Name: Procedury identyfikacji zakaźnych prionów po przejściu przez układ pokarmowy gatunku ptaków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-06T21:30:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: Poznaj metody identyfikacji zakaźnych prionów po przejściu przez układ pokarmowy kruków amerykańskich. Technika obejmuje gawage, zbieranie kału i bioassay na myszach z analizą western blot.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować S. Wernerowi za dostarczenie wron wykorzystywanych w tym badaniu oraz personelowi USDA, APHIS, WS, NWRC za opiekę nad zwierzętami i monitorowanie. Wzmianka lub użycie produktu nie oznacza poparcia USDA. Finansowanie tego badania zostało zapewnione przez USDA, APHIS, Veterinary Services.

Nasz protokół jest zaadaptowany z tego, który wcześniej opublikowaliśmy7. Wszystkie procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Wykorzystania Zwierząt Departamentu Rolnictwa Stanów Zjednoczonych (USDA), Inspekcji Zdrowia Zwierząt i Roślin (APHIS), Wildlife Services (WS), National Wildlife Research Center (NWRC).
1. Karawik
<ol>
	<li>Oszacuj czas przejścia "pseudo materiału mózgowego" przez przewód pokarmowy wron amerykańskich.
	<ol>
		<li>Wymieszaj 5 ml ugotowanego i jajecznicy z niebieskim barwnikiem i zgłębnik 1 kruka za pomocą igły 2-calowej (ryc. 1).</li>
		<li>Sprawdzaj wrony co 30 minut, aż kał zabarwiony na niebiesko/zielono przestanie być wydalany.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uzyskaj niezakażone i nieuleczalnie chore mózgi myszy C57BL/6 zakażone RML (szczep Chandlera).</li>
	<li>Wygeneruj normalny i zakażony homogenat mózgu myszy o stężeniu 20% wag. / obj. w homogenizatorze mieszalnika kulowego z 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i szklanymi kulkami, a następnie odwiruj przy 3,000 x g przez 1 minutę, aby usunąć większe cząstki stałe. Usunąć supernatant i rozcieńczyć równą objętością 1x PBS, aby uzyskać 10% wag./obj. w sterylnym PBS. Zamrażać w temperaturze -80 °C do czasu, gdy będzie potrzebny.</li>
	<li>17 godzin przed zgłębkiem usuń jedzenie z kojców dla kruków, ale nie wodę.</li>
	<li>Losowo przydziel wrony do grup leczonych i doustnie zgłębnik każdej wrony podaj 5 ml normalnego lub zakażonego homogenatu mózgu myszy za pomocą igły do zgłębnika o średnicy 2 cali.</li>
	<li>Przenieś wrony do indywidualnych klatek i zbierz i zgromadź wszystkie odchody w każdej klatce przez 4 godziny po zgłębniku (ryc. 2).</li>
	<li>Homogenizuj kałużę dla każdej wrony w homogenizatorze bullet blender ze szklanymi kulkami, aż do uzyskania jednolitej tekstury. *Kał wrony jest w większości płynny i można go łatwo mieszać.</li>
	<li>Dla każdej wrony rozcieńczyć 500 μl homogenatu kału w 9,5 ml 1x PBS, aby uzyskać całkowitą objętość 10 ml.</li>
	<li>Odwirować homogenat kału przez 15 minut przy 1 400 x g i wyekstrahować supernatant.</li>
	<li>Aby zminimalizować zagrożenie wtórną infekcją bakteryjną, należy potraktować supernatant 1 μl 100 jednostek/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny (Invitrogen, NY) na 100 μl homogenatu, a następnie umieścić w świetle UV w temperaturze pokojowej na 20 minut, aby zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia wirusowego i bakteryjnego. Po ekspozycji na promieniowanie UV, sonikować próbki w sonikatorze 3000 Mp przy ustawieniu 70 przez 30 sekund, aby przerwać błonę pozostałych drobnoustrojów.</li>
</ol>
2. Szczepienie myszy
<ol>
	<li>Losowo przydziel myszy do następujących grup leczenia (Tabela 1):
	<ol>
		<li>Grupa 1 - Myszy z pozytywnym wynikiem leczenia zaszczepione dootrzewnowo (IP) 1 ml homogenatu kału od wron doustnie pobranych 5 ml zakażonych mózgów myszy.</li>
		<li>Grupa 2 - Myszy z negatywnym leczeniem zaszczepione IP 1 ml homogenatu kału od wron doustnie poddanych 5 ml normalnych mózgów myszy.</li>
		<li>Rozcieńczyć zakażony i normalny homogenat mózgu myszy dla grup 3 i 4 do 1:100 w/v w 1x PBS.</li>
		<li>Grupa 3 - Myszy z kontrolą pozytywną zaszczepione IP 1 ml zakażonego homogenatu mysiego mózgu.</li>
		<li>Grupa 4 - Myszy z kontrolą ujemną zaszczepione IP 1 ml normalnego homogenatu mysiego i mózgu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<obramowanie tabeli="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Grupa zabiegowa</td>
			<td>Liczba zwierząt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grupa 1</td>
			<td>Trzęsawka + Kał Wrony</td>
			<td>100</td> szt.
		</tr>
		<tr>
			<td>Grupa 2</td>
			<td>Trzęsawka - Kał wrony</td>
			<td>25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grupa 3</td>
			<td>Trzęsawka + Mózg myszy</td>
			<td>10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grupa 4</td>
			<td>Trzęsawka - Mózg myszy</td>
			<td>5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Status szczepionki w zakresie trzęsawki owiec (dodatni +, ujemny -) i liczba wykorzystanych zwierząt7.
<ol start="2">
	<li>Inokulacja dootrzewnowa myszy:
	<ol>
		<li>Mysz kark za futro na grzbietowej szyi z kciukiem i palcem wskazującym i delikatnie obróć, aby odsłonić stronę brzuszną.</li>
		<li>Podnieś tylny koniec myszy tak, aby głowa znajdowała się nieco niżej.</li>
		<li>Wprowadzić igłę 25 G 1 cm przez skórę, 1 cm po boku linii środkowej i 1-2 cm przed stawem krzyżowo-biodrowym za pomocą strzykawki z blokadą igły.</li>
		<li>Wstrzyknąć powoli 1 ml inokulacji do jamy ciała myszy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Monitorowanie myszy
<ol>
	<li>Monitoruj myszy codziennie, dopóki nie wyrażą klinicznych objawów trzęsawki myszy. Objawy kliniczne mogą obejmować: kifozę, ataksję, sztywność ogona, brak pielęgnacji, wychudzenie i letarg.</li>
	<li>Oceń myszy za każdy z 6 objawów klinicznych, gdy widoczne oznaki są widoczne, gdzie 0 = brak widocznych, 1 = umiarkowany, a 2 = ciężki.</li>
	<li>Eutanazję myszy, gdy całkowite dzienne wyniki dla każdego znaku osiągną ≥8 przez 1 dzień, ≥ 6 nieprzerwanie przez 3 dni lub po 365 dniach od zaszczepienia (dpi).</li>
	<li>Mózg należy pobrać bezpośrednio po eutanazji i przechowywać w temperaturze -70 °C.</li>
	<li>Aby potwierdzić diagnozę trzęsawki, należy strawić próbki mózgu za pomocą 3 μl 50 μg/ml roztworu proteinazy K (PK) rozcieńczonego w następujący sposób: 3,1. μl PK, 12,5 μl 500 mM EDTA, pH 8, 109,39 μl 1x PBS przez 30 minut w temperaturze 45 °C, a następnie dezaktywować PK, dodając 8 μl buforu ładującego i inkubując próbki w temperaturze 95 °C przez 5 minut. Załadować próbki na 12% żel SDS-PAGE, elektroforezę i transfer do membrany Immobilon PVDF i blok z 5% mlekiem beztłuszczowym w 0,2% Tween 20 w PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie sondować przeciwciałem monoklonalnym Bar224 anty-PrP sprzężonym z peroksydazą chrzanową, rozcieńczonym w Superbloku, przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Płukać membranę przez 1 godzinę za pomocą PBS-0,2% Tween 20. Aby to zobrazować, inkubuj Western blot przez 5 minut z podłożem chemiluminescencyjnym i obrazem w systemie dokumentacji żelu G-box.</li>
</ol>

<ol><li>Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+proteinaceous+infectious+particles+cause+scrapie%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie.</a> Science. 216 (4542), 136-144 (1982).</li>
<li>Miller, M. W., Williams, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epizootiology+of+chronic+wasting+disease+in+free-ranging+cervids+in+Colorado+and+Wyoming%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Wildlife+Diseases%22%5BJournal%5D)">Epizootiology of chronic wasting disease in free-ranging cervids in Colorado and Wyoming.</a> Journal of Wildlife Diseases. 36 (4), 676-690 (2000).</li>
<li>Miller, M. W., Williams, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horizontal+prion+transmission+in+mule+deer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Horizontal prion transmission in mule deer.</a> Nature. 425 (6953), 35-36 (2003).</li>
<li>Sigurdson, C. J., Adriano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+Wasting+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Chronic Wasting Disease.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1772 (6), 610-618 (2007).</li>
<li>Miller, M. W., Williams, E. S., Hobbs, N. T., Wolfe, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+sources+of+prion+transmission+in+mule+deer%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Environmental sources of prion transmission in mule deer.</a> Emerging Infectious Diseases. 10 (6), 1003-1006 (2004).</li>
<li>Mathiason, C. K., Hays, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectious+prions+in+pre-clinical+deer+and+transmission+of+chronic+wasting+disease+solely+by+environmental+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Infectious prions in pre-clinical deer and transmission of chronic wasting disease solely by environmental exposure.</a> PLoS ONE. 4 (6), e5916(2009).</li>
<li>VerCauteren, K. C., Pilon, J. L., Nash, P. B., Phillips, G. E., Fischer, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion+remains+infectious+after+passage+through+digestive+system+of+American+crows+%28Corvus+crachyrhunchos%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Prion remains infectious after passage through digestive system of American crows (Corvus crachyrhunchos).</a> PLoS ONE. 7 (10), e45774(2012).</li>
<li>Imran, M., Mahmood, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+animal+prion+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Virology+Journal%22%5BJournal%5D)">An overview of animal prion diseases.</a> Virology Journal. 8 (493), (2011).</li>
<li>Watts, J. C., Balachandran, A., Westaway, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expanding+universe+of+prion+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+PATHOGENS%22%5BJournal%5D)">The expanding universe of prion disease.</a> PLoS PATHOGENS. 2 (3), e26(2006).</li>
<li>Bruce, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmissions+to+mice+indicate+that+%27new+variant%27+CJD+is+caused+by+the+BSE+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transmissions to mice indicate that 'new variant' CJD is caused by the BSE agent.</a> Nature. 389 (6650), 498-501 (1997).</li>
<li>Ryder, S., Dexter, G., Bellworty, S., Tongue, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+of+lateral+transmission+of+scrapie+between+sheep+kept+under+natural+conditions+using+lymphoid+tissue+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22Research+in+Veterinary+Science%22%5BJournal%5D)">Demonstration of lateral transmission of scrapie between sheep kept under natural conditions using lymphoid tissue biopsy.</a> Research in Veterinary Science. 76 (2004), 211-217 (2004).</li>
<li>Collinge, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+risk+of+prion+zoonoses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The risk of prion zoonoses.</a> Science. 335 (6067), 411-413 (2012).</li>
<li>Beringue, V., Vilotte, J. L., Laude, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion+agent+diversity+and+species+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Prion agent diversity and species barrier.</a> Veterinary Research. 39 (47), (2008).</li>
<li>Harrington, R. D., Baszler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+species+barrier+limits+transmission+of+chronic+wasting+disease+to+mink+%28Mustela+vison%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">A species barrier limits transmission of chronic wasting disease to mink (Mustela vison).</a> The Journal of General Virology. 89 (4), 1086-1096 (2008).</li>
<li>Wisniewski, H. M., Sigurdarson, S., Rubenstein, R., Kascsak, R. J., Carp, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mites+as+vectors+for+scrapie%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Mites as vectors for scrapie.</a> Lancet. 347 (9008), 1114(1996).</li>
<li>Post, K., Riesner, D., Walldorf, V., Mehlhorn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fly+larvae+and+pupae+as+vectors+for+scrapie%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Fly larvae and pupae as vectors for scrapie.</a> Lancet. 354 (9194), 1969-1970 (1999).</li>
<li>Matthews, D., Cooke, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+for+transmissible+spongiform+encephalopathies+in+non-ruminant+livestock+and+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Revue+Scientifique+Et+Technique-Office+International+Des+Epizooties%22%5BJournal%5D)">The potential for transmissible spongiform encephalopathies in non-ruminant livestock and fish.</a> Revue Scientifique Et Technique-Office International Des Epizooties. 22 (1), 283-296 (2003).</li>
<li>Jennelle, C. S., Samuel, M. D., Nolden, C. A., Berkley EA, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deer+carcass+decomposition+and+potential+scavenger+exposure+to+chronic+wasting+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Wildlife+Management%22%5BJournal%5D)">Deer carcass decomposition and potential scavenger exposure to chronic wasting disease.</a> Journal of Wildlife Management. 73 (5), 655-662 (2009).</li>
<li>Scherbel, C., Pichner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradation+of+scrapie+associated+prion+protein+%28PrPSc%29+by+the+gastrointestinal+microbiota+of+cattle%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Degradation of scrapie associated prion protein (PrPSc) by the gastrointestinal microbiota of cattle.</a> Veterinary Research. 37 (5), 695-703 (2006).</li>
<li>Jeffrey, M., Gonzaález, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transportation+of+prion+protein+across+the+intestinal+mucosa+of+scrapie+susceptible+and+scrapie-resistant+sheep%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Transportation of prion protein across the intestinal mucosa of scrapie susceptible and scrapie-resistant sheep.</a> Journal of Pathology. 209 (1), 4-14 (2006).</li>
<li>Nicholson, E. M., Richt, J. A., Rasmussen, M. A., Hamir, A. N., Lebepe-Mazur, S., Horst, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+of+sheep+scrapie+brain+homogenate+to+rumen-simulating+conditions+does+not+result+in+a+reduction+of+PrP%28Sc%29+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Letters+in+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Exposure of sheep scrapie brain homogenate to rumen-simulating conditions does not result in a reduction of PrP(Sc) levels.</a> Letters in Applied Microbiology. 44 (6), 631-636 (2007).</li>
<li>Motes C, M. aluquerde, Grassi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excretion+of+BSE+and+scrapie+prions+in+stools+from+murine+models%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Excretion of BSE and scrapie prions in stools from murine models.</a> Veterinary Microbiology. 131 (1-2), 205-211 (2008).</li>
<li>Kruger, D., Thomzig, A., Lenz, G., Kampf, K., McBride, P., Beekes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Faecal+shedding%2C+alimentary+clearance+and+intestinal+spread+of+prions+in+hamsters+fed+with+scrapie%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Faecal shedding, alimentary clearance and intestinal spread of prions in hamsters fed with scrapie.</a> Veterinary Research. 40 (1), 4(2009).</li>
<li>Mathiason, C. K., Nalls, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Susceptibility+of+domestic+cats+to+chronic+wasting+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Susceptibility of domestic cats to chronic wasting disease.</a> Journal of Virology. 87 (4), 1947-1956 (2013).</li>
<li>Bjorndal, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flexibility+of+digestive+responses+in+two+generalist+herbivores%2C+the+tortoises+Geochelone+carbonaria+and+Geochelone+denticulate%5BTitle%5D)+AND+%22Oecologia%22%5BJournal%5D)">Flexibility of digestive responses in two generalist herbivores, the tortoises Geochelone carbonaria and Geochelone denticulate.</a> Oecologia. 78 (3), 317-321 (1989).</li>
<li>Clark, R. G., Gentle, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimates+of+grain+passage+time+in+captive+mallards%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Zoology%22%5BJournal%5D)">Estimates of grain passage time in captive mallards.</a> Canadian Journal of Zoology. 68 (11), 2275-2279 (1990).</li>
<li>Dierenfeld, E. S., Koontz, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feed+intake%2C+digestion+and+passage+of+proboscis+monkey+%28Nasalis+larvatus%29+in+captivity%5BTitle%5D)+AND+%22Primates%22%5BJournal%5D)">Feed intake, digestion and passage of proboscis monkey (Nasalis larvatus) in captivity.</a> Primates. 33 (3), 399-405 (1992).</li>
<li>Thompson, A. K., Samuel, M. D., Van Deelen, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+feeding+strategies+and+potential+disease+transmission+in+Wisconsin+white-tailed+deer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Wildlife+Management%22%5BJournal%5D)">Alternative feeding strategies and potential disease transmission in Wisconsin white-tailed deer.</a> Journal of Wildlife Management. 72 (2), 416-421 (2008).</li>
<li>Pulford, B., Spraker, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+PrPCWD+in+feces+from+naturally+exposed+Rocky+Mountain+elk+%28Cervus+elaphus+nelsoni%29+using+protein+misfolding+cyclic+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Wildlife+Diseases%22%5BJournal%5D)">Detection of PrPCWD in feces from naturally exposed Rocky Mountain elk (Cervus elaphus nelsoni) using protein misfolding cyclic amplification.</a> Journal of Wildlife Diseases. 48 (2), 425-433 (2012).</li>
<li>Hicks, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guano+deposition+in+an+Oklahoma+crow+roost%5BTitle%5D)+AND+%22Condor%22%5BJournal%5D)">Guano deposition in an Oklahoma crow roost.</a> Condor. 81 (3), 247-250 (1979).</li>
<li>Aldous, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Winter+habits+of+crows+in+Oklahoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Wildlife+Management%22%5BJournal%5D)">Winter habits of crows in Oklahoma.</a> Journal of Wildlife Management. 73 (4), 290-295 (1944).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Przedstawiono procedurę dokumentowania przejścia materiału PrPRes przez układ pokarmowy wron. Użyliśmy konwencjonalnych metod, aby określić, czy wrony mają zdolność do przemieszczania materiału PrPRes na obszary geograficzne wolne od choroby. Inni ocenili oporność PrPRes na płyny trawienne przeżuwaczy19-21 i gryzoni22,23 , z których oba nie były w stanie go wyeliminować. Techniki te powinny być w przyszłości stosowane w odniesieniu do innych drapieżników24 ,</su...

Zakaźne encefalopatie gąbczaste (TSE) to śmiertelne zakaźne choroby neurodegeneracyjne, które dotykają dziką przyrodę, zwierzęta domowe i ludzi. Wydaje się, że czynnikiem zakaźnym chorób TSE są nieprawidłowo sfałdowane lub chorobotwórcze izoformy (PrP, Res) białek prionowych1. Choroby TSE u zwierząt obejmują przewlekłą chorobę wyniszczającą (CWD) u mulaków (Odocoileus hemionus), jeleni wirginijskich (Odocoileus virginianus), łosi (Cervus elaphus) i łosi (Alces alces); trzęsawka owiec i kóz; gąbczasta encefalopatia bydła (BSE) u bydła domowego; pasażacyjna encefalopatia norek u norek utrzymywanych w warunkach fermowych; gąbczasta encefalopatia kotów u kotów; egzotyczna encefalopatia gąbczasta kopytnych u przeżuwaczy z egzotycznych ogrodów zoologicznych z rodziny Bovidae; i encefalopatia gąbczasta u naczelnych innych niż ludzie8. Choroba TSE występująca u pojedynczego człowieka, wariant choroby Creutzfeldta-Jakoba, jest rzadka i uważa się, że nabywa się ją poprzez spożywanie żywności skażonej PrPRes 9. Podobnie, BSE może zarażać ludzi, jeśli spożyta jest skażona wołowina10. Spośród wszystkich chorób TSE, trzęsawka i CWD są jedynymi dwoma, w których występują samopodtrzymujące się epidemie, a źródła zakażenia przypuszcza się, że pochodzą ze zwierzęciana zwierzę 2,3,11, a także ze źródeł środowiskowych4-6. Badania sugerują, że większość chorób TSE wymaga znacznie wydłużonych okresów inkubacji, od naturalnej ekspozycji materiału PrPRes do manifestacji objawów klinicznych2-4,6,8, a pozorne bariery gatunkowe minimalizują, ale nie eliminują możliwości transmisji międzygatunkowej12-14.
Identyfikacja mechanizmów rozprzestrzeniania się zakaźnego materiału prionowego (PrPRes) jest niezwykle ważna dla odpowiedzi na pytania o to, jak choroby TSE przemieszczają się po krajobrazie. Badania eksperymentalne sugerują, że owady15,16, drób i świnie17 oraz wrony amerykańskie (Corvus brachyrhynchos)7,18 są biernymi nośnikami lub dyspergatorami materiału PrPRes. Niedawno udokumentowano przechodzenie materiału PrPRes przez układ pokarmowy wron, co wskazuje na rolę, jaką mogą one odgrywać w rozprzestrzenianiu się chorób TSE7. Wyniki te uprawdopodabniają wrony, padlinożerców, mogą napotkać, spożywać i transportować materiał zakaźny poprzez odkładanie kału na obszary wolne od choroby.
Procedury, które tutaj demonstrujemy, zostały wykorzystane do udokumentowania przejścia materiału PrPRes przez system trawienny wron i znacznie ułatwią zastosowanie tych metod do innych modeli specyficznych dla gatunków padlinożerców i mięsożerców w powiązanych przyszłych badaniach. W niniejszej pracy wykorzystano konwencjonalne metody do zbadania niekonwencjonalnych sposobów transportu materiałów PrPRes, które mogą przyczyniać się do rozprzestrzeniania się i ogólnego obciążenia materiałemPrP Res.

<table><tbody><tr><td>RML szczep Chandler trzęsawka przystosowana do myszy</td><td>Rocky Mountain Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RC57BL/6 myszy</td><td>Hilltop Lab Animals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wrony amerykańskie</td><td>dziko schwytane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pióro/paciorkowiec</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Invitrogen</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Sonikator</td><td>Misonix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proteinase-K roztwór</td><td>Roche</td><td>3115887001</td><td></td></tr><tr><td>Bufor ładujący</td><td>Invitrogen</td><td>NP0007 i 0009</td><td></td></tr><tr><td>Bis-tris SDS PAGE 12% żel</td><td>Invitrogen</td><td>NP0342</td><td></td></tr><tr><td>Membrana Immobilon PVDF</td><td>Millipore</td><td>1SEQ00010</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>Bullet homogenizator blendera</td><td>Braintree Scientific</td><td>BBX24B</td><td></td></tr><tr><td>2,3 mm Koraliki cyrkonowe/krzemionkowe</td><td>Produkty BioSpec</td><td>11079125Z</td><td></td></tr><tr><td>Bar224 przeciwciało monoklonalne anty-PrP</td><td>Cayman Chemical</td><td>10009035</td><td></td></tr><tr><td>Superblock</td><td>Thermo Scientific</td><td>37517</td><td></td></tr> podłoże <tr><td>chemiluminescencyjne</td><td>Millipore</td><td>WBKLS0500</td><td></td></tr><tr><td>G-box system dokumentacji żeli</td><td>Syngene</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

procedury identyfikacji zakaźnych prionów po przejściu przez układ pokarmowy gatunku ptaków

Procedures for Identifying Infectious Prions After Passage Through the Digestive System of an Avian Species

Zakaźny materiał prionowy (PrPRes) jest prawdopodobnie przyczyną śmiertelnych, neurodegeneracyjnych chorób zakaźnej encefalopatii gąbczastej (TSE)1. Zakłada się, że choroby TSE, takie jak przewlekła choroba wyniszczająca (CWD), są przenoszone ze zwierzęciana zwierzę 2,3, a także ze źródeł środowiskowych4–6. Padlinożercy i mięsożercy mają potencjał do translokacji materiału PrPRes poprzez konsumpcję i wydalanie padliny skażonej CWD. Ostatnie prace udokumentowały przechodzenie materiału PrPRes przez układ pokarmowy wron amerykańskich (Corvus brachyrhynchos), pospolitego padlinożercy z Ameryki Północnej7.
Opisujemy procedury używane do dokumentowania przejścia materiału PrPRes przez amerykańskie wrony. Wrony zostały zgłębnięte trzęsawką przystosowaną do myszy szczepu RML, a ich kał zebrano 4 godziny po zgłębniku. Kał wrony został następnie zebrany i wstrzyknięty dootrzewnowo myszom C57BL/6. Myszy były monitorowane codziennie, dopóki nie wystąpiły u nich kliniczne objawy trzęsawki myszy, a następnie zostały poddane eutanazji. Myszy bezobjawowe były monitorowane do 365 dni po inokulacji. Przeprowadzono analizę Western blot w celu potwierdzenia statusu choroby. Wyniki wykazały, że priony pozostają zakaźne po przejściu przez układ pokarmowy wron i są obecne w kale, powodując chorobę u myszy testowych.

Stosowane procedury pokazują, że układ trawienny wron nie eliminuje zakaźności PrPRes 4 godziny po doustnym zgłębniku mózgu trzęsawki7. Wszystkie dwadzieścia wron, które zostały pokryte materiałem PrPRes, następnie przekazało materiał PrPRes z kałem myszom. Chore myszy zidentyfikowano na podstawie objawów klinicznych trzęsawki myszy, a potwierdzenie choroby zakończono analizą Western blot.
Badanie czasu zatrzymywania materiału spożywanego przez wrony...

Padlinożercy mają potencjał do przenoszenia zakaźnych prionów gąbczastej encefalopatii w swoim kale do obszarów wolnych od chorób. Szczegółowo opisujemy metody stosowane do określenia, czy priony trzęsawki przystosowane do myszy pozostają zakaźne po przejściu przez przewód pokarmowy wron amerykańskich (Corvus brachyrhynchos), powszechnego konsumenta martwych zwierząt.

Procedury identyfikacji zakaźnych prionów po przejściu przez układ pokarmowy gatunku ptaków

Infectious prion (PrPRes) material is likely the cause of fatal, neurodegenerative transmissible spongiform encephalopathy (TSE) diseases1. Transmission ...

Ogólnym celem tej procedury jest udokumentowanie przejścia zakaźnego materiału PreOn przez układ pokarmowy wron amerykańskich. Osiąga się to poprzez pierwsze pomiary wron za pomocą zakaźnego materiału PreOn. Drugim krokiem jest zebranie kału wrony przez cztery godziny po zgłębniku i przygotowanie go do wstrzyknięcia myszom.Następnie myszy zaszczepia się dootrzewnowo jednym mililitrem homogenatu kału krowy. Ostatnim krokiem jest codzienne monitorowanie myszy, aż wyrażą kliniczne objawy zatrzęsienia myszy. Ostatecznie analiza western blot służy do potwierdzenia obecności zakaźnego PreOn w modelu mysim i zweryfikowania transmisji choroby.Pomysł, że wrony mogą się przenosić. CWD przyszło do nas pewnego zimowego dnia, kiedy po jeździe do ośrodka hodowli łosi w niewoli, gdzie robiliśmy badania i widzieliśmy zabijane łosie zabijane na drogach karmione przez wrony, a później tego samego dnia wrony pojawiające się z nieba znikąd, lądujące w tych korytach, żerujące tuż obok łosia, wypróżniające się na ziarno, które łosie zjadały, oprócz obserwacji z literatury, że wiele z nich wrony tego lata w całym Kolorado, Wyoming zimują w skoncentrowanym obszarze w Nowym Meksyku, tak się składa, że ten obszar w Nowym Meksyku jest miejscem, w którym pojawiło się trochę CABD i jest to sto mil setki mil od epicentrum choroby wyniszczającej pękanie. Te dwie obserwacje skłoniły nas do myślenia, że potencjalnie wrony mogą odgrywać rolę w przenoszeniu CWD po krajobrazie.Wizualna demonstracja tych technik ma kluczowe znaczenie, ponieważ nieprawidłowe techniki podawania przez zgłębnik dootrzewnowy i ustny mogą prowadzić do śmierci badanych zwierząt. Na początek dodaj cztery krople niebieskiego barwnika do jajecznicy i dobrze wymieszaj. Następnie narysuj pięć mililitrów mieszanki barwnika i jaj do dwucalowej igły do zgłębnika, a jedna osoba delikatnie powstrzymuje wronę.Otwórz dziób wrony na tyle szeroko, aby zajrzeć do gardła i ostrożnie włóż igłębkę do przełyku. W przypadku zauważenia zaburzeń oddychania należy wyjąć strzykawkę i spróbować ponownie, ponieważ mogła zostać umieszczona w tchawicy. Po upewnieniu się, że igła do zgłębka znajduje się w przełyku, powoli odciągnij zawartość strzykawki.Sprawdzaj wrony co 30 minut, aż niebiesko-zielony kał przestanie być wydalany. Testowe wrony potrzebowały około czterech godzin, aby przestać wydalać zabarwiony na niebiesko kał. Następnie dodaj jedną część niezainfekowanego C 57 czarnego sześciomściwego mózgu myszy do czterech części sterylnego PBS i kilku szklanych koralików do blendera pociskowego.Homogenizator Homogenizuj próbkę przez jedną do pięciu minut, aż do uzyskania gładkiej konsystencji. Powtórz proces, używając nieuleczalnie chorego szczepu R ML Chandler zakażonego C 57 czarnych mózgów myszy. Następnie odwirować jednorodny materiał w temperaturze 3000 razy G przez jedną minutę.Aby usunąć większe cząstki stałe. Następnie usunąć supernatant i rozcieńczyć go równą objętością sterylnego XPBS, aby wytworzyć 10% masy na objętość materii mózgowej. W PBS przechowuj próbki w temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza do czasu, gdy będą potrzebne 17 godzin przed zgłębnikiem.Usuń jedzenie, ale nie wodę z zagród dla kruków. Losowo przydziel wrony do grup poddanych działaniu środka i ustnie zgłębnij każdą wronę pięcioma mililitrami świeżo rozmrożonego, normalnego lub zakażonego homogenatu mózgu myszy za pomocą dwucalowej igły do zgłębnika. Następnie przenieś wrony do pojedynczych klatek.Zbierz i zgromadź wszystkie odchody w każdej klatce po czterech godzinach od zgłębnika. Następnie homogenizuj zebrane kał dla każdej wrony w homogenizatorze z niebieskimi kulkami ze szklanymi kulkami, aż do uzyskania jednolitej tekstury. Następnie weź 500 mikrolitrów mieszaniny i rozcieńcz ją od 1 do 20 za pomocą 9,5 mililitra sterylnej wirówki PBS, rozcieńczonego homogenatu kału przez 15 minut.Dodać 1,300 razy G, a następnie przenieść supernatant do świeżej probówki. Aby zminimalizować zagrożenie wtórną infekcją bakteryjną, dodaj jedną jednostkę penicyliny i jeden mikrogram streptomycyny na mililitr homogenatu. Następnie poddaj próbki sonikacji w urządzeniu 3000 MP przy ustawieniu mocy 70 przez 30 sekund, aby przerwać błonę pozostałych drobnoustrojów.Najpierw losowo przypisz myszy do jednej z czterech pokazanych tutaj grup. Grupa pierwsza otrzyma zakażony kał wrony. Grupa druga otrzyma niezakażone odchody kruków.Grupa trzecia otrzyma zakażony mózg myszy, a grupa czwarta otrzyma normalny mózg myszy. Następnie dla grup MN pierwszej i drugiej należy pobrać jeden mililitr złomowanego dodatniego lub złomowanego ujemnego kału wrony. Homogenizować za pomocą igły o rozmiarze 25 G zgodnie z numerem grupy myszy.Następnie poszarp mysz za futro na grzbietowej szyi. Za pomocą kciuka i palca wskazującego delikatnie obróć go, aby odsłonić brzuszną stronę. Podnieś tylny koniec myszy tak, aby jej głowa znajdowała się nieco niżej.Wbij igłę jeden centymetr przez skórę, jeden centymetr boczny linii środkowej i jeden do dwóch centymetrów przed stawem krzyżowo-biodrowym. Następnie lekko odciągnij i powoli wstrzyknij jednorodny substancję do jamy ciała myszy. Następnie należy przygotować zamrożony homogenat mózgu myszy z resztkami i bez skrawków do wstrzyknięcia zwierzętom w grupie trzeciej i czwartej.Najpierw rozcieńczając mieszanki podstawowe haws od 1 do 10 sterylnym PBS. Następnie wstrzyknąć jeden mililitr rozcieńczonego homogenatu mózgu z dodatnim wynikiem złomowania myszom w grupie trzeciej i jeden mililitr rozcieńczonego homogenatu mózgu z negatywnym wynikiem złomowania myszom. W grupie czwartej.Monitoruj myszy codziennie, dopóki nie wyrażą klinicznych objawów złomowania myszy. Objawy kliniczne mogą obejmować kifozę, ataksję, sztywność ogona, brak pielęgnacji, wychudzenie i letarg. Oceniaj moje codzienne wyniki dla każdego z sześciu objawów klinicznych.Gdy widoczne są znaki. Zero oznacza brak widocznych znaków. Jeden oznacza umiarkowany, a dwa oznacza poważny poziom znaku.Eutanazja myszy, gdy łączne dzienne wyniki dla każdego objawu osiągną więcej lub osiem przez jeden dzień więcej lub równe sześciu nieprzerwanie przez trzy dni lub po 365 dniach. Po zaszczepieniu należy pobrać mózgi bezpośrednio po eutanazji i przechowywać je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Następnie odpowiednio zutylizuj tusze, aby potwierdzić niepewną diagnozę.Rozmrozić zamrożone mózgi myszy i indywidualnie homogenizować je w homogenizatorze z niebieskimi kulkami ze szklanymi kulkami, aż do uzyskania jednolitej tekstury. Następnie przygotuj 125 mikrolitrów roztworu do trawienia proteinazy K, łącząc 109,39 mikrolitrów PBS z 12,5 mikrolitrami 500-milimolowego EDTA o pH ósmym i 3,1 mikrolitra 50 mikrogramów na mililitr roztworu proteinazy K. Następnie dodaj trzy mikrolitry roztworu trawiącego do 17 mikrolitrów mózgu. Homogenat.Próbki inkubować w temperaturze 45 stopni Celsjusza na wytrząsanym bloku grzewczym przez 30 minut. Po zakończeniu inkubacji dezaktywuj roztwór wytrawiający, dodając osiem mikrolitrów bufora ładującego stronę SDS i inkubuj próbki w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut. Następnie załaduj próbki na stronę 12%SDS.Elektroforeza żelowa białek i przeniesienie żelu do membrany IMON PVDF Po przeniesieniu zablokuj membranę PVDF 5% beztłuszczowym mlekiem w PBS z 0,2% między 20 i kołysz przez godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie sondować błonę za pomocą BORROW 224 i przeciwciała monoklonalnego IPRP sprzężonego z peroksydazą chrzanu rozcieńczonego w stosunku 1 do 20 000 w superbloku i skalać przez godzinę w temperaturze pokojowej po inkubacji. Płukać membranę przez godzinę w PBS z 0,2% między 20.Wizualizacja białek poprzez inkubację błony z substratem chemiluminescencyjnym przez pięć minut. Następnie zobrazowanie membrany w systemie dokumentacji żelu G box. Chore myszy zidentyfikowano na podstawie objawów klinicznych zadrapań u myszy, a potwierdzenie choroby zakończono analizą krwi zachodniej.Normalny mózg myszy, jednorodny, bez zadrapań, pokazano tutaj po lewej stronie dwa pasy z i bez pomocy proteazy K Bez proteazy K widoczne są trzy zagięcia. Ponieważ jednak normalne białko jest podatne na proteinazy, zagięcia nie są widoczne na drugim pasie. Pas trzeci pokazuje trawioną przez proteazę próbkę kontroli pozytywnej strawionej przez proteazę.Proteazy powodują przesunięcie w trzech pierwotnych prążkach z powodu utraty końców n i c białek. Ale zainfekowane białka nie są w stanie zostać całkowicie strawione, tak jak to miało miejsce w normalnej próbce mózgu. Mózg strawiony przez proteinazę K od myszy zaszczepionej kałem zaszczepionej wrony jest pokazany po prawej stronie i potwierdza obecność prionów w próbce, ponieważ prążki nie są trawione.Po obejrzeniu tego filmu lepiej zrozumiesz, jak dokumentować przejście zakaźnego materiału prionowego przez układ pokarmowy wron. Następnie zweryfikuj zakaźność za pomocą międzyotrzewnowego testu biologicznego na myszach.

procedures-for-identifying-infectious-prions-after-passage-through

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W niniejszej pracy opisujemy nową metodę monitorowania pobierania i transportu prionów przez komórki odpornościowe bezpośrednio po inokulacji doprzewnowej, polegającą na oczyszczaniu i znakowaniu fluorescencyjnym zagregowanych prętów prionowych z zakażonego materiału mózgowego, a następnie śledzeniu ich pobierania i przemieszczania się z miejsca wstrzyknięcia oraz charakteryzacji komórek pośredniczących w tych zdarzeniach.

Monitorowanie przemieszczania się komórek odpornościowych do fluorescencyjnych pręcików prionowych w godzinach po zakażeniu drogą dosytrychialną

Niniejsze badanie opisuje diagnostykę grypy ptaków u dzikiego ptactwa z wykorzystaniem przenośnego systemu rRT-PCR. Metoda ta wykorzystuje liofilizowane odczynniki do badania dzikich ptaków w warunkach poza laboratoryjnymi, typowych dla scenariusza ogniska choroby. Zastosowanie narzędzi molekularnych zapewnia dokładne i czułe alternatywy dla szybkiej diagnostyki.

Szybka diagnostyka wirusa grypy ptaków u dzikich ptaków: wykorzystanie przenośnego urządzenia rRT-PCR i liofilizowanych odczynników w warunkach terenowych

Zwalidowano i rozszerzono metodę konserwacji, detekcji i sekwencjonowania RNA wirusów grypy ptasiej, wykorzystując naturalne próbki odchodów ptaków. Technika ta eliminuje konieczność zachowania łańcucha chłodniczego oraz obchodzenia się z zakaźnymi wirusami i może być zastosowana w wysokoprzepustowym układzie 96-dołkowym.

Nadzór nad grypą ptaków z wykorzystaniem kart FTA: rozwiązanie problemów związanych z metodami terenowymi, bezpieczeństwem biologicznym i transportem

Source: Brauer, R. et al., Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates the synthesis and harvest of the influenza virus in fertilized chicken eggs. The virus is inoculated into the allantoic cavity, where it replicates in epithelial cells and buds into the allantoic fluid, which is then collected and stored for downstream applications.

Propagation and Harvest of Influenza Virus from a Fertilized Chicken Egg

Ten film demonstruje technikę wykrywania nieprawidłowo sfałdowanego białka prionowego w sekcjach mózgu za pomocą immunohistochemii. Po potraktowaniu części mózgu kwasem mrówkowym w celu denaturacji prionów i zminimalizowania ryzyka infekcji, a także po zdemaskowaniu agregatów prionowych za pomocą indukowanego ciepłem odzyskiwania epitopów, skrawki są znakowane immunologicznie pod kątem nieprawidłowo sfałdowanych agregatów białka prionowego i obserwowane pod mikroskopem.

Wykrywanie nieprawidłowych białek prionowych w tkance mózgowej za pomocą immunohistochemii

Przedstawiono krótki protokół badania klinicznego, który ma pomóc w wykrywaniu klasycznej i nietypowej trzęsawki owiec i kóz.

Protokół badania klinicznego w celu wykrycia trzęsawki atypowej i klasycznej u owiec

Pomiar bariery dla międzygatunkowego przenoszenia chorób prionowych jest trudny i zazwyczaj wiąże się z wyzwaniami zwierzęcymi lub testami biochemicznymi. W tym miejscu przedstawiamy test konwersji białka prionowego in vitro z możliwością przewidywania barier gatunkowych.

Ocena barier gatunkowych pasażowalnej encefalopatii gąbczastej za pomocą testu konwersji białka prionowego in vitro

Tutaj prezentujemy protokół opisujący prostą, szybką i efektywną technikę wzmacniania prionów, metodę konwersji indukowanej wstrząsami w czasie rzeczywistym (RT-QuIC).

Test konwersji wywołany wstrząsem w czasie rzeczywistym do wykrywania prionów CWD w materiale kałowym

Tutaj prezentujemy protokół chirurgicznego tworzenia 'podwiązanych pętli jelitowych' w jelicie cienkim kurczaka. Procedura ta pozwala na porównanie zjadliwości wielu szczepów Clostridium perfringens in situ w jednym żywicielu. Metoda ta znacznie zmniejsza liczbę kurcząt zwykle niezbędnych do podobnych eksperymentów in vivo.

Zligowany model pętli jelitowej u znieczulonych kurczaków wolnych od specyficznych patogenów w celu zbadania zjadliwości Clostridium perfringens

Immunoznakowanie nieprawidłowego białka prionowego za pomocą protokołów immunohistochemicznych wymaga specyficznych metod przygotowania próbki i przeciwciał anty-PrP. Niniejszy protokół opisuje kluczowe etapy demaskowania epitopów w celu zapewnienia prawidłowego znakowania immunologicznego PrP i zminimalizowania niespecyficznego barwienia tła. Podejście to uwzględnia również środki bezpieczeństwa biologicznego podczas prowadzenia badań immunohistochemicznych na tkankach zakażonych prionami.

Wykrywanie nieprawidłowego białka prionowego za pomocą immunohistochemii

Brakuje metody oceny powszechnie używanych obszarów w warunkach laboratoryjnych pod kątem zanieczyszczenia prionami i skutecznej dekontaminacji. Opisany tutaj protokół zawiera kluczowe podstawy do wdrożenia laboratoryjnego testu bezpieczeństwa prionów, który można łatwo modyfikować w celu spełnienia indywidualnych potrzeb określonych laboratoriów.

Test laboratoryjny bezpieczeństwa prionowego

Poznaj metody identyfikacji zakaźnych prionów po przejściu przez układ pokarmowy kruków amerykańskich. Technika obejmuje gawage, zbieranie kału i bioassay na myszach z analizą western blot.

Procedury identyfikacji zakaźnych prionów po przejściu przez układ pokarmowy gatunku ptaków

Przeglądaj więcej filmów