Utrzymanie Drosophila

Powodzenie badań nad Drosophila melanogaster zależy od prawidłowego utrzymania i hodowli tego cennego organizmu modelowego. W poniższym filmie omówione zostaną niezbędne kroki wymagane do zapewnienia odpowiedniego odżywiania, zakwaterowania oraz obchodzenia się z muszką.

Choć potocznie znana jako muszka owocówka, Drosophila melanogaster w rzeczywistości żywi się mikroorganizmami, takimi jak drożdże, które rozwijają się na fermentujących owocach. W warunkach laboratoryjnych dieta muchy jest modyfikowana w celach praktycznych. Dostępnych jest kilka receptur, a wszystkie zawierają niezbędne składniki: cukier i drożdże. Poniższa receptura pochodzi z Uniwersytetu Indiana w Bloomington, słynącego z ogromnej różnorodności szczepów much. Składa się ona z: wody sterylnej, drożdży, mąki sojowej, żółtej mąki kukurydzianej, agaru dla nadania odpowiedniej konsystencji, syropu kukurydzianego oraz kwasu propionowego w celu zahamowania wzrostu pleśni i bakterii. Składniki te są łączone, podgrzewane, mieszane, a następnie rozlewane do plastikowych fiolek hodowlanych za pomocą pompy. Po napełnieniu fiolki są zatykane watą, owijane i chłodzone w temperaturze 4 °C. Po zestaleniu pożywka jest sterylizowana w autoklawie.

Po zapoznaniu się z dietą muszek, przyjrzyjmy się temu, gdzie one żyją i w jaki sposób się z nimi pracuje.

Do hodowli muszek wykorzystuje się różne rodzaje pojemników. Probówki służą do utrzymywania populacji i optymalnie zawierają 50-100 osobników dorosłych. Butelki stosuje się do większych kultur, w których znajduje się 300-600 dorosłych muszek. Inkubatory kontrolują warunki środowiskowe i mogą pomieścić setki probówek oraz butelek. Standardowe warunki przechowywania muszek to 25 °C i 60-65% wilgotności względnej.

Podczas pracy z muszkami ważne jest stosowanie właściwego etykietowania i dokumentacji oraz utrzymywanie czystości otoczenia, aby zachować integralność linii muszek i eksperymentów. Pojemnik należy zmienić, gdy około połowa poczwerek przejdzie w stadium imago, czyli opuści poczwarkową łupinę. Łupiny te stają się wówczas przezroczyste.

Dla informacji: stadium poczwarki występuje pomiędzy stadium larwalnym a imago i jest to czas, w którym larwy inkubują i rozwijają się w osobniki dorosłe. Aby stwierdzić, że łupiny poczwarek są przezroczyste, należy przyłożyć pojemnik do źródła światła i obejrzeć poczwarkę.

Muszki przenosi się do fiolek ze świeżym medium — fachową nazwą pożywki dla muszek — za pomocą procesu znanego jako "flipping flies" (przesypywanie muszek). Przed przeniesieniem muszek należy sprawdzić stan pożywki. Muszki nie przeżyją na pożywce spękanej z wysuszenia lub zanieczyszczonej pleśnią bądź bakteriami.

Aby przenieść muszki, najpierw delikatnie ostukaj fiolkę o blat, aby strząsnąć muszki ze ścianek naczynia. Następnie szybko usuń korek i sprawnie odwróć fiolkę, przesypując muszki ze starego pojemnika do nowego. Proces ten wykonuje się szybko, aby zapobiec ucieczce muszek lub ich zmiażdżeniu przez korek, a także aby zapobiec dostaniu się do wnętrza fiolek przypadkowych osobników podczas przenoszenia.

Choć przenoszenie much przez wytrzepywanie jest preferowaną metodą masowego transferu Drosophila, do sortowania much niezbędne jest ich znieczulenie. W niniejszym materiale omówione zostaną dwie metody znieczulania: schładzanie oraz zastosowanie dwutlenku węgla. Aby schłodzić muchy, należy umieścić kulturę w zamrażarce o temperaturze -20 °C na 8-12 minut. Następnie muchy przenosi się na schłodzoną, płaską powierzchnię roboczą w celu selekcji. Muchy można również znieczulić zimnem, schładzając je bezpośrednio na zamrożonej powierzchni.

Dwutlenek węgla jest preferowaną metodą znieczulania, ponieważ nie powoduje on gwałtownej śmiertelności much ani nie stwarza zagrożenia dla badacza. System podawania CO2 składa się z: butli z CO2; rurki połączonej z igłą, służącej do znieczulania much w fiolkach i butelkach; oraz rurki połączonej z płytką do CO2, przeznaczonej do analiz pod mikroskopem.

Aby znieczulić muchy, należy wprowadzić igłę z CO2 przez korek. Alternatywnie można opukać pojemnik o powierzchnię, usunąć korek i szybko wysypać muchy na płytkę do CO2, utrzymując szczelne zamknięcie do momentu, aż muchy przestaną się poruszać. Za pomocą pędzelka lub pęsety należy delikatnie przenieść muchy do nowego pojemnika.

Niepotrzebne muchy należy usunąć do „morgu dla much”, który składa się z dużej butelki wypełnionej izopropanolem lub etanolem oraz olejem mineralnym, zwieńczonej lejkiem.

Po zapoznaniu się ze sposobami utrzymywania i obchodzenia się z muchami w laboratorium, przyjrzyjmy się temu, jak modyfikuje się warunki ich zakwaterowania i żywienia na potrzeby różnych eksperymentów.

Niektóre eksperymenty wymagają zastosowania alternatywnych form zakwaterowania, aby pomieścić większą liczbę much.

W tym eksperymencie badacz wykorzystuje klatkę populacyjną dla much w celu zebrania dużej ilości embrionów. Klatka populacyjna to przezroczyste, plastikowe pudełko zdolne pomieścić tysiące much. Badacz uwalnia odpowiednie muchy z kilku butelek do klatki populacyjnej, a następnie umieszcza w niej płytki agarowe do zbierania embrionów.

Niektóre eksperymenty wymagają manipulacji dietą much.

W tym eksperymencie badacz chce zaobserwować reakcję ucieczki u much transgenicznych, które wykazują ekspresję aktywowanego światłem kanału jonowego w neuronach regulujących reakcję ucieczki much. Dieta Drosophila jest wzbogacona o "all-trans-retinal", który jest kofaktorem tego kanału i umożliwia jego funkcjonowanie. Odbywa się to poprzez stopienie pożywki i dodanie odczynnika. Następnie mucha jest wystawiona na działanie niebieskiego światła, które aktywuje kanał i wywołuje reakcję ucieczki, a czas lotu zostaje zmierzony.

Na potrzeby eksperymentów można manipulować wieloma warunkami zakwaterowania i obchodzenia się ze zwierzętami.

W tym eksperymencie stworzono rozbudowaną konstrukcję "power tower", aby zbadać wpływ ćwiczeń na Drosophila. Power tower to urządzenie, które nieustannie unosi się i opada, wykorzystując naturalną reakcję muchy do poruszania się w górę, przeciwko grawitacji, znaną jako "ujemna geotaksja."

Wydajność much ćwiczących w power tower jest mierzona za pomocą testu szybkiej iteracyjnej ujemnej geotaksji, w skrócie testu RING. Muchy w pustych fiolkach są umieszczane przed kamerą. Fiolki są stukane, a przebyte odległości w górę są rejestrowane. Eksperyment ten pokazuje, że w porównaniu z grupą kontrolną ćwiczenia miały pozytywny wpływ na aktywność w czasie.

Niniejszy film JoVE omówił zasady utrzymania i hodowli Drosophila melanogaster. Po obejrzeniu tego materiału powinni Państwo potrafić przygotować pożywkę dla much, prawidłowo dobrać odpowiednie pojemniki hodowlane, przenosić muchy do nowych probówek oraz przeprowadzać proste eksperymenty. Dziękujemy za uwagę!