Tworzenie uporządkowanych struktur biomolekularnych przez samoorganizację krótkich peptydów

Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie zespołów na bazie peptydów w postaci biomolekularnych naszyjników. Osiąga się to poprzez uprzednie przygotowanie roztworów podstawowych poprzez rozpuszczenie difenyloalaniny i jej chronionego przez Bacha analogu oddzielnie w odpowiedniej ilości HFP do końcowego stężenia 100 miligramów na mililitr. Drugim krokiem jest zmieszanie roztworów podstawowych peptydów w stosunku pięć do trzech poprzez zmieszanie 10 mikrolitrów roztworu peptydu difenyloalaniny z sześcioma mikrolitrami chronionego roztworu peptydu difenyloalaniny.

Następnie zmieszany roztwór podstawowy peptydu dodaje się do świeżo przygotowanego 50% etanolu, aby uzyskać końcowe stężenie pięciu miligramów na mililitr difenyloalaniny i trzech miligramów na mililitr odpowiednio dla chronionej przez Bacha difenyloalaniny. Efektywnie, ostatecznie skaningowa mikroskopia elektronowa służy do pokazania biomolekularnych naszyjników złożonych przez dwa peptydy. Główną zaletą stosowania procesów samoorganizacji, takich jak ten pokazany tutaj, jest to, że poprzez spontaniczny postęp możliwe jest wytworzenie złożonej struktury.

In vitro reprezentują tutaj samoorganizację peptydu, a konkretnie koorganizację dipeptydów demonstrującą tę procedurę będzie nuran, doktorant byłego laboratorium. Aby rozpocząć procedurę samoorganizacji difenyloalaniny w struktury rurkowe, należy przygotować 100 miligramów na mililitr roztworu podstawowego peptydu, rozpuszczając peptyd difenyloalaniny w HFP. Aby zapewnić jednorodność roztworu, wymieszaj go mieszalnikiem wirowym przez kilka sekund i odstaw na kilka minut na ławkę, aż peptyd całkowicie się rozpuści, a roztwór będzie klarowny.

Rozcieńczyć roztwór podstawowy peptydu do końcowego stężenia dwóch miligramów na mililitr w wodzie potrójnie destylowanej. Roztwór należy przechowywać w temperaturze pokojowej przez 24 godziny. W celu procedury wspólnego montażu rozpuścił oddzielnie dwa miligramy peptydu difenyloalaniny i jeden miligram peptydu difenyloalaniny chronionego przez Bacha w HFP do stężenia 100 miligramów na mililitr.

Następnie mieszaj roztwory za pomocą miksera wirowego przez kilka sekund i odstaw je na ławkę na kilka minut, aż peptydy całkowicie się rozpuszczą, a roztwory będą klarowne. Zmieszać roztwory podstawowe peptydów w stosunku pięć do trzech, mieszając 10 mikrolitrów roztworu peptydu difenyloalaniny z sześcioma mikrolitrami chronionego roztworu peptydu difenyloalaniny. Następnie wymieszaj roztwór za pomocą miksera wirowego.

Następnie dodaj osiem mikrolitrów zmieszanego roztworu podstawowego peptydu do 92 mikrolitrów świeżo przygotowanego 50% etanolu, aby uzyskać końcowe stężenie pięciu miligramów na mililitr dla difenyloalaniny i trzech miligramów na mililitr. Dla Bacha chroniona difenyloalanina. Użyj pipety, aby delikatnie wymieszać roztwór.

Po 24 godzinach inkubacji w temperaturze pokojowej nanieść 10 mikrolitrów kropli roztworu peptydowego na szklane szkiełko nakrywkowe i pozostawić do wyschnięcia w temperaturze pokojowej. Pokryj próbkę na szklanym szkiełku nakrywkowym cienką warstwą złota za pomocą napylacza przez 90 sekund. Po zakończeniu zobrazuj zespoły za pomocą SEM działającego przy napięciu od 10 do 20 kilowoltów.

W celu analizy TEM umieść 10-mikrolitrową kroplę roztworu peptydu na miedzianej siatce o siatce 200 pokrytej węglem i ustabilizowanej nośnikiem z folii polimerowej. Po minucie usuń nadmiar płynu za pomocą bibuły filtracyjnej. Następnie przenieś 2% roztwór octanu pisuaru do strzykawki i przefiltruj go za pomocą jednostki filtrującej o temperaturze zerowej 22 mikrometrów.

Aby pozostać w próbce, umieść 10 mikrolitrów kropli roztworu octanu pisuaru na siatce. Po 30 sekundach usuń nadmiar płynu za pomocą bibuły filtracyjnej, zobrazuj próbkę na siatce za pomocą TEM działającego przy napięciu 120 kilowoltów. Do analizy FTIR nałóż 30 mikrolitrów kropli roztworu peptydu na okienko fluorku wapnia.

Pozostawić roztwór do wyschnięcia w temperaturze pokojowej, aby stłumić sygnał wody w widmie FTIR. Umieść kroplę tlenku deuteru na suchej próbce peptydu. Po wysuszeniu próbki w osuszaczu w próżni powtórz poprzednie kroki dwukrotnie, aby zapewnić maksymalną wymianę wodoru z deuterem.

Na koniec zarejestruj widma FTIR za pomocą detektora deuterowanego siarczanu triglicyny. Określ minimalne wartości transmitancji za pomocą oprogramowania dostarczonego z urządzeniem, aby zademonstrować tworzenie uporządkowanych struktur przez samoorganizację peptydów. Współskładanie dwóch prostych peptydów aromatycznych przygotowano i scharakteryzowano za pomocą analizy SEM i TEM.

Zmieszane peptydy utworzyły architekturę kulistych zespołów o średnicy kilku mikronów połączonych wydłużonymi strukturami o średnicy kilkuset nanometrów ze względu na duże podobieństwo morfologii do bicia ich strun. Struktury te nazywane są naszyjnikami molekularnymi. Analiza FM tych struktur wyraźnie pokazuje ich trójwymiarowy układ.

Ponadto analiza SEM różnych regionów różnych próbek wskazuje, że proces ten zachodził z dużą wydajnością. Analiza FTIR dostarcza informacji na temat drugorzędowej struktury zespołów peptydów. Widmo absorpcyjne amidu.

Jeden z pasm sferycznych zespołów utworzonych przez chroniony przez chroniony przez Bacha peptyd difenyloalaniny w etanolu wykazał pojedynczy pik amidowy na poziomie 1 657 odwrotnych centymetrów, co wskazuje na potwierdzenie helisy alfa. Struktury rurkowe utworzone przez peptyd difenyloalaniny w etanolu wykazały dwa charakterystyczne piki na 1,613 odwrotnych centymetrów i 1,682 odwrotnych centymetrów, które korelują ze strukturą drugorzędową arkusza beta. Widmo FTIR biomolekularnych naszyjników utworzonych przez współmontaż dwóch peptydów zostało odroczone od przypisania piku dla każdego pojedynczego peptydu.

Pierwszy pik na 1 653 odwrotnych centymetrach odpowiada strukturze helisy alfa, a drugi pik na 1 684 odwrotnych centymetrach odnosi się do potwierdzenia skrętu beta. Różnica między różnymi widmami wskazuje na unikalną strukturę naszyjników biomolekularnych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak generować montaż na bazie peptydów za pomocą peptydu barwnikowego.

Metodę tę można łatwo zastosować do innych biomolekuł w celu utworzenia złożonej struktury. Nie zapominaj, że chodzenie z rozpuszczalnikami organicznymi może być bardzo niebezpieczne. Rękawiczki. Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze nosić fartuch laboratoryjny i okulary ochronne.