Name: Ekstrakcja i analiza kortyzolu z włosów ludzkich i małpich (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-24T08:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Poznaj metodę ekstrakcji i analizy kortyzolu z włosów ludzkich i małpich. Technika ta umożliwia precyzyjne pomiary przewlekłego stresu poprzez ocenę aktywności osi HPA w badaniach neurobiologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Kymberlee O'Brien, Celii Moore i Edwardowi Tronickowi (Wydział Psychologii, University of Massachusetts, Boston) za dostarczenie próbek ludzkich włosów analizowanych w tym badaniu, oraz Stephenowi Suomi i Amandzie Dettmer (Laboratorium Etologii Porównawczej, NICHD) za dostarczenie próbek włosów małpy rezus. Początkowy rozwój i dalsze stosowanie tej metody było wspierane przez NIH RR11122 do M.A.N.

1. Pobieranie i przechowywanie próbek
<ol>
	<li>Włosy ludzkie
	<ol>
		<li>Zabezpiecz całą długość włosów, z których chcesz pobrać próbkę (do średnicy ołówka) za pomocą gumki lub klipsa. Przytnij włosy jak najbliżej skóry głowy (uważając, aby nie naciąć skóry) czystymi nożyczkami. Uwaga: Standardowym obszarem pobierania próbek jest tylny wierzchołek czaszki.</li>
		<li>Niektórzy badacze donosili o spadku poziomu CORT ludzkich włosów wraz z odległością od skóry głowy6, co może być spowodowane wypłukiwaniem z powodu wielokrotnej ekspozycji na wodę i szampon7 (chociaż patrz Manenschijn i wsp.8 oraz Thomson i wsp. 9 dla przeciwnych wyników, w których nie zaobserwowano spadku segmentów) Aby zminimalizować wpływ tego potencjalnego "efektu wypłukiwania", zalecamy pobranie segmentów włosów proksymalnie do skóry głowy o długości nie większej niż 3 cm (zakładając średnie tempo wzrostu 1 cm/miesiąc10, segment o długości 3 cm zawiera CORT, który został zdeponowany w ciągu około ostatnich 3 miesięcy). Aby to osiągnąć, użyj linijki, aby zmierzyć 3 cm od pierwszego cięcia i potnij ponownie, aby uzyskać 3 cm próbkę. Uwaga: Po przycięciu włosów na długość nie jest już konieczne utrzymywanie pasm w jednej linii, chyba że badanie obejmuje cięcie próbki na oddzielne segmenty o długości 1 cm w celu ustalenia retrospektywnego kalendarza osadzania CORT w okresie poprzedzającym pobraniepróbki 6.</li>
		<li>Umieść próbkę włosów w woreczku wykonanym z folii aluminiowej, czystej papierowej kopercie lub 15 ml zakręcanej polipropylenowej probówce wirówkowej, typu używanego do mycia próbek. Ponieważ CORT jest wyjątkowo stabilny we włosach2, próbki mogą być przechowywane przez czas nieokreślony w temperaturze -20 °C i, jeśli to konieczne, wysyłane przez noc w temperaturze otoczenia.</li>
		<li>Procedura pobierania włosów powinna być przećwiczona na ochotnikach, a próbki do ćwiczeń powinny zostać zważone przed rozpoczęciem pełnego badania. Uwaga: Próbki włosów o wielkości zaledwie 5-10 mg można analizować przy użyciu opisanych tutaj metod, chociaż pożądane jest pobieranie próbek >10 mg, aby zminimalizować prawdopodobieństwo uzyskania odczytów EIA poniżej najniższego standardu CORT.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sierść małpy
	<ol>
		<li>Ogolić włosy (100-250 mg) od karku za pomocą standardowej maszynki do strzyżenia zwierząt. Gol się jak najbliżej skóry, uważając, aby nie zranić skóry i nie spowodować krwawienia, ponieważ poziom CORT we krwi jest bardzo wysoki w porównaniu z tymi, które znajdują się we włosach. Uwaga: Obszar szyi został wybrany do rutynowego pobierania próbek, ponieważ jest to na ogół dobre źródło włosów i można go łatwo zaobserwować pod kątem odrastania włosów przed ponownym pobraniem próbki.</li>
		<li>Umieść próbkę włosów w woreczku wykonanym z folii aluminiowej lub w polipropylenowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml z zakrętką. Próbki włosów małp powinny być przechowywane i wysyłane w taki sam sposób, jak opisano powyżej w odniesieniu do próbek włosów ludzkich.</li>
		<li>Ponieważ włosy małpy, w przeciwieństwie do włosów na ludzkiej skórze głowy, rosną do pewnej długości, a następnie przestają rosnąć11, w tym przypadku generalnie nie jest możliwe wykorzystanie odległości od skóry jako kalendarza do odkładania się CORT. Jeżeli jednak od zwierzęcia można pobrać więcej niż jeden raz (na przykład podczas okresowych rutynowych badań lekarskich), pożądane jest wykonanie wstępnego golenia w celu ustalenia punktu czasowego linii bazowej, a następnie ponowne golenie tego samego obszaru po upływie pożądanego czasu. CORT w drugiej próbce został zdeponowany w okresie między goleniem a ponownym goleniem, co pozwala na precyzyjne przypisanie zawartości CORT w próbce do aktywności HPA w tym przedziale5.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Mycie i suszenie próbek
<ol>
	<li>mycie
	<ol>
		<li>Umieść każdą próbkę włosów w polipropylenowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml z zakrętką.</li>
		<li>Dodać 5 ml izopropanolu klasy wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) do każdej probówki, a następnie powtarzać inwersję przez 3 minuty za pomocą rotatora.</li>
		<li>Zdekantować izopropanol do pojemnika na odpady, uważając, aby nie stracić żadnej cząstki próbki.</li>
		<li>Powtórz kroki 2.1.2 i 2.1.3 jeszcze raz.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>suszenie
	<ol>
		<li>Susz włosy przez co najmniej 2-3 dni, aby zapewnić całkowite odparowanie izopropanolu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Mielenie próbek i ekstrakcja CORT - Metoda 1 dla dużych próbek
<ol>
	<li>Mielenie próbek
	<ol>
		<li>Umieść do 250 mg suszonych włosów w 10 ml naczyniu do mielenia ze stali nierdzewnej wraz z pojedynczą kulą mielącą ze stali nierdzewnej o średnicy 12 mm.</li>
		<li>Mielić próbkę przez 6 minut z prędkością 25 Hz za pomocą młyna kulowego.</li>
		<li>Zważyć do 50 mg sproszkowanych włosów na wadze analitycznej, a następnie przenieść je do czystej probówki mikrowirówkowej z polipropylenu o pojemności 2,0 ml w celu późniejszej ekstrakcji CORT.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekstrakcja CORT
	<ol>
		<li>Dodać 1,0 ml metanolu klasy HPLC do probówki mikrowirówki zawierającej sproszkowaną próbkę.</li>
		<li>Zakryć probówkę i inkubować próbkę przez 18-24 godziny w temperaturze pokojowej ze stałą inwersją za pomocą rotatora.</li>
		<li>Odwiruj probówki z prędkością 14 000 obr./min przez 1 minutę w temperaturze pokojowej, aby granulować sproszkowane włosy.</li>
		<li>Przenieść 0,6 ml supernatantu do czystej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml, uważając, aby nie naruszyć osadu sproszkowanych włosów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Mielenie próbek i ekstrakcja CORT - Metoda 2 dla małych próbek
<ol>
	<li>Mielenie próbek
	<ol>
		<li>Umieść do 60 mg włosów w wstępnie zważonej probówce mikrowirówkowej o pojemności 2 ml wzmocnionej do ubijania koralików.</li>
		<li>Ponownie zważyć fiolkę w celu uzyskania masy próbki.</li>
		<li>Do każdej fiolki dodać trzy kulki ze stali chromowej o średnicy 3,2 mm, a następnie mielić próbkę przez co najmniej 2 minuty w ubijaku do kulek. Jeśli oględziny wykażą, że próbka jest niewystarczająco sproszkowana, należy przeprowadzić dodatkowe mielenie przez 0,5 lub 1 minutę. Uwaga: W tym przypadku nie jest konieczne przenoszenie zmielonych włosów, ponieważ ekstrakcja CORT jest przeprowadzana w tej samej fiolce co mielenie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekstrakcja CORT
	<ol>
		<li>Dodać 1,5 ml metanolu klasy HPLC do probówki mikrowirówki zawierającej sproszkowaną próbkę.</li>
		<li>Zakryć probówkę i inkubować próbkę przez 18-24 godziny w temperaturze pokojowej ze stałą inwersją za pomocą rotatora.</li>
		<li>Odwiruj probówki z prędkością 10 000 obr./min przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby granulować sproszkowane włosy. Uwaga: Koraliki ze stali chromowanej pozostają w probówce z włosami podczas etapów ekstrakcji i wirowania, co odpowiada za niższą prędkość wirowania w porównaniu z metodą 1.</li>
		<li>Przenieść 1,0 ml supernatantu do czystej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml, uważając, aby nie naruszyć osadu sproszkowanych włosów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Odparowanie rozpuszczalnika i rekonstytucja próbki
<ol>
	<li>Wysuszyć metanol za pomocą parownika próżniowego lub strumienia azotu, jeśli parownik próżniowy nie jest dostępny. W przypadku zastosowania parownika próżniowego opary metanolu mogą zostać uwięzione za pomocą wymrażarki lub pułapki chemicznej wyposażonej we wkład z węglem aktywnym.</li>
	<li>Po usunięciu metanolu należy rozpuścić ekstrakt CORT w odpowiedniej objętości buforu do oznaczania OOŚ (rozcieńczalnik do oznaczania). Jeśli przewiduje się stosunkowo wysokie wartości CORT, należy użyć buforu o objętości 0,4 ml lub większej. Jeśli przewiduje się stosunkowo niskie wartości, objętość można zmniejszyć do 0,2 ml lub mniej, aby zwiększyć czułość. Uwaga: 0,2 ml to wystarczająca objętość, aby co najmniej dwukrotnie pobrać zduplikowane podwielokrotności próbki, w przypadku gdy wymagane jest ponowne przeprowadzenie próbki.</li>
	<li>Odtworzoną próbkę należy natychmiast oznaczyć lub zamrozić w temperaturze -20 °C do późniejszej analizy. Uwaga: Jeśli odtworzona próbka zostanie zamrożona, ważne jest, aby unikać sublimacji w okresie zamrażania, ponieważ zmiana objętości próbki doprowadzi do fałszywej wartości CORT podczas wykonywania ostatecznych obliczeń.</li>
</ol>
6. Test CORT i konwersja danych
<ol>
	<li>Oznacz ekstrakty z włosów pod kątem CORT za pomocą zestawu do testu immunoenzymatycznego o wysokiej czułości (EIA). Uwaga: W przypadku korzystania z komercyjnego zestawu CORT EIA do śliny, postępuj zgodnie z zaleceniami producenta określonymi w ulotce zestawu, z wyjątkiem tego, że próbki testowe będą duplikatami podwielokrotności każdego odtworzonego ekstraktu do włosów zamiast próbek śliny.</li>
	<li>Przygotuj ekstrakt do włosów w ramach kontroli jakości (QC) do użycia w każdym teście.
	<ol>
		<li>Zebrać pewną liczbę dodatkowych próbek włosów i albo przetworzyć je pojedynczo, jak w krokach 4.1 i 4.2, albo połączyć je w celu przetworzenia dużej próbki, jak w krokach 3.1 i 3.2.</li>
		<li>Odparować rozpuszczalnik i rozpuścić ekstrakty w sposób opisany w krokach 5.1 i 5.2, a następnie zebrać odtworzone ekstrakty z kilku próbek pojedynczych lub zbiorczych.</li>
		<li>Podwielokrotność odtworzonego ekstraktu (np. 0,10 ml) rozlać do pojedynczych probówek do mikrowirówek i zamrozić do późniejszego wykorzystania.</li>
		<li>Rozmrozić i uruchomić jedną podwielokrotność kontroli jakości w dwóch egzemplarzach na każdej mikropłytce testu immunologicznego, aby zapewnić referencyjną wartość CORT do sprawdzenia jakości każdej serii.</li>
		<li>Współczynnik zmienności wewnątrztestowej (CV; zdefiniowany jako odchylenie standardowe podzielone przez średnią zestawu wartości próbki) można obliczyć, analizując 10-12 studzienek QC w tej samej serii, podczas gdy CV między testami można obliczyć przy użyciu wartości QC w grupie serii. Jeśli oprogramowanie czytnika mikropłytek oblicza CV dla zduplikowanych studzienek reprezentujących każdy ekstrakt z włosów, alternatywną metodą określania CV w teście wewnętrznym jest obliczenie średniej tych indywidualnych wartości CV na całej płytce.</li>
		<li>Jeżeli którykolwiek z ekstraktów próbki daje odczyt większy niż najwyższy standard CORT w OOŚ, wówczas kolejną podwielokrotność ekstraktu rozcieńcza się odpowiednią ilością buforu do oznaczania, a następujący odczyt OOŚ koryguje się o współczynnik rozcieńczenia. Próbki są również rutynowo poddawane ponownej analizie, jeśli CV dla zduplikowanych studzienek wynosi >10%.</li>
		<li>Ponieważ zestawy CORT EIA są przeznaczone do pomiaru wartości CORT w próbkach cieczy, takich jak ślina lub osocze, dane wyjściowe oprogramowania czytnika mikropłytek muszą zostać przeliczone na ilość CORT na jednostkę masy sproszkowanych włosów. Poniższy wzór konwertuje wynik testu w μg/dl na pg CORT na mg włosów: 
		(A/B) * (C/D) * E * 10 000 = F 
		gdzie A = μg/dl od wyników testu; B = waga (w mg) włosów poddanych ekstrakcji; C = obj. (w ml) metanolu dodanego do sproszkowanych włosów; D = obj. (w ml) metanolu odzyskanego z ekstraktu, a następnie wysuszonego; E = obj. (w ml) buforu do oznaczania użytego do rozpuszczenia wysuszonego ekstraktu; i F = końcowa wartość stężenia CORT we włosach w pg/mg.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Selye, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+and+the+general+adaptation+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+Med.+J%22%5BJournal%5D)">Stress and the general adaptation syndrome.</a> Br. Med. J. 1 (4667), 1383-1392 (1950).</li>
<li>Meyer, J. S., Novak, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minireview%3A+Hair+cortisol%3A+A+novel+biomarker+of+hypothalamic-+pituitary-adrenocortical+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Minireview: Hair cortisol: A novel biomarker of hypothalamic- pituitary-adrenocortical activity.</a> Endocrinology. 153, 4120-4127 (2012).</li>
<li>Tiefenbacher, S., Novak, M. A., Lutz, C. K., Meyer, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physiology+and+neurochemistry+of+self-injurious+behavior%3A+A+nonhuman+primate+model%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Biosci%22%5BJournal%5D)">The physiology and neurochemistry of self-injurious behavior: A nonhuman primate model.</a> Front. Biosci. 10, 1-11 (2005).</li>
<li>Davenport, M. D., Tiefenbacher, S., Lutz, C. K., Novak, M. A., Meyer, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+endogenous+cortisol+concentrations+in+the+hair+of+rhesus+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Gen.+Comp.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Analysis of endogenous cortisol concentrations in the hair of rhesus macaques.</a> Gen. Comp. Endocrinol. 147, 255-261 (2006).</li>
<li>Davenport, M. D., Lutz, C. K., Tiefenbacher, S., Novak, M. A., Meyer, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rhesus+monkey+model+of+self+injury%3A+Effects+of+relocation+stress+on+behavior+and+neuroendocrine+function%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">A rhesus monkey model of self injury: Effects of relocation stress on behavior and neuroendocrine function.</a> Biol. Psychiatry. 63, 990-996 (2008).</li>
<li>Kirschbaum, C., Tietze, A., Skoluda, N., Dettenborn, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hair+as+a+retrospective+calendar+of+cortisol+production+-+Increased+cortisol+incorporation+into+hair+in+the+third+trimester+of+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Psychoneuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">Hair as a retrospective calendar of cortisol production - Increased cortisol incorporation into hair in the third trimester of pregnancy.</a> Psychoneuroendocrinology. 34, 32-37 (2009).</li>
<li>Hamel, A. F., Meyer, J. S., Henchey, E., Dettmer, A. M., Suomi, S. J., Novak, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+shampoo+and+water+washing+on+hair+cortisol+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Effects of shampoo and water washing on hair cortisol concentrations.</a> Clin. Chim. Acta. 412, 382-385 (2011).</li>
<li>Manenschijn, L., Koper, J. W., Lamberts, S. W., van Rossum, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+method+to+measure+long+term+cortisol+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Steroids%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a method to measure long term cortisol levels.</a> Steroids. 76, 1032-1036 (2011).</li>
<li>Thomson, S., Koren, G., Fraser, L. A., Rieder, M., Friedman, T. C., Van Uum, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hair+analysis+provides+a+historical+record+of+cortisol+levels+in+Cushing%E2%80%99s+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Clin.+Endocrinol.+Diabetes%22%5BJournal%5D)">Hair analysis provides a historical record of cortisol levels in Cushing’s syndrome.</a> Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes. 118, 133-138 (2010).</li>
<li>LeBeau, M. A., Montgomery, M. A., Brewer, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+variations+in+growth+rate+and+sample+collection+on+interpreting+results+of+segmental+analyses+of+hair%5BTitle%5D)+AND+%22Forensic+Sci.+Int%22%5BJournal%5D)">The role of variations in growth rate and sample collection on interpreting results of segmental analyses of hair.</a> Forensic Sci. Int. 210, 110-116 (2011).</li>
<li>Dolnick, E. H. Variability of hair growth in Macaca mulatta. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDolnick%2C+EH+%22Adv.+Biol.+Skin%22">Adv. Biol. Skin</a>. Montagna, W., Dobson, R. L. IX, Pergamon Press. 121-128 (1969).</li>
<li>Sauvé, B., Koren, G., Walsh, G., Uum Tokmakejian, S. V. an, H, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+cortisol+in+human+hair+as+a+biomarker+of+systemic+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Invest.+Med%22%5BJournal%5D)">Measurement of cortisol in human hair as a biomarker of systemic exposure.</a> Clin. Invest. Med. 30, 183-191 (2007).</li>
<li>Gow, R., Thomson, S., Rieder, M., Van Uum, S., Koren, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assessment+of+cortisol+analysis+in+hair+and+its+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Forensic+Sci.+Int%22%5BJournal%5D)">An assessment of cortisol analysis in hair and its clinical applications.</a> Forensic Sci. Int. 196, 32-37 (2010).</li>
<li>Bechshøft, T. Ø, Sonne, C., Dietz, R., Born, E. W., Novak, M. A., Henchey, E., Meyer, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortisol+levels+in+hair+of+East+Greenland+polar+bears%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Total+Environ%22%5BJournal%5D)">Cortisol levels in hair of East Greenland polar bears.</a> Sci. Total Environ. 409, 831-834 (2011).</li>
<li>Cooper, G. A. A., Kronstrand, R., Kintz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Society+of+Hair+Testing+guidelines+for+drug+testing+in+hair%5BTitle%5D)+AND+%22Forensic+Sci.+Int%22%5BJournal%5D)">Society of Hair Testing guidelines for drug testing in hair.</a> Forensic Sci. Int. 218, 20-28 (2012).</li>
<li>Ito, N., Ito, T., Kromminga, A., Bettermann, A., Takigawa, M., Kees, F., Straub, R. H., Paus, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+hair+follicles+display+a+functional+equivalent+of+the+hypothalamic-pituitary-adrenal+%28HPA%29+axis+and+synthesize+cortisol%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Human hair follicles display a functional equivalent of the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis and synthesize cortisol.</a> FASEB J. 19, 1332-1334 (2005).</li>
<li>Russell, E., Koren, G., Rieder, M., Van Uum, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hair+cortisol+as+a+biological+marker+of+chronic+stress%3A+Current+status%2C+future+directions+and+unanswered+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Psychoneuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">Hair cortisol as a biological marker of chronic stress: Current status, future directions and unanswered questions.</a> Psychoneuroendocrinology. 37, 589-601 (2012).</li>
<li>Stalder, T., Kirschbaum, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cortisol+in+hair+-+State+of+the+art+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav.+Immun%22%5BJournal%5D)">Analysis of cortisol in hair - State of the art and future directions.</a> Brain Behav. Immun. 26, 1019-1029 (2012).</li>
<li>Staufenbiel, S. M., Penninx, B. W., Spijker, A. T., Elzinga, B. M., van Rossum, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hair+cortisol%2C+stress+exposure%2C+and+mental+health+in+humans%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Psychoneuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">Hair cortisol, stress exposure, and mental health in humans: A systematic review.</a> Psychoneuroendocrinology. 38, 1220-1235 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Opisana powyżej procedura CORT jest prosta do wykonania, stosunkowo niedroga, wykorzystuje łatwo dostępne chemikalia, odczynniki i materiały eksploatacyjne oraz wymaga sprzętu, który, z jednym wyjątkiem, prawdopodobnie jest obecny w typowym laboratorium analitycznym. Wyjątkiem jest urządzenie do mielenia, takie jak młyn kulowy lub mini-ubijak do koralików. Zauważamy, że niektóre grupy badawcze mielą próbki włosów na małe fragmenty o długości około12 mm 12, ale na podstawie naszych obserwacji zalecamy mielenie ...

Pomiar CORT w osoczu, ślinie, a czasami w moczu lub kale, jest używany jako wskaźnik stresu fizjologicznego od czasu odkrycia przez Selye roli osi HPA w stresie1. Chociaż opublikowano wiele prac dotyczących aktywności HPA w sytuacjach ostrego stresu, dziedzina ta jest utrudniona przez brak prostego i wiarygodnego wskaźnika przewlekłego stresu fizjologicznego. Problem ten pojawia się, ponieważ zarówno osocze, jak i ślina dają "punktowe" oszacowania aktywności HPA, które podlegają zmianom okołodobowym i mogą być zakłócone przez zakłócenia środowiskowe. Próbki moczu i kału dają pomiary CORT i/lub wydalania metabolitów, które w niektórych przypadkach obejmują kilka godzin, a w niektórych przypadkach nawet cały dzień. Pobranie wielu próbek przy użyciu którejkolwiek z tych matryc może zapewnić przybliżony złożony wskaźnik poziomów CORT w czasie; jednak żadne z tych podejść nie zapewnia prawdziwie długoterminowego wskaźnika aktywności HPA i reakcji tego systemu na przewlekłe czynniki stresogenne.
Pomiar CORT we włosach zaczął zaspokajać tę ważną potrzebę w literaturze dotyczącej stresu. Wstępne badania przeprowadzone przez kilka laboratoriów wykazały obecność CORT w ludzkich włosach, ale nie badano, czy poziom CORT we włosach zmienił się w funkcji stresu2. Ponieważ nasze laboratorium od wielu lat interesuje się regulacją osi HPA małpy rezusów przez różne czynniki społeczne i behawioralne3, postanowiliśmy ustalić i zwalidować metody ekstrakcji i analizy włosów małp rezusów4. Opierając się na założeniu, że CORT przenoszony przez krew jest powoli i stale wprowadzany do rosnących włosów, celem tej nowej metody było wykorzystanie poziomów CORT pochodzących z włosów jako zintegrowanego wskaźnika aktywności HPA w okresach od tygodni do miesięcy.
Podczas opracowywania obecnego protokołu napotkano kilka wyzwań metodologicznych. Po pierwsze, wcześniejsze badania wykazały, że niewielkie ilości krążącego CORT są wydalane z potem i sebum, a zatem mogą pokrywać zewnętrzną stronę łodygi włosa2. Aby wyeliminować ten potencjalny błąd, opracowaliśmy łagodną procedurę mycia, która wydaje się usuwać zewnętrzny CORANT, jednocześnie wywierając minimalny wpływ na CORT obecny w rosnącej łodydze włosa. Tak więc małpie włosy poddane tej procedurze (tj. dwóm 3-minutowym myciom izopropanolem) straciły około 7-8% całkowitej zawartości CORT włosów, a trzecie mycie usunęło mniej niż 1% więcej sterydów z próbki4. Wydaje się, że w ludzkich włosach jest więcej zewnętrznego CORT, ponieważ ta sama procedura usunęła średnio 27% całkowitej zawartości CORT z próbek (K. Rosenberg i J. Meyer, niepublikowane). Jednak podobnie jak w przypadku sierści małpy, dodatkowe mycie zawierało znacznie mniej CORT (około 7%) niż pierwsze dwa mycia. Dlatego wyniki zarówno z włosów małpich, jak i ludzkich wspierają twierdzenie, że większość (jeśli nie wszystkie) zewnętrznych CORT można usunąć przy zachowaniu głównej frakcji CORT w wewnętrznej macierzy włosa. Po drugie, nasze badania pilotażowe wykazały również, że mielenie włosów przed ekstrakcją znacznie zwiększyło odzysk CORT z próbki, prawdopodobnie poprzez rozbicie złożonej macierzy białkowej łodygi włosa, a także zwiększenie powierzchni dostępnej dla penetracji rozpuszczalnika. Opracowano dwie różne metody mielenia, z których każda ma zalety i wady. Metoda 1, która wykorzystuje młyn kulowy, ma tę zaletę, że wytwarza najdrobniejszy proszek. Jednak młyn kulowy jest stosunkowo drogim elementem wyposażenia, a jeśli jest używany ze standardowymi naczyniami i kulami do mielenia, jest w stanie zmielić tylko dwie próbki na raz. Małe próbki są również trudne do przetworzenia za pomocą młyna kulowego ze standardowymi naczyniami mielącymi. Metoda 2, która wykorzystuje ubijak do koralików, jest mniej skuteczna pod względem zdolności mielenia. W rezultacie, średni odzysk CORT jest o około 10% niższy przy zastosowaniu tej metody w porównaniu z młynem kulowym (dane niepublikowane). Z drugiej strony ubijak do koralików jest znacznie tańszy niż młyn kulowy, w zależności od modelu można zmielić jednorazowo 16-24 próbki, a metoda dobrze nadaje się do małych próbek. Ze względu na wyżej wspomniany odzysk różnicowy zaleca się stosowanie tej samej metody mielenia dla wszystkich próbek w ramach danego badania.
Po przetworzeniu próbek włosów, są one ekstrahowane metanolem, a CORT w ekstraktach jest analizowany za pomocą czułego i specyficznego komercyjnego zestawu EIA, pierwotnie zaprojektowanego do pomiaru CORT w ślinie. Procedury ekstrakcji i testów zostały częściowo zweryfikowane poprzez wykazanie, że seryjne rozcieńczenia ekstraktów z próbek włosów małp dały odczyty EIA, które były bardzo podobne do odczytów uzyskanych z autentycznych wzorców CORET. Następnie wykazaliśmy, że CORT włosów (oprócz CORT w osoczu i ślinie) był wrażliwy na główny stresor życiowy, jakim było administracyjnie nakazane przeniesienie małp do nowych kwater mieszkalnych4,5. Niniejsza praca zawiera szczegółowy opis metod stosowanych rutynowo w naszym laboratorium do przetwarzania próbek włosów ludzkich i małpich oraz do ekstrakcji i analizy CORT z takich próbek.

<table><tbody><tr><td>Izopropanol klasy HPLC</td><td>Fisher</td><td>A451</td><td></td></tr><tr><td>Metanol klasy HPLC</td><td>Fisher</td><td>A452</td><td></td></tr><tr><td>Zestawy do oznaczania kortyzolu w ślinie</td><td>Salimetrics</td><td>1-3002</td><td>Informacje na temat czułości i swoistości testu można znaleźć we wlotce producenta</td></tr>: <tr><td>15 ml Probówki wirówkowe z polipropylenową nakrętką</td><td>Max Scientific</td><td>10-9151</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Probówki do mikrowirówek Safe-Lock</td><td>Fisher</td><td>05-402-25</td><td></td></tr><tr><td>2,0 ml probówki do mikrowirówek Safe-Lock</td><td>Fisher</td><td>05-402-7</td><td></td></tr><tr><td>2,0 ml XXTuff wzmocnione mikrofiolki</td><td>BioSpec</td><td>330TX</td><td>Do stosowania z kulkami ze</td></tr><tr><td>stali chromowej 3,2 mm</td><td>BioSpec</td><td>11079132c</td><td>Stosować z mini-beadbeater</td></tr><tr><td>10 ml słoiki do mielenia ze stali nierdzewnej</td><td>Retsch</td><td>02.462.0061</td><td>Do użytku z młynkiem miksującym</td></tr><tr><td>12 mm kule mielące ze stali nierdzewnej</td><td>Retsch</td><td>05.368.0037</td><td>Do użytku z młynem miksującym</td></tr><tr><td>Wkład z węglem aktywnym Savant</td><td>DTK120R Do</td><td></td><td>użytku z pułapką chemiczną Savant</td></tr><tr><td>Rotator do probówek wirówkowych 15 ml</td><td>Fisher</td><td>S02135</td><td></td></tr><tr><td>Rotator do probówek do mikrowirówek</td><td>Fisher</td><td>NC9854190</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka stołowa do probówek do mikrowirówek</td><td>Fisher</td><td>13-100-675</td><td></td></tr><tr><td>MM 200 młyn miksujący</td><td>Retsch</td><td>20.746.0001</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Beadbeater 16&nbsp;</td><td>BioSpec</td><td>607</td><td></td></tr><tr><td>Savant DNA Speedvac</td><td>Fisher</td><td>DNA120-115</td><td></td></tr><tr><td>Pułapka chłodnicza</td><td>Savant Fisher</td><td>RVT400-115</td><td></td></tr><tr><td>Pułapka chemiczna Savant</td><td>Fisher</td><td>SCT120</td><td>Alternatywa dla pułapki parowej z chłodzeniem</td></tr><tr><td>Czytnik</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mikropłytek Myjka</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>do mikropłytekMieszalnik</td><td></td><td></td><td></td>do mikropłytek</tr><tr><td>Pipetor</td><td></td><td></td><td></td>wielokanałowy</tr><tr><td>Waga analityczna</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ekstrakcja i analiza kortyzolu z włosów ludzkich i małpich

Extraction and Analysis of Cortisol from Human and Monkey Hair

Hormon stresu kortyzol (CORT) jest powoli wprowadzany do rosnących łodyg włosów u ludzi, naczelnych i innych ssaków. Opracowaliśmy i zwalidowaliśmy metodę ekstrakcji i analizy CORT z włosów małp rezusów, a następnie dostosowaliśmy tę metodę do stosowania z ludzkimi włosami na skórze głowy. W przeciwieństwie do "próbek punktowych" CORT pobieranych z osocza lub śliny, CORT włosów zapewnia zintegrowany pomiar aktywności układu podwzgórze-przysadka-kory nadnerczy (HPA), a tym samym stresu fizjologicznego, w okresie włączenia hormonów. Ponieważ włosy na ludzkiej skórze głowy rosną średnio w tempie 1 cm/miesiąc, poziomy CORT uzyskane z segmentów włosów o długości kilku cm mogą potencjalnie służyć jako biomarker stresu doświadczanego przez wiele miesięcy.
W naszej metodzie, każda próbka włosów jest najpierw dwukrotnie myta w izopropanolu, aby usunąć z zewnętrznej części łodygi włosa resztki materiału, które zostały naniesione przez pot lub sebum. Po wysuszeniu próbka jest mielona na drobny proszek w celu rozbicia macierzy białkowej włosa i zwiększenia powierzchni do ekstrakcji. CORT z wnętrza łodygi włosa jest ekstrahowany do metanolu, metanol jest odparowywany, a ekstrakt jest odtwarzany w buforze testowym. Wyekstrahowany CORT, wraz z wzorcami i kontrolami jakości, jest następnie analizowany za pomocą czułego i specyficznego dostępnego na rynku zestawu do testów immunoenzymatycznych (EIA). Odczyt z EIA jest przeliczany na pg CORT na mg masy sproszkowanych włosów. Metoda ta została zastosowana w naszym laboratorium do analizy CORT włosów u ludzi, kilku gatunków makaków, marmozet, psów i niedźwiedzi polarnych. Wiele badań, zarówno przeprowadzonych w naszym laboratorium, jak i w innych grupach badawczych, wykazało szerokie zastosowanie CORT włosów do oceny narażenia na przewlekły stres zarówno w warunkach naturalnych, jak i laboratoryjnych.

Rycina 1 przedstawia wydruk z reprezentatywnego zestawu próbek ludzkich włosów (dorosłe osoby płci męskiej i żeńskiej) przetworzonych przy użyciu metody 2 – rozcierania i ekstrakcji. Do wygenerowania wyników oraz dopasowania 4-parametrycznej krzywej sigmoidalnej do wzorców CORT wykorzystano oprogramowanie komputerowe (Rycina 2). Współczynniki zmienności (CV) między dołkami na tej płytce wynosiły od 0,01 do 5,73%, przy średnim CV wewnątrz analizy wynoszącym 1,34%. CV między analizami, wyz...

Kortyzol (CORT) gromadzi się w rosnących łodygach włosów ludzi i naczelnych. Opisujemy metody ekstrakcji i analizy włosów CORT z dużą precyzją i czułością. Pomiar CORT włosów jest szczególnie dobrze przystosowany do oceny przewlekłego stresu w okresach od tygodni do miesięcy.

Ekstrakcja i analiza kortyzolu z włosów ludzkich i małpich

The stress hormone cortisol (CORT) is slowly incorporated into the growing hair shaft of humans, nonhuman primates, and other mammals. We developed and ...

Ogólnym celem poniższej procedury jest ekstrakcja i pomiar hormonu stresu kortyzolu z włosów ludzkich lub małpich. Osiąga się to poprzez uprzednie umycie próbki w izopropanolu w celu usunięcia wydalanego kortyzolu z zewnętrznej powierzchni włosów. W drugim etapie próbka jest mielona na drobny proszek w celu rozbicia macierzy włosa i zwiększenia powierzchni do ekstrakcji.Kortyzol obecny we wnętrzu łodygi włosa jest następnie ekstrahowany metanolem i ta sama zawartość kortyzolu jest oznaczana ilościowo za pomocą enzymatycznego testu immunologicznego. Ostatecznie można ocenić poziom odkładania się kortyzolu w czasie w próbce włosów. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak punktowe pomiary kortyzolu we krwi lub ślinie, jest to, że kortyzol we włosach stanowi miarę przewlekłej aktywności układu podwzgórze-przysadka, kory nadnerczy.Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie stresu, takie jak jaki jest związek między stresem a psychopatologią u ludzi lub jaki jest wpływ różnych warunków chowu na fizjologię stresu u naczelnych innych niż ludzie? Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku terapii zaburzeń, takich jak zespół stresu po

extraction-and-analysis-of-cortisol-from-human-and-monkey-hair

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ekstrakcja i analiza kortyzolu z ludzkich i małpiich włosów

Przedstawiamy nieinwazyjne podejście do pobierania próbek, umożliwiające efektywne gromadzenie próbek sierści od płochliwych małych ssaków, co zaprezentowano na przykładzie piki amerykańskiej. Wykazujemy użyteczność tej metody poprzez ekstrakcję DNA z pobranej sierści oraz amplifikację kilku typów markerów molekularnych powszechnie stosowanych w badaniach nad ekologią i ochroną dzikiej przyrody.

Nieinwazyjna technika pobierania próbek sierści w celu pozyskania wysokiej jakości DNA od trudnych do uchwycenia małych ssaków

Aktywność nadnerczy może być oceniona u koniowatych poprzez analizę kału pod kątem metabolitów kortykosteronu. Metoda ta oferuje nieinwazyjną opcję oceny długoterminowych wzorców zarówno u koni domowych, jak i wolno żyjących. Protokół ten opisuje zaangażowany test immunologiczny sprzężony z enzymem i związaną z nim walidację biochemiczną.

Analiza glikokortykosteroidów w kale: nieinwazyjne monitorowanie nadnerczy u koniowatych

Analiza stężenia kortyzolu we włosach stanowi alternatywę dla tradycyjnych pomiarów kortyzolu; jednakże, aby pobrać próbki włosów od Afroamerykanów, naukowcy muszą być kulturowo poinformowani i kompetentni. Celem tego protokołu jest zademonstrowanie kulturowo poinformowanej techniki pobierania próbek włosów do analizy kortyzolu od Afroamerykanów.

Pobieranie próbek włosów do analizy kortyzolu we włosach u Afroamerykanów

Przedstawiamy protokół do określenia optymalnego rozpuszczalnika ekstrakcyjnego do pomiaru kortyzolu z futra koali. Rozpuszczalnikami stosowanymi w tym protokole są metanol, etanol i izopropanol. Określenie optymalnego rozpuszczalnika ekstrakcyjnego pomoże w wiarygodnym pomiarze sierści w celu określenia wpływu przewlekłego stresu na koale.

Pomiar kortyzolu w futrze koali (Phascolarctos cinereus)

W tym badaniu prezentujemy protokół ekstrakcji kortyzolu z płetwy i szczęki jesiotra. Poziom kortyzolu w płetwach i szczękach badano dalej, porównując dwa rozpuszczalniki do mycia, a następnie testy ELISA. W ramach tego badania pilotażowo sprawdzono wykonalność kortyzolu w kości szczęki jako nowego wskaźnika stresu.

Ekstrakcja kortyzolu z matryc płetw jesiotra i szczęk

Ten protokół pokazuje, jak zapewnić praktyczne, znaczące wzbogacenie środowiska dla świń, które są trzymane na podłodze z rusztów w różnych etapach ich życia, oraz jak pobierać próbki śliny w sposób nieinwazyjny do pomiaru stężenia kortyzolu, jako biomarkera ostrego stresu.

Zapewnienie znaczącego wzbogacenia środowiska i pomiar kortyzolu w ślinie u świń trzymanych na podłodze rusztowej

Ten protokół opisuje szybki metodę przetwarzania przedpłynku do poprawy wykrywania kortyzolu. Używany jest przenośny urządzenie do filtrowania w celu usunięcia mucyn i innych substancji interferencyjnych przy zachowaniu docelowego analitu. Przetworzony przedpłyn wykazuje ulepszony przepływ kapilarny, co umożliwia bardziej spójne i bardziej powtarzalne wykonanie testu.

Urządzenie przenośne do przetwarzania śliny w celu poprawy wykrywania kortyzolu

Opisano metodologię izolacji wysokiej jakości genomowego DNA o wysokiej masie cząsteczkowej z mikrobiologicznej społeczności glebowej.

Ekstrakcja wysokocząsteczkowego genomowego DNA z gleb i osadów

W niniejszym filmie zaprezentowano protokół ekstrakcji DNA z materiału utrwalonego w formalinie i zatopionego w parafinie. Jest to procedura wielodniowa, w ramach której skrawki tkanek są deparafinowane ksylenem, rehydratowane etanolem i traktowane proteinazą K w celu oczyszczenia i wyizolowania DNA do późniejszej analizy genowo-specyficznej lub całego genomu.

Ekstrakcja DNA z materiału zatopionego w parafinie do analiz genetycznych i epigenetycznych

Analiza specyficzna dla tkanki w modelu regeneracji mieszka włosowego z wykorzystaniem lentiwirusów do mediacji funkcji wzmocnionej (gain-of-function) lub utraconej (loss-of-function).

Szybka analiza genetyczna sygnalizacji nabłonkowo-mezenchymalnej podczas regeneracji włosa

Poznaj metodę ekstrakcji i analizy kortyzolu z włosów ludzkich i małpich. Technika ta umożliwia precyzyjne pomiary przewlekłego stresu poprzez ocenę aktywności osi HPA w badaniach neurobiologicznych.

Ekstrakcja i analiza kortyzolu z włosów ludzkich i małpich

Przeglądaj więcej filmów