Name: Metody identyfikacji rezonansów NMR 13C-dimetylo-N-końcowej aminy na redukcyjnie metylowanych białkach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-12T13:45:00.000+00:00
Duration: 13 min 59 s
Description: Poznaj metody identyfikacji rezonansów NMR dimetyloaminy α- i ε- na N-końcowej lizynie w lizozymie. Wykorzystaj selektywność pH i aminopeptydazę do analizy metylowanych reszt białkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało wsparte przez Nagrodę Numer R00RR024105 od National Center For Research Resources, National Institute of Health.

1. Redukcyjna metylacja lizozymu
<ol>
	<li>Przygotować 500 ml 50 mM buforu fosforanu sodu o pH 7,5. Przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Oznacz trzy probówki mikrowirówkowe o pojemności 1 ml dla próbki w pełni znakowanej (FLS), próbki częściowo znakowanej o niskim pH (LpH) i próbki częściowo znakowanej o wysokim pH (HpH).</li>
	<li>Odważyć 10 mg lizozymu i rozpuścić w 2 ml buforu fosforanu sodu w celu uzyskania roztworu wodnego o stężeniu 5 mg/ml. Przykryć probówki folią aluminiową, aby chronić formaldehyd przed degradacją spowodowaną ekspozycją na światło. Do każdej probówki dodać 500 μl roztworu lizozymu.</li>
	<li>Przygotować świeże 1,0 M roztwory kompleksu dimetyloamino-boranu (DMAB) i 13C-formaldehydu. Przechowywać w temperaturze 0 °C.</li>
	<li>W przypadku próbki w pełni znakowanej należy zastosować stosunek molowy 1:10 (amina reaktywna: formaldehyd), a w przypadku próbek częściowo znakowanych należy użyć stosunku 1:5. Alternatywnie współczynnik ten można zoptymalizować. Na przykład, aby zobaczyć dominację piku C-dimetyloaminy α-13przy niskim pH, wymagany był stosunek 2:7.</li>
	<li>Dodaj 6,1 μl 1,0 M DMAB do FLS, dodaj 3,2 μl 1,0 M DMAB do LpH i HpH i delikatnie odwiruj. Następnie dodać 12,3 μl 1,0 M 13C-formaldehydu do FLS i 6,1 μl 1,0 M 13C-formaldehydu do LpH i HpH. Wstrząsać mieszaninami reakcyjnymi w temperaturze 4 °C przez 2 godziny.</li>
	<li>Dodać kolejną podwielokrotność 1,0 M DMAB i 13C-formaldehydu, jak w poprzednim kroku, i wstrząsnąć mieszaniną reakcyjną przez noc w temperaturze 4 °C, uzyskując całkowity czas reakcji wynoszący 18-24 godziny.</li>
	<li>Wymienić bufor próbki na fosforan o pH 7,5 w celu usunięcia nadmiaru odczynników i produktów ubocznych za pomocą filtra odśrodkowego (odcięcie masy cząsteczkowej 3 kDa).</li>
	<li>W przypadku częściowo znakowanych próbek, redukcyjnie metylować próbki o pH 7,5 z formaldehydem o naturalnej obfitości, aby uzyskać jednorodnie zmodyfikowane białko. Przygotować nowe 1,0 M roztwory DMAB i formaldehydu o naturalnej obfitości.</li>
	<li>Przykryj probówki z próbkami folią, dodaj 6,1 μl DMAB do LpH i HpH i delikatnie odwiruj. Następnie dodaj 12,3 μl formaldehydu o naturalnej obfitości. Wytrząsać mieszaniny reakcyjne w temperaturze 4 °C przez 2 godziny.</li>
	<li>Dodać kolejną porcję 1,0 M DMAB i formaldehydu o naturalnej obfitości, jak w poprzednim kroku, i wstrząsnąć mieszaninami reakcyjnymi przez noc w temperaturze 4 °C, uzyskując całkowity czas reakcji wynoszący 18–24 godziny. Następnie należy przeprowadzić wymianę buforową w krokach 2.5–2.6 i przechowywać 50 μg próbek w temperaturze -20 °C dla MS.</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbki do analizy NMR
<ol>
	<li>Przygotować 2,0 M roztwór buforowy boranu sodu o pH 8,5 wH2O.</li>
	<li>Dodać 375 μl 2,0 M roztworu buforowego boranu sodu do czterech stożkowych probówek o pojemności 15 ml. Parafilm wierzchołków i. Umieścić kolbę w kolbie liofilizacyjnej i zamrozić próbkę.</li>
	<li>Umieść zamrożoną próbkę na liofilizatorze do wyschnięcia. Usuń po wyschnięciu.</li>
	<li>Za pomocą pipety dodać 15 mlD2Odo każdej probówki i wymieszać.</li>
	<li>Oznaczyć trzy filtry odśrodkowe o pojemności 4 ml (odcięcie masy cząsteczkowej 3 kDa) za pomocą FLS, LpH i HpH. Dodać odpowiednią próbkę do probówek filtracyjnych (~500 μl). Do każdej probówki dodać 3,0 ml 50 mM buforu boranu sodu o pH 8,5. Sporządzić probówkę równoważącą dla trzeciej probówki i zagęścić próbki do 500 μl za pomocą wirówki z wirnikiem o stałym kącie nachylenia 35° w temperaturze 4 °C i 7 500 rcf.</li>
	<li>Opróżnij syfon pod każdym filtrem. Dodać kolejne 3,0 ml buforu do próbek i ponownie zagęścić próbki do 500 μl. Powtórz krok 2.5 4x.</li>
	<li>Korzystając z testu białkowego kwasu bicinchoninowego (BCA)36, oznacz stężenie każdej próbki. Rozcieńczyć próbki lizozymu 50 mM buforem boranu sodu, aby otrzymać próbki o wielkości 150 μM.</li>
	<li>Przenieś 530 μl do probówki NMR 5 mm lub 250 μM do probówki o dopasowanej podatności magnetycznej 5 mm.</li>
	<li>Przygotować 80 mM roztwór podstawowy 1,2-dichloroetanu-13 C2 w D2O. Przechowywać ten roztwór podstawowy w temperaturze -80 °C. Rozcieńczyć do 24 mM w 80 μl i przenieść do współosiowej probówki w celu użycia jako odniesienie w analizie NMR. Analizować próbki za pomocą NMR. Uwaga: Uruchom 1D 1 H-13C HSQC i zintegruj obszary pików dla każdego rezonansu. Obszary pików powinny być takie same dla w pełni oznakowanej próbki.</li>
</ol>
3. Degradacja lizozymu przez aminopeptydazę
<ol>
	<li>Przygotować 5 mg/ml roztworu lizozymu w ultraczystej wodzie.</li>
	<li>Dodać 250 μl roztworu lizozymu do czystej, 1 ml probówki wirówkowej.</li>
	<li>Dodać 25 μl 0,1 M roztworu trycyny o pH 8,0 i 6 μl roztworu aminopeptydazy Aeromonas proteolytica.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C przez 6 godzin.</li>
	<li>Dodać dodatkowe 6 μl roztworu aminopeptydazy o stężeniu 2,16 μg/ml do próbki, aby uzyskać stosunek 1:50 molowy aminopeptydazy do lizozymu. Inkubować przez 20 godzin w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Odsolić 30 μl próbki za pomocą kolumny wirowej C18 (zgodnie z protokołem producenta). Przechowywać w temperaturze -20 °C do analizy MALDI MS.</li>
	<li>Przygotować pozostałą próbkę białka do NMR zgodnie z opisem w protokole 2).</li>
</ol>
4. Przygotowanie próbek do spektrometrii mas
<ol>
	<li>Korzystając z 50 μg próbki zarezerwowanej w kroku 2.3, wymienić bufor na 100 mM wodorowęglanu amonu o pH 8,0 i zagęścić do około 50 μl za pomocą filtra odśrodkowego o pojemności 1 ml (granica masy cząsteczkowej 3 kDa). Przenieść próbkę do probówki wirówkowej o pojemności 1 ml i zawinąć w folię aluminiową.</li>
	<li>Dodać 2,0 μl 500 mM ditiotreitolu w celu zmniejszenia wiązań dwusiarczkowych. Inkubować roztwór w temperaturze 60 °C przez 1 godzinę.</li>
	<li>Dodać 2 μl świeżo przygotowanego 500 mM jodoacetamidu, aby alkilować grupy tiolowe. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut.</li>
	<li>Usunąć folię i dodać 1,0 μl 500 mM roztworu ditiotreitolu w celu wygaszenia reakcji.</li>
	<li>Dodaj 2,0 μg trypsyny do sekwencjonowania, aby strawić białko. Inkubować mieszaninę w temperaturze 37 °C przez 16-24 godzin.</li>
	<li>Dodawaj TFA, aż pH spadnie poniżej 2, aby ugasić trawienie. (Można również stosować kwas mrówkowy i octowy)</li>
	<li>Odsolić próbkę na kolumnie wirowej C18 i wymyć białko w 80% acetonitrylu/0,1% TFA. Wysuszyć próbkę za pomocą koncentratora próżniowego.</li>
	<li>Rozpuść próbkę w 5,0 μl 50% acetonitrylu/0,1% TFA do analizy MALDI MS. Zmieszać równe objętości odtworzonej próbki i nasycony roztwór roztworu matrycowego kwasu 2,5-dihydroksybenzoesowego na płytce tarczowej MALDI. Przeanalizować próbki na MALDI MS. Uwaga: Użyj tandemowego MS, aby potwierdzić tożsamość pików peptydów. Wygładź widma masowe i przeanalizuj. Dla każdego peptydu zawierającego dimetyloaminę należy określić intensywność piku i powierzchnię piku każdego izotopu w profilu. Oblicz procent 13C-inkorporacji, jak opisano poprzednio34.</li>
</ol>

<ol><li>Bax, A., Grzesiek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+Advances+in+Protein+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Methodological Advances in Protein NMR.</a> Accounts of Chemical Research. 26 (4), 131-138 (1993).</li>
<li>Shimba, N., Yamada, N., Yokoyama, K., Suzuki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+Labeling+of+Arbitrary+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Enzymatic Labeling of Arbitrary Proteins.</a> Analytical Biochemistry. 301 (1), 123-127 (2002).</li>
<li>Palomares, L., Estrada-Moncada, S., Ramírez, O. Production of Recombinant Proteins. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPalomares%2C+L+%22Recombinant+Gene+Expression%22">Recombinant Gene Expression</a>. Balbás, P., Lorence, A. 267, Humana Press. New York City, New York, USA. 15-51 (2004).</li>
<li>Graslund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Production+and+Purification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein Production and Purification.</a> Nature Methods. 5 (2), 135-146 (2008).</li>
<li>Terwilliger, T. C., Stuart, D., Yokoyama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lessons+from+Structural+Genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Lessons from Structural Genomics.</a> Annual Review of Biophysics. 38, 371-383 (2009).</li>
<li>Goto, N. K., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Developments+in+Isotope+Labeling+Strategies+for+Protein+Solution+NMR+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">New Developments in Isotope Labeling Strategies for Protein Solution NMR Spectroscopy.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 10 (5), 585-592 (2000).</li>
<li>Lian, L., Middleton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labelling+Approaches+for+Protein+Structural+Studies+by+Solution-State+and+Solid-State+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Nuclear+Magn.+Reson.+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">Labelling Approaches for Protein Structural Studies by Solution-State and Solid-State NMR.</a> Progress in Nuclear Magn. Reson. Spectroscopy. 39 (3), 171-190 (2001).</li>
<li>Mason, A., Siarheyeva, A., Haase, W., Lorch, M., van Veen, H., Glaubitz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+Acid+Type+Selective+Isotope+Labelling+of+the+Multidrug+ABC+Transporter+LmrA+for+Solid-State+NMR+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Febs+Lett%22%5BJournal%5D)">Amino Acid Type Selective Isotope Labelling of the Multidrug ABC Transporter LmrA for Solid-State NMR Studies.</a> Febs Lett. 568 (1-3), 117-121 (2004).</li>
<li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Amino-Acid-Type+Selective+Isotope+Labeling+of+Protein+Expressed+in+Pichia+pastoris%5BTitle%5D)+AND+%22Proteins%3AStructure+Function+and+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Preparation of Amino-Acid-Type Selective Isotope Labeling of Protein Expressed in Pichia pastoris.</a> Proteins:Structure Function and Bioinformatics. 62 (1), 279-287 (2006).</li>
<li>Means, G., Feeney, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reductive+Alkylation+of+Amino+Groups+in+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">Reductive Alkylation of Amino Groups in Proteins.</a> Biochem. 7 (6), 2192 (1968).</li>
<li>Jentoft, J. E., Jentoft, N., Gerken, T. A., Dearborn , D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-13+NMR-Studies+of+Ribonuclease-A+Methylated+With+Formaldehyde-C-13.%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">C-13 NMR-Studies of Ribonuclease-A Methylated With Formaldehyde-C-13.</a> J. Biol. Chem. 254 (11), 4366-4370 (1979).</li>
<li>Rayment, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reductive+alkylation+of+lysine+residues+to+alter+crystallization+properties+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecular+Crystallography%2C+Pt+A%22%5BJournal%5D)">Reductive alkylation of lysine residues to alter crystallization properties of proteins.</a> Macromolecular Crystallography, Pt A. 276 (97), 171-179 (1997).</li>
<li>French, D., Edsall, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Reactions+of+Formaldehyde+with+Amino+Acids+and+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Protein+Chem%22%5BJournal%5D)">The Reactions of Formaldehyde with Amino Acids and Proteins.</a> Adv. Protein Chem. 2, 277-335 (1945).</li>
<li>Jentoft, N., Dearborn, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+of+Proteins+by+Reductive+Methylation+Using+Sodium+Cyanoborohydride%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Labeling of Proteins by Reductive Methylation Using Sodium Cyanoborohydride.</a> J. Biol. Chem. 254 (11), 4359-4365 (1979).</li>
<li>Walter, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysine+Methylation+as+a+Routine+Rescue+Strategy+for+Protein+Crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Struct%22%5BJournal%5D)">Lysine Methylation as a Routine Rescue Strategy for Protein Crystallization.</a> Struct. 14 (11), 1617-1622 (2006).</li>
<li>Rypniewski, W., Holden, H., Rayment, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Consequences+of+Reductive+Methylation+of+Lysine+Residues+in+Hen+Egg-White+Lysozyme+-+An+X-ray+Analysis+at+1.8-Angstrom+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">Structural Consequences of Reductive Methylation of Lysine Residues in Hen Egg-White Lysozyme - An X-ray Analysis at 1.8-Angstrom Resolution.</a> Biochem. 32 (37), 9851-9858 (1993).</li>
<li>Bokoch, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand-specific+regulation+of+the+extracellular+surface+of+a+G-protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nat%22%5BJournal%5D)">Ligand-specific regulation of the extracellular surface of a G-protein-coupled receptor.</a> Nat. 463 (7277), (2010).</li>
<li>Jentoft, J., Gerken, T., Jentoft, N., Dearborn, D. C-13] Methylated Ribonuclease-A - C-13 NMR Studies of the Interaction of Lysine 41 with Active Site. 256 (1), 231-236 (1981).</li>
<li>Sherry, A., Teherani, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+Studies+of+C-13-Methylated+Concanavalin+A+-+pH+and+Co2%2B-Induced+Nuclear+Magn.+Reson.+Shifts.%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Physical Studies of C-13-Methylated Concanavalin A - pH and Co2+-Induced Nuclear Magn. Reson. Shifts.</a> J. Biol. Chem. 258 (14), 8663-8669 (1983).</li>
<li>Dick, L., Sherry, A., Newkirk, M., Gray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reductive+Methylation+and+C-13+NMR+Studies+of+the+Lysyl+Residues+of+fd+Gene+5+Protein+-+Lysines+24%2C+46%2C+and+69+May+be+Involved+in+Nucleic+Acid+Binding.%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Reductive Methylation and C-13 NMR Studies of the Lysyl Residues of fd Gene 5 Protein - Lysines 24, 46, and 69 May be Involved in Nucleic Acid Binding.</a> J. Biol. Chem. 263 (35), 18864-18872 Forthcoming.</li>
<li>Moore, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-epsilon%2CN-epsilon-dimethyl-lysine+cytochrome+c+as+an+NMR+probe+for+lysine+involvement+in+protein-protein+complex+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">N-epsilon,N-epsilon-dimethyl-lysine cytochrome c as an NMR probe for lysine involvement in protein-protein complex formation.</a> Biochem. J. 332, 439-449 (1998).</li>
<li>Jentoft, J. E., Gerken, T. A., Jentoft, N., Dearborn, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+the+Active-Site+Lysine+of+Ribonuclease-A+By+C-13+NMR.%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Studies of the Active-Site Lysine of Ribonuclease-A By C-13 NMR.</a> Biophys. J. 25 (2), 56 (1979).</li>
<li>Gerken, T., Jentoft, J., Jentoft, N., Dearborn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramolecular+Interactions+of+Amino+Groups+in+C-13+Reductively+Methylated+Hen+Egg-White+Lysozyme%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Intramolecular Interactions of Amino Groups in C-13 Reductively Methylated Hen Egg-White Lysozyme.</a> J. Biol. Chem. 257 (6), 2894-2900 (1982).</li>
<li>Dick, L. R., Geraldes, C., Sherry, A. D., Gray, C. W., Gray, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-13+NMR+of+Methylated+Lysines+of+fd+Gene-5+Protein+-+Evidence+for+A+Conformational+Change+Involving+Lysine-24+Upon+Binding+of+A+Negatively+Charged+Lanthanide+Chelate%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">C-13 NMR of Methylated Lysines of fd Gene-5 Protein - Evidence for A Conformational Change Involving Lysine-24 Upon Binding of A Negatively Charged Lanthanide Chelate.</a> Biochem. 28 (19), 7896-7904 (1989).</li>
<li>Gluck, M., Sweeney, W. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-13-NMR+of+Clostridium-Pasteurianum+Ferredoxin+After+Reductive+Methylation+of+the+Amines+Using+C-13+Formaldehyde%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">C-13-NMR of Clostridium-Pasteurianum Ferredoxin After Reductive Methylation of the Amines Using C-13 Formaldehyde.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1038 (2), 146-151 (1990).</li>
<li>Jentoft, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reductive+Methylation+and+C-13+Nuclear-Magnetic-Resonance+in+Structure-Function+Studies+of+Fc+Fragment+and+Its+Subfragments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Reductive Methylation and C-13 Nuclear-Magnetic-Resonance in Structure-Function Studies of Fc Fragment and Its Subfragments.</a> Methods in Enzymology. 203, 261-295 (1991).</li>
<li>Sparks, D., Phillips, M., Lundkatz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Conformation+of+Apolipoprotein+A-I+in+Discoidal+and+Spherical+Recombinant+High+Density+Lipoprotein+Particles+-+C-13+NMR+Studies+of+Lysine+Ionization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The Conformation of Apolipoprotein A-I in Discoidal and Spherical Recombinant High Density Lipoprotein Particles - C-13 NMR Studies of Lysine Ionization.</a> J. Biol. Chem. 267 (36), 25830-25838 (1992).</li>
<li>Ashfield, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+Modification+of+a+Variant+of+Human+MIP-1+Alpha%2C+Implications+for+Dimer+Structure.%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Chemical Modification of a Variant of Human MIP-1 Alpha, Implications for Dimer Structure.</a> Protein Science. 9 (10), 2047-2053 (2000).</li>
<li>Goux, W., Teherani, J., Sherry, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amine+Inversion+in+Proteins+-+A+C-13-NMR+Study+of+Proton+Exchange+and+Nitrogen+Inversion+Rates+in+N-Epsilon%2CN-Epsilon%2CN-Alpha%2CN-Alpha-%5BC-13%5DTetramethyllysine%2C+N-Epsilon%2CN-Epsilon%2CN-Alpha%2CN-Alpha%5BC-13%5DTetramethyllysine+Methyl-Ester%2C+and+Reductively+Methylated+Concanavalin-A.%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Amine Inversion in Proteins - A C-13-NMR Study of Proton Exchange and Nitrogen Inversion Rates in N-Epsilon,N-Epsilon,N-Alpha,N-Alpha-[C-13]Tetramethyllysine, N-Epsilon,N-Epsilon,N-Alpha,N-Alpha[C-13]Tetramethyllysine Methyl-Ester, and Reductively Methylated Concanavalin-A.</a> Biophysical Chemistry. 19 (4), 363-373 (1984).</li>
<li>Sherry, A. D., Keepers, J., James, T. L., Teherani, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methyl+Motions+in+C-13+Methylated+Concanavalin-as+Studied+by+C-13+Magnetic-Resonance+Relaxation+Techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Methyl Motions in C-13 Methylated Concanavalin-as Studied by C-13 Magnetic-Resonance Relaxation Techniques.</a> Biochemistry. 23 (14), 3181-3185 (1984).</li>
<li>Huque, M., Vogel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-13+NMR+Studies+of+the+Lysine+Side+Chains+of+Calmodulin+and+Its+Proteolytic+Fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Protein+Chemistry%22%5BJournal%5D)">C-13 NMR Studies of the Lysine Side Chains of Calmodulin and Its Proteolytic Fragments.</a> Journal of Protein Chemistry. 12 (6), 695-707 (1993).</li>
<li>Brown, L., Bradbury, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proton-Magnetic-Resonance+Studies+of+Lysine+Residues+of+Ribonuclease-A%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Proton-Magnetic-Resonance Studies of Lysine Residues of Ribonuclease-A.</a> Eur. J. Biochem. 54 (1), 219-227 (1975).</li>
<li>Zhang, M., Vogel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+Side+Chain+pKa+Values+of+the+Lysine+Residues+in+Calmodulin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Determination of the Side Chain pKa Values of the Lysine Residues in Calmodulin.</a> J. Biol. Chem. 268 (30), 22420-22428 (1993).</li>
<li>Macnaughtan, M., Kane, A., Mass Prestegard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrometry+Assisted+Assignment+of+NMR+Resonances+in+Reductively+C-13-Methylated+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Spectrometry Assisted Assignment of NMR Resonances in Reductively C-13-Methylated Proteins.</a> J. Am. Chem. Soc. 127 (50), 17626-17627 (2005).</li>
<li>Cordova, E., Gao, J., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncovalent+Polycationic+Coatings+for+Capillaries+in+Capillary+Electrophoresis+of+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Noncovalent Polycationic Coatings for Capillaries in Capillary Electrophoresis of Proteins.</a> Anal. Chem. 69 (7), 1370-1379 (1997).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+Protein+Using+Bicinchoninic+Acid%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Measurement of Protein Using Bicinchoninic Acid.</a> Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).</li>
<li>Larda, S. T., Bokoch, M. P., Evanics, F., Prosser, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysine+methylation+strategies+for+characterizing+protein+conformations+by+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomolec.+NMR%22%5BJournal%5D)">Lysine methylation strategies for characterizing protein conformations by NMR.</a> J. Biomolec. NMR. 54 (2), 199-209 (2012).</li>
<li>Bradbury, J. H., Brown, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+Dissociation+Constants+of+Lysine+Residues+of+Lysozyme+by+Proton-Magnetic-Resonance+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Determination of Dissociation Constants of Lysine Residues of Lysozyme by Proton-Magnetic-Resonance Spectroscopy.</a> Eur. J. Biochem. 40 (2), 565-576 (1973).</li>
<li>Frey, S. T., Guilmet, S. L., Egan, R. G., Bennett, A., Soltau, S. R., Holz, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+of+the+Aminopeptidase+from+Aeromonas+proteolytica+on+Mg2%2B%2FAl3%2B+Layered+Double+Hydroxide+Particles%5BTitle%5D)+AND+%22Acs+Appl.+Mater.%2C+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Immobilization of the Aminopeptidase from Aeromonas proteolytica on Mg2+/Al3+ Layered Double Hydroxide Particles.</a> Acs Appl. Mater., & Interfaces. 2 (10), 2828-2832 (2010).</li>
<li>Poncz, L., Dearborn, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Resistance+to+Tryptic+Hydrolysis+of+Peptide-Bonds+Adjacent+to+N-epsilon%2CN-Dimethyllysyl+Residues%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The Resistance to Tryptic Hydrolysis of Peptide-Bonds Adjacent to N-epsilon,N-Dimethyllysyl Residues.</a> J. Biol. Chem. 258 (3), 1844-1850 (1983).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Przypisanie sygnałów NMR redukcyjnie 13C-metylowanych białek jest konieczne, aby w pełni wykorzystać tę metodę znakowania izotopowego. Wykorzystanie MS do pomocy w przypisywaniu sygnałów NMR poprzez korelację częściowych danych 13C-inkorporacji jest obiecującą techniką. Przewagą tej techniki nad innymi metodami przypisywania jest to, że potrzebna jest tylko pierwszorzędowa sekwencja aminokwasów. Metoda przypisywania wspomagana przez MS jest ograniczona, gdy N-końcowy aminokwas jest lizyną, ...

Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) jest cennym narzędziem wyjaśniającym strukturę białek1. Spektroskopia NMR może być stosowana do określania struktury roztworu białka w jego stanie natywnym. Aby przezwyciężyć niską naturalną obfitość stabilnych izotopów magnetycznych, konieczne jest włączenie 13C i 15N do interesującego nas białka. Najpowszechniejszą stosowaną metodą jest ekspresja rekombinowana w bakteryjnym gospodarzu2-3. Jednak dwie wady nadmiernej ekspresji gospodarza bakteryjnego to to, że nie może on wytwarzać modyfikacji potranslacyjnych i nie działa dla wszystkich białek3-4. Gdy ekspresja bakterii nie jest realną drogą produkcji białek, można zastosować nadmierną ekspresję w gospodarzach niebakteryjnych, ale znakowanie izotopowe jest trudne i kosztowne5. Alternatywne metody ekspresji do włączania izotopów 13C i 15N do białek do analizy NMR obejmują rzadkie techniki znakowania z użyciem prekursorów metabolicznych do znakowania metylu6 i pojedynczych aminokwasów 13C, 15N7-9. Chemicznym podejściem do rzadkiego znakowania zastosowanym w tym artykule jest dobrze ugruntowana redukcyjna reakcja metylacji 13C (ryc. 1), w której pierwszorzędowe grupy aminowe na białku - N-końcowa α-amina i lizyna, ε-aminy o łańcuchu bocznym - są metylowane. Po utworzeniu monometyloamin amina łatwo ulega ponownej metylacji, ze względu na wyższą wartość pKa, tworząc dimetyloaminy.
Redukcyjna metylacja została po raz pierwszy wprowadzona jako metoda chemicznej modyfikacji białek przez Meansa i Feeneya10. Zaletą tej reakcji jest jej szerokie zastosowanie i łagodne warunki reakcji przy buforowanym, fizjologicznym pH i niskich temperaturach11,12. W obecności formaldehydu i czynnika redukującego, takiego jak kompleks dimetyloamino-boranu (DMAB), grupy ε-aminowe lizyny i N-końcowa grupa α-aminowa są selektywnie metylowane w celu wytworzenia amin dimetylanowych. Chociaż wiadomo, że formaldehyd sieciuje białka poprzez tworzenie mostków metylenowych, proces ten jest blokowany przez środek redukujący13,14.
Redukcyjna metylacja została z powodzeniem wykorzystana do badania białek zarówno za pomocą NMR, jak i krystalografii rentgenowskiej. Metylacja redukcyjna jest stosowana w celu ułatwienia krystalizacji białek, które w przeciwnym razie byłyby trudne do opanowania15. Lizozym białka jaja kurzego był pierwszym białkiem skrystalizowanym w postaci dimetylowanej. Średnia kwadratowa różnica między ciężkimi atomami w metylowanych i niemetylowanych strukturach lizozymu wynosi 0,40 A16. Porównanie to pokazuje, że struktura białka może zostać zachowana po redukcyjnej metylacji, co sprawia, że reakcja jest realnym, znakowanym narzędziem do wyjaśniania struktury.
Używając 13formaldehydu znakowanego C w reakcji redukcyjnej metylacji, powstaje 13C-dimetylonowych amin. 13C-dimetyloamin to sondy wykrywalne przez NMR, które są szeroko stosowane do badania dynamiki, struktury i funkcji białek. NMR i redukcyjna metylacja 13C zostały wykorzystane do badania interakcji białko-ligand i białko-białko dla receptora adrenergicznego17 β2, rybonukleazy A18, lizozymu19, białka genu fd 520 i cytochromu c21. Podobnie badano właściwości strukturalne i funkcjonalne redukcyjnie 13C-metylowanej rybonukleazy A22, lizozymu23, białka genu fd 524, ferredoksyny Clostridium pasteurianum 25, fragmentu Fc IgG26, apolipoproteiny A-I27 i MIP-1α28 Dynamika 13grup C-dimetyloaminowych została zbadana na konkanawalinie A29-30 i kalmodulinie31.
Mimo że redukcyjna metylacja 13C była szeroko stosowana do badania białek za pomocą NMR, metoda znakowania zawsze była ograniczona przez trudności w przypisywaniu rezonansów NMR26. Większość strategii przypisywania redukcyjnie 13C-metylowanych białek opierała się na niewielkiej liczbie miejsc,20,28 znanych właściwościach strukturalnych11,19,23,26,31,32. lub rozległe modyfikacje genetyczne33. W żadnym z tych badań nie przypisano wszystkich 13pików C-dimetyloaminy, z wyjątkiem badania kalmoduliny, w którym piki zostały przypisane przez mutagenezę ukierunkowaną na miejsce każdej lizyny33. W badaniu tworzenia dimerów MIP-1α po raz pierwszy zgłoszono zastosowanie spektrometrii mas (MS) w celu pomocy w przypisaniu NMR redukcyjnie 13C-metylowanych amin28. Do identyfikacji lizyny na granicy faz dimeru wykorzystano matrycowo wspomaganą desorpcję laserową i jonizację czasu przelotu (MALDI-TOF) MS. Częściowo metylowane lizyny ludzkich peptydów tryptycznych MIP-1α zidentyfikowano ze stwardnieniem rozsianym i skorelowano z pojawieniem się sygnałów mono- i dimetyloaminy nienaruszonego białka obserwowanych w widmach 2D 1 H-13C HSQC NMR28. Nasza grupa rozszerzyła zakres stosowania stwardnienia rozsianego i przedstawiła metodę przypisywania, która nie wymaga wcześniejszej wiedzy na temat struktury lub właściwości białka innych niż sekwencja aminokwasów34. Ta metoda ma zastosowanie do większości białek. Jednym z wyjątków jest sytuacja, gdy białko ma N-końcową lizynę, ponieważ profil izotopowy MS N-końcowych C-dimetyloamin lizyny α i ε-13nie może być niezależnie zmierzony.
Tutaj prezentujemy dwie metody, jedną chemiczną i jedną enzymatyczną, do identyfikacji N-końcowej α-dimetyloaminy oraz miejsc o łańcuchu bocznym ε-dimetyloaminy N-końcowej reszty lizyny. Pierwsza metoda została zainspirowana przez Córdova i wsp.którzy wykorzystali pH do kontrolowania selektywności acetylacji białek35. Reakcja faworyzuje N-końcową α-aminę o niskim pH i ε-aminy o łańcuchu bocznym o wysokim pH, co pozwala na rozróżnienie grup białkowych α- i ε-aminowych w ich badaniach za pomocą elektroforezy kapilarnej35. Pokazujemy, w jaki sposób wysokie i niskie pH jest wykorzystywane do zmiany znakowania grup aminokwasów białkowych za pomocą redukcyjnej reakcji metylacji 13C i umożliwia zastosowanie strategii przypisywania wspomaganego przez MS. Druga metoda przypisywania N-końcowych α- i ε-13C-dimetyloaminy wykorzystuje selektywne usuwanie N-końcowych reszt za pomocą rekombinowanej aminopeptydazy Aeromonas proteolytica.

<table><tbody><tr><td>Acetonitryl</td><td>Sigma</td><td>34851</td><td></td></tr><tr><td>Filtr odśrodkowy Amicon Ultra 4 ml (3k MWCO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>UFC800308 (8pk)</td><td></td></tr><tr><td>Aminopeptydaza</td><td>Creative Biomart</td><td>Aminopeptydaza-86A</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan amonu</td><td>Sigma</td><td>A6141</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan amonu</td><td>Sigma</td><td>A5132</td><td></td></tr><tr><td>Kompleks boran-dimetyloamina</td><td>Sigma 180238</td><td></td><td>Przed użyciem przygotuj świeży 1 M roztwór.</td></tr><tr><td>Kwas borowy</td><td>Sigma</td><td>B6768</td><td></td></tr><tr><td>Insulina trzustka bydlęca</td><td>Sigma</td><td>I5500</td><td></td></tr><tr><td>C18 Kolumny obrotowe</td><td>Thermo Scientific</td><td>89870</td><td></td></tr><tr><td>Tlenek deuteru</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>DLM-4-100</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dichloroetano-13C2</td><td>Sigma</td><td>714321</td><td>80 mM roztwór podstawowy przechowywany w temperaturze -80 stopni Celsjusza. Używany jako odniesienie w widmach NMR przy 24 mM.</td></tr><tr><td>Formaldehyd (36,5% wag./wt)</td><td>Sigma</td><td>33220</td><td>Przygotuj świeży 1 M roztwór przed użyciem.</td></tr><tr><td>13C-formaldehyd (99%)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>CLM-806-1</td><td>Przed użyciem przygotuj świeży 1 M roztwór.</td></tr><tr><td>Lizozym (białko jaja kurzego)</td><td>Sigma</td><td>L6376</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu (dwuzasadowy siedmiowodny)</td><td>Sigma</td><td>S9390</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu (monozasadowy)</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Tricine</td><td>Sigma</td><td>T0377</td><td></td></tr><tr><td>Kwas trifluorooctowy</td><td>Sigma</td><td>302031</td><td></td></tr><tr><td>700 MHz Varian VNMRS z sondą 5 mm HCN 5922</td><td>Agilent Technologie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bruker UltrafleXtreme MALDI TOF/TOF</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

metody identyfikacji rezonansów nmr 13c-dimetylo-n-końcowej aminy na redukcyjnie metylowanych białkach

Methods to Identify the NMR Resonances of the 13C-Dimethyl N-terminal Amine on Reductively Methylated Proteins

Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) jest sprawdzoną techniką do badań struktury białek i dynamiki. Aby badać białka za pomocą NMR, stabilne izotopy magnetyczne są zwykle włączane metabolicznie, aby poprawić czułość i umożliwić sekwencyjne przypisanie rezonansu. Redukcyjna 13C-metylacja jest alternatywną metodą znakowania białek, które nie są podatne na nadmierną ekspresję gospodarza bakteryjnego, najczęstszą metodę włączania izotopów. Redukcyjna 13C-metylacja to reakcja chemiczna przeprowadzana w łagodnych warunkach, która modyfikuje pierwszorzędowe grupy aminowe białka (grupy lizynowe ε-aminowe i N-końcową grupę α-aminową) do 13grup C-dimetyloaminowych. Modyfikacja nie zmienia struktury i funkcji większości białek, co czyni ją realną alternatywą dla znakowania metabolicznego. Ponieważ redukcyjna metylacja 13C dodaje rzadkie, izotopowe znaczniki, tradycyjne metody przypisywania sygnałów NMR nie mają zastosowania. Opracowano alternatywną metodę przypisywania wykorzystującą spektrometrię mas (MS) w celu pomocy w przypisywaniu sygnałów NMR białka 13C-dimetyloaminy. Metoda opiera się na częściowym i różnych ilościach znakowania 13C w każdej pierwszorzędowej grupie aminowej. Jedno ograniczenie metody pojawia się, gdy N-końcową resztą białka jest lizyna, ponieważ grupy α- i ε-dimetyloaminowe Lys1 nie mogą być indywidualnie mierzone za pomocą MS. Aby obejść to ograniczenie, opisano dwie metody identyfikacji rezonansu NMR 13C-dimetyloamin związanych zarówno z N-końcową α-aminą, jak i łańcuchem bocznym ε-aminy. Sygnały NMR N-końcowej α-dimetyloaminy i ε-dimetyloaminy o łańcuchu bocznym lizozymu białka jaja kurzego, Lys1, są identyfikowane w heterojądrowych widmach koherencji pojedynczegokwantu 1 H-13C.

Metylacja redukcyjna i pH
pH-indukowana chemoselektywna redukcja 13Reakcję C-metylacji wykazano w przypadku lizozymu. Przy niskim pH reakcja preferuje N–terminalna grupa $\alpha$-aminowa nad grupami $\varepsilon$-aminowymi w łańcuchach bocznych i odwrotnie przy wysokim pH. W roztworze grupy aminowe białka znajdują się w stanie równowagi między wolną aminą a sprzężonym kwasem, co można regulować za pomocą pH. Optymalny zakres pH dla tej reakcji zależy od zastosowanego środka re...

Opisano dwie metody przypisywania sygnałów magnetycznego rezonansu jądrowego α- i ε-dimetyloaminy redukcyjnie 13C-metylowanej N-końcowej lizyny. Jedna metoda wykorzystuje selektywność reakcji metylacji redukcyjnej wywołanej pH, a druga wykorzystuje aminopeptydazę do selektywnego usuwania N-końcowej lizyny.

Metody identyfikacji rezonansów NMR 13C-dimetylo-N-końcowej aminy na redukcyjnie metylowanych białkach

Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is a proven technique for protein structure and dynamic studies. To study proteins with NMR, stable magnetic ...

Ogólnym celem tej procedury jest przypisanie węgla alfa i epsilon. 13 dimetyloamina NMR rezonans końcowej lizyny końcowej, reszta lizozymu. Osiąga się to poprzez najpierw redukcyjną metylację lizozymu o niskim i wysokim pH, z subgeometryczną ilością formaldehydu węgla 13.Drugim krokiem jest redukcyjna metylacja próbek o niskim i wysokim pH z nadmiarem naturalnej obfitości formaldehydu w celu całkowitej metylacji. Ostatnim krokiem jest wymiana buforowa redukcyjnie zmetylowanych próbek w bufor D two O do analizy NMR. W drugiej metodzie cel ten osiąga się poprzez degradację próbki lizozymu przez aminopeptydazę.Drugim krokiem jest redukcyjna metylacja skróconej próbki białka nadmiarem formaldehydu węglowo-13, a następnie wymiana buforu do analizy NMR. Ostatecznie spektroskopia NMR służy do wykazania braku rezonansu metylowego węgla 13 w celu wykonania przypisań. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest to, że pozwala ona na jednoznaczne przypisanie rezonansów zarówno alfa, jak i SSON dimetyloloaminy oraz ML wewnętrznej lizyny białka Oznacz trzy mililitrowe mikroprobówki wirówkowe z F-L-S-L-P-H i HPH rozpuść trzy próbki lizozymu we wcześniej przygotowanym roztworze buforowym przy pH sześć, 7,5 i 10, aby uzyskać końcowe stężenie pięciu miligramów na mililitr.Przykryj probówki folią aluminiową, aby chronić je przed degradacją pod wpływem światła. Następnie dodać 6,1 mikrolitra wcześniej przygotowanego jednomolowego roztworu kompleksu wiertniczego dimetyloaminy do probówki FLS i 3,2 mikrolitra tego samego roztworu do probówek LPH i HPH. Po delikatnym zwirowaniu mieszanin dodać 12,3 mikrolitra wcześniej przygotowanego jednomolowego roztworu węgla 13 formaldehydu do próbki FLS i 6,1 mikrolitra tego samego roztworu do próbek L-P-H-H-N-H-P-H.Wstrząsaj mieszaninami reakcyjnymi w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwie godziny. Powtórz poprzednie kroki, dodając te same porcje DMAB i formaldehydu węgla 13 do odpowiednich probówek. Wytrząsać mieszaniny reakcyjne przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez łączny czas reakcji od 18 do 24 godzin po wstrząsnięciu, wymienić bufor każdej próbki na trzy mililitry buforu fosforanowego o pH 7,5 w celu usunięcia nadmiaru odczynników i produktów ubocznych za pomocą filtra odśrodkowego przy odciętej masie cząsteczkowej trzech kilodaltonów, zagęścić próbki do 500 mikrolitrów za pomocą wirówki z wirnikiem o stałym kącie 35 stopni w temperaturze czterech stopni Celsjusza i 7 stopni, 500 RCF.Powtórz poprzednie kroki dwa razy, wykonując poczynania powyższe. Przykryj częściowo oznakowane probówki z próbkami folią aluminiową i dodaj do nich 6,1 mikrolitra świeżo przygotowanego jednomolowego roztworu DMAB. Po zawirowaniu próbek dodać do probówek 12,3 mikrolitra świeżo przygotowanego jednomolowego roztworu formaldehydu o naturalnej obfitości.Wstrząsaj mieszaninami reakcyjnymi w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwie godziny. Dodać te same podwielokrotności DMAB i formaldehydu o naturalnej obfitości, jak w poprzednim kroku, i wstrząsnąć mieszaninami reakcyjnymi przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby uzyskać całkowity czas reakcji od 18 do 24 godzin po wymianie buforu z 50-milimolowym buforem fosforanu sodu. Przenieść 10 mikrolitrów podwielokrotności każdej próbki do czystych mikroprobówek wirówkowych i przechowywać próbki w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do analizy MALDI MS.Następnie dodaj 375 mikrolitrów wcześniej przygotowanego dwumolowego roztworu buforowego boranu sodu do czterech 15-mililitrowych stożkowych probówek. Zafoliuj górną część rurek i przebij otwory przez folię para. Umieścić probówki w liofilizowanej kolbie i zamrozić próbkę.Po zamrożeniu próbek umieścić kolbę na liofilizatorze do wyschnięcia, po wyjęciu próbki z pipety liofilizatora 15 mililitrów D dwa O do każdej probówki i wymieszać zgodnie z tą etykietą trzy czteromililitrowe stożkowe probówki zawierające filtry odśrodkowe z F-L-S-L-P-H i HPH. Dodaj około 500 mikrolitrów każdej próbki do odpowiednich probówek filtracyjnych. Następnie dodaj trzy mililitry 50-milimolowego buforu sodowego.Dodaj pH 8,5 do każdej probówki. Zagęścić próbki do 500 mikrolitrów za pomocą wirówki z wirnikiem o stałym kącie nachylenia 35 stopni w temperaturze czterech stopni Celsjusza i 7 500 RCF. Po opróżnieniu pułapki pod każdym filtrem dodać kolejne trzy mililitry buforu do próbek i zagęścić je do 500 mikrolitrów.Powtórz poprzednie kroki cztery razy, używając testu białka kwasu bissy. Oznaczyć stężenie w każdej próbce. Rozcieńczyć próbki lizozymu 50-milimolowym buforem pustym sodu, aby uzyskać końcowe stężenie 150 mikromolów.Następnie przenieś 530 mikrolitrów każdej próbki do pięciomilimetrowej probówki NMR. Następnie przygotuj 80-milimolowy roztwór podstawowy węgla 13 znakowany jednym dwoma DI CHLORO etan w D dwa O. Rozcieńczyć roztwór do 24 milimoli za pomocą D dwa O, a następnie przenieś go do współosiowej rurki wprowadzającej, aby użyć jako odniesienia NMR. Po uruchomieniu 1D PROTON CARBON H-S-Q-C-N-M-R zintegruj obszary pików dla każdego rezonansu.Przygotuj pięć miligramów na mililitr roztworu lizozymu w ultraczystej wodzie. Przenieś 250 mikrolitrów roztworu lizozymu do czystej mililitrowej probówki wirówkowej. Następnie dodać 25 mikrolitrów roztworu o stężeniu 0,1 mola i pH osiem i sześć mikrolitrów po 16 mikrogramów na mililitr.Roztwór romanistycznej proteolitycznej aminopeptydazy do probówki wirówkowej. Inkubować mieszaninę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez sześć godzin. Po inkubacji dodać dodatkowe sześć mikrolitrów roztworu aminopeptydazy do próbki, aby uzyskać stosunek aminopeptydazy od jednego do 50 molowych do inkubacji przez dodatkowe 20 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Następnie ODSOLIĆ 30 mikrolitrów próbki za pomocą kolumny wirowej C 18 i wymyć próbkę w 80% próbie ACEDONITE na 0,1% TFA, przechowywać próbkę w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Do analizy maldi MS przygotuj pozostałą próbkę białka do NMR, jak opisano wcześniej, Na lizozymie przy niskim pH wykazano reakcję metylacji selektywnej chemioselektywnej redukcyjnej węgla 13 wywołaną przez pH. Reakcja preferuje końcową końcową alfa aminę nad elasem bocznym aminy epsilon i odwrotnie przy wysokim pH, jak pokazano w widmach NMR tutaj.Pik siódmy jest nieobecny w próbce lizozymu przechodzącej reakcję przy pH 10, co wskazuje, że piki od jednego do sześciu należą do grup aminowych epsilonu dimetyloaminowego, a pik siódmy jest końcową końcową grupą alfa-dimetyloaminową. Alpha Amin faworyzował węgiel redukcyjny. 13 metylację przy pH szóstym obserwowano, gdy ilość użytego formaldehydu węgla 13 została zredukowana do stosunku molowego od dwóch do siedmiu, a próbka nie była dalej reagowana z formaldehydem o naturalnej obfitości, jak pokazano tutaj, metylacja przy niskim pH jest mieszaniną monometyloamin i dimetyloamin.Trzy grupy aminowe wykazują dim metylację węgla 13, co wskazuje, że grupy te zareagowały szybciej niż grupy wykazujące węgiel. 13 monometylo z trzech węgla 13 dimetyloaminy. Szczyt siódmy ma największą intensywność i został przypisany jako grupa N end alfa dimetyloaminy, co potwierdza przypisanie piku siódmego.Za pomocą próbki przereagowano w wysokim pH ze zdolnością do zmiany szybkości redukcyjnej metylacji N-końcowej grupy alfa-aminowej. Można zastosować metodę wspomaganą przez MS do przypisywania rezydenta NMR. Próbka lizozymu, która była redukcyjnie metylowana węglem 13 przy pH 10, była trawiona trypsyną i analizowana za pomocą maldi TOF MS, ponieważ grupa alfa-aminowa nie była redukcyjnie metylowana węglem 13.W tych warunkach profil izotopowy MS tetrametylowanego peptydu końcowego N można wykorzystać do ilościowego określenia procentowej zawartości węgla 13 włączonego do końcowej grupy aminowej epsilon dimetylu. Węgiel 13 znakowany metylowanym N-końcowym peptydem 6 6 2 DIM dał skalowany procent węgla. 13 włączenie 27% NMR analiza tej samej próbki lizozymu dała procent włączenia węgla 13 wynoszący 33% dla piku szóstego, co wskazuje, że pik szósty jest końcowym terminalem lizyny epsilon węgla 13 dimetyloaminy Maldi, widma masowe TOF próbek lizozymu poddanych działaniu aminopeptydazy są przedstawione tutaj.Insulina, która była używana jako kontrola pozytywna, wykazuje przesunięcie w kierunku niższego średniego współczynnika ładunku głównego w porównaniu z jej natywną formą 5731.2. Leczony lizozym wykazuje przesunięcie od 14305,8 do 13930,5, co odpowiada utracie pierwszych trzech końcowych reszt lizozymu, lizyny, waliny i fenyloalaniny. Pokazano tutaj widma NMR próbek lizozymu metylowanego węglem 13 bez traktowania i aminopeptydazy traktowanych redukcyjnie w porównaniu z kontrolowanym widmem, widmo próbki traktowanej aminopeptydazą wykazuje spadek intensywności pików szóstych i siódmych oraz dodatkowego piku oznaczonego siedmioma A Z tych danych piki sześć i siedem można przypisać parami jako lizynę, alfa i epsilon dimetyloamina.Przed przystąpieniem do tej procedury ważne jest, aby wziąć pod uwagę rozpuszczalność białka, różne ph i odpowiednio dostosować protokół.

methods-to-identify-nmr-resonances-13c-dimethyl-n-terminal-amine-on

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Metody identyfikacji rezonansów NMR 13C-dimetylowej aminokwasu N-końcowego na redukcyjnie metylowanych białkach

Znakowanie stabilnych izotopów peptydów metodą redukcyjnej dimetylacji (znakowanie ReDi) to szybka, tania strategia dla dokładnej proteomiki ilościowej opartej na spektrometrii mas. W tym miejscu demonstrujemy solidną metodę przygotowania i analizy mieszanin białkowych przy użyciu podejścia ReDi, którą można zastosować do prawie każdego rodzaju próbki.

Proteomika ilościowa wykorzystująca dimetylację redukcyjną do znakowania stabilnych izotopów

Neurochemia mózgu ssaków ulega zmianie w wielu chorobach neurologicznych i ogólnoustrojowych. Profile charakterystyczne metabolitów mózgowych można skutecznie uzyskać na podstawie surowych ekstraktów tkanki mózgowej. W tym celu stosuje się wysokorozdzielczą spektroskopię NMR, umożliwiającą szczegółową analizę ilościową stężeń metabolitów (metabolomika).

Analiza metabolomiczna mózgu szczura za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego o wysokiej rozdzielczości ekstraktów tkankowych

Opisujemy tutaj metodę identyfikacji wielokrotnych fosforylacji wewnętrznie nieuporządkowanego białka za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR), używając białka Tau jako studium przypadku. Rekombinowany Tau jest izotopowo wzbogacany i modyfikowany in vitro przez kinazę przed pozyskaniem i analizą danych.

Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego do identyfikacji wielokrotnych fosforylacji białek wewnętrznie nieuporządkowanych

Struktury supramolekularnych zespołów białkowych w rozdzielczości atomowej mają duże znaczenie ze względu na ich kluczowe role w różnych zjawiskach biologicznych. W niniejszym artykule przedstawiamy protokół do wykonywania wysokorozdzielczych badań strukturalnych nierozpuszczalnych i niekrystalicznych zespołów białek wielkocząsteczkowych za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego w stanie stałym z wirowaniem pod magicznym kątem (MAS SSNMR).

Badania strukturalne układów makromolekularnych w skali atomowej za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego w ciele stałym

Metylacja argininy (R) jest szeroko rozpowszechnioną modyfikacją potranslacyjną regulującą wiele szlaków biologicznych. Spektrometria mas jest najlepszą technologią do globalnego profilowania proteomu R-metylowego, w połączeniu z podejściami biochemicznymi do wzbogacania zmodyfikowanych peptydów. Przepływ pracy przeznaczony do identyfikacji globalnej metylacji R-metylacji w komórkach ludzkich o wysokim poziomie pewności jest opisany tutaj.

Podejście proteomiczne oparte na spektrometrii mas do globalnej i wysoce wiarygodnej analizy R-metylacji białek

Ten artykuł opisuje metodę przygotowania próbki opartą na inaktywacji termicznej w celu zachowania endogennych peptydów unikających degradacji po śmierci, a następnie względnej kwantyfikacji za pomocą znakowania izotopowego plus LC-MS.

Przygotowanie próbki i względna ocena ilościowa przy użyciu redukcyjnej metylacji amin do badań peptydomicznych

Przedstawiono protokół zastosowania spektroskopii NMR wzmacniającej relaksację paramagnetyczną do wykrywania słabych i przejściowych interakcji między- i wewnątrzcząsteczkowych w białkach wewnętrznie nieuporządkowanych.

Wzmocnienie relaksacji paramagnetycznej do wykrywania i charakteryzowania samoasocjacji wewnętrznie nieuporządkowanych białek

Niniejszy protokół opisuje przygotowanie i ilościowy pomiar wolnych i związanych z białkami argininy i metylo-arginin za pomocą spektroskopii 1H-NMR.

Badanie metylomu argininy za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego

Tutaj prezentujemy protokół szczegółowo opisujący pozyskiwanie, przetwarzanie i analizę serii eksperymentów NMR mających na celu scharakteryzowanie interakcji białko-glikan w roztworze. Przedstawiono najpopularniejsze metodologie oparte na ligandach i białkach, które niewątpliwie przyczyniają się do rozwoju glikobiologii strukturalnej i badań nad rozpoznawaniem molekularnym.

Rozplątywanie oddziaływań glikan-białko: magnetyczny rezonans jądrowy (NMR) na ratunek

Struktura roztworu NMR peptydu modelowego metalochaperonu z Cu (I) została określona, a szczegółowy protokół od przygotowania próbki i zbierania danych 1D i 2D do struktury trójwymiarowej jest opisany.

Oznaczanie struktury i koordynacji kompleksów peptyd-metal metodą 1D i 2D 1H NMR

Poznaj metody identyfikacji rezonansów NMR dimetyloaminy α- i ε- na N-końcowej lizynie w lizozymie. Wykorzystaj selektywność pH i aminopeptydazę do analizy metylowanych reszt białkowych.

Metody identyfikacji rezonansów NMR ¹³C-dimetylo-N-końcowej aminy na redukcyjnie metylowanych białkach

Przeglądaj więcej filmów