Wzbogacanie i oczyszczanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych poprzez wykrywanie antygenów powierzchniowych komórek przy użyciu przeciwciał monoklonalnych TG30 i GCTM-2

Ogólnym celem tej procedury jest sortowanie podzbiorów ludzkich embrionalnych komórek macierzystych według wiązania antygenu powierzchniowego komórki przez dwa przeciwciała monoklonalne TG 30 i GC TM. Osiąga się to poprzez pierwszą dysocjację hodowli ludzkich embrionalnych komórek macierzystych lub HESC na zawiesiny pojedynczych komórek. W drugim etapie HESC są barwione przeciwciałami monoklonalnymi, TG 30 i GCTM dwa.

Na koniec komórki są rozdzielane przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją i zwracane do hodowli. Ostatecznie zdolność posortowanych komórek do tworzenia kolonii można ocenić za pomocą cytometrii przepływowej i mikroskopii z kontrastem fazowym. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak obserwacja wizualna, jest to, że zapewnia ona obiektywną miarę pluripotencji na podstawie komórki po komórce dla dużej liczby komórek, a to ułatwia oddzielenie embrionalnych komórek macierzystych od komórek zróżnicowanych.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie pluripotencji, takie jak to, w jaki sposób zmiany warunków hodowli wpływają ilościowo na różne linie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych i indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych. Dzisiaj procedurę zademonstrują naukowcy z mojego laboratorium, George Zoe Hun Chi i Bay Wang, Aby wykonać zawiesinę pojedynczej komórki Hessa, zacznij od aspiracji pożywki Hessa z dwóch kolb T 75 zawierających hodowlaną linię komórek Hessa. Przemyć każdą kolbę 10 mililitrami DPBS, a następnie inkubować każdą kulturę z trzema mililitrami roztworu dysocjacyjnego wyrażonego potrójnym E w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2.

Po pięciu minutach uderz w bok kolby, aby usunąć komórki, a następnie potwierdź oderwanie pod mikroskopem. Następnie dodaj 10 mililitrów zimnej pożywki hodowlanej do każdej kolby za pomocą sterylnej 10-mililitrowej pipety. Delikatnie rozdrobnić zdysocjowane komórki kilkakrotnie o ścianę kolby, aby uzyskać zawiesinę z przeważającą ilością pojedynczych komórek.

Teraz przenieś zawiesiny pojedynczych komórek hes przez sitko do komórek o średnicy 70 mikronów w sterylnej 50-mililitrowej probówce polipropylenowej, aby zabarwić antygeny powierzchniowe komórek Hessa. Najpierw Eloqua około 100 000 komórek w 150 mikrolitrach pożywki do każdej z sześciu kontrolnych mikroprobówek wirówkowych o pojemności 1,5 mililitra. Następnie inkubować probówki kontrolne i pozostałą próbkę sortowania z podstawowymi przeciwciałami będącymi przedmiotem zainteresowania w końcowych objętościach reakcji odpowiednio 200 mikrolitrów i około dziewięciu mililitrów w pożywkach hodowlanych, w tym w kontrolach izotypu.

Umieść rurki poziomo na lodzie i delikatnie mieszaj je przez 30 minut na bujanej platformie. Po odwirowaniu komórek wyrzuć supernatant, a następnie umyj próbkę sortowania w 20 mililitrach zimnej pożywki hodowlanej, a próbki kontrolne w 200 mikrolitrach tego samego. Teraz inkubować próbkę sortowania w końcowej objętości 2,5 mililitra z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi w zimnych pożywkach hodowlanych, a kontrole w końcowej objętości 200 mikrolitrów tego samego, dodać świeżo przygotowane przeciwciało PE anty-US CD 90,2 do odpowiedniej probówki kontrolnej również w tym czasie.

Ponownie delikatnie wymieszaj rurki poziomo na lodzie przez 30 minut na bujanej platformie. Po odwirowaniu komórek ponownie zawiesić próbkę sortowania w 20 mililitrach zimnej pożywki hodowlanej, a kontrole w 200 mikrolitrach i dwukrotnie umyć komórki w pożywce. Zawiesić próbkę sortowania w dwóch do trzech mililitrach zimnej pożywki hodowlanej uzupełnionej jodkiem propidyny i każdą z kontrol, z wyjątkiem niebarwionych komórek, w 300 mikrolitrach tego samego.

Następnie przecedź każdą pojedynczą zawiesinę komórek przez sitko do komórek o średnicy 35 mikronów połączone z pięciomililitrowymi probówkami z okrągłym dnem z polistyrenu i odwiruj probówki, aby wtłoczyć resztkową zawiesinę komórek na pokrywkach sitka do probówek. Następnie postukaj w boki probówek, aby ponownie zawiesić każdą pojedynczą zawiesinę komórek i umieść komórki na lodzie. Ustaw cytometr przepływowy do sortowania komórek TG 30 GCTM z dwoma aktywowanymi fluorescencją, tak aby zdysocjowane zawiesiny komórek Hessa były bramkowane jako pojedyncze komórki w celu wyeliminowania potencjalnych grudek i dubletów.

Następnie usuń potencjalne zanieczyszczenia za pomocą przednich i bocznych bramek rozpraszających, aby posortowane zostały tylko nienaruszone komórki. Następnie wyklucz komórki niezdolne do życia na podstawie ich ekspresji jodku propidyny. Odciąć mysie fibroblasty embrionalne lub komórki żywiące się metamfetaminą przez selekcję negatywną na podstawie ich ekspresji mysiego CD 90.2 pe.

Ustaw TG 30 G CTM dwa ujemne chody zgodnie z autofluorescencją tła dla niebarwionych komórek, a także kontrolek izotypu. Wyizolowana żywotna frakcja HESC wolna od podajników metamfetaminy może być następnie ostatecznie frakcjonowana na TG 30 ujemne GCT M, dwie ujemne TG 30 niskie GCT, M dwie niskie TG 30 średnie GC TM dwie średnie i TG 30 wysokie GCTM dwie wysokie subpopulacje. Po ustawieniu cytometru przepływowego dodaj jeden mililitr pożywki kondycjonowanej metamfetaminą do każdej z dwóch pięciomililitrowych probówek z okrągłym dnem z polistyrenu i umieść je na lodzie.

Następnie odzyskaj po 400 000 komórek ze zróżnicowanej TG 30 ujemnej GC TM dwie ujemne i pluripotencjalnej TG 30 o wysokiej GCTM dwie wysokie frakcje komórek. Po odwirowaniu probówek zbiorczych, resus zawiesić każdą komórkę w jednym mililitrze wstępnie zbalansowanego podłoża kondycjonowanego MEF. Następnie zasiewaj jedną wstępnie zrównoważoną kolbę T 75 o jednej trzeciej gęstości MEF z HESC z każdej frakcji w pożywce kondycjonowanej metamfetaminą, inkubuj kultury komórkowe w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy 5% CO2, odświeżając pożywkę codziennie przez około dwa tygodnie.

Hodowle pluripotencjalnych komórek o wysokiej TG 30 o wysokiej GCTM pokazują ludzkie kolonie podobne do łodyg po tygodniu i osiągają około 80% płynności po dziewięciu do 11 dniach. Hodowle TG 30 ujemnych GC TM dwóch ujemnych komórek w większości rosną jako trawnik fibroblastów, takich jak komórki, które osiągają płynność po 11 do 13 dniach. Połączone wykrywanie antygenów powierzchniowych komórek TG 30 i GC TM dwa pozwala na rozróżnienie wielu podzbiorów komórek na etapie pluripotencjalnym i na różnych etapach wczesnego różnicowania HESC, na co wskazuje ich ekspresja markerów komórek macierzystych i czynników transkrypcyjnych specyficznych dla linii, zgodnie z poprzednimi raportami, TG 30 GC TM dwa ujemne niskie, Średnie i wysokie subfrakcje można rozróżnić w ludzkiej embrionalnej męskiej komórce macierzystej jednej linii użytej do tego badania tutaj, procenty różnych bramkowanych subpopulacji typowych dla analizy cytometrii dwuprzepływowej TG 30 GCTM pokazano w przedstawionym tutaj eksperymencie.

Zdefiniowana liczba TG 30 ujemnych GCT M dwóch ujemnych komórek była kolejno hodowana po sortowaniu przez około dwa tygodnie, a następnie uciekała się do zbierania tylko TG 30 ujemnej GCT M dwie ujemne frakcje przed ponownym posiewem. Przy każdym pasażu wyniki wskazują, że początkowa TG 30 ujemna gct M dwie ujemne subfrakcje wzbogacają o TG 30 ujemne GCT M dwie ujemne zróżnicowane komórki po kolejnym pakowaniu. Niewielka populacja komórek TG 30 o wysokiej GCT M two jest wykrywana przy początkowym pasażu, ale ostatecznie znika wraz z dalszym pakowaniem, pozostawiając tylko próbki wolne od pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Przedstawiono typową morfologię trawnika zróżnicowanych komórek TG 30 ujemnych GCT M dwóch ujemnych komórek po 14 dniach. Należy zauważyć, że sporadyczne kolonie podobne do HESC widoczne po 14 dniach mieszały się z TG 30 ujemnymi GC TM dwoma ujemnymi komórkami, które najprawdopodobniej są generowane przez zanieczyszczające TG 30 o wysokiej GCT M. Należy zauważyć, że zdarza się to rzadko, a w początkowym fragmencie po faktach opartym na wcześniejszych obserwacjach przy użyciu tego testu oczekuje się, że pobranie i hodowla dwóch komórek o wysokim poziomie GCTM TG 30 powinno wzbogacić się o tworzenie kolonii pluripotencjalnych HSC.

W związku z tym w tych reprezentatywnych hodowlach badano również kolejne pakowanie pluripotencjalnych komórek o wysokiej TG 30 o wysokiej GCTM po sortowaniu za pomocą cytometrii przepływowej, komórki sortowano faksem przy użyciu TG 30 i G CT M dwa, zastępując tylko TG 30 o wysokiej G CTM dwie wysokie komórki przy każdym pasażu. W ten sposób zaobserwowano, że większość komórek znajdowała się w podfrakcjach związanych z pluripotencją, co wskazuje na wzbogaconą populację komórek pluripotencjalnych, która zachowuje również zdolność do różnicowania i regeneracji niewielkiego odsetka dwu ujemnych komórek TG 30 ujemnych G CTM. Co więcej, kolejne hodowle TG 30 high G CTM dwóch wysoko posortowanych komórek wykazują dużą liczbę kolonii podobnych do HESC po pasażowaniu, co również wskazuje na utrzymanie stanu pluripotencji.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o kalibracji faksu przed użyciem za każdym razem, aby zapewnić powtarzalność wyników Zgodnie z tą procedurą. Inne metody, takie jak mikromacierze, sekwencjonowanie całego genomu lub potworniaki, można wykonać, aby odpowiedzieć na pytania, takie jak czy te komórki są naprawdę pluripotencjalne po jego rozwoju? Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się indukowanymi pluripotencjalnymi komórkami macierzystymi do zbadania bezpieczeństwa i stabilności tych komórek w porównaniu z ludzkimi embrionalnymi komórkami macierzystymi.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak starannie przygotować i wybarwić mieszane kultury ludzkich komórek macierzystych enbr w celu wzbogacenia o komórki perieta. Nie zapominaj, że praca z ludzkimi komórkami może być bardzo niebezpieczna, a środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek i praca z klasą drugą przy szafie bezpieczeństwa, powinny być zawsze podejmowane podczas wykonywania tej procedury.