Name: Ilościowa ocena migracji neutrofili człowieka przez nabłonek pęcherza moczowego z hodowlą (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-07T19:40:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Poznaj metodę ilościowej oceny migracji neutrofili przez nabłonek pęcherza moczowego w odpowiedzi na zakażenie bakteryjne. Technika ta pozwala badać mechanizmy odpowiedzi immunologicznej in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty National Institutes of Health (NIH) R01-DK080752 i P50-DK064540. Dziękujemy J. Loughman za jej wysiłki w ustanowieniu tego testu.

1. Hodowla 5637 komórek nabłonka pęcherza moczowego
Wykonaj następujące kroki w kapturze do hodowli tkanek z przepływem laminarnym, przygotowanym za pomocą promieniowania UV i przetartym 70% etanolem.
<ol>
	<li>Przygotować pożywkę RPMI-1640 zawierającą 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) [określaną jako RPMI+], przefiltrować wysterylizować za pomocą filtra o wielkości porów 0,22 μm i ogrzać do 37 °C w łaźni wodnej.</li>
	<li>Rozmrozić kriowial składający się z 5637 komórek (American Type Culture Collection HTB-9; pochodzący z raka pęcherza moczowego) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Szybko przenieś rozmrożone komórki do kolby do hodowli tkankowych o długości 75cm2 zawierającej 20 ml RPMI+.</li>
	<li>Inkubować kolbę w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze z 5% CO2 do momentu, gdy komórki zlewają się w około 95% (~6 x 106 komórek na kolbę), około 4 dni.</li>
	<li>Aby przeprowadzić subkulturę 5637 komórek:
	<ol>
		<li>Usunąć podłoże z kolby. Umyj komórki 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Dodać 6 ml ciepłego (37 °C) 0,05% roztworu trypsyny, 0,02% EDTA do kolby i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 15 minut.</li>
		<li>Przenieść komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i osadzać przez odwirowanie przy 300 x g przez 5 minut. Usunąć roztwór trypsyny/EDTA.</li>
		<li>Ponownie zawiesić komórki w 6 ml RPMI+ (106 komórek/ml) i przenieść 1 ml (106 komórek) do nowej kolby o długości 75cm2 zawierającej 20 ml RPMI+.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powtórz krok 1.4 dla subhodowli komórek co 4 dni lub gdy komórki osiągną 95% konfluencji.</li>
</ol>
2. Siew i uprawa 5637 komórek na przepuszczalnych podporach
Wykonaj następujące kroki w kapturze do hodowli tkanek przy użyciu techniki aseptycznej. Aby uzyskać optymalne wyniki, użyj 5637 komórek, które przeszły mniej niż 10 subkultur.
<ol>
	<li>Za pomocą sterylnych kleszczy odwróć przepuszczalne podpory w sterylnym naczyniu do hodowli tkanek o głębokości 25 mm.</li>
	<li>Trypsynizować kolbę o długości 75cm2 zawierającą 5637 komórek przy 95% zbiegu zgodnie z krokami 1.4.1-1.4.3.</li>
	<li>Za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl delikatnie zawiesić komórki w ~2 ml RPMI+ do stężenia 3 x 106 komórek/ml, oznaczonego przez zliczanie komórek za pomocą hemocytometru.</li>
	<li>Nanieść 50 μl zawiesiny komórek (1,5 x 105 komórek) na każde przepuszczalne podłoże bez dotykania błony. Umieść pokrywkę na naczyniu i ostrożnie umieść naczynie w temperaturze 37 °C z 5% CO2 na nie dłużej niż 16 godzin.</li>
	<li>Za pomocą sterylnych kleszczyków umieść przepuszczalne podpory w 24-dołkowej płytce zawierającej 0,6 ml RPMI+ na studzienkę. Dodaj 0,1 ml RPMI+ do górnego zbiornika każdego przepuszczalnego nośnika. Inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
	<li>Wymieniaj podłoże co 2 dni. Najpierw należy zassać pożywkę z górnego zbiornika, a następnie dolnego zbiornika, a następnie nanieść świeży RPMI+ w odwrotnej kolejności do dolnego zbiornika (0,6 ml), a następnie do górnego zbiornika (0,1 ml).</li>
	<li>Siedem dni po wysianiu przepuszczalnych podpór z 5637 komórkami oceń zbieg komórek. Napełnij górny zbiornik RPMI+ (~0,35 ml). Komórki są wystarczająco zlewne, gdy podłoże nie znajduje równowagi między górnym i dolnym zbiornikiem.</li>
</ol>
3. Przygotowanie inokulum bakteryjnego
<ol>
	<li>Stosując technikę aseptyczną, dodać 20 ml odpowiedniego bulionu hodowlanego do kolby o pojemności 250 ml z nakrętką. Do hodowli bakterii E. coli należy używać bulionu Luria-Bertani (LB) i w razie potrzeby dodawać antybiotyki do bulionu.</li>
	<li>Za pomocą sterylnej pętli inokulacyjnej zaszczepij bulion bakteriami z bulionu glicerolowego lub płytki smugowej. W przypadku szczepów UPEC inkubować kulturę bakteryjną w temperaturze 37 °C przez około 16 godzin, bez wstrząsania (w celu pobudzenia produkcji pilusów typu 1).</li>
	<li>Przenieś kulturę bakteryjną do probówki wirówkowej. Osadzać bakterie przez odwirowanie przy 8 000 x g przez 10 minut.</li>
	<li>Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić bakterie w PBS do OD600 = 1.000, co odpowiada ~109 CFU/ml.
	<ol>
		<li>Aby wytworzyć bodziec bakteryjny zabity termicznie, należy inkubować podwielokrotność (np. ~1,5 x 108 CFU w 150 μl) zawieszonych bakterii w temperaturze 55 °C przez 30 minut. Umieścić na płytce podwielokrotność zawiesiny zabitej termicznie w celu potwierdzenia śmierci bakterii.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Bezpośrednio przed użyciem rozcieńczyć zawieszone bakterie (żywe lub zabite termicznie) 10-krotnie do 108 CFU/ml w ciepłym RPMI bez surowicy [zwanym RPMI-] w probówce do mikrofuge.</li>
</ol>
4. Izolacja ludzkich neutrofili od krwi obwodowej
Pobieranie krwi od dorosłych ochotników wymaga wcześniejszego przeglądu i zatwierdzenia przez instytucjonalną komisję rewizyjną. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej i odpowiednio utylizować materiały niebezpieczne, aby uniknąć narażenia na kontakt z ludzką krwią.
<ol>
	<li>Około 25 ml krwi żylnej od zdrowego dorosłego ochotnika powinno zostać pobrane do 3 sterylnych probówek do pobierania krwi zawierających heparynę sodową przez personel przeszkolony w zakresie upuszczania krwi.
	<ol>
		<li>Szczelnie owiń gumową opaskę uciskową wokół ramienia, powyżej łokcia.</li>
		<li>Zdezynfekuj miejsce wejścia, dół przedłokciowy, za pomocą sterylnej chusteczki nasączonej 70% alkoholem.</li>
		<li>Przymocuj plastikowy uchwyt na rurkę do systemu skrzydeł motylkowych.</li>
		<li>Wbić igłę do żyły łokciowej pod kątem 30° lub mniejszym, skosem skierowanym do góry. Igła przebiła żyłę, gdy w plastikowej rurce pojawia się tryskająca krew.</li>
		<li>Włóż probówkę do pobierania krwi do plastikowego uchwytu probówki. Gdy pierwsza probówka zbiorcza jest pełna, wymień ją na drugą. Powtórz z trzecią tubką.</li>
		<li>Gdy trzecia probówka jest wypełniona mniej więcej do połowy, zdejmij opaskę uciskową.</li>
		<li>Przykryj miejsce wkłucia sterylnym wacikiem i powoli wyjmij igłę z żyły. Nasuń osłonę ochronną na igłę i umieść w pojemniku na ostre przedmioty stanowiące zagrożenie biologiczne.</li>
		<li>Uciskaj miejsce nakłucia. Przykryj miejsce nakłucia i wacik bandażem samoprzylepnym.</li>
		<li>Delikatnie odwróć probówki do pobierania krwi, aby rozproszyć heparynę.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
Wykonaj następujące kroki w kapturze do hodowli tkanek przy użyciu techniki aseptycznej.
<ol start="2">
	<li>Za pomocą pipety o pojemności 10 ml delikatnie przenieś krew do świeżej, sterylnej probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Dodaj równoważną objętość 3% (w/v) dekstranu w 0,9% NaCl i wymieszaj przez inwersję. Inkubować probówkę w pozycji pionowej w temperaturze pokojowej przez 20 minut.</li>
	<li>Nie naruszając dolnej warstwy, ostrożnie zassać górną warstwę i przenieść ją do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Granulować komórki przez odwirowanie przy 300 x g przez 10 min. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w objętości 0,9% NaCl odpowiadającej początkowej objętości krwi.</li>
	<li>Warstwę 10 ml gęstego roztworu wirującego pod zawiesinę komórkową, zachowując granicę faz między dwiema fazami. Wirować przy 400 x g przez 30 minut bez hamulca. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Aby zlizować pozostałe czerwone krwinki, ponownie zawieś osad komórkowy w 10 ml zimnego 0,2% NaCl. Inkubować przez 30 sekund, a następnie natychmiast dodać 10 ml zimnego 1,6% NaCl, aby przywrócić izotoniczność.</li>
	<li>Osadzać komórki przez odwirowanie przy 300 x g przez 6 minut. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Powtarzaj kroki 4.6-4.7, aż osadek komórkowy wydaje się być wolny od czerwonych krwinek, zwykle 3 rundy lizy.</li>
	<li>Za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl zawiesić osad komórek, głównie PMN, w ciepłym (37 °C) RPMI- do stężenia 107 komórek/ml, oznaczonego przez zliczanie komórek za pomocą hemocytometru. Przechowywać ogniwa w temperaturze 37 °C do momentu użycia. Zazwyczaj żywotność i czystość PMN wynoszą >99%, co ocenia się odpowiednio za pomocą wykluczenia błękitu trypanowego i wizualizacji morfologii jądra po barwieniu.</li>
</ol>
5. Test migracji neutrofili przezuroepitelialnych
Wykonaj następujące kroki w kapturze do hodowli tkanek przy użyciu techniki aseptycznej. Używaj tylko przepuszczalnych podpór zawierających zlewające się warstwy komórek 5637, jak określono w kroku 2.7. Płytki 24-dołkowe zawierające RPMI- można przygotować wcześniej i przechowywać w temperaturze 37 °C z 5% CO2 do momentu użycia.
<ol>
	<li>Podwielokrotność 1 ml ciepłego RPMI- na studzienkę w 24-dołkowej płytce; przygotować 3 dołki na przepuszczalne podłoże.</li>
	<li>Zassać pożywkę z górnego i dolnego zbiornika przepuszczalnych podpór.</li>
	<li>Za pomocą sterylnych kleszczy przenieś przepuszczalne podpory na 24-dołkową płytkę przygotowaną w kroku 5.1. Umyj przepuszczalne podpory trzykrotnie, przenosząc podpory ze studni do studni.</li>
	<li>Jeśli ma być użyty inokulum bakteryjne, należy odwrócić przepuszczalne podpory w sterylnym naczyniu do hodowli tkankowych o głębokości 25 mm. Jeżeli ma być użyty chemoatraktant (np. N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLF) lub IL-8), należy przejść do kroku 5.6.</li>
	<li>W przypadku eksperymentów z żywymi lub zabitymi bodźcami bakteryjnymi, należy zaszczepić wierzchołkową stronę każdego przepuszczalnego podłoża 60 μl RPMI- (pozorowana infekcja) lub inokulum bakteryjnym (6 x 106 CFU) przygotowanym w kroku 3.5. Umieścić pokrywkę na naczyniu i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 1 godzinę.</li>
	<li>Dodać 0,6 ml RPMI- na studzienkę do 24-dołkowej płytki o niskim mocowaniu; przygotować 1 dołek na przepuszczalne podłoże. Przygotuj 3 studzienki zawierające 0,5 ml RPMI- w celu wyliczenia danych wejściowych PMN.
	<ol>
		<li>Jeśli zamiast bakterii stosuje się chemoatraktant, dodać chemoatraktant do 0,6 ml RPMI- w 24-dołkowej płytce przygotowanej w kroku 5.6.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść przepuszczalne podpory w 24-dołkowej płycie o niskim mocowaniu.</li>
	<li>Dodać 0,1 ml PMN (106 PMN), przygotowanego w kroku 4.9, do górnego zbiornika (strona podstawno-boczna) każdej przepuszczalnej podpory. Dodać 100 μl PMN bezpośrednio do studzienek zawierających 500 μl RPMI-. Inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 1 godzinę.</li>
	<li>Za pomocą sterylnych kleszczyków delikatnie zeskrob membranę przepuszczalnego podłoża o krawędź studzienki, aby usunąć dodatkowy PMN od strony wierzchołkowej, a następnie wyrzuć podporę.</li>
	<li>Zebrać PMN, delikatnie zeskrobując dno każdej studzienki za pomocą końcówki pipety o pojemności 1 000 μl, a następnie przenieść zawiesiny PMN do probówek do mikrofuge.</li>
	<li>Wylicz PMN za pomocą hemocytometru.</li>
	<li>Aby obliczyć całkowitą liczbę PMN w dolnym zbiorniku, pomnóż liczbę PMN w 1 mm2 (100 nl) przez 6 000. Dane mogą być raportowane jako procent wejściowego PMN lub jako liczby PMN znormalizowane do 106 wejściowych PMN.</li>
</ol>

<ol><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).</li>
<li>Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orientation+chamber+in+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Orientation chamber in chemotaxis.</a> Methods Enzymol. 162, 65-72 (1988).</li>
<li>Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+direct-viewing+chemotaxis+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">A new direct-viewing chemotaxis chamber.</a> J. Cell Sci. 99 (Pt. 4), 769-775 (1991).</li>
<li>Chin, A. C., Parkos, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathobiology+of+neutrophil+transepithelial+migration%3A+implications+in+mediating+epithelial+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Pathobiology of neutrophil transepithelial migration: implications in mediating epithelial injury.</a> Annu. Rev. Pathol. 2, 111-143 (2007).</li>
<li>Zemans, R. L., Colgan, S. P., Downey, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transepithelial+migration+of+neutrophils%3A+mechanisms+and+implications+for+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Cell+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Transepithelial migration of neutrophils: mechanisms and implications for acute lung injury.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 40, 519-535 (2009).</li>
<li>Loughman, J. A., Hunstad, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+human+neutrophil+migration+and+function+by+uropathogenic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">Attenuation of human neutrophil migration and function by uropathogenic bacteria.</a> Microbes Infect. 13, 555-565 (2011).</li>
<li>Lau, M. E., Loughman, J. A., Hunstad, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YbcL+of+uropathogenic+Escherichia+coli+suppresses+transepithelial+neutrophil+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">YbcL of uropathogenic Escherichia coli suppresses transepithelial neutrophil migration.</a> Infect. Immun. 80, 4123-4132 (2012).</li>
<li>Loughman, J. A., Hunstad, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+indoleamine+2%2C3-dioxygenase+by+uropathogenic+bacteria+attenuates+innate+responses+to+epithelial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Induction of indoleamine 2,3-dioxygenase by uropathogenic bacteria attenuates innate responses to epithelial infection.</a> J. Infect. Dis. 205, 1830-1839 (2012).</li>
<li>Foxman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epidemiology+of+urinary+tract+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Urol%22%5BJournal%5D)">The epidemiology of urinary tract infection.</a> Nat. Rev. Urol. 7, 653-660 (1038).</li>
<li>Haraoka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+recruitment+and+resistance+to+urinary+tract+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Neutrophil recruitment and resistance to urinary tract infection.</a> J. Infect. Dis. 180, 1220-1229 (1999).</li>
<li>Billips, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+host+innate+immune+response+in+the+bladder+by+uropathogenic+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Modulation of host innate immune response in the bladder by uropathogenic Escherichia coli.</a> Infect. Immun. 75, 5353-5360 (2007).</li>
<li>Bozeman, P. M., Learn, D. B., Thomas, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+of+the+human+leukocyte+enzymes+myeloperoxidase+and+eosinophil+peroxidase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Assay of the human leukocyte enzymes myeloperoxidase and eosinophil peroxidase.</a> J. Immunol. Methods. 126, 125-133 (1990).</li>
<li>Lee, W. Y., Chin, A. C., Voss, S., Parkos, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+neutrophil+transepithelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro neutrophil transepithelial migration.</a> Methods Mol. Biol. 341, 205-215 (2006).</li>
<li>Säve, S., Mohlin, C., Vumma, R., Persson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+adenosine+A2A+receptors+inhibits+neutrophil+transuroepithelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Activation of adenosine A2A receptors inhibits neutrophil transuroepithelial migration.</a> Infect. Immun. 79, 3431-3437 (2011).</li>
<li>Agace, W. W., Patarroyo, M., Svensson, M., Carlemalm, E., Svanborg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+induces+transuroepithelial+neutrophil+migration+by+an+intercellular+adhesion+molecule-1-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli induces transuroepithelial neutrophil migration by an intercellular adhesion molecule-1-dependent mechanism.</a> Infect. Immun. 63, 4054-4062 (1995).</li>
<li>Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+model+of+urinary+tract+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A murine model of urinary tract infection.</a> Nat. Protoc. 4, 1230-1243 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Korzystając z hodowli linii komórek nabłonka pęcherza moczowego i świeżo wyizolowanego ludzkiego PMN, stworzyliśmy model migracji międzynabłonkowych neutrofili in vitro . Model ten odegrał zasadniczą rolę w rozpoczęciu analizy złożoności wrodzonej odpowiedzi immunologicznej podczas infekcji dróg moczowych (ZUM), niezwykle powszechnej infekcji bakteryjnej zwykle wywoływanej przez UPEC9. Podczas zakażenia pęcherza moczowego lub zapalenia pęcherza moczowego rekrutacja PMN do światła pęcherza moczowego je...

Ruch komórek w całym ciele, często na duże odległości, jest niezbędny do wzrostu i rozwoju, gojenia się ran i odpowiedzi immunologicznej. Migracja komórek jest złożona i wymaga koordynacji wielu różnych procesów, w tym kaskad sygnalizacyjnych i przegrupowania składników cytoszkieletu. Komórki mogą poruszać się losowo (chemokineza), a także w kierunku zdefiniowanych gradientów chemicznych (chemotaksja). Opracowano wiele technik badania migracji komórek in vitro. Najstarsza i najbardziej powszechna technika, komora Boydena, składa się z pionowego systemu dwukomorowego, w którym substancja chemoatraktantowa jest umieszczana w dolnej komorze, a komórki będące przedmiotem zainteresowania są umieszczane w górnej komorze1. Monitorowany jest ruch komórek w poprzek filtra przepuszczalnego, z porami o określonej wielkości, oddzielającymi dwie komory. Opracowano dodatkowe techniki badania migracji komórek, w tym komorę Zigmonda2 i komorę Dunna3. Te zbiorowe podejścia dostarczyły istotnych informacji na temat ruchu wielu różnych typów komórek.
Oprócz badania podstawowych zasad chemokinezy i chemotaksji, testy dwukomorowe ułatwiły badanie migracji komórek przez składniki macierzy zewnątrzkomórkowej oraz warstwy komórek śródbłonka i nabłonka. Przewagą systemów dwukomorowych nad innymi technikami jest to, że porowata błona może być pokryta białkami, takimi jak kolagen lub fibrynogen, a także można ocenić migrację komórek przez barierę przypominającą macierz zewnątrzkomórkową. Dodatkowo hodowane linie komórkowe mogą być hodowane i różnicowane na przepuszczalnych podporach. Aby zbadać ruch komórek przez barierę śródbłonka, hodowane komórki śródbłonka są wysiewane i hodowane w górnym zbiorniku przepuszczalnych podpór. Komórki ruchome, takie jak komórki odpornościowe, są dodawane do górnego zbiornika i obserwuje się migrację do dolnego zbiornika przez barierę śródbłonkową w fizjologicznym kierunku wierzchołkowym do podstawno-bocznego. Model ten okazał się nieoceniony w zrozumieniu wynaczynienia komórek odpornościowych z krwiobiegu. W przeciwieństwie do migracji przezśródbłonkowej, ruch komórek przez barierę nabłonkową zwykle odbywa się w kierunku podstawno-bocznym do wierzchołkowego. Aby modelować te zdarzenia in vitro, naukowcy wysiewają i hodują hodowane komórki nabłonkowe na spodniej stronie przepuszczalnych podpór. Komórki ruchome są dodawane do górnego zbiornika i monitorowana jest migracja przez barierę nabłonkową, reprezentującą kierunek podstawno-boczny do wierzchołkowego. Takie modele migracji przeznabłonkowej znacząco przyczyniły się do naszego zrozumienia reakcji zapalnych na powierzchniach błon śluzowych, szczególnie w płucach i jelitach4,5.
Natomiast transport komórek odpornościowych przez nabłonek dróg moczowych cieszy się znacznie mniejszym zainteresowaniem. Aby pogłębić naszą wiedzę na temat wrodzonych odpowiedzi immunologicznych w drogach moczowych podczas zakażenia uropatogenną Escherichia coli (UPEC), opracowaliśmy test in vitro, test migracji neutrofili przeznabłonkowych, który umożliwia badanie ruchu leukocytów wielojądrzastych (PMN; neutrofili) przez barierę nabłonkową pęcherza moczowego 6-8. Podobnie jak w przypadku innych dwukomorowych modeli migracji przeznabłonkowej, hodowane ludzkie komórki nabłonka pęcherza moczowego są hodowane na spodniej stronie przepuszczalnego podłoża i tworzą zlewające się warstwy nabłonka. Ludzkie neutrofile, wyizolowane z krwi żylnej, są umieszczane po podstawno-bocznej stronie warstwy nabłonka, a migracja przez nabłonek w fizjologicznie istotnym kierunku podstawno-bocznym do wierzchołkowego jest określana ilościowo w odpowiedzi na zakażenie różnymi szczepami E. coli lub obecność cząsteczek chemoatraktantu. Wiele badań koncentrowało się na ruchu neutrofili, zarówno chemokinezy, jak i chemotaksji, przy braku dodatkowych typów komórek. Test migracji neutrofili przeznabłonkowych jest korzystny, ponieważ uwzględnia złożone interakcje między komórkami nabłonka pęcherza moczowego a komórkami odpornościowymi podczas infekcji. Ten elastyczny model in vitro może potencjalnie umożliwić szczegółowe badanie odpowiedzi immunologicznych na powierzchniach nabłonka moczowego.

<table><tbody><tr><td>Wkłady Transwell (i.e.&nbsp; podpory przepuszczalne)</td><td>Corning</td><td>3472</td><td>6,5 mm, 3 &mu; m por, wkład z membrany poliestrowej</td></tr><tr><td>Probówki do pobierania krwi BD Vacutainer</td><td>Becton, Dickinson and Company (BD)</td><td>366480</td><td>16 mm x 100 mm x 10 ml zielone probówki z nakrętką zawierające heparynę sodową</td></tr><tr><td>BD Safety-Lok Zestaw do pobierania i infuzji krwi</td><td>Becton, Dickinson and Company (BD)</td><td>367281</td><td>21 G x 0,75 cala igła x 12 cali rurka</td></tr><tr><td>BD Vacutainer jednorazowego użytku, Uchwyt niesztaplowany</td><td>Becton, Dickinson and Company (BD)</td><td>364815</td><td></td></tr><tr><td>Dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4876</td><td>Z Leuconostoc mesenteroides</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS roztwór do wirowania o gęstości</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>Płytki o ultraniskim mocowaniu</td><td>Corning</td><td>3473</td><td>24-dołkowe, przezroczyste płaskie dno</td></tr><tr><td>N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3506</td><td>Rozpuszczony w DMSO do 10 mM</td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki CXCL8/IL-8</td><td>R& Systemy D</td><td>208-IL</td><td>Rozpuszczony w PBS do 100 &mu; g/ml</td></tr></tbody></table>

ilościowa ocena migracji neutrofili człowieka przez nabłonek pęcherza moczowego z hodowlą

Quantitative Assessment of Human Neutrophil Migration Across a Cultured Bladder Epithelium

Rekrutacja komórek odpornościowych z peryferii do miejsca zapalenia jest niezbędnym krokiem w wrodzonej odpowiedzi immunologicznej na każdej powierzchni błony śluzowej. Podczas infekcji pęcherza moczowego leukocyty wielojądrzaste (PMN; neutrofile) migrują z krwiobiegu i przechodzą przez nabłonek pęcherza moczowego. Niepowodzenie w ustąpieniu infekcji przy braku odpowiedzi neutrofilowej świadczy o znaczeniu PMN w obronie pęcherza moczowego. Aby ułatwić kolonizację nabłonka pęcherza moczowego, uropatogenna Escherichia coli (UPEC), czynnik wywołujący większość infekcji dróg moczowych (ZUM), tłumi ostrą reakcję zapalną za pomocą różnych częściowo zdefiniowanych mechanizmów. Aby dokładniej zbadać wzajemne oddziaływanie między gospodarzem a patogenem bakteryjnym, opracowaliśmy model in vitro tego aspektu wrodzonej odpowiedzi immunologicznej na UPEC. W transuroepitelialnym teście migracji neutrofili, odmianie komory Boydena, hodowane komórki nabłonka pęcherza moczowego są hodowane do zbiegu na spodniej stronie przepuszczalnego podłoża. PMN są izolowane z ludzkiej krwi żylnej i są nakładane na podstawno-boczną stronę warstw komórek nabłonka pęcherza moczowego. Migrację PMN reprezentującą fizjologicznie istotny kierunek podstawno-boczny do wierzchołkowego w odpowiedzi na infekcję bakteryjną lub cząsteczki chemoatraktantu oblicza się za pomocą hemocytometru. Model ten może być wykorzystany do zbadania interakcji między UPEC a komórkami eukariotycznymi, a także do zbadania wymagań molekularnych dotyczących przechodzenia nabłonka pęcherza moczowego przez PMN. Model migracji neutrofili przez-nabłonkowych pozwoli nam lepiej zrozumieć początkową reakcję zapalną na UPEC w pęcherzu moczowym.

Test transurotelialnej migracji neutrofili umożliwia ilościową ocenę migracji ludzkich PMN przez hodowlane warstwy komórek nabłonka pęcherza moczowego w odpowiedzi na różne bodźce (Rycina 1B). Choć protokół jest prosty, istnieje szereg zmiennych, które mogą wpływać na migrację PMN, a w konsekwencji na powtarzalność tego testu. Podczas przygotowania wkładów przepuszczalnych oraz PMN należy podjąć odpowiednie środki w celu zmniejszenia zmienności między powtórzeniami technicznymi i biologicznymi. Na przykł...

Opracowaliśmy model in vitro, który naśladuje ważny składnik ostrej reakcji zapalnej podczas infekcji pęcherza moczowego uropatogennym Escherichia coli. Test migracji neutrofili przezuroepitelialnych umożliwia ilościową ocenę migracji neutrofili u ludzi przez nabłonek pęcherza moczowego, hodowanych na przepuszczalnych podporach, w odpowiedzi na infekcję bakteryjną lub substancje chemoatraktantowe.

Ilościowa ocena migracji neutrofili człowieka przez nabłonek pęcherza moczowego z hodowlą

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. ...

Ogólnym celem tej procedury jest ilościowe określenie poziomu migracji neutrofili przez barierę nabłonkową pęcherza moczowego podczas infekcji bakteryjnej lub w odpowiedzi na cząsteczki chemoatrakcyjne. Osiąga się to najpierw poprzez hodowlę komórek nabłonka pęcherza moczowego do uzyskania konfluencji na podłożach przepuszczalnych. W drugim kroku komórki nabłonka pęcherza moczowego infekuje się różnymi bakteriami lub wprowadza cząsteczki chemoatrakcyjne do dolnego zbiornika podłoży przepuszczalnych.Następnie neutrofile są izolowane z krwi żylnej i nanoszone do górnego zbiornika podpór przepuszczalnych. Ostatnim krokiem jest policzenie liczby neutrofili w dolnym zbiorniku po jednej godzinie przy użyciu hemocytometru. W rezultacie test transurotelialnej migracji neutrofili jest wykorzystywany do oceny różnic w migracji neutrofili wywołanej przez różne bodźce.Choć metoda ta może dostarczyć informacji na temat aspektów wrodzonej odpowiedzi immunologicznej podczas zakażenia układu moczowego, można ją również wykorzystać do badania innych chorób, w tym infekcji bakteryjnych występujących na innych powierzchniach błon śluzowych. Procedurę tę należy przeprowadzić w komorze z laminarnym przepływem powietrza, stosując technikę aseptyczną oraz sterylną pęsetę. Odwróć wkładki przepuszczalne w sterylnym naczyniu hodowlanym o głębokości 25 mm.Aby uzyskać optymalne wyniki, należy użyć komórek nabłonka pęcherza moczowego 5 6 3 7, które przeszły mniej niż 10 pasaży trypsynizacyjnych. Zgodnie z treścią tekstu, należy wykorzystać kolbę o powierzchni 75 cm² z komórkami 5 6 3 7 przy 95% konfluencji. Używając pipety 1000 µL, należy delikatnie resuspenderć komórki w około 2 mL pożywki RPMI plus do stężenia 3 milionów komórek/mL określonego na podstawie zliczenia komórek.Używając hemocytometru, nanieś 50 µL zawiesiny komórkowej na każde przepuszczalne podłoże, unikając dotykania membrany. Nałóż pokrywkę na szalkę i ostrożnie umieść szalkę w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 na nie więcej niż 16 godzin. Użyj sterylnej pęsety.Umieść wkładki przepuszczalne w płytce 24-dołkowej zawierającej 0,6 ml pożywki RPMI plus na dołek. Do górnego zbiornika każdej wkładki przepuszczalnej dodaj 0,1 ml pożywki RPMI plus przed inkubacją płytki w temperaturze 37 °C przy 5% CO2. Wymieniaj pożywkę co dwa dni, odsysając ją najpierw z górnego, a następnie z dolnego zbiornika.Następnie nanieś świeże pożywkę RPMI plus w odwrotnej kolejności, dodając 0,6 milliliters do dolnego zbiornika, a następnie 0,1 milliliters do górnego zbiornika. Siedem dni po wysianiu komórek 5 6 3 7 na przepuszczalne podłoża, oceń konfluencję komórek, napełniając górny zbiornik 0,35 milliliters pożywki RPMI.Komórki osiągają wystarczającą konfluencję, gdy pożywka nie wyrównuje się między górnym a dolnym zbiornikiem. Przygotować inokulum bakteryjne i pobrać krew od dorosłych ochotników zgodnie z opisem w protokole tekstowym, pracując w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Za pomocą pipety 10 ml ostrożnie przenieść krew do nowej, sterylnej probówki stożkowej o pojemności 50 ml.Dodać równą ilość 3% dekstranu w 0,9% NaCl. Inkubować probówkę w pozycji pionowej w temperaturze pokojowej przez 20 minut, nie naruszając dolnej warstwy. Ostrożnie odessać górną warstwę i przenieść ją do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.Odwirować komórki przy 300 ×g przez 10 minut, a następnie odlać nadsącz. Osad komórkowy zawiesić w objętości 0,9% chlorku sodu równoważnej początkowej objętości krwi. Następnie pod zawiesinę komórkową nalać 10 ml roztworu do wirowania gradientowego.Zachowując granicę między obiema fazami, wiruj przez 30 minut przy 400 ×g bez hamowania przed odlaniem nadsączu w celu usunięcia pozostałych czerwonych krwinek. Przesuś i zawieś osad komórkowy w 10 ml zimnego 0,2% NaCl; po inkubacji przez 30 sekund niezwłocznie dodaj 10 ml zimnego, 1,6% NaCl w celu przywrócenia izotoniczności. Osadź komórki poprzez wirowanie przy 300 ×g przez sześć minut i odlej nadsącz. Powtarzaj te kroki, aż osad komórkowy będzie wydawał się wolny od czerwonych krwinek.Zazwyczaj wykonuje się trzy rundy lizy przy użyciu pipety 1000 µL. Osad komórkowy, składający się głównie z leukocytów polimorfojądrowych (PMN), resuspenduje się w ciepłym medium RPMI minus do stężenia 10 milionów komórek na ml, wyznaczonego poprzez zliczenie komórek przy użyciu komory countingowej. Komórki należy przechowywać w temperaturze 37 °C do momentu użycia.Zazwyczaj żywotność i czystość pm n przekraczają 99%, co oceniano odpowiednio za pomocą wykluczania błękitu trypanu oraz wizualizacji morfologii jądra po barwieniu. Do testu migracji należy używać wyłącznie przepuszczalnych podłoży z konfluentnymi warstwami komórek 5 6 3 7.Do każdego dołka wlej 1 mL ciepłego medium RPMI minus. Przygotowując trzy dołki na każdy support przepuszczalny w płytce 24-dołkowej, odessaj medium z górnych i dolnych zbiorników supportów przepuszczalnych za pomocą sterylnej pęsety. Przenieś supporty przepuszczalne do płytki 24-dołkowej i wypłucz je trzykrotnie, przenosząc supporty z dołka do dołka.Jeśli planowane jest użycie inokulum bakteryjnego, należy odwrócić podpory przepuszczalne w sterylnym naczyniu hodowlanym do tkanek o głębokości 25 mm. W przypadku eksperymentów z żywymi lub zabitymi bodźcami bakteryjnymi, stronę apikalną każdej podpory przepuszczalnej należy zaszczepić 60 µL medium RPMI (w przypadku pozorowanej infekcji) lub przygotowanym inokulum bakteryjnym. Naczynie należy przykryć pokrywką i inkubować w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez jedną godzinę.Następnie do płytki 24-dołkowej o niskim stopniu adhezji dodaje się 0,6 mililitrów pożywki RPMI minus do każdego dołka. Przygotowuje się jeden dołek na każdy support przepuszczalny. Przygotowuje się trzy dołki zawierające 0,5 mililitrów pożywki RPMI minus w celu zliczenia wprowadzonej liczby PMN.Alternatywnie, jeśli zamiast bakterii stosowany jest chemoatraktant, należy dodać chemoatraktant do 0,6 milliliters RPMI minus w przygotowanej płytce 24-dołkowej. Następnym krokiem w obu eksperymentach jest umieszczenie wkładek przepuszczalnych w 24-dołkowej płytce o niskim przywieraniu. Następnie do górnego zbiornika każdej wkładki przepuszczalnej należy dodać 0,1 milliliters przygotowanych PMN.Dodaj 0,1 ml PMN bezpośrednio do dołków zawierających 0,5 ml RPMI minus i inkubuj w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 przez jedną godzinę. Używając pipety 1000 µl, wypłucz dolną stronę membrany wspornika przepuszczalnego medium z dolnego zbiornika; za pomocą sterylnej pęsety delikatnie przetrzyj membranę o krawędź dołka.Aby usunąć nadmiar PMN ze strony apikalnej, należy zebrać PMN, delikatnie zeskrobując dno każdego dołka końcówką pipety 1000 µL, a następnie przenieść zawiesiny PMN do probówek do mikrocentryfugi. Liczbę PMN należy określić za pomocą hemocytometru, aby obliczyć całkowitą liczbę PMN w dolnym zbiorniku.Liczbę PMN w jednym milimetrze kwadratowym pomnożyć przez 6 000. Dane można przedstawić jako procent PMN wejściowych lub jako liczbę PMN znormalizowaną do 10 do szóstej potęgi. Ścisłe przestrzeganie protokołu przedstawionego w tym filmie podczas wprowadzania PMN umożliwia zliczenie migracji PMN w odpowiedzi na bodźce, w tym bakterie i substancje chemoatraktanty, w tym zakażenie niepatogennym szczepem e coli MG 1655.Zabite wysoką temperaturą szczepy MG 1655 lub mutant PEC wywołują znacznie silniejszą migrację PMN niż infekcja pozorowana lub infekcja szczepem pec typu dzikiego UTI 89, izolatem zapalenia pęcherza moczowego. Dodanie chemoatraktantów, FMLF lub IL-8 do dolnego zbiornika skutkuje znacznie większą migracją PMN niż w przypadku traktowania pozorowanego. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat oceny migracji neutrofili przez barierę nabłonkową w odpowiedzi na bodźce chemotaktyczne.

quantitative-assessment-human-neutrophil-migration-across-cultured

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ilościowa ocena migracji ludzkich neutrofili przez uprawiane nabłonek pęcherza moczowego

Opisujemy protokół mikroskopii intravitalnej w świetle jasnym do pomiaru dynamicznych oddziaływań między neutrofilami a komórkami śródbłonka podczas rekrutacji neutrofili w odpowiedzi na źródło chemoatraktanta dla neutrofili in vivo. Pełzanie neutrofili wewnątrz naczyniowych, migracja transendotelialna oraz chemotaksja w tkance mięśnia kroczo ścięgnistego myszy są wizualizowane za pomocą fotografii wideo z odstępami czasu i śledzone przy użyciu programu ImageJ.

Śledzenie pełzania wewnątrznaczyniowego, migracji transendotelialnej i chemotaksji neutrofili w tkankach za pomocą intravitalnej wideomikroskopii

Niniejszy artykuł opisuje najpierw procedurę izolacji ludzkich komórek śródbłonka z żył pępkowych, a następnie pokazuje, jak wykorzystać te komórki do badania transmigracji neutrofili w warunkach przepływu. Dzięki zastosowaniu komory przepływowej o małej objętości, wykonanej z polimeru o właściwościach optycznych szkła, możliwe jest również obrazowanie fluorescencyjne żywych komórek rzadkich populacji komórkowych.

Izolacja ludzkich komórek śródbłonka żyły pępkowej oraz ich zastosowanie w badaniu transmigracji neutrofili w warunkach przepływu

Przyleganie neutrofili do aktywowanego śródbłonka w miejscach infekcji jest integralnym składnikiem odpowiedzi zapalnej gospodarza. W niniejszym raporcie opisano test wiązania neutrofili, który pozwala na ilościowe określenie in vitro pierwotnego wiązania ludzkich neutrofili z komórkami śródbłonka aktywowanymi przez mediatory stanu zapalnego w warunkach statycznych.

Ilościowy test in vitro do pomiaru adhezji neutrofili do aktywowanych pierwotnych ludzkich komórek śródbłonka mikronaczyniowego w warunkach statycznych

Prezentujemy test migracji komórek ex vivo, który pozwala na precyzyjne określenie potencjału migracji komórek grzebienia nerwowego jelit w obecności różnych czynników wzrostu.

Ilościowy test migracji komórek dla mysich jelitowych progenitorów nerwowych

Migracja trans-nabłonkowa neutrofili w odpowiedzi na infekcję bakteryjną błony śluzowej przyczynia się do uszkodzenia nabłonka i choroby klinicznej. Opracowano model in vitro, który łączy patogen, ludzkie neutrofile i spolaryzowane warstwy ludzkich komórek nabłonkowych hodowanych na filtrach transwell, aby ułatwić badania nad rozwikłaniem mechanizmów molekularnych kierujących tym zjawiskiem.

Metody in vitro Test kokultury w celu oceny migracji transnabłonkowej neutrofili indukowanej patogenem

Ten protokół szczegółowo opisuje test przeznaczony do pomiaru chemotaksji ludzkich neutrofili z jednej kropli krwi pełnej z solidną powtarzalnością. Takie podejście pozwala obejść potrzebę separacji neutrofili i wymaga tylko kilku minut czasu na przygotowanie testu. Chip mikroprzepływowy umożliwia wielokrotny pomiar chemotaksji neutrofili w czasie u niemowląt lub małych ssaków, gdzie objętość próbki jest ograniczona.

Platforma mikroprzepływowa do pomiaru chemotaksji neutrofili z nieprzetworzonej krwi pełnej

Leukocyty przenikają przez monowarstwę śródbłonka drogą parakomórkową lub transkomórkową. Opracowaliśmy prosty test do śledzenia rozkładu endogennej złączowej VE-kadheryny i PECAM-1 podczas transśródbłonkowej migracji leukocytów pod przepływem fizjologicznym, aby rozróżnić dwie drogi transmigracji.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym połączeń komórka-komórka śródbłonka podczas transmigracji neutrofili pod wpływem przepływu fizjologicznego

Ten artykuł przedstawia szczegółową metodę przeprowadzania szybkiego testu chemotaksji neutrofili poprzez integrację wbudowanej izolacji neutrofili z krwi pełnej oraz testu chemotaksji na pojedynczym chipie mikroprzepływowym.

Kompleksowa metoda do szybkiej analizy chemotaksji neutrofili bezpośrednio z kropli krwi

Protokoły ilościowej oceny chemotaksji i migracji limfocytów są ważnymi narzędziami do badań immunologicznych. Opisano w nim protokół in vitro, który umożliwia multipleksowaną ocenę migracji komórek w czasie rzeczywistym, a także komplementarną technikę in vivo umożliwiającą śledzenie komórek natywnych do śledziony.

Kwantyfikacja chemotaksji ludzkich monocytów in vitro i handlu mysimi limfocytami in vivo

Tutaj prezentujemy trzy metody oceny migracji i infiltracji neutrofili zarówno in vivo, jak i in vitro. Metody te mogą być wykorzystane do odkrycia obiecujących terapii ukierunkowanych na migrację neutrofili.

Wykrywanie migracji i infiltracji neutrofili u myszy

Ten protokół generuje mikromatryce biocząstek, które zapewniają przestrzennie kontrolowane rojenie neutrofili. Zapewnia łatwy dostęp do mediatorów, które uwalniają neutrofile podczas migracji i pozwala na ilościową analizę obrazową.

Mikromacierze biocząstek do chemotaktycznej i molekularnej analizy roju ludzkich neutrofili in vitro

Poznaj metodę ilościowej oceny migracji neutrofili przez nabłonek pęcherza moczowego w odpowiedzi na zakażenie bakteryjne. Technika ta pozwala badać mechanizmy odpowiedzi immunologicznej in vitro.

Ilościowa ocena migracji neutrofili człowieka przez nabłonek pęcherza moczowego z hodowlą

Przeglądaj więcej filmów