Procedury identyfikacji zakaźnych prionów po przejściu przez układ pokarmowy gatunku ptaków

Ogólnym celem tej procedury jest udokumentowanie przejścia zakaźnego materiału PreOn przez układ pokarmowy wron amerykańskich. Osiąga się to poprzez pierwsze pomiary wron za pomocą zakaźnego materiału PreOn. Drugim krokiem jest zebranie kału wrony przez cztery godziny po zgłębniku i przygotowanie go do wstrzyknięcia myszom.

Następnie myszy zaszczepia się dootrzewnowo jednym mililitrem homogenatu kału krowy. Ostatnim krokiem jest codzienne monitorowanie myszy, aż wyrażą kliniczne objawy zatrzęsienia myszy. Ostatecznie analiza western blot służy do potwierdzenia obecności zakaźnego PreOn w modelu mysim i zweryfikowania transmisji choroby.

Pomysł, że wrony mogą się przenosić. CWD przyszło do nas pewnego zimowego dnia, kiedy po jeździe do ośrodka hodowli łosi w niewoli, gdzie robiliśmy badania i widzieliśmy zabijane łosie zabijane na drogach karmione przez wrony, a później tego samego dnia wrony pojawiające się z nieba znikąd, lądujące w tych korytach, żerujące tuż obok łosia, wypróżniające się na ziarno, które łosie zjadały, oprócz obserwacji z literatury, że wiele z nich wrony tego lata w całym Kolorado, Wyoming zimują w skoncentrowanym obszarze w Nowym Meksyku, tak się składa, że ten obszar w Nowym Meksyku jest miejscem, w którym pojawiło się trochę CABD i jest to sto mil setki mil od epicentrum choroby wyniszczającej pękanie. Te dwie obserwacje skłoniły nas do myślenia, że potencjalnie wrony mogą odgrywać rolę w przenoszeniu CWD po krajobrazie.

Wizualna demonstracja tych technik ma kluczowe znaczenie, ponieważ nieprawidłowe techniki podawania przez zgłębnik dootrzewnowy i ustny mogą prowadzić do śmierci badanych zwierząt. Na początek dodaj cztery krople niebieskiego barwnika do jajecznicy i dobrze wymieszaj. Następnie narysuj pięć mililitrów mieszanki barwnika i jaj do dwucalowej igły do zgłębnika, a jedna osoba delikatnie powstrzymuje wronę.

Otwórz dziób wrony na tyle szeroko, aby zajrzeć do gardła i ostrożnie włóż igłębkę do przełyku. W przypadku zauważenia zaburzeń oddychania należy wyjąć strzykawkę i spróbować ponownie, ponieważ mogła zostać umieszczona w tchawicy. Po upewnieniu się, że igła do zgłębka znajduje się w przełyku, powoli odciągnij zawartość strzykawki.

Sprawdzaj wrony co 30 minut, aż niebiesko-zielony kał przestanie być wydalany. Testowe wrony potrzebowały około czterech godzin, aby przestać wydalać zabarwiony na niebiesko kał. Następnie dodaj jedną część niezainfekowanego C 57 czarnego sześciomściwego mózgu myszy do czterech części sterylnego PBS i kilku szklanych koralików do blendera pociskowego.

Homogenizator Homogenizuj próbkę przez jedną do pięciu minut, aż do uzyskania gładkiej konsystencji. Powtórz proces, używając nieuleczalnie chorego szczepu R ML Chandler zakażonego C 57 czarnych mózgów myszy. Następnie odwirować jednorodny materiał w temperaturze 3000 razy G przez jedną minutę.

Aby usunąć większe cząstki stałe. Następnie usunąć supernatant i rozcieńczyć go równą objętością sterylnego XPBS, aby wytworzyć 10% masy na objętość materii mózgowej. W PBS przechowuj próbki w temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza do czasu, gdy będą potrzebne 17 godzin przed zgłębnikiem.

Usuń jedzenie, ale nie wodę z zagród dla kruków. Losowo przydziel wrony do grup poddanych działaniu środka i ustnie zgłębnij każdą wronę pięcioma mililitrami świeżo rozmrożonego, normalnego lub zakażonego homogenatu mózgu myszy za pomocą dwucalowej igły do zgłębnika. Następnie przenieś wrony do pojedynczych klatek.

Zbierz i zgromadź wszystkie odchody w każdej klatce po czterech godzinach od zgłębnika. Następnie homogenizuj zebrane kał dla każdej wrony w homogenizatorze z niebieskimi kulkami ze szklanymi kulkami, aż do uzyskania jednolitej tekstury. Następnie weź 500 mikrolitrów mieszaniny i rozcieńcz ją od 1 do 20 za pomocą 9,5 mililitra sterylnej wirówki PBS, rozcieńczonego homogenatu kału przez 15 minut.

Dodać 1,300 razy G, a następnie przenieść supernatant do świeżej probówki. Aby zminimalizować zagrożenie wtórną infekcją bakteryjną, dodaj jedną jednostkę penicyliny i jeden mikrogram streptomycyny na mililitr homogenatu. Następnie poddaj próbki sonikacji w urządzeniu 3000 MP przy ustawieniu mocy 70 przez 30 sekund, aby przerwać błonę pozostałych drobnoustrojów.

Najpierw losowo przypisz myszy do jednej z czterech pokazanych tutaj grup. Grupa pierwsza otrzyma zakażony kał wrony. Grupa druga otrzyma niezakażone odchody kruków.

Grupa trzecia otrzyma zakażony mózg myszy, a grupa czwarta otrzyma normalny mózg myszy. Następnie dla grup MN pierwszej i drugiej należy pobrać jeden mililitr złomowanego dodatniego lub złomowanego ujemnego kału wrony. Homogenizować za pomocą igły o rozmiarze 25 G zgodnie z numerem grupy myszy.

Następnie poszarp mysz za futro na grzbietowej szyi. Za pomocą kciuka i palca wskazującego delikatnie obróć go, aby odsłonić brzuszną stronę. Podnieś tylny koniec myszy tak, aby jej głowa znajdowała się nieco niżej.

Wbij igłę jeden centymetr przez skórę, jeden centymetr boczny linii środkowej i jeden do dwóch centymetrów przed stawem krzyżowo-biodrowym. Następnie lekko odciągnij i powoli wstrzyknij jednorodny substancję do jamy ciała myszy. Następnie należy przygotować zamrożony homogenat mózgu myszy z resztkami i bez skrawków do wstrzyknięcia zwierzętom w grupie trzeciej i czwartej.

Najpierw rozcieńczając mieszanki podstawowe haws od 1 do 10 sterylnym PBS. Następnie wstrzyknąć jeden mililitr rozcieńczonego homogenatu mózgu z dodatnim wynikiem złomowania myszom w grupie trzeciej i jeden mililitr rozcieńczonego homogenatu mózgu z negatywnym wynikiem złomowania myszom. W grupie czwartej.

Monitoruj myszy codziennie, dopóki nie wyrażą klinicznych objawów złomowania myszy. Objawy kliniczne mogą obejmować kifozę, ataksję, sztywność ogona, brak pielęgnacji, wychudzenie i letarg. Oceniaj moje codzienne wyniki dla każdego z sześciu objawów klinicznych.

Gdy widoczne są znaki. Zero oznacza brak widocznych znaków. Jeden oznacza umiarkowany, a dwa oznacza poważny poziom znaku.

Eutanazja myszy, gdy łączne dzienne wyniki dla każdego objawu osiągną więcej lub osiem przez jeden dzień więcej lub równe sześciu nieprzerwanie przez trzy dni lub po 365 dniach. Po zaszczepieniu należy pobrać mózgi bezpośrednio po eutanazji i przechowywać je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Następnie odpowiednio zutylizuj tusze, aby potwierdzić niepewną diagnozę.

Rozmrozić zamrożone mózgi myszy i indywidualnie homogenizować je w homogenizatorze z niebieskimi kulkami ze szklanymi kulkami, aż do uzyskania jednolitej tekstury. Następnie przygotuj 125 mikrolitrów roztworu do trawienia proteinazy K, łącząc 109,39 mikrolitrów PBS z 12,5 mikrolitrami 500-milimolowego EDTA o pH ósmym i 3,1 mikrolitra 50 mikrogramów na mililitr roztworu proteinazy K. Następnie dodaj trzy mikrolitry roztworu trawiącego do 17 mikrolitrów mózgu. Homogenat.

Próbki inkubować w temperaturze 45 stopni Celsjusza na wytrząsanym bloku grzewczym przez 30 minut. Po zakończeniu inkubacji dezaktywuj roztwór wytrawiający, dodając osiem mikrolitrów bufora ładującego stronę SDS i inkubuj próbki w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut. Następnie załaduj próbki na stronę 12%SDS.

Elektroforeza żelowa białek i przeniesienie żelu do membrany IMON PVDF Po przeniesieniu zablokuj membranę PVDF 5% beztłuszczowym mlekiem w PBS z 0,2% między 20 i kołysz przez godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie sondować błonę za pomocą BORROW 224 i przeciwciała monoklonalnego IPRP sprzężonego z peroksydazą chrzanu rozcieńczonego w stosunku 1 do 20 000 w superbloku i skalać przez godzinę w temperaturze pokojowej po inkubacji. Płukać membranę przez godzinę w PBS z 0,2% między 20.

Wizualizacja białek poprzez inkubację błony z substratem chemiluminescencyjnym przez pięć minut. Następnie zobrazowanie membrany w systemie dokumentacji żelu G box. Chore myszy zidentyfikowano na podstawie objawów klinicznych zadrapań u myszy, a potwierdzenie choroby zakończono analizą krwi zachodniej.

Normalny mózg myszy, jednorodny, bez zadrapań, pokazano tutaj po lewej stronie dwa pasy z i bez pomocy proteazy K Bez proteazy K widoczne są trzy zagięcia. Ponieważ jednak normalne białko jest podatne na proteinazy, zagięcia nie są widoczne na drugim pasie. Pas trzeci pokazuje trawioną przez proteazę próbkę kontroli pozytywnej strawionej przez proteazę.

Proteazy powodują przesunięcie w trzech pierwotnych prążkach z powodu utraty końców n i c białek. Ale zainfekowane białka nie są w stanie zostać całkowicie strawione, tak jak to miało miejsce w normalnej próbce mózgu. Mózg strawiony przez proteinazę K od myszy zaszczepionej kałem zaszczepionej wrony jest pokazany po prawej stronie i potwierdza obecność prionów w próbce, ponieważ prążki nie są trawione.

Po obejrzeniu tego filmu lepiej zrozumiesz, jak dokumentować przejście zakaźnego materiału prionowego przez układ pokarmowy wron. Następnie zweryfikuj zakaźność za pomocą międzyotrzewnowego testu biologicznego na myszach.