwymi wirusami ptasiej grypy11,12. Może to być doskonały sposób na zmniejszenie ryzyka rozprzestrzenienia się tej ostatniej ze zwierząt dzikich na udomowione, a tym samym pomoc w zapobieganiu ewentualnemu międzygatunkowemu przeskokowi przerażającej ptasiej grypy na ludzi. Wreszcie, NDV z ekspresją reporterową wykorzystano do oceny wrodzonej odpowiedzi immunologicznej, a także do identyfikacji antagonisty interferonu kodowanego przez wiele wirusów18-27.
Proces ratunkowy rekombinowanego, niesegmentowanego, ujemnie niciowego wirusa RNA zasadniczo polega na sztucznym wymuszaniu cyklu replikacji wirusa w komórce produkującej poprzez transfekcję cDNA kodującego minimalną infekcyjną maszynerię molekularną, znaną jako rybonukleoproteina lub RNP (Rysunek 2). RNP składają się z polimerazy wirusowej (białka P i L), nukleoproteiny (NP) i antygenomowego RNA wirusa o pełnej długości. Ten antygenom RNA+ jest matrycą wymaganą do wytworzenia komplementarnych genomów RNA-, który, związany również z pozostałymi białkami wirusowego RNP, rekapituluje ten sam kompleks zakaźny, który naturalny wirus uwolniłby na cytoplazmie komórki po infekcji (Figura 2A). Począwszy od tego etapu, cykl wirusowy może przebiegać naturalnie i zostaną wygenerowane rekombinowane wiriony, otaczające zmodyfikowane genomy (ryc. 2B). Co ciekawe, transfekcja genomowego cDNA zamiast antygenomicznego cDNA znacznie osłabia lub całkowicie znosi skuteczność ratunkową2,28-30. Nawet w przypadku transfekcji antygenomowego cDNA skuteczność enkapdykacji rekombinowanego RNA do RNP w transfekowanych komórkach jest prawdopodobnie bardzo niska. Z tego powodu protokoły ratunkowe dla NDV często obejmują różne etapy amplifikacji kilku cząstek wirusa uwolnionych z pierwotnie transfekowanych komórek poprzez kokulturację ich z komórkami permisywnymi i/lub przez zakażenie zarodków jajowych.
Przed uratowaniem, cDNA może być manipulowane za pomocą standardowych procedur klonowania w celu wygenerowania pożądanych modyfikacji. Podczas gdy specyficzne mutacje różnych produktów genowych i sekwencji regulatorowych wirusa można łatwo osiągnąć w ten sposób, wiele opublikowanych prac dotyczących rekombinowanego NDV wymagało dodania nowej jednostki transkrypcyjnej do genomu NDV. Podobnie jak inni członkowie rodziny paramyksowirusów, genom NDV koduje osiem różnych białek w sześć jednostek transkrypcyjnych, które ulegają zróżnicowanej ekspresji w zależności od ich lokalizacji względem końca 3' w malejącym gradiencie krytycznym dla cyklu życia wirusa1. Z tego powodu lokalizacja nowej jednostki transkrypcyjnej w genomie musi być starannie dobrana, aby osiągnąć równowagę między ekspresją transgenu a upośledzeniem replikacji wirusa. Najczęściej stosowano insercję między genami P i M, chociaż inne miejsca również zostały przetestowane13,31.
Bez względu na to, co zostanie wstawione, klonowanie do cDNA NDV musi być zgodne z pewnymi zasadami, aby wygenerować konstrukt, który można uratować: (i) każdy nowy gen, który ma być włączony do genomu NDV, musi być pod kontrolą odpowiednich sygnałów dla wirusowej polimerazy RNA zależnej od RNA. Sekwencje te muszą być dodane przed nową otwartą ramką odczytu (ORF), aby polimeraza mogła rozpoznać koniec poprzedniego genu (GE) i początek nowego transgenu (GS), oddalone od siebie pojedynczą sekwencją międzygenową nukleotydu (IG). Dodanie prawidłowej sekwencji Kozak (K) w celu poprawy eukariotycznej translacji rybosomalnej jest również zalecane w celu uzyskania lepszej ekspresji obcych białek32; (ii) skuteczna replikacja NDV, podobnie jak w przypadku większości członków rodziny Paramyxoviridae, zależy od długości genomu będącej wielokrotnością sześciu33; w związku z tym każde wprowadzenie do NDV musi być zgodne z tą "zasadą sześciu". W razie potrzeby wymagane dodatkowe nukleotydy można dodać za nowym ORF; oraz (iii) sekwencja transgenu powinna zostać sprawdzona w celu znalezienia możliwych sekwencji podobnych do GE i GS, które mogłyby upośledzać skuteczność ratunkową, ekspresję transgenu i/lub żywotność wirusa. Jeśli są obecne, sekwencje te muszą zostać usunięte przez cichą mutagenezę. Generowanie rekombinowanego cDNA o pełnej długości zgodnie z powyższymi zasadami jest pierwszym krokiem w celu wydajnego wytworzenia genetycznie zmodyfikowanego NDV, jak opisano tutaj.
W systemie wszystkie konstrukty DNA są pod kontrolą promotora polimerazy RNA T7 (Rysunek 3). Ta polimeraza cytoplazmatyczna jest dostarczana w trans przez koinfekcję rekombinowanym zmodyfikowanym wirusem krowianki Ankara (MVA-T7)34. Rysunek 3A przedstawia plazmid pNDV-B1, który koduje antygenomowe cDNA5 o pełnej długości. Rysunek 3B przedstawia plazmidy pTM1 kodujące NP, P i L ORF. Jako kontrole stosuje się plazmidy pCITE-GFP, które kodują pod promotorem T7 białko zielonej fluorescencji (GFP) i pCAGGs GFP18, które koduje ten sam ORF pod promotorem beta aktyny kurczaka 35. W tym protokole pokazujemy procedurę ratowania rekombinowanego NDV z cDNA lentogennego szczepu NDV Hitchner B15 (Figura 4).

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>CORNING Cellgro</td><td>10-013-CV</td><td>Dowolny dostawca</td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>GIBCO</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 (LPF2000)</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>35% Albumina bydlęca (BA)</td><td>Sigma</td><td>232-936-2</td><td>Dowolny dostawca</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>CORNING Cellgro</td><td>25-052-CI</td><td>Dowolny dostawca</td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna (PS) 100x</td><td>CORNING Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td>Dowolny dostawca</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Hyclon</td><td>SH30070.03</td><td>Dowolny dostawca</td></tr><tr><td colspan="4"> Linie komórkowe Komórki A549 (numer katalogowy CRL-185), komórki HEp-2 (numer katalogowy CRL-185), fibroblasty zarodków kurzych (numer katalogowy CRL-12203) i fibroblasty zarodków kaczki (numer katalogowy CCL-141) to dostępne w American Type Culture Collection (ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA. 20110-2209 USA). Wszystkie linie komórkowe są utrzymywane w 37 & stopniach; Inkubator C z 5% CO2 w DMEM 10% FBS, 1% PS. Zarodki kurze Zarodki kurze można uzyskać w Charles River Laboratories, Specific Pathogen Fee Avian Supply (SPAFAS) Produkty i usługi dla ptaków (Franklin Commons, 106 Route 32, North Franklin, CT 06254, USA) i są utrzymywane w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Żywotność zarodków ocenia się za pomocą świecy do jaj. Jaja są zakażone, gdy osiągną wiek 8-10 dni. Zarówno zakażenie, jak i pobranie płynu omoczniowego odbywa się w sterylnych warunkach. Wszystkie jaja są sterylizowane w autoklawie i wyrzucane zgodnie ze standardowymi laboratoryjnymi protokołami bezpieczeństwa biologicznego. Czerwone krwinki z indyka (RBC) Turkey RBC można kupić w Truslow Farms (201 Valley Road, Chestertown, Md 21620, USA) i przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Aby przygotować erytrocyty do oznaczania kwasu hialuronowego, przemyć 5 ml bulionu handlowego 45 ml PBS 1x w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Wirować przez 5 minut przy 1 000 obr./min i ostrożnie wyrzucić supernatant. Rozcieńczyć granulowane RBC 1:1,000 w PBS 1x, aby uzyskać końcowe stężenie 0,5-1,0%. Umyte RBC można przechowywać w temperaturze 4 & deg; C przez kilka dni. Plasmids Preparaty plazmidowe uzyskuje się z dowolnym dostępnym na rynku zestawem maxiprep następującym producent&#039; s instrukcje, rozcieńczone w ddH20 do końcowego stężenia 1 &mu; g/&mu; l i przechowywane w temperaturze -20 stopni Celsjusza. Stężenie i czystość DNA ocenia się za pomocą spektrofotometrii przy 260 i 280 nm. Preparaty o stosunku 260/280 wyższym niż 1,8 są uważane za akceptowalne dla akcji ratunkowej. Jakość plazmidowego DNA jest również rutynowo dwukrotnie sprawdzana za pomocą chromatografii żelowej agarozowej. Viruses Opisany protokół ratowania lentogennego szczepu NDV Hitchner B1 może być przeprowadzony w warunkach poziomu bezpieczeństwa biologicznego (BSL) 2. Zmodyfikowana krowianka Ankara wyrażająca polimerazę RNA T7 (MVA-T7) została opisana pod numerem 34 i uzyskana od dr Bernarda Mossa. Wirus ten rośnie w zlewających się monowarstwach fibroblastów zarodków kurczaka i miareczkuje się w komórkach ssaków (A549 lub HEp-2). Stada NDV są hodowane w zarodkach jaj kurzych i miareczkowane za pomocą IFA przy użyciu surowicy poliklonalnej hodowanej przeciwko oczyszczonym wirionom. Wszystkie skażone materiały powinny być bezpiecznie sterylizowane i utylizowane zgodnie ze standardowymi procedurami bezpieczeństwa biologicznego. Pożywki i roztwory do hodowli tkankowych: DMEM 10% FBS 1% PS: Dulbecco&#039; s zmodyfikowany Orzeł&#039; s Pożywka (DMEM) uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i penicyliną/streptomycyną (P/S): 445 ml DMEM, 50 ml inaktywowanego termicznie FBS, 5 ml 100x komercyjny roztwór P/S. Przechowywać w temperaturze 4 & st. C. 10x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS): 80 g NaCl, 2 g KCl, 11,5 g Na2HPO4.7H2O, 2 g KH2PO4. Dodać ddH2O do 1 L. Dostosuj pH do 7,3. Sterylizuj w autoklawie. Przechowywać w temperaturze pokojowej. <silny>1x PBS:</mocny> Rozcieńczyć 10x PBS 1:10 z ddH2O. Sterylizować w autoklawie i przechowywać w temperaturze pokojowej. <silny>100x Ca/Mg: </mocny> 1,327 g CaCl2,2H2O, 2,133 g MgCl2,6H2O i dodać ddH2O do 100 ml. Autoklaw i przechowywać w temperaturze pokojowej. 1x PBS/BA/PS: 50 ml 10x Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) w 437 ml ddH2O. Autoklaw i po schłodzeniu do temperatury pokojowej dodać 5 ml 100x penicyliny/streptomycyny, 3 ml 35% bydła i 5 ml 100x Ca/Mg. Przechowywać w temperaturze 4 < stopni Celsjusza/> </td></tr></tbody></table>

ratowanie rekombinowanego wirusa rzekomego pomoru drobiu z cdna

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

Wirus rzekomego pomoru drobiu (NDV), prototypowy przedstawiciel rodzaju Avulavirus z rodziny Paramyxoviridae1, jest niesegmentowanym, jednoniciowym, otoczkowym wirusem RNA (Rysunek 1) z potencjalnymi zastosowaniami jako wektor do szczepień i leczenia chorób ludzkich. Dogłębne badanie tych zastosowań stało się możliwe dopiero po ustanowieniu technik genetyki odwrotnej w celu ratowania rekombinowanych wirusów przed plazmidami kodującymi ich pełne genomy jako cDNA2-5. CDNA wirusa można wygodnie modyfikować in vitro przy użyciu standardowych procedur klonowania w celu zmiany genotypu wirusa i/lub włączenia nowych jednostek transkrypcyjnych. Ratowanie takich genetycznie zmodyfikowanych wirusów stanowi cenne narzędzie do zrozumienia czynników wpływających na wiele etapów infekcji, a także pozwala na opracowanie i ulepszenie wektorów do ekspresji i dostarczania antygenów do szczepień i terapii. Tutaj opisujemy protokół ratowania rekombinowanych NDV.

Rekonstrukcja NDV jest dobrze ugruntowaną procedurą, rutynowo wykonywaną w laboratoriach posiadających dostęp do pełnego cDNA wirusa. Jednakże immanentny stochastyczny charakter tej metody utrudnia osiągnięcie 100% wydajności rekonstrukcji. Monitorowanie wczesnych etapów procesu, w szczególności wydajności transfekcji oraz zakażenia MVA-T7, pomaga w identyfikacji potencjalnych problemów. Rysunek 5A przedstawia standardową wydajność transfekcji oraz transfekcji/zakażenia, która jest wystarczająca do pomyś...

Wirus rzekomego pomoru drobiu (NDV) był intensywnie badany w ciągu ostatnich kilku lat w celu opracowania nowych wektorów do szczepień i terapii, między innymi. Badania te były możliwe dzięki technikom ratowania rekombinowanego wirusa z cDNA, takim jak te, które tutaj opisujemy.

Ratowanie rekombinowanego wirusa rzekomego pomoru drobiu z cDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Ogólnym celem tej procedury jest uratowanie rekombinowanego wirusa rzekomego pomoru drobiu lub NDV ze sklonowanego DNA. Osiąga się to poprzez najpierw zakażenie komórek ssaków wirusem pomocniczym kodującym polimerazę T siedem, a następnie transekcję tych komórek plazmidami, kodującymi minimalną maszynerię replikacyjną wirusa pod kontrolą promotora T siedem. Drugim krokiem jest kohodowla transfekowanych komórek ssaków z komórkami ptaków, które pochodzą od naturalnych gospodarzy wirusa.Nowo wygenerowane variany uwolnione z komórek ssaków zainfekują komórki ptaków w pierwszej rundzie amplifikacji. Następnie supernatant kokultury jest inokulowany do zarodków kurzych w celu dalszego wzrostu uratowanego wirusa, ostatnim krokiem jest pobranie płynu LAN toic z zaszczepionych jaj. Ostatecznie prosty test narodu hemaglutyniny jest używany do wykazania obecności NDV w płynie LAN i powodzenia procesu ratunkowego.Rekombinowane wirusy uratowane tą metodą mogą dostarczyć informacji na temat różnych czynników wpływających na zakażenie, a także mogą być wykorzystywane jako wektory do dostarczania antygenów do szczepień i terapii przeciwnowotworowej. Aby rozpocząć dzielenie wątroby ssaków na dwie lub 5 49 komórek na dzień przed transfekcją na płytkach sześciodołkowych, gęstość komórek powinna osiągnąć 80 do 90% zbiegu następnego dnia. Dla każdego wirusa, który ma zostać uratowany, należy dołączyć od dwóch do czterech różnych studzienek.Uwzględniono również dwie dodatkowe studzienki dla kontrolnych PCA, GFP i pite, GFP miało na celu monitorowanie odpowiednio skuteczności transfekcji i MVAT siedmiu infekcji. Umyj komórki dwukrotnie jednym mililitrem podgrzanego PBS, a następnie zainfekuj hodowane komórki ssaków wirusem MVA T seven przy wielokrotności infekcji wynoszącej jeden PFU na komórkę. W końcowej objętości 200 mikrolitrów w PBS pozostawić komórki do inkubacji przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej podczas inkubacji infekcji wirusowej, przygotować mieszankę transfekcyjną zgodnie z opisem w tekście pisanym po przygotowaniu optymalnego roztworu lipektomii i wstępnej inkubacji przez pięć minut.250 mikrolitrów roztworu do probówek DNA i inkubować przez 20 do 30 minut w temperaturze pokojowej po inkubacji z MVAT 7, usunąć inokulum wirusa przez aspirację i zastąpić mieszanką do transfekcji DNA lipo. Dodaj jeden mililitr DMEM 10% FBS do każdego dania. Inkubuj zakażone transfekowane komórki przez sześć do ośmiu godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla.Następnie zastąp pożywkę do transfekcji 1,5 mililitra świeżego DMEM 10% FBS Po 24 godzinach od transfekcji można obserwować studzienki kontrolne pod mikroskopem fluorescencyjnym w celu oceny skuteczności transfekcji i aktywności polimerazy T siedem przed przystąpieniem do kohodowli zakażonych transfekowanych komórek ssaków z ptasimi fibroblastami. Zwykle na dwie transfekowane studzienki stosuje się zlewające się 100-milimetrowe naczynie z hodowlą tkankową fibroblastów zarodków kurczaka lub kaczki. Pamiętaj, aby przygotować się odpowiednio wcześniej.100 milimetrowe szalki do hodowli tkankowych komórek ptaków na wszystkie próby ratowania w celu skutecznego ratowania wirusa. Pożywka DMEM 10%FBS jest uzupełniona 5% płynem toikowym elan i 30 milimolowym chlorkiem magnezu. Po dwukrotnym umyciu komórek ssaków podgrzaną trypsyną XPBS oczy komórki z 0,2 mililitra trypsyny EDTA, aż się oderwą.Ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze uzupełnionego DMEM i przenieść do 100-milimetrowej naczynia do hodowli tkankowej w trzech mililitrach tego samego podłoża. Po dwukrotnym umyciu komórek ptasich podgrzaną trypsyną XPBS oczy komórki z jednym mililitrem trypsyny EDTA i inkubować przez jedną do dwóch minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż komórki się oderwą. Ponownie zawiesić komórki ptasie, dodając osiem mililitrów przygotowanej pożywki.Następnie dodaj cztery mililitry komórek ptaków inizowane trypsami do komórek ssaków w 100-milimetrowym naczyniu do hodowli tkankowej z kokulturą Uzyskać łączną objętość ośmiu mililitrów. Delikatnie wstrząśnij wyhodowanymi komórkami w 100-milimetrowym naczyniu, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie, a następnie umieść je w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza na trzy do czterech dni. Jaja są zakażone, gdy wszystkie komórki hodowane co są dotknięte efektem cytopatycznym z powodu infekcji wirusowej MVAT seven.W tym momencie należy usunąć jeden mililitr supernatantu z hodowli tkankowych i dodać go do wirówki probówkowej DPH. Supernatant do hodowli tkankowej przez jedną minutę przy 12 000 obr./min w wirówce stołowej. Aby usunąć resztki komórkowe, zapal jaja za pomocą lekkiego pudełka do konserwowania, aby zobaczyć interfejs między workiem powietrznym a jamą Alan Toic.Zaznacz na granicy interfejsu, unikając lokalizacji naczyń krwionośnych. Rozpyl jaja 70% etanolem, aby stworzyć sterylne warunki. Delikatnie zrób otwór w skorupce jajka w zaznaczonym miejscu.Następnie zaszczepić 500 mikrolitrów snatu za pomocą jednomililitrowej strzykawki, kierując igłę pionowo i bezpośrednio do jamy Alan Toic. Uszczelnij nacięcie w skorupce jajka roztopionym woskiem lub parafiną. Wysiaduj jaja przez dwa do trzech dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Inkubuj zakażone jaja przez dwie do czterech godzin lub przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby zabić zarodek kurczaka i skrzepnąć krew. Spryskaj jajka 70% etanolem, aby utrzymać sterylne warunki. Ostrożnie postukaj łyżką w wierzchołkową część jajka nad jamą powietrzną.Po rozbiciu skorupki jajka usuń fragmenty kleszczami i całkowicie odsłonij błonę LAN toic. Odsłoń jamę toic LAN, wycinając błonę laryngologiczną kleszczykami i nożyczkami, unikając uszkodzenia naczyń krwionośnych i dębu. Ostrożnie dociśnij zarodek szpatułką i zbierz płynący do góry płyn LAN za pomocą 10-mililitrowej pipety.Unikaj uszkadzania błony żółtkowej. Przenieś płyn LAN toic do 15-mililitrowej probówki wirówkowej na lodzie. Sklaruj płyn toiczny LAN, wirując przez pięć minut przy 1500 obr./min.Przenieść supernatant do świeżej probówki, nie naruszając osadu. Próbki należy przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do jednego tygodnia, aż do sprawdzenia ich na obecność NDV za pomocą testu Hemagglutynin Nation. Obecność wirusa w płynie Alan Toic z zakażonych jaj można określić makroskopowo na podstawie ich zdolności do hemaglutyniny ośmiu czerwonych krwinek z indyka, próbek kontroli negatywnej, takich jak jeden XPBS lub niezakażony płyn Alan Toic, a także pozytywnych próbek kontrolnych, takich jak płyn Al Toic z dowolnego wirusa NDV, należy zawsze włączać do każdego testu HA w celu jego walidacji.Aby przeprowadzić test HA, należy pipetować 50 mikrolitrów po jednym XPBS na studzienkę w 96-dołkowej płytce V z dnem, a następnie pipetować 50 mikrolitrów próbek płynu LAN toic do studzienek w pierwszej kolumnie płytki. Przeprowadzić dwukrotne seryjne rozcieńczanie przez pozostałą część płytki i wyrzucić ostatnie dodatkowe 50 mikrolitrów z dołków. W ostatniej kolumnie dozować 50 mikrolitrów 0,5% czerwonych krwinek z indyka w jednym XPBS na studzienkę, delikatnie potrząsnąć płytką, stukając w inkubację płytki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 do 45 minut lub do momentu, gdy w studzienkach kontroli ujemnej utworzy się klarowna osadka.Wczesne kroki w procedurze ratunkowej NDV mogą być monitorowane, w szczególności skuteczność transfekcji i zakażenie MVAT 7 pokazane tutaj. Reprezentatywne obrazy fluorescencyjne i w jasnym polu 5 49 komórek transfekowanych PAG GFP lub zakażonych MVAT siedem i transfekowanych P osiem GFP konstytutywnych. Ekspresja GFP sterowana przez PCA jest wskaźnikiem wydajności transfekcji, podczas gdy ekspresja GFP sterowana przez promotor T siedem w miejscu P jest kontrolą infekcji MVAT siedem i aktywności polimerazy T siódemki.Obrazy pokazują skuteczność transfekcji i infekcji transfekcyjnej, która jest wystarczająca do skutecznego uratowania NDV po rundach amplifikacji w kokulturach ssaków ptasich i zarodkowych jajach, obecność uratowanego wirusa jest wykrywana przez dodatnie dołki w teście HA. NDV indukuje hemaglutyninę poprzez wiązanie erytrocytów i w ten sposób zapobiega ich sedymentacji na dnie studzienki w kształcie litery V. Dlatego brak aktywności HA można łatwo odróżnić po utworzeniu czerwonej okrągłej osadki czerwonych krwinek, jak pokazano tutaj w kontroli negatywnej i jednym ujemnym wyniku z trzech nieznanych próbek uzyskanych po akcji ratunkowej.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak uratować rekombinowany wirus rzekomego pomoru drobiu z CDNA z wysoką odtwarzalnością.

rescue-of-recombinant-newcastle-disease-virus-from-cdna

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Odzyskiwanie wirusów grypy typu A z plazmidowego DNA jest podstawową i niezbędną techniką eksperymentalną, która pozwala badaczom grypy na generowanie wirusów rekombinowanych w celu badania wielu aspektów biologii wirusa grypy, a także do wykorzystania ich jako potencjalnych wektorów lub szczepionek.

Generowanie rekombinowanego wirusa grypy z plazmidowego DNA

System genetyki odwrotnej dla szczepionkowego szczepu MP-12 wirusa gorączki Doliny Rift jest użytecznym narzędziem do tworzenia dodatkowych mutantów MP-12 o zwiększonej atenuacji i immunogenności. Opisujemy protokół generowania i charakteryzacji szczepów mutantów NSs.

Wykorzystanie genetyki odwrotnej do manipulacji genem NSs szczepu MP-12 wirusa gorączki doliny Rift w celu poprawy bezpieczeństwa i skuteczności szczepionki

Source: Yuan, M., et al. A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the process of performing a fluorescent plaque assay using recombinant vaccinia virus encoding red fluorescent protein (RFP) in fibroblast cells, followed by plaque isolation and purification for further analysis.

Fluorescence-Based Detection and Purification of Recombinant Vaccinia Virus

Ratowanie rekombinowanych arenawirusów ze sklonowanych cDNA, podejście określane jako genetyka odwrotna, pozwala badaczom badać rolę określonych produktów genowych wirusa, a także wkład ich różnych specyficznych domen i reszt, w wielu różnych aspektach biologii arenawirusa. Podobnie, techniki genetyki odwrotnej w zatwierdzonych przez FDA liniach komórkowych (Vero) do opracowywania szczepionek zapewniają nowe możliwości generowania skutecznych i bezpiecznych szczepionek do zwalczania ludzkich...

Generowanie rekombinowanego arenawirusa do opracowania szczepionki w komórkach Vero zatwierdzonych przez FDA

W ciągu ostatnich 15 lat, wektory pochodzące od psiego adenowirusa typu 2 (CAV2) udowodniły swoją skuteczność w transdukcji komórek in vitro i in vivo i są szeroko stosowane w szczepieniach i terapii genowej. W tym miejscu opisujemy procedurę konstruowania, wytwarzania i oczyszczania wektorów CAV2, w wyniku której powstają zawiesiny wirusa o wysokim mianie.

Produkcja i oczyszczanie niereplikacyjnych wektorów pochodnych adenowirusa psów typu 2

Tutaj przedstawiono protokół tworzenia zakaźnego bakteryjnego sztucznego chromosomu zawierającego pełnowymiarowe cDNA pozytywnej nici genomowego RNA wirusa japońskiego zapalenia mózgu. Protokół ten może być wykorzystany do skonstruowania funkcjonalnego cDNA innych wirusów o dodatniej nici RNA, co czyni go potężnym narzędziem genomicznym do badania biologii wirusów.

Sztuczne chromosomy bakteryjne: funkcjonalne narzędzie genomiczne do badania wirusów o dodatniej nici RNA

Opisujemy metodę generowania i amplifikacji genetycznie modyfikowanych syncytialnych wirusów oddechowych (RSV) oraz zoptymalizowany test płytki nazębnej dla RSV. Ilustrujemy ten protokół, tworząc dwa rekombinowane wirusy, które odpowiednio umożliwiają ilościowe określenie replikacji RSV i analizę na żywo ciał inkluzyjnych RSV i dynamiki granulek związanych z ciałami inkluzyjnymi.

Wytwarzanie, amplifikacja i miareczkowanie rekombinowanych syncytialnych wirusów oddechowych

Niedawna epidemia wirusa Zika podkreśla znaczenie ustanowienia odwrotnego podejścia genetycznego do opracowania szczepionek i/lub strategii terapeutycznych. W tym miejscu opisujemy protokół ratowania zakaźnego rekombinowanego wirusa Zika z pełnowymiarowego klonu cDNA złożonego w bakteryjnym sztucznym chromosomie pod kontrolą ludzkiego wirusa cytomegalii o natychmiastowym wczesnym promotorze.

Uratowanie rekombinowanego wirusa Zika z bakteryjnego klonu cDNA ze sztucznego chromosomu

Tutaj przedstawiamy szczegółową procedurę produkcji, oczyszczania i kwantyfikacji rekombinowanego wirusa rzekomego pomoru drobiu o wysokim mianie. Protokół ten konsekwentnie daje &gt; 6 × 109 jednostek tworzących blaszki miażdżycowe/ml, zapewniając ilości wirusa odpowiednie do badań in vivo na zwierzętach. Opisano dodatkowe testy kontroli jakości w celu zapewnienia bezpieczeństwa in vivo.

Wytwarzanie rekombinowanego wirusa rzekomego pomoru drobiu o wysokim mianie z płynu omoczniowego

Ten artykuł o protokole opisuje metodologię mikroiniekcji retrowirusa RCAS(A) do embrionalnej soczewki kurczaka jako narzędzia do badania funkcji in situ i ekspresji białek podczas rozwoju soczewki.

Mikroiniekcja rekombinowanego retrowirusa RCAS(A) do soczewki embrionalnej kurczaka

Ten artykuł przedstawia uproszczoną metodę przygotowania 4 jednostek hemagglutynacji antygenu do testów serologicznych wirusa rzekomego pomoru drobiu. Dzięki dokładnemu określeniu miana hemaglutynacji antygenu, w połączeniu z bardziej rygorystyczną metodą miareczkowania wstecznego i dobrze zdefiniowanym procesem regulacji, zwiększa wydajność testu, zmniejsza liczbę wyników fałszywie dodatnich i poprawia nadzór nad chorobami u drobiu.

Optymalizacja preparatu antygenowego do oznaczania hamowania hemaglutynacji wirusa rzekomego pomoru drobiu

Poznaj metodę ratowania rekombinowanego wirusa rzekomego pomoru drobiu z cDNA poprzez infekcję komórek ssaczych wirusem pomocniczym i transfekcję plazmidów. Technika ta umożliwia rozwój wektorów szczepionkowych i terapeutycznych.

Ratowanie rekombinowanego wirusa rzekomego pomoru drobiu z cDNA

Przeglądaj więcej filmów