Name: Suplementacja diety wielonienasyconych kwasów tłuszczowych w Caenorhabditis elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-29T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Poznaj metodę suplementacji diety wielonienasyconymi kwasami tłuszczowymi w Caenorhabditis elegans. Technika ta pozwala badać funkcje lipidów w rozwoju i fizjologii nicienia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Chrisowi Websterowi za przeprowadzenie wstępnych eksperymentów pokazanych na rysunku 3 reprezentatywnych wyników oraz Jasonowi Wattsowi i Chrisowi Websterowi za pomocne komentarze do manuskryptu. Finansowanie tego badania zostało zapewnione z grantu z National Institutes of Health (USA) (R01DK074114) dla JLW. Niektóre szczepy nicieni użyte w tej pracy zostały dostarczone przez Centrum Genetyki Caenorhabditis, które jest finansowane przez Biuro Programów Infrastruktury Badawczej NIH (P40 OD010440).

Wielonienasycone kwasy tłuszczowe są wrażliwe na ciepło, światło i tlen. Dlatego podczas przygotowywania płytek do suplementacji kwasów tłuszczowych należy zachować ostrożność, aby kwasy tłuszczowe nie były narażone na nadmierne ciepło i światło. Pożywka NGM zawierająca 0,1% tergitolu (NP-40) jest sterylizowana w autoklawie i częściowo schładzana, po czym dodaje się sole sodowe kwasów tłuszczowych przy ciągłym mieszaniu. Talerze pozostawia się do wyschnięcia w ciemności. Wychwyt kwasów tłuszczowych przez C. elegans hodowany na tych płytkach można następnie monitorować za pomocą chromatografii gazowej.
1. Przygotowanie pożywek z dodatkiem kwasów tłuszczowych
<ol>
	<li>Odmierzyć składniki pożywki do kolby o odpowiedniej wielkości. Na 1 l dodaj 17 g bakto-agaru, 2,5 g tryptonu, 3 g NaCl, 1 ml 5 mg/ml cholesterolu rozpuszczonego w etanolu i 10 ml 10% tergitolu rozpuszczonego w wodzie.</li>
	<li>Dodać 80% końcowej pożądanej objętości wody Millipore i autoklawować pożywkę wraz z pustymi szklanymi butelkami (równymi liczbie różnych stężeń kwasów tłuszczowych do badania), a także odpowiednimi cylindrami z podziałką.</li>
	<li>Schłodzić podłoże w łaźni wodnej o temperaturze 55 °C. Podczas schładzania pożywki należy przygotować roboczy roztwór podstawowy soli sodowej kwasu tłuszczowego, otwierając szklaną fiolkę, stosując środki ostrożności i upewniając się, że cząstki szkła nie mieszają się z kwasami tłuszczowymi. Odważ wystarczającą ilość kwasu tłuszczowego, aby uzyskać 100 mM materiału roboczego.</li>
	<li>Doprowadzić roztwór kwasu tłuszczowego do końcowego stężenia 100 mM za pomocą oczyszczonej wody. Całkowite rozpuszczenie soli sodowej kwasu tłuszczowego trwa zwykle około 20-30 minut. Oczyść materiał roboczy z kwasów tłuszczowych argonem lub azotem, ponieważ kontakt z gazem obojętnym zapobiega utlenianiu. Zakryć fiolkę i przechowywać materiał roboczy w ciemności do czasu ostygnięcia podłoża.</li>
	<li>(Opcjonalnie) Jeśli pożądane jest podłoże RNAi, zmierz tutaj roztwory ampicyliny i izopropylo β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG).</li>
	<li>Gdy agar ostygnie do temperatury 55 °C, dodać na 1 l: 1 ml 1 MMgSO4, 1 ml 1 M CaCl2 i 25 ml buforu fosforanowego (108,3 g KH2PO4 i 35,6 g K2HPO4 na 1 l autoklawowany). Dodaj filtr wysterylizowany roztworami ampicyliny i IPTG, jeśli robisz płytki RNAi. W przypadku wszystkich rodzajów płytek należy dodać sterylną wodę, aby uzyskać ostateczną objętość podłoża do 1 l.</li>
	<li>W pobliżu płomienia przenieś pożywkę do autoklawowanego i odpowiednio dobranego cylindra z podziałką, a następnie dodaj ciepłą sterylną wodę do żądanej objętości. Przenieść pożywkę z powrotem do kolby początkowej i wymieszać, mieszając.</li>
	<li>W pobliżu płomienia przenieś pożywkę do liczby butelek równej liczbie stężeń, które mają być badane, mierząc za pomocą autoklawowanego cylindra z podziałką o odpowiedniej wielkości. Utrzymywać poddane podłoże w postaci ciekłej, używając łaźni wodnej do czasu całkowitego rozpuszczenia zapasu roboczego kwasów tłuszczowych.</li>
	<li>Umieść jedną butelkę na talerzu do mieszania i mieszaj, aż podłoże będzie ciepłe w dotyku, ale nie gorące. Upewnij się, że masz wystarczająco dużo czasu na wymieszanie z roztworem podstawowym kwasu tłuszczowego i wlanie talerzy, zanim podłoże zacznie krzepnąć. Jeśli mieszadło ma regulowaną temperaturę, ustaw ją na 55 °C.</li>
	<li>Rozcieńczyć 100 mM materiału roboczego z kwasem tłuszczowym w pożywce, aby uzyskać pożądane końcowe stężenie. Mieszać pożywkę, aż biały osad znajdzie się w roztworze (około 1 min). Po tym czasie podłoże może być nadal lekko mętne.</li>
	<li>(Opcjonalnie) Jeśli pożądane jest podłoże RNAi, dodać ampicylinę do 0,1 mg/ml i IPTG do 2 mM stężenia końcowego.</li>
	<li>Wlać podłoże za pomocą automatycznego pipety i sterylnej pipety o pojemności 25 ml, dodając 8 ml pożywki na płytkę o średnicy 60 mm lub 25 ml pożywki na płytkę o średnicy 100 mm. Powtórz etapy dodawania kwasów tłuszczowych i nalewania płytek do pozostałych butelek.</li>
	<li>Po zestaleniu się agaru przykryj płytki uzupełnione kwasami tłuszczowymi pudełkiem lub przechowuj w temperaturze pokojowej w dobrze wentylowanej szufladzie, aby chronić przed lekkim utlenianiem.</li>
	<li>Wysiewaj E. coli OP50 na talerze dwa dni po wyschnięciu płytek. W przypadku płytek o średnicy 60 mm odpipetować 300 μl nocnej kultury OP50 (wyhodowanej w temperaturze 37 °C). Jeśli wylano płytki RNAi, wysiewaj je 300 μl bakterii RNAi po wyschnięciu płytek przez cztery dni. Czas schnięcia płytki może wymagać dostosowania ze względu na różnice w wilgotności w różnych środowiskach laboratoryjnych.</li>
	<li>Inkubuj płytki w ciemnym otoczeniu w temperaturze pokojowej, podczas gdy trawnik bakteryjny wysycha.</li>
</ol>
2. Indukowanie niszczenia komórek rozrodczych przez suplementację DGLA
<ol>
	<li>C. elegans wyhodowane na płytkach zawierających 0,3 mM DGLA (20:3n-6) stają się bezpłodne z powodu zniszczenia komórek rozrodczych zarówno w stadium larwalnym, jak i u dorosłych nicieni.
	<ol>
		<li>Przygotuj zsynchronizowaną populację larw L1, traktując grawitatory alkalicznym roztworem podchlorynu (na 10 ml roztworu: 0,5 ml 5M NaOH, 2,5 ml domowego wybielacza i 7 mlH2O). Delikatnie kołysz graitami hermafrodytów w tym roztworze, aż dorosłe robaki się rozpuszczą. Jaja zostaną zakonserwowane i mogą być granulowane przez wirowanie z niską prędkością.</li>
		<li>Preparat jajeczny umyć 3 razy w buforze M9 (3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O do 1 L. DodaćMgSO4 po autoklawowaniu). Aby zapewnić wystarczającą ilość tlenu, ponownie zawieś jaja w plastikowej probówce o pojemności 15 ml do końcowej objętości 5 ml buforu M9 i rozbujaj je na wytrząsarce przez noc.</li>
		<li>Larwy L1 należy dodać do uzupełnionych płytek dwa dni po wysianiu OP50 lub jeden dzień po posianiu bakterii RNAi. Inkubować robaki w temperaturze 20 °C przez trzy dni lub do momentu, gdy osiągną stadium dorosłe.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dorosłe robaki można ocenić pod kątem bezpłodności za pomocą mikroskopu preparacyjnego o wystarczająco dużym powiększeniu, aby uwidocznić zarodki rozwijające się w macicy. Udana utrata komórek rozrodczych objawi się oczyszczoną macicą pozbawioną komórek jajowych.</li>
	<li>Robaki można również oceniać poprzez utrwalanie i barwienie barwnikiem kwasu nukleinowego diamindinofenylindol (DAPI), który ułatwia wizualizację jąder w komórkach rozrodczych i rozwijających się zarodkach. Szybkie plamienie DAPI uzyskuje się poprzez zbieranie robaków do kropli bufora M9 na szkiełku zegarkowym9.
	<ol>
		<li>Zalać szkiełko zegarkowe 1 ml 0,2 ng/m. DAPI w 95% roztworze etanolu, odstawić na około 5 minut.</li>
		<li>Zbierz robaki do kropli VectaShield na szkiełku, a następnie przykryj szkiełkiem nakrywkowym.</li>
		<li>Szkiełko nakrywkowe należy zapieczętować i przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności przez noc w celu uzyskania optymalnego zabarwienia, jednak szkiełka można również natychmiast obejrzeć. Ocena obecności lub braku jąder komórek rozrodczych przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w lampę UV i filtr.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Potwierdzanie poboru kwasów tłuszczowych za pomocą chromatografii gazowej
Ogólny skład kwasów tłuszczowych C. elegans można określić poprzez produkcję estrów metylowych kwasów tłuszczowych (FAME), które są następnie rozdzielane i oznaczane ilościowo za pomocą chromatografii gazowej4.
<ol>
	<li>Zbierz 500-1,000 dorosłych robaków, zmywając je z talerzy wodą i przenosząc do silanizowanej szklanej rurki o wymiarach 13 mm x 100 mm.</li>
	<li>Pozwól robakom osiąść grawitacyjnie, a następnie usuń jak najwięcej wody za pomocą szklanej pipety Pasteura.</li>
	<li>Umyj robaki raz wodą, a następnie ponownie usuń jak najwięcej wody.</li>
	<li>FAME tworzy się przez dodanie 1 ml 2,5 % H2SO4 do metanolu, a następnie ogrzewanie w temperaturze 70 °C przez 1 godzinę w łaźni wodnej.</li>
	<li>Wyjmij rurki z łaźni wodnej i schładzaj przez 1 min.</li>
	<li>Ekstrahuj FAMEs, dodając 1,5 ml wody i 0,25 ml heksanu.</li>
	<li>Ponownie zamknij probówki i energicznie wstrząśnij.</li>
	<li>Odwiruj probówki w wirówce klinicznej stołowej przez 1 minutę z maksymalną prędkością, aby oddzielić heksan od wodnego rozpuszczalnika.</li>
	<li>Przenieść heksan (górna warstwa) do wkładki do fiolki GC w fiolce GC, uważając, aby nie przenieść żadnej fazy wodnej. W celu analizy GC 1-2 μl FAME w heksanie wstrzykuje się do polarnej kolumny kapilarnej chromatografii gazowej odpowiedniej do analizy FAME. Wtryskiwacz Agilent 7890 GC jest ustawiony na 250 °C, z natężeniem przepływu 1,4 ml/min, a piekarnik GC jest zaprogramowany na temperaturę początkową 130 °C, która jest utrzymywana przez 1 minutę. Następnie temperatura jest zwiększana o 10 °C/min do 190 °C, a następnie ponownie zwiększana do 5 °C/min do 210 °C i utrzymywana przez dodatkowy 1 minutę.</li>
	<li>Aby upewnić się, że nastąpił absorpcja DGLA, należy przeanalizować FAME za pomocą detekcji płomieniowo-jonizacyjnej (FID) lub spektrometrii mas (MS), stosując autentyczne wzorce do identyfikacji kwasów tłuszczowych C. elegans.</li>
</ol>

<ol><li>Haeggstrom, J. Z., Funk, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipoxygenase+and+leukotriene+pathways%3A+biochemistry%2C+biology%2C+and+roles+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Lipoxygenase and leukotriene pathways: biochemistry, biology, and roles in disease.</a> Chem. Rev. 111, 5866-5898 (2011).</li>
<li>de Lorgeril, M., Salen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+health+effects+of+dietary+saturated+and+omega-6+and+omega-3+polyunsaturated+fatty+acids%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med%22%5BJournal%5D)">New insights into the health effects of dietary saturated and omega-6 and omega-3 polyunsaturated fatty acids.</a> BMC Med. 10, 50(2012).</li>
<li>Spychalla, J. P., Kinney, A. J., Browse, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+animal+omega-3+fatty+acid+desaturase+by+heterologous+expression+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Identification of an animal omega-3 fatty acid desaturase by heterologous expression in Arabidopsis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 1142-1147 (1997).</li>
<li>Watts, J. L., Browse, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+polyunsaturated+fatty+acid+synthesis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of polyunsaturated fatty acid synthesis in Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5854-5859 (2002).</li>
<li>Watts, J. L., Phillips, E., Griffing, K. R., Browse, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiencies+in+C20+Polyunsaturated+Fatty+Acids+Cause+Behavioral+and+Developmental+Defects+in+Caenorhabditis+elegans+fat-3+Mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Deficiencies in C20 Polyunsaturated Fatty Acids Cause Behavioral and Developmental Defects in Caenorhabditis elegans fat-3 Mutants.</a> Genetics. 163, 581-589 (2003).</li>
<li>Kahn-Kirby, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+Polyunsaturated+Fatty+Acids+Drive+TRPV-Dependent+Sensory+Signaling+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Specific Polyunsaturated Fatty Acids Drive TRPV-Dependent Sensory Signaling In Vivo.</a> Cell. 119, 889-900 (2004).</li>
<li>Brock, T. J., Browse, J., Watts, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+regulation+of+unsaturated+fatty+acid+composition+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetic regulation of unsaturated fatty acid composition in C. elegans.</a> PLoS Genet. 2, e108(2006).</li>
<li>Webster, C. M., Deline, M. L., Watts, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+response+pathways+protect+germ+cells+from+omega-6+polyunsaturated+fatty+acid-mediated+toxicity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Stress response pathways protect germ cells from omega-6 polyunsaturated fatty acid-mediated toxicity in Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 373, 14-25 (2013).</li>
<li>Kadyk, L. C., Lambie, E. J., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((glp-3+is+required+for+mitosis+and+meiosis+in+the+Caenorhabditis+elegans+germ+line%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">glp-3 is required for mitosis and meiosis in the Caenorhabditis elegans germ line.</a> Genetics. 145, 111-121 (1997).</li>
<li>Watts, J. L., Browse, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+manipulation+implicates+lipid+signaling+in+the+regulation+of+germ+cell+maintenance+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Dietary manipulation implicates lipid signaling in the regulation of germ cell maintenance in C. elegans.</a> Dev. Biol. 292, 381-392 (2006).</li>
<li>Pryor, W. A., Stanley, J. P., Blair, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoxidation+of+polyunsaturated+fatty+acids%3A+II.+A+suggested+mechanism+for+the+formation+of+TBA-reactive+materials+from+prostaglandin-like+endoperoxides%5BTitle%5D)+AND+%22Lipids%22%5BJournal%5D)">Autoxidation of polyunsaturated fatty acids: II. A suggested mechanism for the formation of TBA-reactive materials from prostaglandin-like endoperoxides.</a> Lipids. 11, 370-379 (1976).</li>
<li>Kniazeva, M., Shen, H., Euler, T., Wang, C., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+maternal+phospholipid+composition+and+IP%283%29-dependent+embryonic+membrane+dynamics+by+a+specific+fatty+acid+metabolic+event+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Regulation of maternal phospholipid composition and IP(3)-dependent embryonic membrane dynamics by a specific fatty acid metabolic event in C. elegans.</a> Genes Dev. 26, 554-566 (2012).</li>
<li>Edmonds, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin%2FFOXO+signaling+regulates+ovarian+prostaglandins+critical+for+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Insulin/FOXO signaling regulates ovarian prostaglandins critical for reproduction.</a> Dev. Cell. 19, 858-871 (2010).</li>
<li>O'Rourke, E. J., Kuballa, P., Xavier, R., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((omega-6+Polyunsaturated+fatty+acids+extend+life+span+through+the+activation+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">omega-6 Polyunsaturated fatty acids extend life span through the activation of autophagy.</a> Genes Dev. 27, 429-440 (2013).</li>
<li>Taubert, S., Van Gilst, M. R., Hansen, M., Yamamoto, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mediator+subunit%2C+MDT-15%2C+integrates+regulation+of+fatty+acid+metabolism+by+NHR-49-dependent+and+-independent+pathways+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A Mediator subunit, MDT-15, integrates regulation of fatty acid metabolism by NHR-49-dependent and -independent pathways in C. elegans.</a> Genes Dev. 20, 1137-1149 (2006).</li>
<li>Lesa, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+chain+polyunsaturated+fatty+acids+are+required+for+efficient+neurotransmission+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Long chain polyunsaturated fatty acids are required for efficient neurotransmission in C. elegans.</a> J. Cell Sci. 116, 4965-4975 (2003).</li>
<li>Brock, T. J., Browse, J., Watts, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+desaturation+and+the+regulation+of+adiposity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Fatty acid desaturation and the regulation of adiposity in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 176, 865-875 (2007).</li>
<li>Goudeau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+desaturation+links+germ+cell+loss+to+longevity+through+NHR-80%2FHNF4+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Fatty acid desaturation links germ cell loss to longevity through NHR-80/HNF4 in C. elegans.</a> PLoS Biol. 9, e1000599(2011).</li>
<li>Yang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ARC%2FMediator+subunit+required+for+SREBP+control+of+cholesterol+and+lipid+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An ARC/Mediator subunit required for SREBP control of cholesterol and lipid homeostasis.</a> Nature. 442, 700-704 (2006).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W tym artykule opisano metodę suplementacji C. elegans dietetycznymi nienasyconymi kwasami tłuszczowymi. Jak wspomniano powyżej, należy zachować ostrożność przy przygotowywaniu płytek z dodatkiem PUFA, ponieważ reaktywny charakter wiązań podwójnych w PUFA powoduje, że te kwasy tłuszczowe są wrażliwe na utlenianie pod wpływem ciepła i światła11. Aby uniknąć utleniania, ważne jest, aby dodać PUFA do płynnego podłoża agarowego po schłodzeniu podłoża do 55 °C i przechowywaniu płytek w ciemnym otoczeniu.</...

Kwasy tłuszczowe są niezbędnymi składnikami strukturalnymi błon, jak również efektywnymi cząsteczkami magazynującymi energię. Dodatkowo kwasy tłuszczowe mogą być oddzielane od błon komórkowych przez lipazy i modyfikowane enzymatycznie w celu wytworzenia efektorów sygnałowych1. Naturalnie występujące wielonienasycone kwasy tłuszczowe (PUFA) zawierają dwa lub więcej podwójnych wiązań cis. Kwasy tłuszczowe omega-3 i kwasy tłuszczowe omega-6 różnią się od siebie na podstawie pozycji wiązań podwójnych w odniesieniu do metylowego końca kwasu tłuszczowego. Zdrowa dieta wymaga zarówno kwasów tłuszczowych omega-6, jak i omega-3. Jednak diety zachodnie są szczególnie bogate w kwasy tłuszczowe omega-6 i ubogie w kwasy tłuszczowe omega-3. Wysoki stosunek kwasów tłuszczowych omega-6 do omega-3 wiąże się ze zwiększonym ryzykiem chorób sercowo-naczyniowych i zapalnych, jednak dokładne korzystne i szkodliwe funkcje określonych kwasów tłuszczowych nie są dobrze poznane2. Glista Caenorhabditis elegans jest przydatna w badaniu funkcji kwasów tłuszczowych, ponieważ syntetyzuje wszystkie enzymy niezbędne do produkcji szeregu kwasów tłuszczowych omega-6 i omega-3, w tym desaturazy omega-3, aktywności, która jest nieobecna u większości zwierząt3,4 . Mutanty pozbawione enzymów desaturazy kwasów tłuszczowych nie wytwarzają specyficznych PUFA, co prowadzi do szeregu wad rozwojowych i neurologicznych4-6.
Aby zbadać fizjologiczne efekty dietetycznych kwasów tłuszczowych, opracowaliśmy test biochemiczny zgodny z analizą genetyczną, wykorzystując zarówno techniki mutantów, jak i RNAi knock-down u C. elegans. Suplementację specyficznymi PUFA uzyskuje się poprzez dodanie roztworu soli sodowej kwasu tłuszczowego do podłoża agarowego przed nalewaniem. Powoduje to wychwyt PUFA przez źródło pożywienia E. coli, gdzie gromadzi się on w błonach bakteryjnych. C. elegans połykają bakterie zawierające PUFA, a ta suplementacja diety jest wystarczająca, aby uratować defekty mutantów z niedoborem PUFA. Suplementacja większości kwasów tłuszczowych nie ma szkodliwego wpływu na zwierzęta typu dzikiego, jednak określone kwasy tłuszczowe omega-6, zwłaszcza kwas dihomo-gamma-linolenowy (DGLA, 20:3n-6) powodują trwałe zniszczenie komórek rozrodczych C. elegans 7,8 .
Chromatografia gazowa jest używana do monitorowania pobierania uzupełnionego kwasu tłuszczowego w bakteryjnym źródle pokarmu (OP50 lub HT115), jak również w nicieniach. Dodatek detergentu Tergitol (NP-40) do pożywki pozwala na równomierne rozprowadzenie kwasów tłuszczowych na całej płytce i bardziej efektywne pobieranie kwasów tłuszczowych przez E. coli i nicienie. Odkryliśmy, że nienasycone kwasy tłuszczowe są łatwo wchłaniane przez bakterie i C. elegans, ale wychwyt nasyconych kwasów tłuszczowych jest znacznie mniej wydajny. W tym artykule opisano krok po kroku, jak uzupełnić podłoże agarowe w kwasy tłuszczowe, a także jak monitorować wychwyt kwasów tłuszczowych przez nicienie za pomocą chromatografii gazowej.

<table><tbody><tr><td>Bacto-Agar</td><td>Difco</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Difco</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>J.T. Baker</td><td>3624-05</td><td></td></tr><tr><td>Tergitol</td><td>Sigma</td><td>NP40S-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma</td><td>C8667-25G</td><td>(5 mg / ml w etanolu)</td></tr> <tr><td>MgSO4</td><td>J.T. Baker</td><td>2504-01</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>J.T. Baker</td><td>1311-01</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>J.T. Baker</td><td>3254-05</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>J.T. Baker</td><td>3246-05</td><td></td></tr><tr><td>Dihomogamma linolenianu sodu</td><td>NuCHEK</td><td>S-1143</td><td></td></tr><tr><td>Ciepła sterylna woda</td> <td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterylna woda do zbierania robaków</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz do roztworu podstawowego DGLA</td><td>Ambion</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760-25</td><td>100 mg/ml w wodzie (do płytek RNAi)</td></tr><tr><td>Izopropylo-beta-D-tiogalaktopiranozyd (IPTG)</td><td>Gold Biotechnology</td><td>12481C100</td><td>1 M w wodzie (do płytek RNAi)</td></tr><tr><td>HSO4</td><td>J.T. Baker</td><td>9681-03</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452-4</td><td></td></tr><tr><td>Heksan</td><td>Fisher Scientific</td><td>H302-4</td><td></td></tr><tr><td>diamindinofenylindol (DAPI)</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>VectaShield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Szklana kolba</td><td>Corning</td><td>4980-2L</td><td></td></tr><tr><td>Autoklawowalne butelki szklane z mieszadłami</td><td>Fisherbrand</td><td>FB-800</td><td></td></tr><tr><td>Autoklawalny szklany cylinder z podziałką</td><td>Fisherbrand</td><td>08-557</td><td></td></tr><tr><td>Płytka mieszająca</td><td>VWR</td><td>97042-642</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel wodna w 55+ &deg; C</td><td>Precyzja Naukowa Inc.</td><td>66551</td><td></td></tr><tr><td>Zakrętka Fiolka z brązowego szkła</td><td>Sun SRI</td><td>200 494</td><td></td></tr><tr><td>Zbiornik</td><td></td><td></td><td></td>na argon</tr><tr><td>Automatyczna pomoc do pipet</td><td>Pipeta-Aid</td><td>P-90297</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne pipety serologiczne (25 ml)</td><td>Corning</td><td>4489</td><td></td></tr><tr><td>Palnik Bunsena</td><td>VWR</td><td>89038-534</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Leica</td><td></td><td></td>TLB3000</tr><tr><td>Rurka ze szkła silanizowanego</td><td>Thermo Scientific</td><td>STT-13100-S</td><td>do detrywatizacji FAME</td></tr><tr><td>Zakrętki z PTFE</td><td>Kimble-Chase</td><td>1493015D</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka kliniczna</td> stołowa <td>Fiolka zaciskana IEC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GC</td><td>SUN SRi</td><td>200 000</td><td></td></tr><tr><td>GC Wkładka do fiolki</td><td>SUN SRi</td><td>200 232</td><td></td></tr><tr><td>GC Nasadka na fiolkę</td><td>Chromatograf gazowy SUN SRi</td><td>200 100</td><td></td></tr> Detektor <tr><td>spektrometrii mas</td><td>Agilent</td><td>7890A</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>Kolumna</td><td></td></tr><tr><td>do chromatografii gazowej Kolumna do chromatografii gazowej</td><td>Suppelco</td><td>SP 2380</td><td>30 m x 0,25 mm kolumna kapilarna z topionej krzemionki</td></tr></tbody></table>

suplementacja diety wielonienasyconych kwasów tłuszczowych w caenorhabditis elegans

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Kwasy tłuszczowe są niezbędne dla wielu funkcji komórkowych. Służą jako wydajne cząsteczki magazynujące energię, tworzą hydrofobowy rdzeń błon i uczestniczą w różnych szlakach sygnałowych. Caenorhabditis elegans syntetyzuje wszystkie enzymy niezbędne do produkcji szeregu kwasów tłuszczowych omega-6 i omega-3. To, w połączeniu z prostą anatomią i szeregiem dostępnych narzędzi genetycznych, sprawia, że jest to atrakcyjny model do badania funkcji kwasów tłuszczowych. W celu zbadania szlaków genetycznych, które pośredniczą w fizjologicznym działaniu dietetycznych kwasów tłuszczowych, opracowaliśmy metodę uzupełniania diety C. elegans w nienasycone kwasy tłuszczowe. Suplementacja jest skutecznym sposobem na zmianę składu kwasów tłuszczowych robaków i może być również stosowana do ratowania defektów w mutantach z niedoborem kwasów tłuszczowych. Nasza metoda wykorzystuje agar z pożywką wzrostową nicieni (NGM) uzupełnioną solami sodowymi kwasów tłuszczowych. Kwasy tłuszczowe w uzupełnionych płytkach zostają włączone do błon bakteryjnego źródła pożywienia, które jest następnie pobierane przez C. elegans, które żywią się uzupełnionymi bakteriami. Opisujemy również protokół chromatografii gazowej w celu monitorowania zmian w składzie kwasów tłuszczowych, które zachodzą w suplementowanych robakach. Jest to skuteczny sposób na uzupełnienie diety zarówno dużych, jak i małych populacji C. elegans, pozwalający na szereg zastosowań tej metody.

Suplementacja diety C. elegans jest ograniczona zdolnością bakteryjnego źródła pożywienia do pobierania i wbudowywania kwasów tłuszczowych w błonę bakteryjną. Aby określić zdolność E. coli OP50 do asymilacji różnych kwasów tłuszczowych do swoich błon, szczep OP50 wysiano na podłoża bez suplementów oraz z kwasem stearynowym (18:0), oleinianem sodu (18:1n-9) i DGLA sodu (20:3n-6) w stężeniach 0,1 mM i 0,3 mM. Płytki suszono w temperaturze pokojowej przez 2 dni w ciemności, a następnie inkubowano w 20 °C p...

Caenorhabditis elegans to użyteczny model do badania funkcji wielonienasyconych kwasów tłuszczowych w rozwoju i fizjologii. Protokół ten opisuje skuteczną metodę uzupełniania diety C. elegans w wielonienasycone kwasy tłuszczowe.

Suplementacja diety wielonienasyconych kwasów tłuszczowych w Caenorhabditis elegans

Fatty acids are essential for numerous cellular functions. They serve as efficient energy storage molecules, make up the hydrophobic core of membranes, ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wykorzystanie środków dietetycznych do zmiany składu kwasów tłuszczowych w elegancji morskiej w celu zbadania funkcji i regulacji kwasów tłuszczowych. Osiąga się to poprzez hodowlę źródła pokarmu nicieni w obecności nienasyconych kwasów tłuszczowych. Następnie elegancja morska jest karmiona uzupełnionymi bakteriami, które pozwalają na wychwyt kwasu tłuszczowego i jego wbudowanie w robaka.Lipidy zmieniają się wtedy w morską elegancję. Skład kwasów tłuszczowych potwierdza chromatografia gazowa i spektrometria mas. Wreszcie, po karmieniu się nienasyconymi kwasami tłuszczowymi, robaki są nacinane pod kątem bezpłodności.Uzyskano wyniki, które pokazują fizjologiczne skutki zmienionego składu kwasów tłuszczowych poprzez rozwój, zachowanie i zmiany w ekspresji genów. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie elegancji morskiej, rozwoju i fizjologii, ponieważ możemy wykorzystać zarówno manipulację genetyczną, jak i wkład dietetyczny, aby zmienić skład kwasów tłuszczowych i monitorować konsekwencje. Ogólnie rzecz biorąc, osoby początkujące w tej metodzie muszą być ostrożne i ostrożne, ponieważ trudno jest uzyskać spójne wyni

dietary-supplementation-polyunsaturated-fatty-acids-caenorhabditis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Suplementacja żywieniowa wielonienasyconych kwasów tłuszczowych w Caenorhabditis elegans

W niniejszym opracowaniu przedstawiamy protokół przeprowadzania restrykcji dietetycznej na sztywnym podłożu u C. elegans z wykorzystaniem zabitych bakterii.

Ograniczenie kaloryczne na stałym podłożu u Caenorhabditis elegans

Prezentujemy solidne metody biochemiczne i mikroskopowe do badania zapasów lipidów Caenorhabditis elegans. Szybka, prosta procedura barwienia utrwalającego do fluorescencyjnego obrazowania kropelek lipidów wykorzystuje właściwości spektralne lipofilowego barwnika czerwieni nilowej. Następnie przedstawiono pomiar biochemiczny triglicerydów i fosfolipidów z wykorzystaniem ekstrakcji do fazy stałej i chromatografii gazowej ze spektrometrią mas.

Biochemiczna i wysokoprzepustowa ocena mikroskopowa masy tłuszczowej w Caenorhabditis elegans

W tym artykule opisujemy zoptymalizowaną procedurę ekstrakcji i analizy prostaglandyn i innych eikozanoidów z C. elegans za pomocą LC-MS/MS.

Ekstrakcja i analiza prostaglandyn w Caenorhabditis elegans

Przedstawiamy tu specyficzny dla Caenorhabditis elegans test zaprojektowany w celu oceny zmian w zachowaniu unikania miedzi i zdolności do zlokalizowania wspólnego źródła pożywienia, w miarę jak organizm przechodzi ze stanu dobrze odżywionego do stanu głodnego.

A Caenorhabditis elegans test oparty na unikaniu miedzi w oparciu o status żywienia

Barwienie czerwienią nilową utrwalonych Caenorhabditis elegans jest metodą ilościowego pomiaru neutralnych złogów lipidowych, podczas gdy barwienie czerwienią olejową O ułatwia jakościową ocenę dystrybucji lipidów wśród tkanek.

Kwantyfikacja obfitości lipidów i ocena rozmieszczenia lipidów w Caenorhabditis elegans za pomocą barwienia czerwienią nilową i czerwienią olejową O

Tutaj prezentujemy protokół izolacji RNA, DNA i białka z tej samej próbki, w celu zmniejszenia zmienności, poprawy odtwarzalności i ułatwienia interpretacji.

Połączone ekstrakcje nukleotydów i białek w Caenorhabditis elegans

Spadek proteostazy jest cechą charakterystyczną starzenia się, ułatwiając wystąpienie chorób neurodegeneracyjnych. Przedstawiamy protokół do ilościowego pomiaru proteostazy w dwóch różnych tkankach Caenorhabditis elegans poprzez heterologiczną ekspresję powtórzeń poliglutaminy połączonych z fluorescencyjnym reporterem. Model ten umożliwia szybką analizę genetyczną proteostazy in vivo.

Kwantyfikacja swoistego dla tkanki spadku proteostazy u Caenorhabditis elegans

Aby wykorzystać Caenorhabditis elegans (C. elegans) w badaniach omiki, potrzebna jest metoda generowania dużych populacji robaków, gdzie pojedyncza próbka może być mierzona na różnych platformach do analiz porównawczych. Przedstawiono tutaj metodę hodowli populacji C. elegans na płytkach hodowlowych na dużą skalę (LSCP) oraz dokumentowania wzrostu populacji.

Kultura i analiza populacji dużoskalowych o mieszanym stadium Caenorhabditis elegans

Mikroskopia stymulowanego rozpraszania Ramana (SRS) umożliwia selektywne, bezznacznikowe obrazowanie określonych cząsteczek chemicznych i została skutecznie wykorzystana do obrazowania cząsteczek lipidów in vivo. W tym miejscu przedstawiamy krótkie wprowadzenie do zasady działania mikroskopii SRS i opisujemy metody jej wykorzystania w obrazowaniu magazynowania lipidów w Caenorhabditis elegans.

Bezznacznikowe obrazowanie dynamiki magazynowania lipidów u Caenorhabditis elegans przy użyciu mikroskopii wymuszonego rozpraszania Ramana

Obecny protokół opisuje metody suplementacji lipidów w kulturach płynnych i na płytkach dla Caenorhabditis elegans, w połączeniu z badaniami podłużnymi i analizą transkrypcji genów z dużej ilości lub kilku robaków i tkanek robaków.

Suplementacja lipidów w celu długowieczności i analizy transkrypcji genów w Caenorhabditis elegans

W protokole tym opisano test do ilościowego określenia szybkości karmienia Caenorhabditis elegans w oparciu o pomiar klirensu bakterii w płynnej kulturze.

Kwantyfikacja spożycia pokarmu w Caenorhabditis elegans poprzez pomiar klirensu bakteryjnego

Poznaj metodę suplementacji diety wielonienasyconymi kwasami tłuszczowymi w Caenorhabditis elegans. Technika ta pozwala badać funkcje lipidów w rozwoju i fizjologii nicienia.

Suplementacja diety wielonienasyconych kwasów tłuszczowych w Caenorhabditis elegans

Przeglądaj więcej filmów