Wykorzystanie kokultury do wykrywania interakcji międzygatunkowych o podłożu chemicznym

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zidentyfikowanie interakcji między różnymi drobnoustrojami, w których pośredniczą wydzielane związki i prowadzą do zmian w ekspresji genów bakteryjnych. Osiąga się to poprzez hodowlę szczepu bakteryjnego zawierającego fluorescencyjny reporter transkrypcyjny z drobnoustrojami środowiskowymi jako koloniami na agarowych płytkach Petriego. Pomarańczowe kółka reprezentują kolonie drobnoustrojów środowiskowych.

Podczas gdy niebieskie kręgi są koloniami reportera, wzrost na stałych podłożach pozwala metabolitom wytwarzanym przez te kolonie dyfundować przez agar i aktywować ekspresję genów w pobliskich koloniach reporterowych. Potencjalne trafienia wskazane tutaj za pomocą gwiazd to te kolonie, które mogą wydzielać związki zmieniające ekspresję genów w reporterze. Organizmy te są izolowane z płytek sitowych kokultury.

Te potencjalne induktory są ponownie testowane w wtórnym badaniu przesiewowym, aby potwierdzić, że były to organizmy wydzielające cząsteczki, które zmieniają ekspresję genów bakteryjnych w reporterze. Chociaż metoda ta zapewnia wgląd w interakcje tworzące biofilm między Bacillus subtles a organizmami glebowymi, można ją również zastosować do innych systemów, takich jak interakcje mikrobiologiczne, które wpływają na ekspresję wirulencji u gatunków Staphylococcus lub Pseudomona. Rzeczywiście, teoretycznie można go zastosować do identyfikacji interakcji mikrobiologicznych, które zmieniają ekspresję genów dla dowolnego reportera w dowolnym genetycznie podatnym mikrobie Po wygenerowaniu fluorescencyjnych konstruktów reporterowych dla wybranego organizmu, zgodnie z protokołem tekstowym, zbierz glebę, usuwając górne 0,5 centymetra odsłoniętej gleby powierzchniowej przed użyciem szpatułki do zbierania gleby i stożkowych rurek, Dodaj 0,85% sterylnej soli fizjologicznej w proporcji 10 mililitrów na jeden gram gleby, aby uzyskać zawiesinę glebową i wirować ją przez jedną minutę, aby usunąć bakterie z cząstek gleby.

Po pozostawieniu gnojowicy glebowej na jedną minutę, przenieś górną warstwę wodną do świeżej probówki, rozcieńczyć reporter i próbki gleby zgodnie z protokołem tekstowym i umieść 50 mikrolitrów każdego z nich na środku płytek sitowych do kokultury w warunkach, które nie aktywują samego konstruktu reporterowego. Również należy umieścić samą próbkę gleby i sam reporter jako kontrolę. Dodaj około 23 milimetrowe sterylne szklane kulki na każdą płytkę i rozprowadź komórki, trzymając płytki na blacie stołu i potrząsając nimi w przód iw tył.

Obracając, aż ciecz zostanie wchłonięta, odwróć płytki i wyrzuć kulki do zlewki na odpady zawierającej etanol. Po inkubacji płytek kokulturowych za pomocą fluorescencji i zaczynając od góry płytki, powoli przesuwaj płytkę w przód iw tył przez pole widzenia do jasnych punktów. Po jednym pełnym przeciągnięciu obróć płytkę o 90 stopni i powtórz proces.

Po wykryciu plamki fluorescencyjnej powoli włącz oświetlenie jasnego pola i określ, czy fluorescencja jest związana z kolonią bakteryjną. Aby wyizolować domniemane organizmy indukujące, które będą koloniami niefluorescencyjnymi bliższymi koloniom fluorescencyjnym. Umieść je w środku pola widzenia i dostępne dla Twojej dominującej ręki, pozostawiając włączoną świetlówkę.

Powoli włącz Brightfield, aby zidentyfikować na podstawie kształtu i położenia kolonię fluorescencyjną i otaczające organizmy indukujące Za pomocą szklanego pręta podnieś sterylną okrągłą końcówkę ładującą żel o pojemności 200 mikrolitrów i trzymaj ją jak ołówek. Oprzyj zewnętrzną dłoń o scenę, aby ustabilizować ją na powierzchni roboczej. Następnie połóż drugą rękę po wewnętrznej stronie kciuka dłoni, aby ustabilizować narzędzie do pobierania, utrzymując końcówkę pipety nad powierzchnią płytki.

Przesuń go w pole widzenia i wyśrodkuj nad kolonią, którą chcesz wybrać. Końcówka będzie nieostra. Używając zewnętrznej krawędzi dłoni, powoli obróć końcówkę pipety w dół do kolonii, która ma zostać pobrana.

Dotykaj go bardzo delikatnie, starając się zminimalizować liczbę innych kolonii, z którymi styka się końcówka, bez obracania narzędzia do zbierania. Nałóż końcówkę na fragment świeżego talerza. Po zebraniu kolonii inkubuj płytki zgodnie z wytycznymi testu.

Kiedy kolonie są widoczne, użyj stereoskopu, aby określić, czy na płytce rośnie jeden lub wiele typów organizmów, ponownie przełóż każdy typ morfo na świeżą płytkę i inkubuj, aż wyrośnie. Aby sprawdzić, czy domniemane induktory są prawdziwymi induktorami, przygotuj trawniki z reporterowych i niefluorescencyjnych szczepów rodzicielskich. Po wyschnięciu płytek użyj sterylnych wykałaczek, aby pobrać komórki z kolonii testowych.

Nałóż na czystą płytę, a następnie na dwie płyty trawnikowe. Alternatywnie, resus, zawiesić przypuszczalne organizmy indukujące w jednym mililitrze płynnego podłoża w sterylnym plastikowym weterynarzu i zmierzyć OD 600 zawiesin po normalizacji OD każdej zawiesiny, aby uzyskać OD 600 0,5 plamki, po jednym mikrolitrze każdej zawiesiny na każdej z trzech płytek. Na koniec, po pozwoleniu organizmom na wzrost, użyj fluorescencji pod mikroskopem preparacyjnym, aby zidentyfikować przypuszczalne organizmy indukujące, które aktywują fluorescencyjny szczep reporterowy, ale nie szczep kontroli rodzicielskiej.

Ekran w tym miejscu został wykorzystany do identyfikacji organizmów glebowych wydzielających związki, które zmieniają ekspresję genów składnika strukturalnego macierzy biofilmu w subtelnych b, za pomocą fluorescencyjnego reportera transkrypcyjnego. Idealnie byłoby, gdyby każda płytka kokulturowa zawierała stosunek kolonii reporterowych do glebowych, które są blisko rozmieszczonymi pojedynczymi koloniami. Tutaj pokazujemy, w jaki sposób wysoki stosunek kolonii reporterowych pokazanych jako niebieskie koła w stosunku do kolonii glebowych pokazanych jako brązowe koła zwiększa pewność w określeniu rzeczywistego organizmu indukującego na płytkach współkulturowych.

Indukujące organizmy glebowe wydzielają związki, które aktywują reportera. Na płycie zostanie indukowanych wiele kolonii reporterowych o wyższym stosunku reportera do gleby, co ułatwi identyfikację prawdziwych induktorów pokazanych na czerwono od innych przypuszczalnych induktorów wskazanych przez gwiazdy. Zawartość składników odżywczych kontroluje stopień tworzenia kolonii wzrostu, podczas gdy rozcieńczenie inokulum określa, czy powstałe kolonie są odpowiednio rozproszone.

Jak widać w tej kokulturze, subtelne obrazy B wytwarzają fluorescencyjną matrycę biofilmu w odpowiedzi na liczne drobnoustroje z gleby. W przypadku zbadanych przez nas gleb uzyskaliśmy wysoki wskaźnik trafień dla reportera macierzy Ptap A YFP. Jest to przeciwieństwo naszych niepublikowanych wyników z analogicznych ekranów.

Korzystając z zarodnikowania i kompetencji, reporterzy byli nieliczni lub nie zidentyfikowano żadnych trafień. W związku z tym wskaźniki HI dla różnych typów komórek są bardzo zmienne i mogą być trudne do przewidzenia z wyprzedzeniem. Pokazano tutaj dwa przykłady płytek przesiewowych do kohodowli przed i po wybraniu potencjalnych kolonii indukujących do izolacji.

Pokazano tutaj negatywne i pozytywne wyniki zarówno metody łatowej, jak i punktowej, przy czym około 50% kolonii badanych na naszym wtórnym ekranie to prawdziwie pozytywne. Zgodnie z tą procedurą można zastosować inne metody, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład sekwencjonowanie DNA 16 s SR w celu określenia tożsamości filogenetycznej organizmu indukującego lub wykorzystanie spektrometrii mas HPLC w NMR w celu określenia tożsamości chemicznej związku aktywnego.