Analiza ilościowa i charakterystyka zmian miażdżycowych w mysiej zatoce aortalnej

Ogólnym celem tej procedury jest scharakteryzowanie i ilościowe określenie zmian miażdżycowych w zatoce aortalnej zawału serca. Osiąga się to poprzez najpierw wypreparowanie pobranego serca w celu oddzielenia części wierzchołkowej i zlokalizowania zatoki aortalnej. Następnie przygotowuje się bloki parafinowe z przetworzonej wierzchołkowej części serca.

Następnie zatoka aorty jest dzielona i montowana na szkiełkach. Na koniec skrawki tkanek są barwione. Ostatecznie dzięki analizie histochemicznej i immunohistochemicznej można uzyskać wyniki, które pokazują różne rozmiary i skład zmian miażdżycowych.

Procedurę zademonstruje Daniel Venga penal, doktorant z mojego laboratorium. Rada Etyki Badań nad Zwierzętami Uniwersytetu McMaster wstępnie zatwierdziła wszystkie procedury opisane w niniejszym dokumencie po znieczuleniu myszy podwójnie ujemnej LDLR i ekstrakcji krwi, eutanazji i utrwaleniu jej przed izolacją serca zgodnie z protokołem tekstowym, użyj skalpela, aby wykonać poprzeczne cięcie na sercu prostopadłe do aorty wstępującej. Umieść wierzchołkową lub górną część serca w kasecie do zatapiania i zanurz ją w Forminie.

Następnie umieść kasetę w procesorze tkanek i przetwarzaj przez noc. Korzystając z programu opisanego w protokole tekstowym dla form histologicznych, topi wosk parafinowy przez noc w temperaturze 62 stopni Celsjusza. Umieść każdą tkankę procesową w głębokiej formie histologicznej, upewniając się, że interfejs serca dotyka podstawy formy, a następnie wlej stopiony wosk parafinowy, aby całkowicie wypełnić formę.

Użyj oznaczonej plastikowej kasety, aby przykryć formę. Po schłodzeniu foremek na lodzie lub zimnej powierzchni oddziel blok od formy, aby przeciąć aortę. Umieść blok w uchwycie na próbkę mikrotomu tak, aby można go było przeciąć od wewnątrz w kierunku górnej części serca.

Dostosuj mikrotom do 10 mikronów i podziel serce. Zbierz skrawki na szklanym szkiełku i zbadaj pod mikroskopem świetlnym, aby określić pozycję i orientację. Zatoka powinna wyglądać jak trzy dwudzielne podstawy zastawki z dołączonymi ulotkami.

Gdy jedna lub dwie zastawki zatoki aortalnej staną się widoczne, w razie potrzeby wyreguluj kąt bloku. Po osiągnięciu zaworów wyreguluj mikrotom, aby przyciąć go od czterech do pięciu mikronów. Montaż pierwszych 10 sekcji każda na górze poszczególnych szkiełek szklanych, a następnie montaż każdej kolejnej grupy 10 sekcji w następnej pozycji.

Na slajdach. Kontynuuj pobieranie skrawków, aż nie zaobserwuje się zmiany miażdżycowej. Aby zabarwić skrawki hematyną i eoiną w celu uwidocznienia zmian, umieść szkiełka w suszarce na osiem minut.

Następnie zmiel sekcje, używając ksylenu, aby umyć je cztery razy po trzy minuty każda. Umyj szkiełka w 100% etanolu trzy razy po trzy minuty każde. Następnie 70% etanolu i 50% etanolu.

Trzy razy po trzy minuty każdy. Użyj wody destylowanej do wypłukania szkiełek, a następnie zanurz je w środku. Ma hematynę przez 15 minut.

Mycie i bieganie. Kranić wodą przez pięć minut. Następnie myj i destyluj wodę przez pięć minut po zanurzeniu w eoinie Y na jedną do pięciu minut.

Umyj i destyluj wodę trzy razy przez pięć minut każdy. 50% etanolu dwa razy po dwie minuty. Następnie 70% etanol trzy razy przez dwie minuty przy każdym myciu i 100% etanol.

Trzy razy po dwie minuty każdy. Następnie umyj i ksylen cztery razy po dwie minuty. Użyj medium montażowego na bazie ksylenu, aby zamontować sekcje i uchwycić obrazy pod mikroskopem świetlnym.

Użyj oprogramowania do obrazowania, aby zidentyfikować i określić ilościowo zmiany, które można określić w określonych odległościach od zatoki aortalnej w odstępach od 40 do 50 mikronów, w zależności od grubości odcinków, zapoznaj się z protokołem tekstowym dotyczącym barwienia immunohistochemicznego i immunofluorescencyjnego. Pięciotygodniowy LDLR. Myszy z dodatnim wynikiem były karmione standardową dietą lub dietą wysokotłuszczową przez 10 tygodni, zanim ich serca zostały naprawione, odizolowane i podzielone na sekcje, jak pokazano tutaj.

Kiedy myszy są karmione standardową dietą, rozwój miażdżycy jest bardzo ograniczony i może nie być wykrywalny po 15 tygodniach z ośmiu. Dieta wysokotłuszczowa znacznie przyspiesza miażdżycę w tym modelu i indukuje powstawanie dużych zaawansowanych zmian zawierających przewlekłe bezkomórkowe rdzenie i włókniste czapeczki. Zmiany miażdżycowe można dodatkowo scharakteryzować poprzez barwienie na obecność określonych typów komórek i czynników określających etapy rozwoju zmiany.

Naciekanie monocytów do błony wewnętrznej stanowi jedno z najwcześniejszych wydarzeń miażdżycy błony wewnętrznej. Monocyty różnicują się w makrofagi, które pochłaniają resztki komórkowe i lipidy. Nabrzmiałe lipidami makrofagi, znane jako komórki piankowe, tworzą widoczną tutaj smugę tłuszczową w ścianie tętnicy.

Komórki piankowate makrofagów można wykryć na wszystkich etapach rozwoju zmiany poprzez barwienie przeciwciałami przeciwko specyficznym markerom makrofagów, takim jak F cztery, 80 i MAC trzy. Komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych lub v SMC są ograniczone do warstwy przyśrodkowej zdrowej tętnicy. VSC są indukowane do migracji i namnażania się w błonie wewnętrznej podczas rozwoju zaawansowanej zmiany.

Jak widać w tym panelu, V SMC można zidentyfikować poprzez barwienie przeciwciałem przeciwko alfa aktynie po jego opracowaniu. Technika ta umożliwiła naukowcom zajmującym się chorobami sercowo-naczyniowymi zbadanie rozwoju i progresji zmian miażdżycowych w pręcikach.