Name: Analiza ilościowa i charakterystyka zmian miażdżycowych w mysiej zatoce aortalnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-07T22:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 43 s
Description: Poznaj metody ilościowej analizy zmian miażdżycowych w zatoce aortalnej myszy. Techniki histochemiczne i immunohistochemiczne pozwalają szczegółowo określić wielkość i skład zmian, wspierając badania nad chorobami układu krążenia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało sfinansowane z grantu operacyjnego z Kanadyjskich Instytutów Nauk o Zdrowiu i Kanadyjskiego Towarzystwa Diabetologicznego. DEV jest wspierany przez stypendium Comisión Nacional de Investigación Científica y Tecnológica (CONICYT, Chile).

Komisja Etyki Badań nad Zwierzętami Uniwersytetu McMaster wstępnie zatwierdziła wszystkie procedury opisane w niniejszym dokumencie.
1. Zbieranie serca i aorty
<ol>
	<li>Znieczul mysz i ostrożnie otwórz jamę klatki piersiowej, aby odsłonić serce i proksymalną aortę.
	<ol>
		<li>Pobrać krew z myszy przez bezpośrednie nakłucie prawej komory serca. 
		Uwaga: Krew może być przechowywana i wykorzystywana do analizy lipidów w osoczu i innych czynników przenoszonych przez krew.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Poddaj mysz eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy.</li>
	<li>Przepłukać naczynia krwionośne 5 ml soli fizjologicznej. 
	Uwaga: Osiąga się to poprzez perfuzję grawitacyjną przez nakłucie igły do lewej komory. Aby umożliwić drenaż, wykonuje się małe nacięcie w prawym przedsionku. Po przepłukaniu układu krwionośnego można pobrać próbki tkanek wątroby, mięśni i tkanki tłuszczowej, zamrozić je w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 ºC do przyszłej analizy.</li>
	<li>Układ krwionośny jest utrwalany przez perfuzję grawitacyjną do lewej komory za pomocą 10% neutralnej buforowanej formaliny. 
	Uwaga: Po rozpoczęciu perfuzji przepływ 10% neutralnej buforowanej formaliny jest dostosowywany do powolnego kapania, tak aby proces trwał 1-2 minuty. Narządy i tkanki, które zostały utrwalone perfuzją, mogą być wykorzystywane do badania ekspresji białek poprzez immunofluorescencję lub histochemię, ale generalnie nie mogą być używane jako próbki do western blottingu lub do badania ekspresji genów.</li>
	<li>Ostrożnie wyjmij serce i około 2 mm proksymalnej aorty z tuszy. Inne tkanki, w tym aortę zstępującą, mogą być pobierane i przechowywane do późniejszej analizy. 
	Uwaga: Aorta zstępująca (do rozwidlenia biodrowego) może być również wykorzystana do badania miażdżycy.</li>
	<li>Wykonaj poprzeczne cięcie skalpelem na usuniętym sercu w sposób prostopadły do aorty wstępującej. 
	Uwaga: Jest to ułatwione dzięki użyciu mikroskopu preparacyjnego i można to skutecznie zrobić, przecinając wzdłuż linii prostej łączącej dolne końcówki prawego i lewego przedsionka (ryc. 1).</li>
	<li>Przechowuj wierzchołkową (górną) część serca w kasecie do zatapiania i zanurz ją w neutralnej buforowanej formalinie w celu przetworzenia.</li>
</ol>
2. Przygotowanie aorty
<ol>
	<li>Umieść kasetę z wypreparowaną tkanką w procesorze tkankowym.</li>
	<li>Przetwarzanie próbek tkanek. 
	Uwaga: Ogólnie rzecz biorąc, procesory tkanek są zaprogramowane do pracy w nocy ze względu na długość operacji i rozwiązania zaangażowane w ten proces. Próbki są przetwarzane zgodnie z ustalonym protokołem:
	<ol>
		<li>10% neutralna buforowana formalina przez 1 godzinę w temperaturze 42 ºC.</li>
		<li>10% neutralna buforowana formalina przez 1 godzinę w temperaturze 42 ºC.</li>
		<li>70% etanolu przez 30 min w temperaturze 40 ºC.</li>
		<li>85% etanolu przez 30 min w temperaturze 40 ºC.</li>
		<li>100% etanol przez 45 min w temperaturze 40 ºC.</li>
		<li>100% etanol przez 45 min w temperaturze 40 ºC.</li>
		<li>100% etanol przez 45 min w temperaturze 40 ºC.</li>
		<li>Ksylen przez 1 godzinę w temperaturze 40 ºC.</li>
		<li>Ksylen przez 1 godzinę w temperaturze 40 ºC.</li>
		<li>Ksylen przez 1 godzinę w temperaturze 40 ºC.</li>
		<li>Wosk parafinowy przez 45 min w temperaturze 63 ºC.</li>
		<li>Wosk parafinowy przez 45 min w temperaturze 63 ºC.</li>
		<li>Wosk parafinowy przez 45 min w temperaturze 63 ºC.</li>
		<li>Wosk parafinowy przez 45 min w temperaturze 63 ºC.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozpuść wosk parafinowy przez noc w temperaturze 62 ºC (rysunki 1D-E). Oszacuj całkowitą ilość wosku parafinowego, która ma być użyta, na podstawie gramów wosku parafinowego potrzebnego do wypełnienia formy histologicznej i liczby bloków, które należy przygotować. 
	Uwaga: Głęboka forma histologiczna jest preferowana w stosunku do płytkiej formy, ponieważ zapewnia szerszy potencjalny kąt obrotu podczas cięcia. Pojedyncza głęboka pleśń histologiczna wymaga 11 g wosku parafinowego.</li>
	<li>Umieść każdą przetworzoną tkankę w głębokiej formie histologicznej, a następnie wlej stopiony wosk parafinowy, aby całkowicie wypełnić formę (ryc. 1F). Przykryj formę opisaną plastikową kasetą (Rysunek 1G).</li>
	<li>Schłodzić wypełnioną formę na lodzie lub na zimnej powierzchni (Rysunek 1H), aby utworzyć solidny blok i oddzielić blok od formy (Rysunki 1I-J). 
	Uwaga: Umieszczając wypreparowane serce w formie, upewnij się, że wewnętrzna powierzchnia serca dotyka podstawy formy, a następnie przystąp do wypełniania bloku stopioną parafiną. Oznakowana plastikowa kaseta zakrywa formę przed jej zestaleniem, aby zapewnić podstawę do obsługi bloku. Po schłodzeniu forma jest usuwana, a bloki parafiny można przechowywać w nieskończoność w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
3. Przekrój aorty
<ol>
	<li>Umieść blok z sercem w uchwycie na próbkę mikrotomu tak, aby można go było przeciąć od wewnątrz w kierunku górnej części serca (ryc. 2)</li>
	<li>Wyreguluj mikrotom, aby wyciąć przekrój o grubości 10 μm i przystąp do cięcia serca.</li>
	<li>Zbierz skrawki na szklanym szkiełku i zbadaj pod mikroskopem świetlnym, aby określić pozycję i orientację.</li>
	<li>Gdy 1 lub 2 zastawki zatoki aortalnej staną się widoczne, w razie potrzeby wyreguluj kąt bloku (ryc. 3A). 
	Uwaga: Zatoka powinna wyglądać jak trzy dwudzielne podstawy zastawki z dołączonymi ulotkami. Jeśli zaobserwuje się tylko jedną lub dwie płytki zaworu, należy odpowiednio dostosować kąt cięcia.</li>
	<li>Wyreguluj mikrotom do cięcia z prędkością 4-5 μm i zbierz skrawki na szkiełkach z powlekanego szkła. 
	Uwaga: Chociaż procedura może być zróżnicowana, zaleca się systematyczne podejście, w którym pierwsze 10 odcinków, od zatoki aorty biegnącej w górę aorty wstępującej, jest zbieranych na górną część oznakowanych szkiełek (szkiełka oznaczone 1-10). Kolejne skrawki zbiera się według tego samego schematu: #11-20, #21-30, #31-40 do momentu, gdy zmiany miażdżycowe przestają być obserwowane (ryc. 3B). W ten sposób można zbadać i scharakteryzować zmiany miażdżycowe w precyzyjnych lokalizacjach wzdłuż aorty wstępującej. Na przykład slajd 1 zawiera sekcje 1, 11, 21, 31, 41 i 51, reprezentujące zmiany miażdżycowe od zatoki aortalnej w górę aorty wstępującej. Jeśli zmiana jest duża, można dołączyć dodatkowe szkiełka, oznaczone jako 11-20, aby zebrać więcej dystalnych odcinków według tego samego wzoru.</li>
	<li>Kontynuuj pobieranie skrawków, aż nie zaobserwuje się zmian miażdżycowych. 
	Uwaga: Preparaty można przechowywać w temperaturze pokojowej przez wiele miesięcy, przed dalszą analizą.</li>
</ol>
4. Barwienie i kwantyfikacja zmian miażdżycowych
Zmiany miażdżycowe mogą być analizowane na wiele różnych sposobów przy użyciu różnych technik. Najbardziej podstawowa analiza polega na określeniu pola przekroju poprzecznego zmiany. Aby dokładnie porównać obszar zmiany chorobowej, ważne jest, aby punkt wyjścia do pomiaru zmiany był spójny dla każdej próbki. Jest to ułatwione dzięki zastosowaniu ulotek zaworów do orientacji. Aby ułatwić dokładną identyfikację i kwantyfikację obszaru zmiany, wybrane przekroje poprzeczne są barwione hematoksyliną i eozyną. Polega to na zanurzeniu szkiełek w serii roztworów na określony czas, które będą deparafinizować/zabarwić tkankę.
Protokół barwienia hematoksyliny i eozyny:
<ol>
	<li>Włóż szkiełka do osuszacza powietrza na 8 minut, a następnie odparafinowaj sekcje, myjąc 4× w ksylenie, przez 3 minuty na pranie.</li>
	<li>Myj szkiełka w 100% etanolu 3× przez 3 minuty każda.</li>
	<li>Myć 3× w 70% etanolu przez 3 minuty każdy, a następnie 2× w 50% etanolu przez 3 minuty każde.</li>
	<li>Spłucz wodą destylowaną, a następnie zanurz w Hematoksylinie Mayera na 15 minut.</li>
	<li>Myć pod bieżącą wodą z kranu przez 5 minut, a następnie myć w wodzie destylowanej przez 5 minut.</li>
	<li>Zanurzyć w Eozynie Y na 1-5 minut.</li>
	<li>Myć w wodzie destylowanej po 3× przez 5 min, myć w 50% etanolu 2× przez 2 min, a następnie 70% etanolu 3× przez 2 min każde.</li>
	<li>Prać w 100% etanolu 3× przez 2 minuty każdy, a następnie prać w ksylenie 4× przez 2 minuty każde.</li>
	<li>Zamontuj sekcje za pomocą medium montażowego na bazie ksylenu i uchwyć obrazy za pomocą kamery cyfrowej zamontowanej na mikroskopie świetlnym.</li>
	<li>Zidentyfikuj i określ ilościowo obszar zmiany za pomocą oprogramowania do obrazowania. 
	Uwaga: Obszar zmiany można określić w określonych odległościach od zatoki aortalnej w odstępach 40-50 μm (w zależności od grubości każdego odcinka). Wykres tych pomiarów powierzchni w funkcji odległości daje profil zmiany miażdżycowej (ryc. 4). Obszar pod krzywą reprezentuje oszacowanie całkowitej objętości zmiany miażdżycowej. Dodatkowa charakterystyka zmiany może obejmować określenie obszaru martwiczego. Martwiczy rdzeń (nc) zaawansowanej zmiany jest tworzony przez apoptotyczne komórki piankowe. Przy odrobinie praktyki można to ustalić, badając bezkomórkowe regiony skrawków barwionych hematoksyliną i eozyną (ryc. 4A). Wczesne zmiany mają zwykle bardzo małą martwicę, podczas gdy bardziej zaawansowane zmiany mają zwiększone obszary martwicze, które mogą przyczyniać się do niestabilności płytki nazębnej. Odcinki szeregowe tej samej aorty należy zbadać, aby potwierdzić obecność martwiczego obszaru.</li>
</ol>
5. Dalsza charakterystyka zmiany miażdżycowej
Szczegółowe informacje dotyczące etapu rozwoju miażdżycy można określić poprzez barwienie przeciwciałami skierowanymi przeciwko określonym typom komórek lub markerom. Immunohistochemia skrawków parafiny jest standardową techniką stosowaną do identyfikacji określonych typów komórek lub markerów w kontekście otaczającej niebarwionej tkanki. Wykrywanie antygenu jest zwykle osiągane przy użyciu substratu peroksydazy chrzanowej.
Barwienie immunofluorescencyjne wymaga użycia przeciwciał sprzężonych z fluoroforem i wymaga mikroskopu fluorescencyjnego oraz odpowiednich filtrów do wykrywania. Technika ta pozwala na jednoczesne barwienie dwóch (lub więcej) antygenów.
Ogólny protokół barwienia immunohistochemicznego:
<ol>
	<li>Umieść szkiełka w suszarce na 8 minut.</li>
	<li>Deparafinizuj sekcje w 4 zmianach ksylenu, 3 min każda.</li>
	<li>Prać w 100% etanolu 3× przez 3 minuty każdy, aby usunąć ksylen.</li>
	<li>Myć 3× w 70% etanolu przez 3 minuty każde, a następnie 2× w 50% etanolu przez 3 minuty każda.</li>
	<li>Myć w wodzie destylowanej po 5 minut, a następnie myć po 3× w PBS przez 5 minut każda.</li>
	<li>Wykonaj pobieranie antygenu. Można to osiągnąć za pomocą metody odzyskiwania epitopów indukowanych ciepłem (HIER) w szybkowarze mikrofalowym i roztworze do odzyskiwania antygenu (10 mM bufor cytrynianowy, pH 6,0). 
	Uwaga: Proces utrwalania formaliny może maskować interesujące nas antygeny. Z naszego doświadczenia wynika, że HIER znacznie poprawia działanie niektórych przeciwciał, ale nie jest wymagany w przypadku innych. Ponadto istnieją inne dostępne alternatywy dla metody pobierania antygenu HIER.</li>
	<li>Gdy szybkowar ostygnie, umieść szkiełka w PBS na 15 minut.</li>
	<li>Skrawki inkubować w normalnej surowicy (tego samego gatunku, od którego pochodziło przeciwciało drugorzędowe) przez 30 minut. NIE MYĆ SZKIEŁEK - ODCEDZIĆ SUROWICĘ.</li>
	<li>Inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym rozcieńczonym w normalnej surowicy blokującej przez 2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Myć PBS 3× przez 5 minut każdy.</li>
	<li>Inkubować skrawki z biotynylowanym przeciwciałem drugorzędowym, które rozcieńczono w PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Inkubować szkiełka z peroksydazą chrzanową streptawidyną przez 30 minut, a następnie przemywać PBS 3× przez 5 minut każda.</li>
	<li>Reakcja chromogenna - inkubacja szkiełek w świeżym DAB (3,3'-diaminobenzydyna) przez 5-30 min. Reakcję tę należy monitorować pod mikroskopem. Zatrzymaj reakcję, myjąc szkiełka w wodzie z kranu.</li>
	<li>Przeciwbarwić hematoksyną przez 1 min. Myć wodą z kranu przez 5 min, a następnie myć w wodzie destylowanej 3× przez 5 min każde.</li>
	<li>Powtórz kroki 4.7-4.9 dla montażu prowadnic.</li>
</ol>
6. Ogólny protokół barwienia immunofluorescencyjnego
Podobny protokół, z niewielkimi zmianami, może być stosowany do barwienia immunofluorescencyjnego.
<ol>
	<li>Umieść szkiełka w osuszaczu na 8 minut, a następnie odparafinowaj sekcje w 4 przemianach ksylenu po 3 minuty każda.</li>
	<li>Prać w 100% etanolu 3× przez 3 minuty każdy, aby usunąć ksylen.</li>
	<li>Myć 3× w 70% etanolu przez 3 minuty każde, a następnie 2× w 50% etanolu przez 3 minuty każda.</li>
	<li>Myć w wodzie destylowanej przez 5 minut, a następnie prać w PBS 3× przez 5 minut każda.</li>
	<li>Wykonaj pobieranie antygenu. Można to osiągnąć za pomocą metody odzyskiwania epitopów indukowanych ciepłem (HIER) w szybkowarze mikrofalowym i roztworze do odzyskiwania antygenu (10 mM bufor cytrynianowy, pH 6,0). 
	Uwaga: Proces utrwalania formaliny może maskować interesujące nas antygeny. Z naszego doświadczenia wynika, że HIER znacznie poprawia działanie niektórych przeciwciał, ale nie jest wymagany w przypadku innych. Ponadto istnieją inne dostępne alternatywy dla metody pobierania antygenu HIER.</li>
	<li>Gdy szybkowar ostygnie, umieść szkiełka w PBS na 15 minut.</li>
	<li>Skrawki inkubować w normalnej surowicy (tego samego gatunku, od którego pochodziło przeciwciało drugorzędowe) przez 30 minut. NIE MYĆ SZKIEŁEK - ODCEDZIĆ SUROWICĘ.</li>
	<li>Inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym rozcieńczonym w normalnej surowicy blokującej przez 2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Myć PBS 3× przez 5 minut każdy.</li>
	<li>Dodać drugorzędowe przeciwciało sprzężone z fluoroforem, które rozcieńcza się w normalnej surowicy blokującej (lub PBS). Inkubować przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Myć PBS 3× przez 5 minut każdy.</li>
	<li>Plama przeciwstawna z DAPI.</li>
	<li>Prać w PBS 3× przez 5 minut każda.</li>
	<li>Nałóż szkiełko nakrywkowe za pomocą środka montażowego zapobiegającego blaknięciu.</li>
</ol>

<ol><li>Zadelaar, S., Kleemann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+for+atherosclerosis+and+pharmaceutical+modifiers%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb.+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mouse models for atherosclerosis and pharmaceutical modifiers.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 27 (8), 1706-1721 (2007).</li>
<li>Daugherty, A., Rateri, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+experimental+designs+for+atherosclerosis+studies+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Development of experimental designs for atherosclerosis studies in mice.</a> Methods. 36, 129-138 (2005).</li>
<li>Getz, G. S., Reardon, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diet+and+murine+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb.+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Diet and murine atherosclerosis.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 26 (2), 242-249 (2006).</li>
<li>Zhang, S. H., Reddick, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+hypercholesterolemia+and+arterial+lesions+in+mice+lacking+apolipoprotein+E%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Spontaneous hypercholesterolemia and arterial lesions in mice lacking apolipoprotein E.</a> Science. 258 (5081), 468-471 (1992).</li>
<li>Ishibashi, S., Goldstein, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massive+xanthomatosis+and+atherosclerosis+in+cholesterol-fed+low+density+lipoprotein+receptor-negative+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Massive xanthomatosis and atherosclerosis in cholesterol-fed low density lipoprotein receptor-negative mice.</a> J. Clin. Invest. 93 (5), 1885-1893 (1994).</li>
<li>Kunjathoor, V. V., Wilson, D. L., LeBoeuf, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+atherosclerosis+in+streptozotocin-induced+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Increased atherosclerosis in streptozotocin-induced diabetic mice.</a> J. Clin. Invest. 97 (7), 1767-1773 (1996).</li>
<li>Hartvigsen, K., Binder, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+diet-induced+hypercholesterolemic+murine+model+to+study+atherogenesis+without+obesity+and+metabolic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb.+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">A diet-induced hypercholesterolemic murine model to study atherogenesis without obesity and metabolic syndrome.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 27 (4), 878-885 (2007).</li>
<li>King, V. L., Hatch, N. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+model+of+obesity+with+accelerated+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Obesity%22%5BJournal%5D)">A murine model of obesity with accelerated atherosclerosis.</a> Obesity. 18 (1), 35-41 (2004).</li>
<li>Taylor Weiss, D. &, R, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deoxycorticosterone+acetate+salt+hypertension+in+apolipoprotein+E-%2F-+mice+results+in+accelerated+atherosclerosis%3A+the+role+of+angiotensin+II%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Deoxycorticosterone acetate salt hypertension in apolipoprotein E-/- mice results in accelerated atherosclerosis: the role of angiotensin II.</a> Hypertension. 51 (2), 218-224 (2008).</li>
<li>Gairola, C. G., Drawdy, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sidestream+cigarette+smoke+accelerates+atherogenesis+in+apolipoprotein+E-%2F-+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Sidestream cigarette smoke accelerates atherogenesis in apolipoprotein E-/- mice.</a> Atherosclerosis. 156 (1), 49-55 (2001).</li>
<li>Pynn, M., Schäfer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise+training+reduces+neointimal+growth+and+stabilizes+vascular+lesions+developing+after+injury+in+apolipoprotein+e-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Exercise training reduces neointimal growth and stabilizes vascular lesions developing after injury in apolipoprotein e-deficient mice.</a> Circulation. 109 (3), 386-392 (2004).</li>
<li>Nakashima, Y., Plump, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ApoE-deficient+mice+develop+lesions+of+all+phases+of+atherosclerosis+throughout+the+arterial+tree%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb%22%5BJournal%5D)">ApoE-deficient mice develop lesions of all phases of atherosclerosis throughout the arterial tree.</a> Arterioscler. Thromb. 14 (1), 133-140 (1994).</li>
<li>Reddick, R. L., Zhang, S. H., Maeda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atherosclerosis+in+mice+lacking+apo+E.+Evaluation+of+lesional+development+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb%22%5BJournal%5D)">Atherosclerosis in mice lacking apo E. Evaluation of lesional development and progression.</a> Arterioscler. Thromb. 14 (1), 141-147 (1994).</li>
<li>Tangirala, R. K., Rubin, E. M., Palinski, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+atherosclerosis+in+murine+models%3A+correlation+between+lesions+in+the+aortic+origin+and+in+the+entire+aorta%2C+and+differences+in+the+extent+of+lesions+between+sexes+in+LDL+receptor-deficient+and+apolipoprotein+E-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitation of atherosclerosis in murine models: correlation between lesions in the aortic origin and in the entire aorta, and differences in the extent of lesions between sexes in LDL receptor-deficient and apolipoprotein E-deficient mice.</a> J. Lipid Res. 36 (11), 2320-2328 (1995).</li>
<li>Paigen, B., Morrow, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+atherosclerotic+lesions+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of atherosclerotic lesions in mice.</a> Atherosclerosis. 68 (3), 231-240 (1987).</li>
<li>Baglione, J., Smith, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Assay+for+Mouse+Atherosclerosis+in+the+Aortic+Root%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Quantitative Assay for Mouse Atherosclerosis in the Aortic Root.</a> Methods in Molecular Medicine. 129, (2006).</li>
<li>Lee, T. Y., Muschal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiostatin+regulates+the+expression+of+antiangiogenic+and+proapoptotic+pathways+via+targeted+inhibition+of+mitochondrial+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Angiostatin regulates the expression of antiangiogenic and proapoptotic pathways via targeted inhibition of mitochondrial proteins.</a> Blood. 114 (9), 1987-1998 (2009).</li>
<li>Ballon, G., Chen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaposi+sarcoma+herpesvirus+%28KSHV%29+vFLIP+oncoprotein+induces+B+cell+transdifferentiation+and+tumorigenesis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Kaposi sarcoma herpesvirus (KSHV) vFLIP oncoprotein induces B cell transdifferentiation and tumorigenesis in mice.</a> J. Clin. Invest. 121 (3), 1141-1153 (2011).</li>
<li>Khallou-Laschet, J., Varthaman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+plasticity+in+experimental+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Macrophage plasticity in experimental atherosclerosis.</a> PLoS One. 5 (1), e8852(2010).</li>
<li>Rotzius, P., Thams, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+infiltration+of+neutrophils+in+lesion+shoulders+in+ApoE-%2F-+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Distinct infiltration of neutrophils in lesion shoulders in ApoE-/- mice.</a> Am. J. Pathol. 177 (1), 493-500 (2010).</li>
<li>Kanellakis, P., Agrotis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-mobility+group+box+protein+1+neutralization+reduces+development+of+diet-induced+atherosclerosis+in+apolipoprotein+e-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb.+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">High-mobility group box protein 1 neutralization reduces development of diet-induced atherosclerosis in apolipoprotein e-deficient mice.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 31 (2), 313-319 (2011).</li>
<li>Schwartz, C. J., Mitchell, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observations+on+localization+of+arterial+plaques%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Observations on localization of arterial plaques.</a> Circ. Res. 11, 63-73 (1962).</li>
<li>Won, D., Zhu, S. N., Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relative+reduction+of+endothelial+nitric-oxide+synthase+expression+and+transcription+in+atherosclerosis-prone+regions+of+the+mouse+aorta+and+in+an+in+vitro+model+of+disturbed+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Relative reduction of endothelial nitric-oxide synthase expression and transcription in atherosclerosis-prone regions of the mouse aorta and in an in vitro model of disturbed flow.</a> Am. J. Pathol. 171 (5), 1691-1704 (2007).</li>
<li>Rosenfeld, M. E., Polinsky, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+atherosclerotic+lesions+in+the+innominate+artery+of+the+ApoE+knockout+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb.+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Advanced atherosclerotic lesions in the innominate artery of the ApoE knockout mouse.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 20 (12), 2587-2592 (2000).</li>
<li>McAteer, M. A., Schneider, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+and+3Dreconstruction+of+atherosclerotic+plaque+components+in+apolipoprotein+E+knockout+mice+using+ex+vivo+high-resolution+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb.+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantification and 3Dreconstruction of atherosclerotic plaque components in apolipoprotein E knockout mice using ex vivo high-resolution MRI.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 24 (12), 2384-2390 (2004).</li>
<li>Martinez, H. G., Prajapati, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Images+in+cardiovascular+medicine%3A+Microscopiccomputedtomography-based+virtual+histology+for+visualization+and+morphometry+of+atherosclerosis+in+diabetic+apolipoprotein+e+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Images in cardiovascular medicine: Microscopiccomputedtomography-based virtual histology for visualization and morphometry of atherosclerosis in diabetic apolipoprotein e mutant mice.</a> Circulation. 120 (9), 821-822 (2009).</li>
<li>Kirkby, N. S., Low, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+3-dimensional+imaging+of+murine+neointimal+and+atherosclerotic+lesions+by+optical+projection+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantitative 3-dimensional imaging of murine neointimal and atherosclerotic lesions by optical projection tomography.</a> PLoS One. 6 (2), e16906(2011).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Miażdżyca jest złożoną, przewlekłą chorobą dużych tętnic mięśniowych, która jest główną przyczyną zawału mięśnia sercowego i udaru mózgu. Postęp choroby obejmuje wzajemne oddziaływanie wielu różnych typów komórek w ścianie tętnicy, z krążącymi krwinkami, cząsteczkami lipoprotein i innymi czynnikami przenoszonymi przez krew, które dopiero zaczynamy rozumieć. Znaczna część naszej obecnej wiedzy na temat rozwoju i progresji miażdżycy pochodzi z badań przeprowadzonych w specjalnie zaprojektowanych systemach modeli myszy poda...

W ciągu ostatnich dwóch dekad rozwój i wykorzystanie modeli myszy podatnych na miażdżycę poprzez dietetyczne i/lub genetyczne manipulacje znacznie zwiększyły nasze zrozumienie molekularnych i komórkowych mechanizmów związanych z rozwojem zmian miażdżycowych1-3. Duża część naszej wiedzy i zrozumienia miażdżycy pochodzi z badań przeprowadzonych na apolipoproteinie (Apo)-E deficient4 myszy, u których zmiany miażdżycowe rozwijają się spontanicznie i z niedoborem receptora lipoprotein o niskiej gęstości (LDLR)5 myszy, u których miażdżyca jest wywołana dietą. Ważną zaletą tych modeli jest to, że pozwalają one na badanie stosunkowo dużej liczby genetycznie zdefiniowanych zwierząt w kontrolowanych warunkach żywieniowych i środowiskowych. Ponadto zaawansowane zmiany miażdżycowe, które rozwijają się w niektórych z tych szczepów myszy, wydają się być bardzo podobne do tych obserwowanych u ludzi, zawierających wypełnione lipidami nekrotyczne rdzenie i włókniste czapeczki. Miażdżyca rozwija się szybko w tych modelach mysich, co sprawia, że bardzo możliwe jest badanie rozwoju zmian, od smug tłuszczowych do zaawansowanej płytki nazębnej, w ciągu kilku tygodni. Ponadto wykazano, że znane czynniki ryzyka chorób sercowo-naczyniowych u ludzi, w tym cukrzyca6, dyslipidemia7, otyłość8, nadciśnienie 9, dym papierosowy10 i siedzący tryb życia11, dodatkowo przyspieszają rozwój zmian.
W większości, jeśli nie we wszystkich modelach myszy podatnych na miażdżycę, rozwój zmian można najpierw wykryć w zatoce aortalnej. Czas wystąpienia zależy od szczepu myszy i diety. W miarę powiększania się zmian mają tendencję do wyrastania z aorty wstępującej. U myszy ApoE-/- i LDLR-/- późniejszy rozwój zmian można wykryć w rozwidleniach aorty w łuku aorty, w aorcie zstępującej i w innych większych tętnicach12-14. Dr Beverly Paigen i współpracownicy, oprócz opracowania jednych z najwcześniejszych modeli miażdżycy wywołanej dietą, ustanowili również test do ilościowego oznaczania zmian miażdżycowych w zatoce aortalnej, który stał się standardem pomiaru zmian w modelach mysich15. Z biegiem lat technika ta została udoskonalona i szczegółowo opisana16. Poniżej przedstawiamy zmodyfikowaną wersję "metody Paigena" do kwantyfikacji i charakterystyki zmian miażdżycowych u myszy. Analiza szeregowych przekrojów poprzecznych aorty z określonego obszaru naczyniowego oraz w określonej i ustalonej orientacji ułatwia precyzyjne gromadzenie danych i pozwala na dokładne wykrycie zmian w rozwoju zmian w różnych grupach leczenia. Przedstawione tutaj metody opierają się na poprzednich technikach. W szczególności opisujemy, w jaki sposób możliwa jest charakterystyka zmiany pod względem obszaru, objętości, martwicy i zawartości komórkowej poprzez badanie odcinków seryjnych przy użyciu kombinacji histochemii i immunohistochemii.

<table><tbody><tr><td>Myszy z niedoborem LDLR&nbsp;( D2.129S7(B6)-Ldlrtm1Her/J)</td><td>Zapas Jackson Laboratory</td><td>#002207</td><td></td></tr><tr><td>Formalina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT5011</td><td></td></tr><tr><td>Formy histologiczne</td><td>Ted Pella Inc</td><td>27195</td><td></td></tr><tr><td>Paramat parafinowy</td><td></td><td>19286-10</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka powlekane</td><td>Fisher</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Pojemniki na rozpuszczalniki</td><td>Tissue Tek II</td><td>4457</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom</td><td>Leica</td><td>RM22S5</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel wodna</td><td>VWR</td><td>80086-982</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>BX41TF</td><td></td></tr><tr><td>Aparat</td><td>Olympus</td><td>DP72</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>www.rsbweb.nih.gov/ij/</td><td></td></tr> <tr><td>Procesor</td><td>Sakura Finetek</td><td>VIP6-A1</td><td></td></tr><tr><td>Kasety do przetwarzania</td><td>VWR</td><td>18000-134</td><td></td></tr><tr><td>Preassure Cooker</td><td>Nordic Ware</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe</td><td>Fisher</td><td>12-545-M</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>Ostrze mikrotomu</td><td>Thermo Scientific</td><td>30-518-35</td><td></td></tr><tr><td>Mocowanie przeciwblaknięcia średnie</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-4680</td><td></td></tr><tr><td>Mocowanie ksylenu Średnie&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44581</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże montażowe Aquous</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1161</td><td></td></tr><tr><td>Mac-3 anbody</td><td>BD Pharmingen</td><td>553322</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Przeciwciało Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>F4/80</td><td>Abcam</td><td>Ab6640</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało alfa aktyny</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-32251</td><td></td></tr><tr><td>Mayer&rsquo; s Hematoxylin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4382</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MHS16</td><td></td></tr><tr><td>DAB (3,3'-Diaminobenzydyna)</td><td>Dako</td><td>K3468</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza ilościowa i charakterystyka zmian miażdżycowych w mysiej zatoce aortalnej

Quantitative Analysis and Characterization of Atherosclerotic Lesions in the Murine Aortic Sinus

Miażdżyca jest chorobą dużych tętnic i główną przyczyną zawału mięśnia sercowego i udaru mózgu. Opracowano kilka różnych modeli mysich, aby ułatwić badanie molekularnej i komórkowej patofizjologii tej choroby. W niniejszym manuskrypcie opisano konkretne techniki kwantyfikacji i charakterystyki zmian miażdżycowych w mysiej zatoce aortalnej i aorcie wstępującej. Zaletą tej procedury jest to, że zapewnia dokładny pomiar pola przekroju poprzecznego i całkowitej objętości zmiany, co można wykorzystać do porównania progresji miażdżycy w różnych grupach leczenia. Jest to możliwe dzięki zastosowaniu ulotek zaworów jako anatomicznego punktu orientacyjnego, wraz ze staranną regulacją kąta przekroju. Opisujemy również podstawowe metody barwienia, które można zastosować, aby rozpocząć charakterystykę progresji miażdżycy. Mogą one być dalej modyfikowane w celu zbadania antygenów o szczególnym znaczeniu dla badacza. Opisane techniki mają ogólne zastosowanie do szerokiej gamy istniejących i nowo powstałych dietetycznych i genetycznie indukowanych modeli miażdżycy.

Pięciotygodniowe myszy LDLR-/- karmiono standardową dietą lub dietą wysokotłuszczową przez dziesięć tygodni. Myszy uśmiercono i poddano perfuzji formaliną zgodnie z powyższym opisem. Przygotowano przekroje poprzeczne zatoki aorty i zabarwiono je hematoksyliną i eozyną w celu określenia powierzchni i objętości zmian (Rysunek 4). W przypadku podawania myszom standardowej karmy, rozwój miażdżycy jest bardzo ograniczony i może być niewykrywalny w 15. tygodniu życia. Dieta wysokotłuszczowa znacząco przyspies...

Opisujemy procedury ilościowego określania i charakteryzowania zmian miażdżycowych w modelach mysich, wykorzystując precyzyjne przekroje zatoki aortalnej aorty i aorty wstępującej w połączeniu z analizą histochemiczną i immunohistochemiczną.

Analiza ilościowa i charakterystyka zmian miażdżycowych w mysiej zatoce aortalnej

Atherosclerosis is a disease of the large arteries and a major underlying cause of myocardial infarction and stroke. Several different mouse models have ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest charakterystyka i ilościowe określenie zmian miażdżycowych w zatoce aorty w modelu MI. Jest to realizowane poprzez wstępne rozcięcie wyekstrahowanego serca w celu oddzielenia części szczytowej i zlokalizowania zatoki aorty. Następnie, z przetworzonej części szczytowej serca, przygotowuje się bloki parafinowe.Następnie zatoka aorty zostaje przekrojona i przeniesiona na szkiełka przedmiotowe. Na koniec przeprowadza się barwienie przekrojów tkankowych. W rezultacie, dzięki analizie histochemicznej i immunohistochemicznej, można uzyskać wyniki ukazujące różne rozmiary i składy zmian miażdżycowych.Procedurę zademonstruje Daniel Venga penal, doktorant z mojego laboratorium. Komisja ds. Etyki Badań na Zwierzętach Uniwersytetu McMaster zatwierdziła wszystkie opisane tutaj procedury; po znieczuleniu myszy z podwójnym niedoborem LDLR i pobraniu krwi, należy przeprowadzić eutanazję i utrwalić zwierzę przed wyizolowaniem serca zgodnie z protokołem tekstowym. Za pomocą skalpela należy wykonać cięcie poprzeczne serca prostopadle do aorty wstępującej. Część szczytową lub górną serca należy umieścić w kasecie do zatapiania i zanurzyć w Formalinie.Następnie u

quantitative-analysis-characterization-atherosclerotic-lesions-murine

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Analiza ilościowa i charakterystyka zmian miażdżycowych w zatoce aortalnej mysich

Analiza ex vivo zmian w tętnicach z modeli zwierzęcych chorób sercowo-naczyniowych klasycznie opiera się na technikach histologicznych i immunohistochemicznych. Zapewniają one 2-wymiarowe pomiary w 3-wymiarowych zmianach. W artykule opisano generowanie zmian tętniczych do analizy ilościowej w 3 wymiarach z wykorzystaniem optycznej tomografii projekcyjnej.

Generowanie i 3-wymiarowa ocena ilościowa zmian w tętnicach u myszy za pomocą optycznej tomografii projekcyjnej

Ten film pokazuje dwa modele rozwoju blaszki miażdżycowej w tętnicach mysich i podkreśla różnice w przeroscie mięśniowo-brzuszkowym i miażdżycy.

Wywoływanie przerostu mięśniowo-wewnętrznego, a miażdżyca u myszy: wprowadzenie dwóch prawidłowych modeli

Ten artykuł opisuje szczegółową metodologię użycia nieprzepuszczającego promieni rentgenowskich kauczuku silikonowego na bazie ołowiu do perfuzji mysiego układu krwionośnego do ilościowego określenia średnicy aorty w mysim modelu tętniaka i rozwarstwienia aorty.

Ilościowa analiza aortapatii metodą mikro-CT w mysim modelu tętniaka i rozwarstwienia aorty wywołanego β-aminopropionitrylem

Opisujemy protokół indukowania miażdżycy w korzeniu aorty myszy ApoE-/- karmionych dietą aterogenną, poprzez ciągłe uwalnianie aldosteronu. Opisano również metody charakteryzowania składu płytki nazębnej.

Indukcja blaszek miażdżycowych poprzez aktywację receptorów mineralokortykoidowych u myszy z niedoborem apolipoproteiny E

Proponujemy ustandaryzowany protokół do scharakteryzowania składu komórkowego późnych zmian miażdżycowych u myszy, w tym systematyczne metody preparacji zwierząt, osadzania tkanek, cięcia, barwienia i analizy tętnic ramienno-głowowych od myszy śledzących linię komórek mięśni gładkich w atheroprone.

Analiza ilościowa składu komórkowego w zaawansowanych zmianach miażdżycowych myszy śledzących linię komórek mięśni gładkich

Mysie modele miażdżycy są użytecznymi narzędziami do badania szlaków patogennych na poziomie molekularnym, ale wymagają standaryzowanej kwantyfikacji rozwoju zmian. Protokół ten opisuje zoptymalizowaną metodę określania wielkości zmiany w głównych naczyniach tętniczych, w tym w korzeniu aorty, łuku aortalnym i tętnicy ramienno-głowowej.

Kwantyfikacja miażdżycy u myszy

Ten protokół krok po kroku przeprowadza procedurę analizy obciążenia miażdżycowego u myszy. Badacze mogą użyć tego protokołu do porównania obfitości, lokalizacji i wielkości zmian miażdżycowych u różnych zwierząt.

Obrazowanie i analiza zmian całej aorty barwionych czerwienią olejową O w mysim modelu hiperlipidemii tętniaka

Tutaj prezentujemy zoptymalizowane protokoły oczyszczania tkanek do obrazowania mysiej aorty w trzech wymiarach (3D). Opisujemy najnowocześniejsze procedury barwienia immunologicznego, oczyszczania optycznego i obrazowania z zamiarem określenia anatomicznej bliskości obwodowego układu nerwowego z blaszkami miażdżycowymi i przydanką w miażdżycy.

Trójwymiarowe obrazowanie tkanek aorty w miażdżycy

Ten protokół dostarcza kompleksową metodologię analizy ilościowej blaszek miażdżycowych, aby ułatwić bardziej dogłębne badania nad mechanizmami i postępem miażdżycy.

Izolacja i analiza zmian łuku aorty i korzeni w mysim modelu miażdżycowym

Postępy w spektrometrii mas umożliwiły wysokoprzepustową analizę ekspresji i modyfikacji białek w wielu tkankach. W połączeniu z frakcjonowaniem subkomórkowym i modelami chorób, ilościowa spektrometria mas oraz bioinformatyka mogą ujawnić nowe właściwości systemów biologicznych. Metoda opisana w niniejszym opracowaniu analizuje białka związane z chromatyną w kontekście chorób serca i jest łatwo stosowalna w innych modelach in vivo chorób ludzkich.

Ilościowa analiza proteomów chromatyny w chorobach

Poznaj metody ilościowej analizy zmian miażdżycowych w zatoce aortalnej myszy. Techniki histochemiczne i immunohistochemiczne pozwalają szczegółowo określić wielkość i skład zmian, wspierając badania nad chorobami układu krążenia.

Analiza ilościowa i charakterystyka zmian miażdżycowych w mysiej zatoce aortalnej

Przeglądaj więcej filmów