Name: Hodowla izolowanej tkanki płytki podłogowej i produkcja kondycjonowanej pożywki w celu oceny właściwości funkcjonalnych sygnałów uwalnianych przez płytkę podłogową (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-11T17:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Naucz się hodowli izolowanej płytki podłogowej i produkcji kondycjonowanej pożywki do oceny sygnałów neuronalnych w rdzeniu kręgowym myszy. Metoda umożliwia analizę biochemiczną markerów komisuralnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Karine Kindbeiter, Muriel Bozon i Florie Reynaud za pomoc. Prace są wspierane przez CNRS, ANR YODA program oraz Labex DevWeCan.

DZIEŃ 1
1. Wycięcie płytki dolnej rdzenia kręgowego (FP) z zarodków myszy E12.5
Uwaga: Cała procedura wymaga użycia sterylnych warunków. Zaleca się przeprowadzenie sekcji pod okapem preparacyjnym, aby uniknąć zanieczyszczenia. Powierzchnię okapu należy oczyścić etanolem. Wszystkie narzędzia preparacyjne muszą być wysterylizowane i przechowywane na sterylnej szalce Petriego. Płyny (pożywka, pożywka do rozwarstwiania) muszą być zamknięte i umieszczone w łaźni lodowej. Każdy zarodek powinien być pobrany w pojedynczej świeżej kropli. Jest to ważne dla zachowania tkanek. Sekcja wykonywana jest za pomocą kleszczy Dumont #5. Aby przenieść zarodki między szalkami, chwyć pępowinę lub głowę bez uszkodzenia tyłomózgowia. Bardzo ważne jest, aby nie uszkodzić rdzenia kręgowego, aby pomyślnie zakończyć sekcję. Przygotuj zimną sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), zimny zrównoważony roztwór soli Hanka (HBSS) -6,5% glukozy i pożywkę neuropodstawową o temperaturze pokojowej.
1.1 Rozwarstwienie rdzenia kręgowego
Zwierzęta są traktowane zgodnie z wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami Centre National de la Recherche Scientifique, zgodnie z europejskimi dyrektywami. Metodą eutanazji jest zwichnięcie szyjki macicy, polega na wywieraniu nacisku na szyję i zwichnięciu kręgosłupa od mózgu. Ta metoda jest zalecana dla mysich modeli zwierzęcych i może być wykonana w szybki i skuteczny sposób.
<ol>
	<li>Poddaj eutanazji ciężarną mysz w E12,5 ciąży (E0,5 = pierwszy dzień po zmatowieniu). Umieść mysz brzuszną stroną do góry.</li>
	<li>Namocz brzuch 70% etanolem. Uszczypnij skórę brzucha kleszczami Adson i przetnij skórę i warstwy otrzewnej nożyczkami chirurgicznymi. Wykonaj nacięcie i użyj go do cięcia po obu stronach myszy, aby odsłonić jamę brzuszną.</li>
	<li>Sznur zarodków jest obecny po każdej stronie myszy. Chwyć jeden róg macicy w tkance między dwoma zarodkami i wypreparuj go, zaczynając od zewnętrznej części. Przenieść nienaruszoną macicę na 100-milimetrową szalkę Petriego z zimnym PBS na lodzie.</li>
	<li>Ekstrakcja zarodków z tkanek pozazarodkowych. Chwyć tkankę łożyska (w kolorze ciemnoczerwonym) dwiema parami kleszczy i delikatnie pociągnij, aby rozerwać tkankę i usunąć zarodki z worka macicy.</li>
</ol>
Uwaga: Dla lepszej konserwacji, zbieraj zarodki z worka macicznego jeden po drugim.
<ol start="5">
	<li>Kolejne kroki wykonywane są pod lupą lornetkową i kapturem sekcyjnym. Umieść jeden zarodek w kropli zimnego HBSS-6,5% glukozy.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy odetnij głowę zarodkowi.</li>
</ol>
Uwaga: Przecięcie między dolną szczęką a tyłomózgowiem, tylna część tyłomózgowia jest ważna dla następnych kroków.
<ol start="7">
	<li>Ułóż zarodek brzusznie twarzą w dół, z przednią częścią skierowaną w stronę eksperymentatora.</li>
	<li>Uszczypnij skórę zarodka jedną parą kleszczy, a drugą parą odciągnij skórę.</li>
</ol>
Uwaga: Ten krok musi być powtarzany, dopóki skóra nie zostanie całkowicie usunięta z przedniej części zarodka.
<ol start="9">
	<li>Obróć zarodek przednią stroną w lewo. Za pomocą jednych kleszczy "przygwoździć" zarodek w przedniej części. Drugimi kleszczami chwyć skórę i pociągnij w kierunku rostralnej strony zarodka. Rdzeń kręgowy jest wtedy dostępny.</li>
	<li>Użyj jednej strony kleszczy, aby przeciąć opony mózgowe, które nadal owijają rdzeń kręgowy. Rdzeń kręgowy jest teraz otwarty.</li>
	<li>Obróć zarodek przednią stronę w prawo.</li>
	<li>Odłącz tkankę od rdzenia kręgowego, zaczynając od szyjnej strony zarodka. Wsuń kleszcze pod rdzeń kręgowy (kleszcze powinny być trzymane zamknięte, aby uniknąć uszkodzenia rdzenia kręgowego). Kleszcze muszą być widoczne pod rdzeniem kręgowym. Niewielkie ruchy obrotowe pod rdzeniem kręgowym wystarczą, aby oderwać otaczającą tkankę i zwoje korzenia grzbietowego (DRG).</li>
</ol>
Uwaga: Pozostawienie przyczepionej otaczającej tkanki zwiększa ciężar rdzenia kręgowego, zwiększając tym samym prawdopodobieństwo jego uszkodzenia podczas następnego kroku.
<ol start="13">
	<li>Umieść izolowany rdzeń kręgowy w świeżej kropli zimnego HBSS-6,5% glukozy.</li>
	<li>Umieść rdzeń kręgowy w płaskiej pozycji, opony mózgowe na górze i przedniej stronie od eksperymentatora.</li>
	<li>"Przygwoździć" rdzeń kręgowy za pomocą pozostałej tyłomózgowia za pomocą jednego kleszcza, a drugimi kleszczami chwyć opony mózgowe. Oderwij opony mózgowe, zaczynając od rostralnej strony rdzenia kręgowego.</li>
</ol>
Uwaga: Ruch powinien być powolny i stały, aby uniknąć przerwania rdzenia kręgowego. Ruchy wibracyjne mogą ułatwić oderwanie opon mózgowych.
1.2 Sekcja FP
<ol>
	<li>Uszczypnij tyłomózgowie jednym kleszczem.</li>
	<li>FP jest centralną przezroczystą częścią tkanki. Za pomocą skalpela wytnij płytę podłogową.</li>
</ol>
Uwaga: Aby przyciąć obie strony z tą samą jakością, zacznij od strony rostralnej i naprzemiennie przycinaj prawą i lewą stronę płyty podłogowej.
<ol start="3">
	<li>Zakonserwuj wypreparowany FP w pożywce neuropodstawowej w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
2. Kultura FP
Uwaga: Wszystkie kroki powinny być wykonywane w sterylnych warunkach w kapturze do hodowli tkankowej. Używaj świeżej pożywki i świeżo rozmrożonych suplementów i odczynników. Przygotuj sterylne szklane szkiełka nakrywkowe, ciepły neurobazal + B27, osocze i trombinę HBSS.
2.1 Kultura FP
<ol>
	<li>Umieścić kilka sterylnych szkiełek nakrywkowych na szalce Petriego o średnicy 100 mm i odpipetować 20 μl osocza na środku każdego szkiełka nakrywkowego.</li>
	<li>Przenieść od dwóch do czterech FP do każdej kropli osocza i dodać 20 μl HBSS-trombiny obok kropli osocza i ostrożnie wymieszać. Szkiełka nakrywkowe należy przechowywać przez co najmniej dziesięć minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić koagulację osocza.</li>
</ol>
Uwaga: Przenieś dwa FP w przypadku całkowitego rozbioru i więcej w przypadku częściowego rozbioru. Mieszać powoli końcówką pipety i unikać kontaktu z eksplantatami FP.
Skrzep plazmy cofa się o kilka μm jako oznaka krzepnięcia. Nie wolno przerywać krzepnięcia przedwcześnie, aby uniknąć oderwania się skrzepu osocza.
<ol start="3">
	<li>Przenieść każde szkiełko nakrywkowe do płytki 24-dołkowej i dodać 500 μl Neurobasal+B27. Inkubować przez 48 godzin w temperaturze 37 °C.</li>
</ol>
DZIEŃ 3
3. Podłoże kondycjonowane przez FP (FPcm) Zbiór
Uwaga: Pobieranie powinno odbywać się w sterylnych warunkach w kapturze do hodowli tkankowych. Jeśli supernatant jest zanieczyszczony lub jeśli płytki podłogowe unoszą się na wodzie (co oznacza, że mogły umrzeć w okresie hodowli), nie należy zbierać FPcm z tej studni.
3.1FP cm zbiorów
<ol>
	<li>Ostrożnie zbierz podłoże z każdej studzienki.</li>
</ol>
Uwaga: Nie pipetuj spolimeryzowanej mieszanki plazmy i trombiny ani żadnych fragmentów FP.
<ol start="2">
	<li>Przechowywać 100 μl porcji w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
DZIEŃ 4
4. Sekcja neuronów spoidła rdzenia kręgowego z zarodków myszy E12.5
Uwaga: To przygotowanie nie musi być wykonywane w sterylnych warunkach. Postępuj zgodnie z procedurą opisaną powyżej, aby pobrać zarodki. Przygotuj zimny PBS, zimny HBSS-6,5% glukozy i zimny neurobazal.
4.1 Rozwarstwienie rdzenia kręgowego
<ol>
	<li>Za pomocą kleszczy odetnij głowę zarodkowi.</li>
</ol>
Uwaga: Przecięcie między dolną szczęką a tyłomózgowiem, tylna część tyłomózgowia jest ważna dla następnych kroków.
<ol start="2">
	<li>Umieść zarodek brzusznie twarzą w dół w świeżej kropli, przednią częścią skierowaną w stronę eksperymentatora.</li>
	<li>Uszczypnij skórę zarodka jednym kleszczem, a drugim odciągnij skórę.</li>
</ol>
Uwaga: Ten krok musi być powtarzany, dopóki skóra nie zostanie całkowicie usunięta z przedniej części zarodka.
<ol start="4">
	<li>Obróć zarodek przednią stroną w lewo. Za pomocą jednych kleszczy "przygwoździć" zarodek w przedniej części. Drugimi kleszczami chwyć skórę i pociągnij w kierunku rostralnej strony zarodka, aby odsłonić rdzeń kręgowy.</li>
	<li>Użyj jednej strony kleszczy, aby przeciąć opony mózgowe, które nadal owijają rdzeń kręgowy. Rdzeń kręgowy jest teraz odsłonięty i otwarty.</li>
	<li>Ustaw zarodek po przedniej stronie po prawej stronie.</li>
	<li>Odłącz tkankę od rdzenia kręgowego, zaczynając od szyjnej strony zarodka. Wsuń kleszcze pod rdzeń kręgowy (trzymaj kleszcze zamknięte). Kleszcze muszą być widoczne pod rdzeniem kręgowym. Małe ruchy obrotowe pod rdzeniem kręgowym wystarczą, aby oderwać sąsiednią tkankę i zwoje korzenia grzbietowego (DRG).</li>
	<li>Przenieś izolowany rdzeń kręgowy w nowej kropli zimnej glukozy HBSS-6,5%.</li>
	<li>Umieść rdzeń kręgowy w płaskiej pozycji, opony mózgowe na górze i przedniej stronie od eksperymentatora.</li>
	<li>"Przygwoździć" rdzeń kręgowy za pomocą pozostałej tyłomózgowia za pomocą jednych kleszczy, a drugimi kleszczami chwyć opony mózgowe. Oderwij opony mózgowe, zaczynając od rostralnej strony rdzenia kręgowego.</li>
</ol>
4.2 Spoidłowa sekcja neuronów
<ol>
	<li>Uszczypnij tyłomózgowie jednym kleszczem.</li>
	<li>Neurony spoidła, znajdują się w najbardziej bocznej części rdzenia kręgowego (po stronie grzbietowej). Wytnij tę boczną część cienkim skalpelem.</li>
</ol>
Uwaga: Grzbietową część rdzenia kręgowego można odróżnić od brzusznej po różnicy gęstości komórek, przy czym część brzuszna jest bardziej nieprzezroczysta.
Uwaga: Aby przyciąć obie strony z tą samą jakością, zacznij od strony rostralnej i na przemian przycinaj niewielką długość prawej strony i lewej strony.
<ol start="3">
	<li>Wypreparowaną tkankę należy zachować w podłożu Neurobasel na lodzie do natychmiastowego użycia.</li>
</ol>
5. Leczenie tkanki spoidła za pomocą FPcm
Uwaga: Ta procedura nie wymaga sterylnych warunków. Tkankę należy pobrać do pojedynczych probówek o pojemności 1,5 ml. Zamrożony FPcm należy użyć tylko raz. Unikaj wielokrotnego zamrażania. Przygotować ciepłą fc cm (37 °C).
5.1 Leczenie neuronów spoidła
<ol>
	<li>Zderzyć tkankę spoidła małymi nożyczkami.</li>
</ol>
Uwaga: Odetnij tkankę tak małą, jak to możliwe, aby zwiększyć dostępność komórek.
<ol start="2">
	<li>Sprawiedliwie rozmieść tkankę między różnymi warunkami eksperymentalnymi, kontrolą leczenia i leczenia FPcm.</li>
	<li>Odwirować fragmenty tkanek w temperaturze 800 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Sprawdź ponowny podział między rurami.</li>
</ol>
Uwaga: Jeśli to konieczne, rozprowadź ponownie i odwiruj, aż fragmenty zostaną równomiernie rozłożone.
<ol start="5">
	<li>Usunąć supernatant.</li>
	<li>Dodaj ciepły FPcm i zabiegi kontrolne do tkanek.</li>
</ol>
Uwaga: Objętość musi być dostosowana do ilości granulki i powinna być co najmniej dwukrotnie większa od objętości granulki.
<ol start="7">
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.</li>
</ol>
Uwaga: Delikatnie potrząsaj co 10-15 minut
<ol start="8">
	<li>Wirować przy 800 x g przez 1 minutę i usunąć zabieg.</li>
	<li>Dodać bufor do lizy</li>
</ol>
Uwaga: Objętość musi być dostosowana do ilości granulki i powinna być co najmniej dwukrotnie większa od objętości granulki.
<ol start="10">
	<li>Pipetować w górę i w dół, aby ponownie zawiesić osad.</li>
</ol>
Uwaga: Można również użyć wiru.
<ol start="11">
	<li>Inkubować 15 minut na lodzie.</li>
	<li>Wirować przy 14 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zachowaj supernatant i zmierz ilość białka za pomocą testu Bradforda9.</li>
	<li>Dodaj 6x bufor Laemmli.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 95 °C przez 5 minut w celu denaturacji zawartości białka.</li>
</ol>
Uwaga: Próbki mogą być używane natychmiast lub mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C.
<ol start="16">
	<li>Oceń efekty leczenia Western blot10.</li>
</ol>
Uwaga: Przynajmniej 50 μg białka powinno być załadowane na każdą linię.

<ol><li>Nawabi, H., Castellani, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+commissures+in+the+central+nervous+system%3A+how+to+cross+the+midline%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Axonal commissures in the central nervous system: how to cross the midline.</a> Cell. Mol. Life Sci. 68, 2539-2553 (2011).</li>
<li>Placzek, M., Briscoe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+floor+plate%3A+multiple+cells%2C+multiple+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The floor plate: multiple cells, multiple signals.</a> Nat. Rev. Neurosci. 6, 230-240 (2005).</li>
<li>Chedotal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+tales+of+the+midline%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Further tales of the midline.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 21, 68-75 (1016).</li>
<li>Nawabi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+midline+switch+of+receptor+processing+regulates+commissural+axon+guidance+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A midline switch of receptor processing regulates commissural axon guidance in vertebrates.</a> Genes Dev. 24, 396-410 (2010).</li>
<li>Ruiz de Almodovar, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF+mediates+commissural+axon+chemoattraction+through+its+receptor+Flk1%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">VEGF mediates commissural axon chemoattraction through its receptor Flk1.</a> Neuron. 70, 966-978 (2011).</li>
<li>Charoy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gdnf+activates+midline+repulsion+by+Semaphorin3B+via+NCAM+during+commissural+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">gdnf activates midline repulsion by Semaphorin3B via NCAM during commissural axon guidance.</a> Neuron. 75, 1051-1066 (2012).</li>
<li>Kiecker, C., Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+organizers+in+patterning+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The role of organizers in patterning the nervous system.</a> Annu. Rev. Neurosci. 35, 347-367 (2012).</li>
<li>Le Dreau, G., Marti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal-ventral+patterning+of+the+neural+tube%3A+a+tale+of+three+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Dorsal-ventral patterning of the neural tube: a tale of three signals.</a> Dev. Neurobiol. 72, 1471-1481 (2012).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blotting%3A+sample+preparation+to+detection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Western blotting: sample preparation to detection.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li>
<li>Salinas, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+morphogen+sonic+hedgehog+collaborates+with+netrin-1+to+guide+axons+in+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The morphogen sonic hedgehog collaborates with netrin-1 to guide axons in the spinal cord.</a> Trends Neurosci. 26, 641-643 (2003).</li>
<li>Bechara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FAK-MAPK-dependent+adhesion+disassembly+downstream+of+L1+contributes+to+semaphorin3A-induced+collapse%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">FAK-MAPK-dependent adhesion disassembly downstream of L1 contributes to semaphorin3A-induced collapse.</a> EMBO J. 27, 1549-1562 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Produkcja pożywki kondycjonowanej na płycie podłogowej zapewnia wydajny i łatwy sposób oceny właściwości biologicznych sygnałów uwalnianych z płyty podłogowej.
Macierz osococowo-trombinowa zapewnia doskonałe warunki do przeżycia tkanek. Niemniej jednak to wzbogacone środowisko może być ograniczeniem dla niektórych typów eksperymentów. W ten sposób tkanka płytki podłogowej może być również hodowana w macierzy agarozowej. Jakość medium kondycjonowanego na płycie podłogowej można ocenić poprzez w...

Płyta podłogowa jest dobrze znanym centrum wzorcowym rozwijającego się rdzenia kręgowego, odgrywającym kluczową rolę w określaniu progenitorów i postmitotycznych linii komórkowych oraz kontrolującym nawigację aksonów7,8. Opisana tutaj procedura eksperymentalna mająca na celu wytworzenie FPcm pozwala badaczom ocenić właściwości funkcjonalne sygnałów pochodzących z płytki podłogowej w różnych kontekstach procesów rozwojowych, od wzorca komórkowego i przeżycia po migrację komórek i aksonów.
Aby zilustrować użycie takiegoCM FP, tkanki grzbietowego rdzenia kręgowego zawierające neurony spoidła są preparowane, dylatowane i stymulowane za pomocą CMFP. Tkanki można następnie przetworzyć do analizy Western blot. Pozwala to na badanie regulacji mechanizmu naprowadzania aksonów za pomocą sygnałów zwalnianych na płycie podłogowej. Metoda leczenia zniszczonej świeżej tkanki ma tę wielką zaletę, że pozwala zachować mikrośrodowisko komórek w tkance. W związku z tym konsekwencje leczenia FPcm lub dowolnego rodzaju leczenia są oceniane w sposób bardziej fizjologiczny niż w warunkach hodowli komórek i tkanek.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Wymagane odczynniki</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, Ca2+/Mg2+- wolny</td><td>Invitrogen</td><td>14170-088</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma</td><td>G-7021</td><td></td></tr><tr><td>Neurobazalny</td><td>Invitrogen</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Plasma</td><td>Sigma</td><td>P-3266</td><td>1 mg / ml (Rozpuścić w H2O i przesączyć)</td></tr><tr><td>Trombina</td><td>Sigma</td><td>T-4648</td><td>10 mg / ml (Rozpuścić w H2O i przesączyć)</td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>50x</td></tr><tr><td>HEPES (260 g/mol)</td><td>Sigma</td><td>H-7006</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E-5513</td><td>0,5 M, pH 8</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Euromedex</td><td>2189</td><td>1M</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>VWR</td><td>24388.295</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL</td><td>Sigma</td><td>I-3021</td><td></td></tr><tr><td>Kompletne tabletki koktajlowe inhibitora proteazy</td><td>Roche</td><td>04 693 116 001</td><td></td></tr><tr><td>Ortowanadan sodu (Na3VO4)</td><td>Sigma</td><td>S-6508</td><td></td></tr><tr><td>Destylowany H 2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tabela 1.Wymagane odczynniki. </td></tr><tr><td colspan="4">Narzędzia i materiały</td></tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne</td><td>Fine Science Tools</td><td>14002-12</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Adson</td><td>Fine Science Tools</td><td>11027-12</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Kleszcze do cienkich końcówek</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Microknives</td><td>Fine Science Tools</td><td>10136-14</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tabela 2. Narzędzia i materiały. </td></tr><tr><td colspan="4"><table border="1"> <tbody> <tr> <td colspan="2">Sekcja i hodowla FP</td> </tr> <tr> <td>Etanol 70%</td> <td></td> </tr><tr> <td>kaptur sekcyjny</td> <td></td> </tr><tr> <td>mikroskop prosektoryjny</td> <td></td> </tr><tr> <td>szalki Petriego</td> <td></td> </tr><tr> <td>szklane szkiełka nakrywkowe</td> <td>18 mm x 18 mm</td> </tr><tr> <td> Palnik gazowy Bunsena</td> <td></td> </tr><tr> <td>24-dołkowa płytka</td> <td></td> </tr><tr> <td>inkubator kultur tkankowych (37 &deg; C, 5% CO2, kontrolowana wilgotność)</td> <td></td> </tr><tr> <td>Wirówka</td> <td></td> </tr><tr> <td colspan="2">Przepisy</td> </tr> <tr> <td colspan="2" >FP pożywki hodowlane</td> </tr> <tr> <td>Neurobasal</td> <td></td> </tr><tr> <td>B27</td> <td>1/50e rozcieńczenie z zapasu</td> </tr><tr> <td colspan="2">HBSS-trombina </td> </tr> <tr> <td>HBSS</td> <td>1 ml </td> </tr><tr> <td>trombina 10 mg/ml</td> <td>30 &mu; l</td> </tr><tr> <td colspan="2">Bufor do lizy pH 7,4</td> </tr> <tr> <td>HEPES (260 g/mol) </td> <td>25 mM</td> </tr><tr> <td>EDTA (pH 8) </td> <td>5 mM</ td> </tr><tr> <td>MgCl2 </td> <td>1 mM</td> </tr><tr> <td>Glycerol </td> <td>10%</td> </tr><tr> <td>IGEPAL (NP40) </td> <td>0,10%</td> </tr>< tr> <td>Koktajl inhibitorów proteazy </td> <td>1x</td> </tr><tr> <td>Orthovanadan sodu </td> <td>0,2 M</td> </tr><tr> <td>H2O</td> <td></td> </tr><tr> <td colspan="2">Laemmli Buffer</td> </tr> <tr> <td>Tris 0,5 M, pH 6,8 </td> <td>375 mM</td> </tr><tr> <td>SDS</td> <td>6%</td> </tr><tr> <td>Glycerol</td> < td>60%</td> </tr><tr> <td>DTT</td> <td>0,6 M</td> </tr><tr> <td>Błękit bromofenolowy</td> <td></td> </tr><tr> <td>H2O</td> <td></td> </ tr></tbody> </stół></td></tr></tbody></table>

hodowla izolowanej tkanki płytki podłogowej i produkcja kondycjonowanej pożywki w celu oceny właściwości funkcjonalnych sygnałów uwalnianych przez płytkę podłogową

Culture of Isolated Floor Plate Tissue and Production of Conditioned Medium to Assess Functional Properties of Floor Plate-released Signals

Podczas rozwoju, neurony progenitorowe i postmitotyczne otrzymują sygnały z sąsiednich terytoriów, które regulują ich los. Płytka podłogowa to grupa komórek glejowych wyściełających kanał wyściółki w pozycji brzusznej. Płytka podłogowa wyraża kluczowe morfogeny przyczyniające się do tworzenia wzorców linii komórkowych w rdzeniu kręgowym. W późniejszych stadiach rozwojowych płytka podłogowa reguluje nawigację aksonów w rdzeniu kręgowym, działając jako bariera zapobiegająca krzyżowaniu się aksonów ipsilateralnych i kontrolująca przekraczanie linii środkowej przez aksonyspoidła1. Funkcje te są osiągane poprzez wydzielanie różnych wskazówek naprowadzających. Niektóre z tych sygnałów działają jako atraktanty i repelenty dla rosnących aksonów, podczas gdy inne regulują receptory naprowadzające i sygnalizację w dół, aby modulować wrażliwość aksonów na lokalne sygnały naprowadzające2,3. W tym artykule opisano metodę, która pozwala na badanie właściwości sygnałów pochodzących z płyty podłogowej w różnych kontekstach rozwojowych, w oparciu o produkcję pożywki kondycjonowanej płytą podłogową (FPcm)4-6. Następnie przedstawiamy przykład użycia tegoCM FP w kontekście prowadzenia aksonów. Najpierw rdzeń kręgowy jest izolowany z zarodka myszy w E12,5, a płytka podłogowa jest wycinana i hodowana w matrycy plazmowo-trombinowej (ryc. 1). Po drugie, dwa dni później, tkanka spoidła jest wycinana z zarodków E12,5, rozcierana i wystawiana na działanieCM FP. Po trzecie, tkanka jest przetwarzana do analizy Western blot markerów spoidła.

Tkanki spoidła były leczone przez FPcm, a próbki zostały przetworzone do analizy poziomów receptorów w Western blot. Wykazano, że zastosowanie FPcm zwiększa poziom receptora naprowadzającego, PlexinA1, który pośredniczy w wrażliwości aksonów spoidła na środek odstraszający linię środkową Semaforyna3B po skrzyżowaniu (ryc. 2). Okazało się, że sygnały uwalniane przez FP regulują poziom PlexinA14,6.
<img alt="...

Płyta podłogowa jest kluczową strukturą rozwijającego się rdzenia kręgowego, dostarczającą dyfuzyjnych sygnałów do progenitorów i różnicujących neurony. Opisujemy metodę wytwarzania pożywki kondycjonowanej płytką podłogową, stosowania jej do świeżej tkanki rdzenia kręgowego oraz oceny wpływu na białka będące przedmiotem zainteresowania przez biochemię.

Hodowla izolowanej tkanki płytki podłogowej i produkcja kondycjonowanej pożywki w celu oceny właściwości funkcjonalnych sygnałów uwalnianych przez płytkę podłogową

During development, progenitors and post-mitotic neurons receive signals from adjacent territories that regulate their fate. The floor-plate is a group of ...

Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie właściwości sygnałów pochodzących z płyty podłogowej w różnych kontekstach rozwojowych w oparciu o produkcję ośrodka kondycjonowanego płytą podłogową. Osiąga się to poprzez najpierw wyizolowanie rdzenia kręgowego z zarodka myszy w E 12,5 i wypreparowanie płytki podłogowej. Drugim krokiem jest wyhodowanie płyty podłogowej w plazmowej matrycy trombinowej w celu wytworzenia pożywki kondycjonowanej na płycie podłogowej.Następnie izoluje się rdzeń kręgowy z zarodków myszy w E 12,5 i wycina tkankę grzbietową zawierającą neurony komunikacyjne, chóralne. Ostatnim etapem jest poddanie i wystawienie wypreparowanej tkanki komunikacyjnej na próbki pożywki kondycjonowanej na płycie podłogowej. Ostatecznie tkanka jest przetwarzana do analizy biochemicznej, takiej jak western blot, aby pokazać ekspresję markerów spoidła.Ta metoda może pomóc zuki w zadawaniu pytań w dziedzinie biologii rozwojowej. Sygnały uwalniane przez płytkę podłogową odgrywają kluczową rolę w regulacji tkanki tłuszczowej, różnicowaniu, proliferacji i prowadzeniu aksonów tkanek i komórek różnego pochodzenia. ZA być wystawionym na działanie podłoża w stanie płyty podłogowej, demonstrując

culture-isolated-floor-plate-tissue-production-conditioned-medium-to

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Przedstawiamy nowatorską metodę utrzymywania ludzkiej błony śluzowej jelita w kulturze oraz monitorowania odpowiedzi na różne rodzaje bodźców przez co najmniej 24 hrs. Dzięki zastosowaniu naszej metody zachowana zostaje polarność tkanki, co umożliwia fizjologiczną stymulację drogą apikalną.

Nowoczesna metoda hodowli i spolaryzowanej stymulacji eksplantów ludzkiej błony śluzowej jelita

Bakterie wytwarzają wydzielane związki, które mogą wpływać na fizjologię swoich mikrobiologicznych sąsiadów. W tym miejscu opisujemy badanie przesiewowe kokultury, które umożliwia wykrywanie takich chemicznie zapośredniczonych interakcji międzygatunkowych poprzez mieszanie mikroorganizmów glebowych z fluorescencyjnymi transkrypcyjnymi szczepami reporterowymi Bacillus subtilis na podłożach stałych.

Wykorzystanie kokultury do wykrywania interakcji międzygatunkowych o podłożu chemicznym

Poniższy protokół opisuje procedurę składania kultur podobnych do kanapek, które mają być używane jako etap pośredni między dwuwymiarowymi (2D) i trójwymiarowymi (3D) środowiskami komórkowymi. Opracowane systemy mogą znaleźć zastosowanie w badaniach mikroskopii, biomechaniki, biochemii i biologii komórki.

Mikrośrodowiska przypominające kanapki w celu wykorzystania interakcji między komórkami a materiałami

Testy kolonii in vitro do wykrywania samoodnawiania i różnicowania komórek progenitorowych wyizolowanych z dorosłej trzustki mysiej zostały opracowane. W tych testach komórki progenitorowe trzustki powodują powstawanie kolonii komórkowych w przestrzeni trójwymiarowej w półstałym podłożu zawierającym metylocelulozę. Opisano protokoły postępowania z pojedynczymi komórkami i charakterystyki poszczególnych kolonii.

In vitro Testy kolonijne do charakteryzowania trójpotencjałowych komórek progenitorowych wyizolowanych z dorosłej mysiej trzustki

Macierz zewnątrzkomórkowa odgrywa główną rolę w definiowaniu mikrośrodowiska komórek oraz w modulowaniu ich zachowania i fenotypu. Opisujemy szybką metodę izolacji macierzy zewnątrzkomórkowej pochodzącej z komórki, którą można dostosować do różnych skal do badań mikroskopowych, biochemicznych, proteomicznych lub funkcjonalnych.

Szybka, skalowalna metoda izolacji, badania funkcjonalnego i analizy macierzy zewnątrzkomórkowej pochodzącej z komórek

Ten protokół zapewnia efektywne kosztowo podejście do izolowania i charakteryzowania pierwotnych komórek kanalików nerkowych myszy, które następnie mogą być subhodowane w celu oceny funkcji biologicznych nerek ex vivo, w tym bioenergetyki mitochondrialnej.

Izolacja, charakterystyka i wysokoprzepustowa analiza strumienia zewnątrzkomórkowego pierwotnych komórek nabłonka kanalików nerkowych myszy

Komórki enterochromafiniczne (EC) stanowią mały podzbiór komórek nabłonka przewodu pokarmowego. Komórki EC są elektrycznie pobudliwe i uwalniają serotoninę, jednak trudności w hodowli i identyfikacji komórek EC mają ograniczone badania fizjologiczne. Przedstawiona tutaj metoda ustanawia model hodowli pierwotnej, który można badać pojedyncze komórki EC za pomocą elektrofizjologii.

Elektrofizjologia całych komórek pierwotnych hodowanych mysich komórek enterochromafinowych

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy protokół tworzenia matryc 3D mikrotkanek ludzkich mięśni szkieletowych oraz minimalnie inwazyjnych testów funkcji in situ, w tym analizy siły skurczu i obchodzenia się z wapniem.

Ocena funkcjonalnych wskaźników zdrowia mięśni szkieletowych w mikrotkankach mięśni szkieletowych człowieka

Opisujemy podejście do wykrywania i przechwytywania inwazyjnych subpopulacji komórek w czasie rzeczywistym. Projekt eksperymentalny wykorzystuje analizę komórkową w czasie rzeczywistym poprzez monitorowanie zmian impedancji elektrycznej komórek. Można wychwycić inwazyjne komórki nowotworowe, immunologiczne, śródbłonkowe lub zrębowe w złożonych tkankach i ocenić wpływ kokultur.

Wykrywanie i wychwytywanie w czasie rzeczywistym inwazyjnych subpopulacji komórek z kokultur

Prezentowany protokół opisuje rozwój i wykorzystanie techniki barwienia aktyną na bazie falloidyny z konfokalną laserową mikroskopią skaningową (CLSM) do wizualizacji przylegającej struktury warstwy komórkowej w mikroprzepływowych kanałach hodowli dynamicznej i tradycyjnych komorach do hodowli statycznej ze stałą studnią. Takie podejście pomaga w ocenie zbiegu warstw komórkowych, tworzenia monowarstw i jednorodności grubości warstwy.

Przygotowanie i ocena strukturalna monowarstw komórek nabłonka w fizjologicznie dobranym urządzeniu do hodowli mikroprzepływowej

Tutaj prezentujemy protokół hodowli komórek IDG-SW3 w trójwymiarowej (3D) macierzy zewnątrzkomórkowej.

Hodowla komórkowa IDG-SW3 w trójwymiarowej macierzy zewnątrzkomórkowej

Naucz się hodowli izolowanej płytki podłogowej i produkcji kondycjonowanej pożywki do oceny sygnałów neuronalnych w rdzeniu kręgowym myszy. Metoda umożliwia analizę biochemiczną markerów komisuralnych.

Hodowla izolowanej tkanki płytki podłogowej i produkcja kondycjonowanej pożywki w celu oceny właściwości funkcjonalnych sygnałów uwalnianych przez płytkę podłogową (Wideo) | JoVE Journal

Hodowla izolowanej tkanki płytki podłogowej i produkcja kondycjonowanej pożywki w celu oceny właściwości funkcjonalnych sygnałów uwalnianych przez płytkę podłogową

Przeglądaj więcej filmów