Name: Wykorzystanie kokultury do wykrywania interakcji międzygatunkowych o podłożu chemicznym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-31T19:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Poznaj metodę kokultury do wykrywania interakcji mikroorganizmów za pośrednictwem związków chemicznych. Technika ta pozwala obserwować zmiany ekspresji genów w Bacillus subtilis przy użyciu fluorescencyjnych reporterów transkrypcyjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autor dziękuje Roberto Kolterowi (Harvard Medical School) za jego nieocenione rady i pomoc podczas tworzenia tego ekranu kokultury. Dziękuje również Matthew Powersowi za przeczytanie manuskryptu dla jasności oraz Chia-yi Cheng za pomoc w zdobyciu ryciny 6.

<ol><li>Berdy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactive+microbial+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antibiot%22%5BJournal%5D)">Bioactive microbial metabolites.</a> J. Antibiot. 58, 1-26 (2005).</li>
<li>Lopez, D., Vlamakis, H., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+multiple+cell+types+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Generation of multiple cell types in Bacillus subtilis.</a> FEMS Microbiol. Rev. 33, 152-163 (2009).</li>
<li>Vlamakis, H., Aguilar, C., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+cell+fate+by+the+formation+of+an+architecturally+complex+bacterial+community%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Control of cell fate by the formation of an architecturally complex bacterial community.</a> Genes Dev. 22, 945-953 (2008).</li>
<li>Branda, S. S., Gonzalez-Pastor, J. E., Ben-Yehuda, S., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fruiting+body+formation+by+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Fruiting body formation by Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 11621-11626 (2001).</li>
<li>Shank, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interspecies+interactions+that+result+in+Bacillus+subtilis+forming+biofilms+are+mediated+mainly+by+members+of+its+own+genus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Interspecies interactions that result in Bacillus subtilis forming biofilms are mediated mainly by members of its own genus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 1236-1243 (2011).</li>
<li>Piston, D. W., Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J., Claxton, N. S., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPiston%2C+DW+%22Introduction+to+Fluorescent+Proteins%22">Introduction to Fluorescent Proteins</a>. , (2013).</li>
<li>Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+proteins+and+their+applications+in+imaging+living+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues.</a> Physiol. Rev. 90, 1103-1163 (2010).</li>
<li>Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+fluorescent+protein+technology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Advances in fluorescent protein technology.</a> J. Cell Sci. 120, 4247-4260 (2007).</li>
<li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat. Methods. 2, 905-909 (2005).</li>
<li>Nicolas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Condition-dependent+transcriptome+reveals+high-level+regulatory+architecture+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Condition-dependent transcriptome reveals high-level regulatory architecture in Bacillus subtilis.</a> Science. 335, 1103-1106 (2012).</li>
<li>Middleton, R., Hofmeister, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+shuttle+vectors+for+ectopic+insertion+of+genes+into+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">New shuttle vectors for ectopic insertion of genes into Bacillus subtilis.</a> Plasmid. 51, 238-245 (2004).</li>
<li>Shimotsu, H., Henner, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+single-copy+integration+vector+and+its+use+in+analysis+of+regulation+of+the+trp+operon+of+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Construction of a single-copy integration vector and its use in analysis of regulation of the trp operon of Bacillus subtilis.</a> Gene. 43, 85-94 (1986).</li>
<li>Guerout-Fleury, A. M., Frandsen, N., Stragier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmids+for+ectopic+integration+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Plasmids for ectopic integration in Bacillus subtilis.</a> Gene. 180, 57-61 (1996).</li>
<li>Semsey, S., Blaha, B., Koles, K., Orosz, L., Papp, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+integrative+elements+of+rhizobiophage+16-3+can+integrate+into+proline+tRNA+%28CGG%29+genes+in+different+bacterial+genera%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Site-specific integrative elements of rhizobiophage 16-3 can integrate into proline tRNA (CGG) genes in different bacterial genera.</a> J. Bacteriol. 184, 177-182 (2002).</li>
<li>Charpentier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+cassette-based+shuttle+vector+system+for+gram-positive+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Novel cassette-based shuttle vector system for gram-positive bacteria.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70, 6076-6085 (2004).</li>
<li>Yang, H. Y., Kim, Y. W., Chang, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+an+integration-proficient+vector+based+on+the+site-specific+recombination+mechanism+of+enterococcal+temperate+phage+phiFC1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Construction of an integration-proficient vector based on the site-specific recombination mechanism of enterococcal temperate phage phiFC1.</a> J. Bacteriol. 184, 1859-1864 (2002).</li>
<li>Choi, K. H., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mini-Tn7+insertion+in+bacteria+with+single+attTn7+sites%3A+example+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa.</a> Nat. Protoc. 1, 153-161 (2006).</li>
<li>Craig, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tn7%3A+a+target+site-specific+transposon%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Tn7: a target site-specific transposon.</a> Mol. Microbiol. 5, 2569-2573 (1991).</li>
<li>Garcia-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+of+Bacillus+subtilis+biofilms+using+fluorescence+microscopy+and+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis of Bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry.</a> J. Vis. Exp. (60), e3796(2012).</li>
<li>Lopez, D., Fischbach, M. A., Chu, F., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structurally+diverse+natural+products+that+cause+potassium+leakage+trigger+multicellularity+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Structurally diverse natural products that cause potassium leakage trigger multicellularity in Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 280-285 (2009).</li>
<li>Vartoukian, S. R., Palmer, R. M., Wade, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+culture+of+%27unculturable%27+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Strategies for culture of 'unculturable' bacteria.</a> FEMS Microbiol. Lett. 309, 1-7 (2010).</li>
<li>Romano, J. D., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas-Saccharomyces+interactions%3A+influence+of+fungal+metabolism+on+bacterial+physiology+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas-Saccharomyces interactions: influence of fungal metabolism on bacterial physiology and survival.</a> J. Bacteriol. 187, 940-948 (2005).</li>
<li>Branda, S. S., Chu, F., Kearns, D. B., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+major+protein+component+of+the+Bacillus+subtilis+biofilm+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A major protein component of the Bacillus subtilis biofilm matrix.</a> Mol. Microbiol. 59, 1229-1238 (2006).</li>
<li>Zengler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivating+the+uncultured%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Cultivating the uncultured.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 15681-15686 (2002).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Jednym z nieodłącznych ograniczeń tego protokołu jest to, że opiera się on na zdolności do uprawy organizmów mikrobiologicznych. Jak zostało dobrze udokumentowane24, większość życia mikrobiologicznego na naszej planecie nie może (jeszcze) rosnąć w warunkach hodowli zbadanych do tej pory. W związku z tym ogromna liczba interakcji między gatunkami drobnoustrojów, które występują w środowisku naturalnym, pozostanie niewykryta przy użyciu tego podejścia. Ponieważ jednak naszym pragnieniem jest nie tylko zidentyfik...

Jesteśmy zainteresowani zrozumieniem, jak metabolity wydzielane przez bakterie wpływają na fizjologię i rozwój sąsiednich mikrobów. Wiele metabolitów zostało scharakteryzowanych ze względu na ich bioaktywne działanie na inne drobnoustroje. Dwa dobrze opisane przykłady obejmują antybiotyki, które hamują rozwój innych drobnoustrojów, oraz cząsteczki quorum sensing, które zmieniają globalną ekspresję genów innych drobnoustrojów. Jednak bakterie wytwarzają wiele innych małocząsteczkowych produktów naturalnych, które nie mają znanej bioaktywności1. Stawiamy hipotezę, że bakterie wyewoluowały i zachowały zdolność do wytwarzania niektórych z tych metabolitów, ponieważ pozwalają im one modulować fizjologię komórkową swoich mikrobiologicznych sąsiadów w złożonych społecznościach drobnoustrojów, w których występuje większość bakterii.
Typy komórek Bacillus subtilis
Skupiliśmy nasze badania na chemicznie zapośredniczonych interakcjach mikrobiologicznych z udziałem Bacillus subtilis. Dzieje się tak nie tylko ze względu na jej status jako bakterii modelowej Gram-dodatniej i wynikające z tego narzędzia genetyczne dostępne do jej manipulacji, ale także ze względu na jej zdolność do różnicowania się w scharakteryzowane typy komórek. Przykłady obejmują komórki, które są: pływanie; wytwarzanie macierzy zewnątrzkomórkowej, która jest niezbędna do tworzenia silnego biofilmu; zdolne do pobierania DNA ze środowiska; i zarodnikowanie m.in.2. Każdy z tych typów komórek wyraża charakterystyczny regulon transkrypcyjny, który sprawia, że różnią się fizjologicznie i/lub fizycznie od swojego genetycznie identycznego rodzeństwa. W wielu warunkach wzrostu wiele typów komórek współistnieje jako różne subpopulacje w obrębie jednej kolonii komórek B. subtilis 3. Chociaż wiele gatunków bakterii może wykazywać analogiczną niejednorodność typów komórek, zjawisko to zostało szczególnie dobrze zbadane w przypadku B. subtilis.
W szczególności zidentyfikowano geny, które są regulowane w górę w każdym z tych specyficznych typów komórek B. subtilis. Identyfikacja takich podwyższonych genów jest niezbędna dla opisanej tutaj pracy, ponieważ wiele z tych interesujących fenotypów mikrobiologicznych jest trudnych lub niemożliwych do bezpośredniego zaobserwowania. Na przykład nie możemy wizualnie wykryć takiej cechy, jak pływanie na stałych (1,5%) płytkach agarowych, mimo że subpopulacja komórek B. subtilis wytwarza wici w tych warunkach3. Innym przykładem jest produkcja matrycy biofilmu. Produkcja macierzy może być wizualizowana przez morfologię kolonii (ponieważ skutkuje makroskopowo pomarszczonymi koloniami), ale tylko na określonej pożywce wzrostowej i tylko po wielu dniach wzrostu4. Jednak wiedząc, które geny są regulowane w górę podczas różnicowania, możemy skonstruować reportery transkrypcyjne, które działają jako markery różnicowania komórkowego w tych typach komórek.
Konstrukcje reporterskie
Te fluorescencyjne reportery transkrypcyjne składają się z promotorów genów specyficznych dla typu komórki, które napędzają produkcję genu reporterowego, na przykład białka fluorescencyjnego. Przykłady obejmują Phag-yfp (dla komórek pływających), PtapA-yfp (dla komórek wytwarzających macierz biofilmu) i PsspB-yfp (dla komórek zarodnikujących), gdzie Px oznacza region promotora dla genu x. Te konstrukty reporterowe są zintegrowane z neutralnym locus na chromosomie (ryc. 1 i patrz poniżej), dzięki czemu natywna regulacja fenotypu pozostaje nienaruszona. Jednak teraz, gdy komórka wyraża ten fenotyp, wyraża również białko fluorescencyjne. Zapewnia to łatwy do wizualizacji odczyt aktywacji określonego zachowania fenotypowego, co pozwala nam na badanie przesiewowe w poszukiwaniu drobnoustrojów, które aktywują tę reakcję fizjologiczną. Chociaż takie reportery są powszechnie stosowane w mikrobiologii, nie były szeroko stosowane w badaniach przesiewowych do identyfikacji interakcji metabolicznych między drobnoustrojami, zanim ta metoda została opisana5.
Istnieje wiele ważnych kwestii związanych z projektowaniem i budową szczepów reporterowych specyficznych dla typu komórki. Użyliśmy wyłącznie transkrypcyjnych reporterów fluorescencyjnych, chociaż inne typy konstruktów są z pewnością możliwe. Odradzamy jednak stosowanie fuzji translacyjnych jako markerów różnicowania typów komórek w naszym badaniu przesiewowym z dwóch powodów: 1) chęci pozostawienia natywnego białka specyficznego dla danego typu komórki niezakłóconego oraz 2) uznania, że rozproszona, obejmująca całą komórkę fluorescencja będzie łatwiejsza do wykrycia niż zlokalizowana puncta w komórkach (powszechne w przypadku fuzji translacyjnych).
Reporter selekcja genów
Po podjęciu decyzji o użyciu transkrypcji jako odczytu, należy wybrać gen reporterowy (np. LacZ, fluorescencja lub lucyferasa). LacZ ma tę zaletę, że wymaga najmniej specjalistycznego sprzętu do wykrywania, ale istnieje znacznie większe prawdopodobieństwo fałszywych alarmów wśród drobnoustrojów środowiskowych. W naszych rękach poziom tła organizmów Lac+ wśród mikroorganizmów glebowych był zaporowo wysoki (>>10% mikroorganizmów glebowych było niebieskich (Lac+) na płytkach X-gal; danych nie pokazano). Możliwe, że poprzez miareczkowanie stężenia X-gal w pożywce, można to zoptymalizować, aby umożliwić użycie reportera X-gal, chociaż nie próbowaliśmy tego. Lucyferazy zapewnia wysoką czułość wykrywania i jest najbardziej ortogonalnym reporterem: nie ma prawie żadnych szans na to, aby mikroorganizmy środowiskowe były z natury luminescencyjne. Okazało się jednak, że trudno jest zidentyfikować oprzyrządowanie w naszej instytucji, które umożliwiałoby wykrywanie luminescencji na całych płytkach Petriego, ponieważ większość z nich została zaprojektowana do skanowania tylko zlokalizowanych obszarów na płytkach wielodołkowych. Mogą również wystąpić komplikacje w wizualizacji kolonii luminescencyjnych w sposób, który pozwolił również na jednoczesną fizyczną izolację organizmów indukujących. Chociaż korzystanie z powierników mogło to umożliwić, zamiast tego zdecydowaliśmy się na użycie fluorescencyjnych reporterów transkrypcyjnych, które okazały się skuteczne w przypadku B. subtilis, zapewniały odpowiednią czułość wykrywania i niskie wskaźniki wyników fałszywie dodatnich wśród organizmów glebowych oraz pozwalały na użycie łatwo dostępnych narzędzi zarówno do wizualizacji, jak i procedur izolacji.
Wybór fluoroforu
Konkretny wybrany fluorofor będzie zależał od gatunku twojego bakterium, pożywki do uprawy agaru, której używasz, oraz konkretnych zestawów filtrów fluorescencyjnych, które masz do dyspozycji. Dzięki naszemu oprzyrządowaniu odkryliśmy, że zarówno same kolonie B. subtilis, jak i agar, na którym były hodowane, wykazywały mniejszą fluorescencję tła, gdy zastosowano filtry YFP (żółte białko fluorescencyjne), co sprawia, że reporter jest lepszy niż GFP (zielone białko fluorescencyjne) w naszych rękach. Wykorzystanie kodonów w białkach fluorescencyjnych jest często optymalizowane dla eukariontów, dlatego ważne jest, aby wybrać fluorofor znany z literatury do pracy u gatunków bakterii lub przetestować go wyraźnie za pomocą konstytutywnego promotora. Obecnie dostępna jest duża liczba stale ewoluujących wariantów białek fluorescencyjnych6, które zostały zrecenzowane w wielu źródłach7,8, z których niektóre wyraźnie zawierają wskazówki dotyczące wyboru odpowiedniego białka fluorescencyjnego do eksperymentu9.
Wybór promotora
Wybór promotora będzie w dużej mierze zależał od typu komórki lub fenotypu, który Cię interesuje. W przypadku organizmów takich jak B. subtilis w literaturze ustalono pewne geny reporterowe specyficzne dla typu komórki. W przypadku innych szczepów bakteryjnych konieczne będzie zbadanie danych mikromacierzowych lub transkrypcyjnych, aby uzyskać informacje o tym, które geny są wysoce regulowane w górę w warunkach, w których przejawia się interesujący Cię typ komórki. W niedawnym badaniu skatalogowano transkrypcję B. subtilis w 104 różnych warunkach wzrostu przy użyciu mikromacierzy kafelkowych10. Artykuł ten dostarcza wyczerpujących informacji na temat tego, które geny są silnie regulowane w górę w różnych warunkach, co jest nieocenione w przypadku słabiej scharakteryzowanych fenotypów.
Zamiast mapować dokładne regiony promotora dla każdego interesującego nas genu, zazwyczaj po prostu używamy sekwencji 200-500 pz przed genem jako promotora. Dokładna długość sekwencji zależy od kontekstu genomowego: w razie potrzeby stosuje się krótsze regiony, aby uniknąć włączania regionów kodujących z sąsiednich otwartych ramek odczytu.
Neutralne loci i integracja
Jak utrzymać konstrukcję reporterową w swoim szczepie bakteryjnym, staje się ostatnim pytaniem przy projektowaniu fluorescencyjnego transkrypcyjnego szczepu reporterowego. U bakterii interesujące geny są często utrzymywane na plazmidach za pomocą selekcji antybiotyków. Jednak stosowanie antybiotyków podczas kokultury bez zabijania drobnoustrojów środowiskowych może nie być możliwe. Jeśli plazmidy są stabilnie utrzymywane w twoim gatunku bakterii, może być możliwe wyhodowanie bakterii zawierających reporter przenoszony przez plazmid w obecności antybiotyków, aby przygotować reportera do badań przesiewowych, a następnie wyeliminować antybiotyki podczas samej kokultury w nadziei, że plazmid będzie wystarczająco utrzymany, aby umożliwić fluorescencję. Jeśli jednak plazmidy łatwo tracą się w bakterii lub są tracone w warunkach stresu, nie będzie to realna opcja. W wielu przypadkach najlepszym rozwiązaniem będzie zintegrowanie konstruktu reporterowego z chromosomem bakteryjnym, co pozwala na stabilne utrzymanie reportera nawet w przypadku braku selekcji. Aby integracja nie zakłóciła normalnej ekspresji lub regulacji interesującego Cię genu, zalecamy integrację z ektopowym miejscem na chromosomie, które może działać jako "neutralne locus". U B. subtilis te miejsca integracji są genami, które - gdy są zmutowane - przenoszą fenotyp w pewnych minimalnych pożywkach (co pozwala na identyfikację integrantów bez selekcji antybiotyków), jednak nie zmieniają tempa wzrostu ani zarodnikowania w pożywkach bogatych i obejmują takie geny, jak amyE, lacA, thrC, pyrD, gltA i sacA (przekazujące zdolność do wykorzystania odpowiednio skrobi, β-galaktozydów, treoniny, uracylu, glutaminianu i sacharozy)11-13.
Chociaż integracja w tych genach była niezawodnie stosowana przez wiele lat u B. subtilis (szczególnie w amyE i lacA), podobna wiedza może nie być dostępna dla genów w wielu innych gatunkach bakterii. Wykorzystanie miejsc przyczepiania fagów jest doskonałą alternatywą dla neutralnych miejsc integracji chromosomów: wiele specyficznych dla gatunkumiejsc 14-16, a także ogólnych miejsc integracji, takich jak miejsce przyłączenia Tn7 (attTn7) zostało zidentyfikowanych i wykorzystanych do insercji genów u wielu gatunków bakterii17,18.
Mikroorganizmy środowiskowe
Używamy gleby jako bezpośredniego źródła mikrobów środowiskowych dla naszego ekranu kokultury. Gleba zawiera dużą różnorodność drobnoustrojów, a wiele z tych organizmów jest bogatym źródłem produktów naturalnych. Stosując płynne zawiesiny gleby umieszczone bezpośrednio na płytkach z naszym fluorescencyjnym transkrypcyjnym szczepem reporterowym (bez wcześniejszej izolacji bakterii z gleby), znacznie upraszczamy podejście eksperymentalne. Gleba może być wykorzystana natychmiast po zbiorach lub zamrożona w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości. Natychmiastowe użycie ma tę zaletę, że potencjalnie można wyhodować większą różnorodność drobnoustrojów, w tym tych, które nie przetrwają dobrze mrozu. Ma to tę wadę, że stężenie organizmów glebowych nadających się do uprawy w tych próbkach jest nieznane, co zwiększa liczbę płyt sitowych, które należy zastosować. Opóźnione użycie ma tę zaletę, że jtk/ml dla każdego źródła gleby można określić z wyprzedzeniem, co pozwala na wyhodowanie optymalnej liczby kolonii na każdej płycie sitowej. Wymaga jednak, aby organizmy glebowe były zdolne do przetrwania zamarzania.
Zauważ, że zróżnicowanie badanej puli induktorów (tj. źródeł glebowych) wydaje się być bardziej skuteczne w identyfikowaniu nowych interakcji międzygatunkowych niż dogłębne badania przesiewowe na tej samej glebie: większą różnorodność filogenetyczną zaobserwowano w trafieniach zidentyfikowanych na naszym ekranie indukcji matrycy, ponieważ dodatkowe źródła gleby były badane, zamiast dokładniej badać te same źródła gleby (E.A. Shank i R. Kolter, Harvard Medical School, wyniki niepublikowane).
Przegląd
Podejście, które tutaj opisujemy, jest proste pod względem wymagań technicznych. Polega ona na: 1) skonstruowaniu fluorescencyjnego reportera transkrypcyjnego u B. subtilis lub innego gatunku bakterii będącego przedmiotem zainteresowania, 2) zidentyfikowaniu warunków, w których ten reporter nie jest aktywowany, 3) przygotowaniu porcji tego szczepu reporterowego i organizmów do badań przesiewowych (w naszym przypadku gleby, ale zamiast tego można wykorzystać inne źródła), 4) zmieszaniu tych dwóch zestawów drobnoustrojów na podłożach stałych, 5) identyfikacja i wyizolowanie przypuszczalnych organizmów indukujących oraz 6) potwierdzenie, że organizmy te rzeczywiście aktywują ten fenotyp w wtórnym badaniu przesiewowym. Po zidentyfikowaniu, organizmy te i ich metabolity dostarczają nam narzędzi chemicznych do modulowania zachowania bakterii, badania fizjologii bakterii i interakcji mikrobiologicznych oraz potencjalnego działania jako nowe rusztowania dla przyszłych związków terapeutycznych.

<table><tbody><tr><td>Spektrofotometr</td><td></td><td></td><td>Dowolny spektrofotomer zdolny do pomiaru wartości absorpcji OD600 absorbancja.</td></tr><tr><td>Rosół Luria, Lennox</td><td>VWR</td><td>80017-484</td><td>Mogą być konieczne alternatywne źródła pożywki.</td></tr><tr><td>Koraliki szklane, 3 mm</td><td>VWR</td><td>26396-508</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do nakładania żelu, okrągłe</td><td>VWR</td><td>29442-666</td><td></td></tr><tr><td>Pręty szklane</td><td>VWR</td><td>59060-069</td><td></td></tr><tr><td>Stereoskop fluorescencyjny</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>Autor użył stereoskopu preparacyjnego Zeiss Stemi SV6 z fluorescencyjnym źródłem światła EXFO X-cite 120, kostką filtra długoprzepustowego YFP, achromatycznym obiektywem 0,63X, okularami 10X i Aparat cyfrowy Axio HRC HR. Większość ekranowania wykonano z mocowaniem do ustawiania ostrości 2,0-3,2X. Każdy stereoskop preparacyjny z możliwością fluorescencji jest w porządku, pod warunkiem, że masz odpowiednie filtry dla używanego FP. Najlepiej, jeśli jest migawka, która pozwala łatwo przełączać się między jasnym polem a fluorescencją, a także stolik, który umożliwia oświetlenie z góry i z dołu. Jeśli chcesz robić zdjęcia, niezbędna jest również dołączona kamera.</td></tr></tbody></table>

wykorzystanie kokultury do wykrywania interakcji międzygatunkowych o podłożu chemicznym

Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions

W naturze bakterie rzadko występują w izolacji; zamiast tego są otoczone przez różnorodny wachlarz innych mikroorganizmów, które zmieniają lokalne środowisko poprzez wydzielanie metabolitów. Metabolity te mają potencjał do modulowania fizjologii i różnicowania swoich mikrobiologicznych sąsiadów i są prawdopodobnie ważnymi czynnikami w tworzeniu i utrzymywaniu złożonych społeczności drobnoustrojów. Opracowaliśmy badanie przesiewowe kokultury oparte na fluorescencji, aby zidentyfikować takie chemiczne interakcje mikrobiologiczne. Badanie przesiewowe polega na połączeniu fluorescencyjnego transkrypcyjnego szczepu reporterowego z mikroorganizmami środowiskowymi na pożywkach stałych i umożliwieniu koloniom wzrostu w kokulturze. Fluorescencyjny reporter transkrypcyjny jest zaprojektowany w taki sposób, aby wybrany szczep bakteryjny fluoryzował, gdy wyraża określony fenotyp zainteresowania (tj. tworzenie biofilmu, zarodnikowanie, produkcja czynnika wirulencji itp.) Badania przesiewowe przeprowadza się w warunkach wzrostu, w których ten fenotyp nie ulega ekspresji (a zatem szczep reporterowy jest zazwyczaj niefluorescencyjny). Kiedy mikrob środowiskowy wydziela metabolit, który aktywuje ten fenotyp, dyfunduje on przez agar i aktywuje fluorescencyjny konstrukt reporterowy. Pozwala to na wykrycie drobnoustrojów wytwarzających metabolity indukujące: są to kolonie niefluorescencyjne najbardziej proksymalne do kolonii fluorescencyjnych. W ten sposób ekran ten umożliwia identyfikację drobnoustrojów środowiskowych, które wytwarzają dyfuzyjne metabolity, które aktywują określoną odpowiedź fizjologiczną w szczepie reporterowym. W niniejszej publikacji omówiono, jak: a) wybrać odpowiednie warunki przesiewowe kokultury, b) przygotować drobnoustroje reporterowe i środowiskowe do badań przesiewowych, c) przeprowadzić badanie przesiewowe kokultury, d) wyizolować przypuszczalne organizmy indukujące oraz e) potwierdzić ich aktywność w badaniu przesiewowym wtórnym. Opracowaliśmy tę metodę do badań przesiewowych w poszukiwaniu organizmów glebowych, które aktywują wytwarzanie matrycy biofilmu u Bacillus subtilis; Omawiamy jednak również kwestie związane z zastosowaniem tego podejścia do innych genetycznie podatnych bakterii.

Ten screening został wykorzystany do zidentyfikowania organizmów glebowych wydzielających związki, które zmieniają fizjologię B. subtilis. Opisane tutaj wyniki koncentrują się na typie komórek produkujących macierz B. subtilis, które wytwarzają białko i egzopolisacharyd niezbędne do tworzenia stabilnego biofilmu u tej bakterii. Do naszej fluorescencyjnej konstrukcji reporterowej (PtapA-yfp) wybraliśmy promotor operonu tapA-sipW-tasA. Operon ten koduje białkowy komponent stru...

Bakterie wytwarzają wydzielane związki, które mogą wpływać na fizjologię swoich mikrobiologicznych sąsiadów. W tym miejscu opisujemy badanie przesiewowe kokultury, które umożliwia wykrywanie takich chemicznie zapośredniczonych interakcji międzygatunkowych poprzez mieszanie mikroorganizmów glebowych z fluorescencyjnymi transkrypcyjnymi szczepami reporterowymi Bacillus subtilis na podłożach stałych.

Wykorzystanie kokultury do wykrywania interakcji międzygatunkowych o podłożu chemicznym

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zidentyfikowanie interakcji między różnymi drobnoustrojami, w których pośredniczą wydzielane związki i prowadzą do zmian w ekspresji genów bakteryjnych. Osiąga się to poprzez hodowlę szczepu bakteryjnego zawierającego fluorescencyjny reporter transkrypcyjny z drobnoustrojami środowiskowymi jako koloniami na agarowych płytkach Petriego. Pomarańczowe kółka reprezentują kolonie drobnoustrojów środowiskowych.Podczas gdy niebieskie kręgi są koloniami reportera, wzrost na stałych podłożach pozwala metabolitom wytwarzanym przez te kolonie dyfundować przez agar i aktywować ekspresję genów w pobliskich koloniach reporterowych. Potencjalne trafienia wskazane tutaj za pomocą gwiazd to te kolonie, które mogą wydzielać związki zmieniające ekspresję genów w reporterze. Organizmy te są izolowane z płytek sitowych kokultury.Te potencjalne induktory są ponownie testowane w wtórnym badaniu przesiewowym, aby potwierdzić, że były to organizmy wydzielające cząsteczki, które zmieniają ekspresję genów bakteryjnych w reporterze. Chociaż metoda ta zapewnia wgląd w interakcje tworzące biofilm między Bacillus subtles a organizmami glebowymi, można ją również zastosować do innych systemów, takich jak interakcje mikrobiologiczne, które wpływają na ekspresję wirulencji u gatunków Staphylococcus lub Pseudomona. Rzeczywiście, teoretycznie można go zastosować do identyfikacji interakcji mikrobiologicznych, które zmieniają ekspresję genów dla dowolnego reportera w dowolnym genetycznie podatnym mikrobie Po wygenerowaniu fluorescencyjnych konstruktów reporterowych dla wybranego organizmu, zgodnie z protokołem tekstowym, zbierz glebę, usuwając górne 0,5 centymetra odsłoniętej gleby powierzchniowej przed użyciem szpatułki do zbierania gleby i stożkowych rurek, Dodaj 0,85% sterylnej soli fizjologicznej w proporcji 10 mililitrów na jeden gram gleby, aby uzyskać zawiesinę glebową i wirować ją przez jedną minutę, aby usunąć bakterie z cząstek gleby.Po pozostawieniu gnojowicy glebowej na jedną minutę, przenieś górną warstwę wodną do świeżej probówki, rozcieńczyć reporter i próbki gleby zgodnie z protokołem tekstowym i umieść 50 mikrolitrów każdego z nich na środku płytek sitowych do kokultury w warunkach, które nie aktywują samego konstruktu reporterowego. Również należy umieścić samą próbkę gleby i sam reporter jako kontrolę. Dodaj około 23 milimetrowe sterylne szklane kulki na każdą płytkę i rozprowadź komórki, trzymając płytki na blacie stołu i potrząsając nimi w przód iw tył.Obracając, aż ciecz zostanie wchłonięta, odwróć płytki i wyrzuć kulki do zlewki na odpady zawierającej etanol. Po inkubacji płytek kokulturowych za pomocą fluorescencji i zaczynając od góry płytki, powoli przesuwaj płytkę w przód iw tył przez pole widzenia do jasnych punktów. Po jednym pełnym przeciągnięciu obróć płytkę o 90 stopni i powtórz proces.Po wykryciu plamki fluorescencyjnej powoli włącz oświetlenie jasnego pola i określ, czy fluorescencja jest związana z kolonią bakteryjną. Aby wyizolować domniemane organizmy indukujące, które będą koloniami niefluorescencyjnymi bliższymi koloniom fluorescencyjnym. Umieść je w środku pola widzenia i dostępne dla Twojej dominującej ręki, pozostawiając włączoną świetlówkę.Powoli włącz Brightfield, aby zidentyfikować na podstawie kształtu i położenia kolonię fluorescencyjną i otaczające organizmy indukujące Za pomocą szklanego pręta podnieś sterylną okrągłą końcówkę ładującą żel o pojemności 200 mikrolitrów i trzymaj ją jak ołówek. Oprzyj zewnętrzną dłoń o scenę, aby ustabilizować ją na powierzchni roboczej. Następnie połóż drugą rękę po wewnętrznej stronie kciuka dłoni, aby ustabilizować narzędzie do pobierania, utrzymując końcówkę pipety nad powierzchnią płytki.Przesuń go w pole widzenia i wyśrodkuj nad kolonią, którą chcesz wybrać. Końcówka będzie nieostra. Używając zewnętrznej krawędzi dłoni, powoli obróć końcówkę pipety w dół do kolonii, która ma zostać pobrana.Dotykaj go bardzo delikatnie, starając się zminimalizować liczbę innych kolonii, z którymi styka się końcówka, bez obracania narzędzia do zbierania. Nałóż końcówkę na fragment świeżego talerza. Po zebraniu kolonii inkubuj płytki zgodnie z wytycznymi testu.Kiedy kolonie są widoczne, użyj stereoskopu, aby określić, czy na płytce rośnie jeden lub wiele typów organizmów, ponownie przełóż każdy typ morfo na świeżą płytkę i inkubuj, aż wyrośnie. Aby sprawdzić, czy domniemane induktory są prawdziwymi induktorami, przygotuj trawniki z reporterowych i niefluorescencyjnych szczepów rodzicielskich. Po wyschnięciu płytek użyj sterylnych wykałaczek, aby pobrać komórki z kolonii testowych.Nałóż na czystą płytę, a następnie na dwie płyty trawnikowe. Alternatywnie, resus, zawiesić przypuszczalne organizmy indukujące w jednym mililitrze płynnego podłoża w sterylnym plastikowym weterynarzu i zmierzyć OD 600 zawiesin po normalizacji OD każdej zawiesiny, aby uzyskać OD 600 0,5 plamki, po jednym mikrolitrze każdej zawiesiny na każdej z trzech płytek. Na koniec, po pozwoleniu organizmom na wzrost, użyj fluorescencji pod mikroskopem preparacyjnym, aby zidentyfikować przypuszczalne organizmy indukujące, które aktywują fluorescencyjny szczep reporterowy, ale nie szczep kontroli rodzicielskiej.Ekran w tym miejscu został wykorzystany do identyfikacji organizmów glebowych wydzielających związki, które zmieniają ekspresję genów składnika strukturalnego macierzy biofilmu w subtelnych b, za pomocą fluorescencyjnego reportera transkrypcyjnego. Idealnie byłoby, gdyby każda płytka kokulturowa zawierała stosunek kolonii reporterowych do glebowych, które są blisko rozmieszczonymi pojedynczymi koloniami. Tutaj pokazujemy, w jaki sposób wysoki stosunek kolonii reporterowych pokazanych jako niebieskie koła w stosunku do kolonii glebowych pokazanych jako brązowe koła zwiększa pewność w określeniu rzeczywistego organizmu indukującego na płytkach współkulturowych.Indukujące organizmy glebowe wydzielają związki, które aktywują reportera. Na płycie zostanie indukowanych wiele kolonii reporterowych o wyższym stosunku reportera do gleby, co ułatwi identyfikację prawdziwych induktorów pokazanych na czerwono od innych przypuszczalnych induktorów wskazanych przez gwiazdy. Zawartość składników odżywczych kontroluje stopień tworzenia kolonii wzrostu, podczas gdy rozcieńczenie inokulum określa, czy powstałe kolonie są odpowiednio rozproszone.Jak widać w tej kokulturze, subtelne obrazy B wytwarzają fluorescencyjną matrycę biofilmu w odpowiedzi na liczne drobnoustroje z gleby. W przypadku zbadanych przez nas gleb uzyskaliśmy wysoki wskaźnik trafień dla reportera macierzy Ptap A YFP. Jest to przeciwieństwo naszych niepublikowanych wyników z analogicznych ekranów.Korzystając z zarodnikowania i kompetencji, reporterzy byli nieliczni lub nie zidentyfikowano żadnych trafień. W związku z tym wskaźniki HI dla różnych typów komórek są bardzo zmienne i mogą być trudne do przewidzenia z wyprzedzeniem. Pokazano tutaj dwa przykłady płytek przesiewowych do kohodowli przed i po wybraniu potencjalnych kolonii indukujących do izolacji.Pokazano tutaj negatywne i pozytywne wyniki zarówno metody łatowej, jak i punktowej, przy czym około 50% kolonii badanych na naszym wtórnym ekranie to prawdziwie pozytywne. Zgodnie z tą procedurą można zastosować inne metody, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład sekwencjonowanie DNA 16 s SR w celu określenia tożsamości filogenetycznej organizmu indukującego lub wykorzystanie spektrometrii mas HPLC w NMR w celu określenia tożsamości chemicznej związku aktywnego.

using-coculture-to-detect-chemically-mediated-interspecies

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wykorzystanie współhodowli do wykrywania chemicznie pośredniczonych interakcji międzygatunkowych

Źródło: Speare, L., et al. Test komonetacyjności do ilościowego określania konkurencyjnych interakcji między izolatami Vibrio fischeri.  J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film przedstawia test współinkubacji używany do badania, w jaki sposób szczepy bakteryjne konkurują ze sobą we wspólnym środowisku. Jest szeroko stosowany w mikrobiologii do identyfikacji mechanizmów, takich jak zabijanie zależne od kontaktu lub niezależne od kontaktu, które napędzają te interakcje.

Test Coincubation do badania konkurencyjnych interakcji między szczepami bakterii

Źródło: Nathoo, N., et al. Hydroponiczny system kouprawy do jednoczesnej i systematycznej analizy interakcji molekularnych roślina/mikroorganizm oraz sygnalizacji. J. Vis. Exp. (2017).Ten film przedstawia hydroponiczny system wspólnej uprawy do badania interakcji między roślinami a bakteriami w sterylnych warunkach. Sadzonki roślin przenosi się do sterylnego, kwaśnego podłoża wzrostowego, inkubuje i sprawdza pod kątem zanieczyszczenia przed zaszczepieniem Agrobacterium. Aktywowane bakterie...

System wspólnej uprawy do badania reakcji molekularnych gospodarzy roślinnych i bakterii oddziałujących na siebie

Źródło: Temkin, M. I. i in. Wysokoprzepustowe testy kokultury do badania interakcji mikroorganizmów. J. Vis. Exp. (2019)Ten film prezentuje test in vitro do badania interakcji mikroorganizmów między Corynebacterium propinquum a Staphylococcus w współkulturze.

Test in vitro do badania interakcji mikroorganizmów w kokulturze

Bakterie mogą gromadzić zarówno szkodliwe, jak i korzystne mutacje w ciągu swojego życia. W populacji komórek osobniki, które zgromadziły korzystne mutacje, mogą szybko prześcignąć swoich pobratymców. W tym miejscu przedstawiamy prostą procedurę wizualizacji konkurencji wewnątrzgatunkowej w populacji komórek bakteryjnych w czasie przy użyciu fluorescencyjnie znakowanych osobników.

Monitorowanie konkurencji wewnątrzgatunkowej w populacji komórek bakteryjnych poprzez kohodowlę szczepów znakowanych fluorescencyjnie

Opisany system kouprawy hydroponicznej wspiera nienaruszone rośliny za pomocą metalowych siatek i współhoduje je z bakteriami. Tkanki roślinne, bakterie i wydzielane cząsteczki mogą być następnie oddzielnie zbierane do dalszych analiz, co jednocześnie pozwala na zbadanie odpowiedzi molekularnych zarówno gospodarzy roślinnych, jak i oddziałujących na siebie mikroorganizmów lub mikrobiomów.

Hydroponiczny system wspólnej uprawy do jednoczesnej i systematycznej analizy interakcji molekularnych między roślinami a mikroorganizmami oraz sygnalizacji

Synergiczne kombinacje leków są trudne i czasochłonne do empirycznego zidentyfikowania. W tym miejscu opisujemy metodę identyfikacji i walidacji synergicznych małych cząsteczek.

Wysokoprzepustowa identyfikacja synergicznych kombinacji leków metodą Overlap2

Bakterie kodują różne mechanizmy do angażowania się w międzybakteryjną rywalizację. W tym miejscu przedstawiamy oparty na kulturze protokół charakteryzujący konkurencyjne interakcje między izolatami bakteryjnymi i ich wpływ na strukturę przestrzenną populacji mieszanej.

Test komonetacyjności do ilościowego określania konkurencyjnych interakcji między izolatami Vibrio fischeri

Testy interakcji międzykulturowych przedstawione w tym protokole są niedrogie, mają wysoką przepustowość i są proste. Testy te można wykorzystać do obserwacji interakcji mikrobiologicznych w kokulturze, identyfikacji wzorców interakcji i scharakteryzowania potencjału hamującego badanego szczepu drobnoustrojów przeciwko patogenom ludzkim i środowiskowym.

Wysokoprzepustowe testy kokultur do badania interakcji mikrobiologicznych

Ten protokół obrazowania żywych komórek bakteryjnych pozwala na wizualizację interakcji między wieloma gatunkami bakterii na poziomie pojedynczej komórki w czasie. Obrazowanie poklatkowe pozwala na obserwację każdego gatunku bakterii w monokulturze lub kokulturze w celu zbadania interakcji międzygatunkowych w wielogatunkowych społecznościach bakteryjnych, w tym ruchliwości i żywotności poszczególnych komórek.

Kinetyczna wizualizacja jednokomórkowych międzygatunkowych interakcji bakteryjnych

Opisujemy podejście do wykrywania i przechwytywania inwazyjnych subpopulacji komórek w czasie rzeczywistym. Projekt eksperymentalny wykorzystuje analizę komórkową w czasie rzeczywistym poprzez monitorowanie zmian impedancji elektrycznej komórek. Można wychwycić inwazyjne komórki nowotworowe, immunologiczne, śródbłonkowe lub zrębowe w złożonych tkankach i ocenić wpływ kokultur.

Wykrywanie i wychwytywanie w czasie rzeczywistym inwazyjnych subpopulacji komórek z kokultur

Ten protokół dostarcza wyczerpujących wytycznych dotyczących konfiguracji i ilościowego monitorowania kokultur, w tym fotoautotroficznych cyjanobakterii wydzielających cukier i drożdży heterotroficznych.

Składanie i kwantyfikacja kokultur łączących drożdże heterotroficzne z fototroficznymi cyjanobakteriami wydzielającymi cukier

Poznaj metodę kokultury do wykrywania interakcji mikroorganizmów za pośrednictwem związków chemicznych. Technika ta pozwala obserwować zmiany ekspresji genów w Bacillus subtilis przy użyciu fluorescencyjnych reporterów transkrypcyjnych.

Wykorzystanie kokultury do wykrywania interakcji międzygatunkowych o podłożu chemicznym

Przeglądaj więcej filmów