Name: Trójwymiarowy model hodowli tkankowej do badania pierwotnego ludzkiego szpiku kostnego i jego nowotworów złośliwych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Poznaj trójwymiarowy system hodowli tkankowej do badania pierwotnych ludzkich komórek szpiku kostnego. Ta metoda umożliwia bezpośrednią wizualizację komórek oraz ich izolację do dalszych analiz.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana z grantów z National Institutes of Health, National Cancer Institute (1R21CA141039), BD Biosciences Research Grant Award, American Cancer Society Institutional Research Grant (IRG #58-006-53), dla Purdue University Center for Cancer Research, oraz Canadian Institutes of Health Research i Alberta Cancer Board Research Initiatives Program. M.P. był wspierany przez National Institutes of Health, National Cancer Institute, Program Stażowy w Profilaktyce Raka (R25CA128770; Kierownik projektu: D. Teegarden) zarządzany przez Centrum Nauk Onkologicznych i Centrum Badań nad Uczeniem się przez Odkrywcę na Uniwersytecie Purdue.

1. Przygotowanie z wyprzedzeniem
<ol>
	<li>Sterylne pipety serologiczne i końcówki do pipet należy przechowywać w temperaturze 4 °C. 
	Rozwiązywanie problemów: Matrigel żele w temperaturze pokojowej (RT); używanie zimnych pipet i końcówek zapobiegnie żelowaniu Matrigel podczas ustawiania hodowli.</li>
	<li>Rozmrozić butelkę Matrigel w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
</ol>
2. Przygotowanie odczynników
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworu podstawowego fibronektyny: Przygotować roztwór podstawowy fibronektyny o stężeniu 1 mg/ml, rozpuszczając 100 mg ludzkiej fibronektyny w 100 ml wody destylowanej. Po rozpuszczeniu fibronektyny przefiltrować jałowo i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 6 miesięcy. 
	Rozwiązywanie problemów: Jeśli fibronektyna nie rozpuści się szybko, inkubuj roztwór przez kilka minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Przygotowanie 10x PBS: W 1 l wody destylowanej rozpuścić 80 g chlorku sodu NaCl, 14,4 g Na2HPO4, 2 g KCl i 2,4 g KH2PO4 w 1 l wody destylowanej. Ustaw pH na 7,4, sterylny filtr i przechowuj w temperaturze 4 °C przez okres do 6 miesięcy.</li>
	<li>Przygotowanie buforu neutralizacyjnego20: Przygotować roztwór zawierający 100 mM HEPES w 2x buforowanym roztworem soli fizjologicznej (PBS) przy użyciu 1 M HEPES i 10 x PBS roztworów podstawowych. Doprowadzić pH roztworu do 7,0. Przechowywać w temperaturze 4 °C przez 2-3 miesiące.</li>
	<li>Przygotowanie roztworu 2 mg/ml kolagenu z ogona szczura typu I: Przygotować roztwór kolagenu I o stężeniu 2 mg/ml w buforze neutralizacyjnym (krok 2.3). Zmieszać roztwór z małą prędkością i delikatnie wymieszać, pipetując w górę iw dół. Ponieważ kolagen ten jest bardzo lepki, należy unikać tworzenia się pęcherzyków powietrza podczas pipetowania. Zaleca się, aby za każdym razem przygotowywać świeży roztwór kolagenu I. Roztwór należy przechowywać na lodzie do czasu użycia.</li>
	<li>Przygotowanie powłoki śródkostnej (rEnd): Wymieszać 1 mg/ml bulionu fibronektyny z 2 mg/ml kolagenu I (kroki 2.1 i 2.4) do końcowego stężenia odpowiednio 77 μg/ml i 29 μg/ml w 1x sterylnym PBS. Wymieszać i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.</li>
	<li>Opracowanie zrekonstruowanej macierzy kostnej (rBM):
	<ol>
		<li>Wstępnie schłodzić probówki mikrowirówkowe o pojemności 1,5 ml na lodzie. Utrzymuj wszystkie roztwory matrycy na lodzie przez cały czas.</li>
		<li>Wymieszać 4 części Matrigelu (stężenie Matrigelu różni się w zależności od partii, ale stwierdzono, że różnice są nieistotne), 2,5 części 1 mg/ml fibronektyny i 1 część 2 mg/ml kolagenu I na lodzie, najpierw pipetując Matrigel do probówki za pomocą zimnych końcówek pipet, a następnie dodając fibronektynę i kolagen I. Matrigel zacznie krzepnąć w temperaturach powyżej 4 °C, dlatego należy pracować szybko podczas pipetowania Matrigel. Matrycę należy mieszać bardzo delikatnie, pipetując w górę i w dół, unikając wprowadzania pęcherzyków. Trzymaj probówki na lodzie podczas mieszania rBM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie pożywki do pomiaru szpiku kostnego (BMGM): Przygotować 500 ml BMGM zawierającego 6,2 x 10-4 M CaCl2, 10-6 M bursztynianu sodu, 10-6 M hydrokortyzonu, 20% osocza ludzkiego (normalnego lub złośliwego pobranego od zdrowych dawców lub pacjentów) i 1% penicyliny/streptomycyny w RPMI-1640. CaCl2, bursztynian sodu i suplementy hydrokortyzonu mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C przez >6 miesięcy w postaci 1000 roztworów podstawowych. Podczas hodowli linii komórkowych płodową surowicę bydlęcą (FBS) można zastąpić ludzkim osoczem.</li>
	<li>Przygotowanie 10% neutralnej buforowanej formaliny (NBF): Dodać 37% roztworu podstawowego formaldehydu do 1x PBS przy 10% v/v. Dobrze wymieszać i przechowywać w temperaturze pokojowej przez 2-3 tygodnie w chronić przed światłem.</li>
	<li>Przygotowanie 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA): Zważyć odpowiednią ilość BSA i rozpuścić ją w 1x PBS. Przechowywać w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu 1 tygodnia. Roztwór BSA ma tendencję do zanieczyszczenia, jeśli jest przechowywany w lodówce przez dłuższy czas. Alternatywnie, roztwór BSA można podzielić na porcje i zamrozić w temperaturze -20 °C w celu długotrwałego przechowywania. Unikaj cykli zamrażania i rozmrażania.</li>
	<li>Przygotowanie roztworu do odzyskiwania komórek (CRS): Przygotować 5 mM EDTA, 1 mM roztworu wanadanu sodu (Na3VO4) i 1,5 mM roztworu fluorku sodu (NaF) w 1x PBS. Sterylny filtr i przechowywać w temperaturze 4 °C do 6 miesięcy.</li>
</ol>
3. Wbudowana hodowla 3D niezłośliwych i złośliwych ludzkich komórek BM
<ol>
	<li>Oczyść pierwotne komórki jednojądrzaste BM przez wirowanie gradientowe Ficoll-Plaque zgodnie z instrukcjami producenta. 
	Opcjonalny krok: komórki można znakować dioctanem karboksyfluoresceiny 0,25 μM, estrem sukcynimidylu (CFSE) zgodnie z instrukcjami producenta, aby śledzić proliferację komórek przez cały okres hodowli. 
	Rozwiązywanie problemów: Jeśli komórki umrą po barwieniu CFSE, należy miareczkować ilość CFSE, ponieważ stężenie zależy od typu komórki; 0,25 μM działa dobrze w przypadku pierwotnych komórek jednojądrzastych BM.</li>
	<li>Dodać 65 μl roztworu rEnd do każdego dołka na 48-dołkowej płytce poddanej działaniu kultur tkankowych. Rozprowadzić roztwór równomiernie, aby pokryć całą powierzchnię studzienki i inkubować przez >30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotować zawiesinę komórek o gęstości 0,5 x 106 komórek w 10 μl 1x PBS na dołek na płytkę 48-dołkową. W probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml wymieszać zawiesinę komórek ze 100 μl matrycy rBM na studzienkę. Wymieszaj komórki i matrycę rBM, delikatnie pipetując w górę iw dół; Unikaj wprowadzania bąbelków. Mieszaninę komórek/matryc należy przechowywać na lodzie, aby uniknąć zżelowania matrycy. 
	Uwaga: system rBM jest w pełni skalowalny; Aby skonfigurować system w formacie innym niż 48-dołkowy, dostosuj ilości wszystkich odczynników (matryc i pożywki) w oparciu o powierzchnię użytej płytki. Odpowiednio przeskaluj liczbę komórek, które mają zostać posiane.</li>
	<li>Odessać pozostały rEnd i dodać mieszaninę komórka/matryca do środka studzienki. Szybko rozprowadź mieszaninę komórek/matryc, aby równomiernie pokryć całą powierzchnię studzienki. Umieścić płytkę na 30-60 minut w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C, 5% CO2 , aby umożliwić zestalenie się matrycy. Nie potrząsać ani nie naruszać płytki podczas inkubacji. 
	Rozwiązywanie problemów: Aby zapobiec nierównomiernemu rozmieszczeniu komórek w rBM, dobrze wymieszaj przed posiewem. Wymieszaj po każdych 5dobrze posianych, aby uniknąć osiadania komórek na dnie probówki. Po platerowaniu komórki nie opadają na dno studzienki z powodu napięcia powierzchniowego w matrycy. 
	Rozwiązywanie problemów: Aby zapobiec nierównomiernemu rozmieszczeniu komórek w rBM, dobrze wymieszaj przed posiewem. Wymieszaj po każdych 5dobrze posianych, aby uniknąć osiadania komórek na dnie probówki. Po platerowaniu komórki nie opadają na dno studni z powodu napięcia powierzchniowego w matrycy.</li>
	<li>Podgrzej BMGM w łaźni wodnej ustawionej na 37 °C.</li>
	<li>Po 30 minutach sprawdź, czy matryca jest prawidłowo ustawiona; utworzy miękką warstwę przypominającą żel, która nie przesuwa się, gdy płytka jest przechylona. Na warstwę komórka/matryca nałożyć 1 ml ciepłego BMGM. Aby uniknąć rozerwania matrycy, należy bardzo delikatnie pipetować pożywkę (dozując kropla po kropli) za pomocą pipety serologicznej. Zmontowaną kulturę rBM umieścić w inkubatorze do hodowli tkankowych o temperaturze 37 °C, 5% CO2 i hodować przez żądany okres czasu. 
	Uwaga: żywotność komórek utrzymuje się przez co najmniej 30 dni bez zmiany pożywki; Jeśli wymagana jest wymiana podłoża, za każdym razem zmieniaj tylko 50% podłoża. 
	Krok krytyczny: Bardzo ważne jest, aby podłoże nie było zimne, ponieważ niska temperatura może zakłócić już ustawioną matrycę. Uważaj, aby nie spryskać pożywki na wierzch matrycy, ponieważ może to spowodować zerwanie miękkiej warstwy matrycy. 
	Rozwiązywanie problemów: Jeśli żywotność komórek w systemie rBM jest niska, może być konieczne eksperymentalne określenie gęstości komórek podczas pracy z komórkami innymi niż pierwotne komórki jednojądrzaste z aspiratów BM. Podczas pracy z liniami komórkowymi zmniejsz liczbę komórek 10-krotnie, ponieważ unieśmiertelnione linie komórkowe rozmnażają się szybciej niż komórki pierwotne.</li>
</ol>
4. Obrazowanie 'w matrycy'
<ol>
	<li>Mikroskopia świetlna
	<ol>
		<li>Obrazuj hodowane komórki bezpośrednio w rBM za pomocą jasnego pola, różnicowego kontrastu interferencyjnego (DIC), konfokalnego lub innych technik obrazowania, które umożliwiają obrazowanie na duże odległości, ponieważ matryca ma grubość około 1 mm. Użyj funkcji Z-stack dostępnej w wielu mikroskopach, aby zobrazować całą kulturę od góry do dołu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie immunofluorescencyjne 
	napiwek: W przypadku poniższego protokołu barwienia immunologicznego należy unikać zasysania roztworów barwiących/myjących, zamiast tego przechylić płytkę i usunąć roztwory za pomocą pipety.
	<ol>
		<li>Usunąć BMGM za pomocą pipety i przemyć 2-3 razy 100 μl/płukanie/studzienkę RT 1x PBS. Upewnij się, że użyto wystarczającej ilości PBS, aby pokryć całą powierzchnię studni.</li>
		<li>Utrwalić komórki w matrycy, dodając 100 μl/basenik (dla płytki 48-dołkowej) 10% NBF przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć NBF i dwukrotnie przemyć komórki 100 μl/płukanie/studzienkę RT 1x PBS. 
		nuta: Unikaj używania zimnego NBF, ponieważ może to spowodować upłynnienie matrycy.</li>
		<li>Usunąć PBS, dodać 1% BSA przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub w temperaturze 4 °C przez noc w celu zablokowania niespecyficznego wiązania przeciwciał.</li>
		<li>Przygotować pierwszorzędowy roztwór przeciwciał w 1% BSA w wymaganym rozcieńczeniu. Rozcieńczenie będzie się różnić dla każdego przeciwciała, skontaktuj się z producentem lub miareczkować, aby określić optymalne stężenie przeciwciał. Dodać 100 μl/basenik roztworu przeciwciała pierwszorzędowego i inkubować zgodnie z instrukcjami producenta. 
		Krok krytyczny: Wszystkie inkubacje z udziałem przeciwciał sprzężonych z fluoroforami lub barwnikami fluorescencyjnymi powinny być przeprowadzane w ciemności.</li>
		<li>Usunąć roztwór przeciwciała pierwszorzędowego i przemyć 3x 1x PBS przez 5 min.</li>
		<li>W przypadku pośredniego barwienia immunofluorescencyjnego inkubować z drugorzędowym przeciwciałem sprzężonym z sondą fluorescencyjną przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Rozcieńczyć przeciwciała w 1% BSA w stężeniu sugerowanym przez producenta.</li>
		<li>Usunąć roztwór przeciwciał drugorzędowych i przemyć 3x 1x PBS przez 5 min. 
		Rozwiązywanie problemów: Aby uniknąć wysokiego tła podczas obrazowania, miareczkować fluorescencyjnie sprzężone przeciwciała drugorzędowe i stosować najniższe stężenie, które zapewnia odpowiedni sygnał. Jeśli wysokie tło nadal stanowi problem, zwiększ liczbę i czas trwania etapów płukania lub użyj bezpośrednio sprzężonych przeciwciał pierwszorzędowych i pomiń krok 4.2.6.</li>
		<li>Aby zabarwić jądra, dodać roztwór do barwienia jądrowego 4',6-diamidyn-2-fenyloindolu (DAPI) w rozcieńczeniu sugerowanym przez producenta i inkubować przez 7-10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Usuń jądrowy roztwór barwiący i przemyj 2x 1x PBS przez 5 min.</li>
		<li>Usunąć PBS z ostatniego prania i dodać kroplę pożywki montażowej (regularny zestaw) na próbkę, aby zachować fluorescencję. Obraz przy użyciu odpowiednich ustawień wzbudzenia/emisji w mikroskopie fluorescencyjnym lub konfokalnym. 
		nuta: Obrazowanie należy wykonać w ciągu 2 dni od barwienia, aby uniknąć degradacji matrycy i utraty integralności rBM oraz utraty sygnału fluorescencyjnego. W przypadku niezobrazowania natychmiast, barwione próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem, aż do momentu obrazowania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Izolacja komórek od rBM
<ol>
	<li>Delikatnie usuń podłoże, nie naruszając warstwy matrycy. Nie aspirować.</li>
	<li>Umyj komórki 2x sterylnym 1x PBS. Nie aspirować.</li>
	<li>Dodać 0,5 ml lodowatego CRS do każdego dołka i usunąć całą warstwę matrycy wraz z komórkami, energicznie pipetując w górę iw dół. Zebrać komórki, matrycę i CRS w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Ułóż na lodzie.</li>
	<li>Dodaj dodatkowe 0,5 ml CRS do tej samej studzienki i zbierz cały pozostały materiał. Przenieść do tej samej probówki do mikrowirówki.</li>
	<li>Wirować mieszaninę komórek, matrycy i CRS i inkubować na lodzie przez 1 godzinę. Wirować komórki co 15 minut, aby ułatwić uwolnienie z matrycy.</li>
	<li>Sprawdź mieszaninę po 1 godzinie, nie powinny być widoczne grudki matrycy. 
	Rozwiązywanie problemów: jeśli po 1 godzinie nadal widoczne są grudki matrycy, przenieś komórki/matrycę/mieszaninę CRS do większej probówki, dodaj dodatkowe 2-5 ml CRS i inkubuj przez dodatkowe 30-60 minut.</li>
	<li>Odwirować komórki w CRS z prędkością 1 000 obr./min przez 5-10 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 1 ml zimnego 1x PBS.</li>
	<li>Wirować z prędkością 1 000 obr./min przez 5-10 minut i usunąć supernatant. Powtórz pranie PBS jeszcze raz.</li>
	<li>Drugie płukanie PBS kończy odzyskiwanie komórek z macierzy, a izolowane komórki mogą być wykorzystywane do dowolnych dalszych zastosowań, takich jak izolacja DNA/RNA/białka, cytometria przepływowa, przeszczep in vivo itp.</li>
</ol>

<ol><li>Carrel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+Permanent+Life+of+Tissues+Outside+of+the+Organism%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">On the Permanent Life of Tissues Outside of the Organism.</a> J. Exp. Med. 15, 516-528 (1912).</li>
<li>Harrison, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observations+on+the+living+developing+nerve+fiber%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Soc.+Exp.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Observations on the living developing nerve fiber.</a> Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 4, 140-143 (1907).</li>
<li>Earle, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+malignancy+in+vitro.+IV.+The+mouse+fibroblast+cultures+and+changes+seen+in+the+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Production of malignancy in vitro. IV. The mouse fibroblast cultures and changes seen in the living cells.</a> J. Natl. Cancer Inst. 4, 165-212 (1943).</li>
<li>Gey, G. O., Coffman, W. D., Kubicek, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Culture+Studies+of+the+Proliferative+Capacity+of+Cervical+Carcinoma+and+Normal+Epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Tissue Culture Studies of the Proliferative Capacity of Cervical Carcinoma and Normal Epithelium.</a> Cancer Res. 12, 264-265 (1952).</li>
<li>Barcelloshoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional-Differentiation+and+Alveolar+Morphogenesis+of+Primary+Mammary+Cultures+on+Reconstituted+Basement-Membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Functional-Differentiation and Alveolar Morphogenesis of Primary Mammary Cultures on Reconstituted Basement-Membrane.</a> Development. 105, 223-227 (1989).</li>
<li>Lamb, R., Ambler, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratinocytes+propagated+in+serum-free%2C+feeder-free+culture+conditions+fail+to+form+stratified+epidermis+in+a+reconstituted+skin+model%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Keratinocytes propagated in serum-free, feeder-free culture conditions fail to form stratified epidermis in a reconstituted skin model.</a> PloS One. 8, (2013).</li>
<li>Duong, H. S., Le, A. D., Zhang, Q. Z., Messadi, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+3-dimensional+culture+system+as+an+in+vitro+model+for+studying+oral+cancer+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Exp.+Pathol%22%5BJournal%5D)">A novel 3-dimensional culture system as an in vitro model for studying oral cancer cell invasion.</a> Int. J. Exp. Pathol. 86, 365-374 (2005).</li>
<li>Kirshner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+three-dimensional+model+for+evaluating+the+impact+of+therapy+on+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A unique three-dimensional model for evaluating the impact of therapy on multiple myeloma.</a> Blood. 112, 2935-2945 (2008).</li>
<li>Gudjonsson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+and+tumor-derived+myoepithelial+cells+differ+in+their+ability+to+interact+with+luminal+breast+epithelial+cells+for+polarity+and+basement+membrane+deposition%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Normal and tumor-derived myoepithelial cells differ in their ability to interact with luminal breast epithelial cells for polarity and basement membrane deposition.</a> J. Cell Sci. 115, 39-50 (2002).</li>
<li>Kirshner, J., Chen, C. J., Liu, P., Huang, J., Shively, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CEACAM1-4S%2C+a+cell-cell+adhesion+molecule%2C+mediates+apoptosis+and+reverts+mammary+carcinoma+cells+to+a+normal+morphogenic+phenotype+in+a+3D+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">CEACAM1-4S, a cell-cell adhesion molecule, mediates apoptosis and reverts mammary carcinoma cells to a normal morphogenic phenotype in a 3D culture.</a> Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 100, 521-526 (2003).</li>
<li>Weaver, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversion+of+the+malignant+phenotype+of+human+breast+cells+in+three-dimensional+culture+and+in+vivo+by+integrin+blocking+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies.</a> J. Cell Biol. 137, 231-245 (1997).</li>
<li>Gunn, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+natural+products+parthenolide+and+andrographolide+exhibit+anti-cancer+stem+cell+activity+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+Lymphoma%22%5BJournal%5D)">The natural products parthenolide and andrographolide exhibit anti-cancer stem cell activity in multiple myeloma.</a> Leukemia Lymphoma. 52, 1085-1097 (2011).</li>
<li>Hsiao, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((384+hanging+drop+arrays+give+excellent+Z-factors+and+allow+versatile+formation+of+co-culture+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">384 hanging drop arrays give excellent Z-factors and allow versatile formation of co-culture spheroids.</a> Biotechnol. Bioeng. 109, 1293-1304 (2012).</li>
<li>Meads, M. B., Gatenby, R. A., Dalton, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environment-mediated+drug+resistance%3A+a+major+contributor+to+minimal+residual+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Environment-mediated drug resistance: a major contributor to minimal residual disease.</a> Nat. Rev. Cancer. 9, 665-674 (2009).</li>
<li>Golde, D. W., Cline, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+Human+Bone-Marrow+in+Liquid+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Growth of Human Bone-Marrow in Liquid Culture.</a> Blood. 41, 45-57 (1973).</li>
<li>Gartner, S., Kaplan, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Term+Culture+of+Human-Bone+Marrow-Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+Biol%22%5BJournal%5D)">Long-Term Culture of Human-Bone Marrow-Cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. Biol. 77, 4756-4759 (1980).</li>
<li>Caligaris-Cappio, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+bone+marrow+stromal+cells+in+the+growth+of+human+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Role of bone marrow stromal cells in the growth of human multiple myeloma.</a> Blood. 77, 2688-2693 (1991).</li>
<li>Pike, B. L., Robinson, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+bone+marrow+colony+growth+in+agar-gel%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Human bone marrow colony growth in agar-gel.</a> J. Cell. Physiol. 76, 77-84 (1970).</li>
<li>Bug, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho+family+small+GTPases+control+migration+of+hematopoietic+progenitor+cells+into+multicellular+spheroids+of+bone+marrow+stroma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukocyte+Biol%22%5BJournal%5D)">Rho family small GTPases control migration of hematopoietic progenitor cells into multicellular spheroids of bone marrow stroma cells.</a> J. Leukocyte Biol. 72, 837-845 (2002).</li>
<li>Provenzano, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+reorganization+at+the+tumor-stromal+interface+facilitates+local+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med%22%5BJournal%5D)">Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion.</a> BMC Med. 4, (2006).</li>
<li>Tancred, T. M., Belch, A. R., Reiman, T., Pilarski, L. M., Kirshner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+Expression+of+Fibronectin+and+Collagens+I+and+IV+in+Multiple+Myeloma+and+Monoclonal+Gammopathy+of+Undetermined+Significance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Altered Expression of Fibronectin and Collagens I and IV in Multiple Myeloma and Monoclonal Gammopathy of Undetermined Significance.</a> J. Histochem. Cytochem. 57, 239-247 (2009).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Model rBM zapewnia kompleksowy system, w którym skład komórkowy BM jest utrzymywany ex vivo przez okres do 30 dni. Komórki BM hodowane w rBM samostratyfikują się zgodnie ze swoją funkcją, ściśle naśladując architekturę BM znalezioną in vivo. Co więcej, jest to pierwszy system, który pozwala na ekspansję klonu szpiczaka mnogiego8. Najbardziej krytycznymi etapami zapewniającymi solidny wzrost komórek BM i ogólny sukces hodowli są: 1) uzyskanie zdrowej populacji komórek BM o żywotności >70% i w ...

Hodowla tkankowa została opracowana do badania zachowania komórek w kontrolowanym środowisku, aby zminimalizować zmienność systemową podczas porównywania różnych procesów w nienaruszonych organizmach. Metoda ta została po raz pierwszy opracowana na początku 1900roku 1,2 i odnosi się do techniki, w której eksplantaty tkanek były hodowane ex vivo w szklanym naczyniu. W połowie XX wieku system został przystosowany do hodowli rozproszonych komórek, a nie fragmentów nienaruszonych tkanek, a terminy "hodowla tkankowa" i "hodowla komórkowa" stały sięsynonimami. W takich konwencjonalnych systemach hodowli komórkowych komórki są hodowane na powierzchni plastiku hodowli tkankowej, pokrytego pożywką wzrostową uzupełnioną różnymi czynnikami wzrostu. Pojawiły się dwa rodzaje kultur w oparciu o zdolność adhezyjną różnych komórek: adherentna hodowla komórkowa, w której komórki przyczepiają się i rozprzestrzeniają na plastikowej kulturze tkankowej oraz kultury nieprzylegające, w których komórki rozmnażają się w zawiesinie. Od początków hodowli komórkowej powstało wiele nieśmiertelnych linii komórkowych, takich jak HeLa4, pierwsza ludzka linia komórek rakowych. Te linie komórkowe mają zdolność do rozmnażania się w nieskończoność w hodowli komórkowej, a większość z nich nie wymaga żadnego specjalnego traktowania, aby utrzymać żywotność.
Redukcjonistyczne podejście oryginalnych metod hodowli komórkowych zostało zaprojektowane tak, aby maksymalnie uprościć system, włączając tylko minimum składników wymaganych do utrzymania żywotności i proliferacji komórek. Jednak uproszczone metody hodowli komórkowych nie są w stanie obsłużyć ex vivo większości pierwotnych typów komórek ludzkich o ograniczonej długości życia. W związku z tym projektowane są nowe systemy hodowli, które mają jak najbardziej zbliżyć mikrośrodowisko tkanek, umożliwiając w ten sposób wzrost eksplantatów komórkowych w warunkach fizjologicznych. W przeciwieństwie do konwencjonalnych/redukcjonistycznych podejść do hodowli komórkowych, trójwymiarowe (3D) systemy hodowli stają się obecnie preferowaną metodą wydajnej hodowli różnych ludzkich linii komórkowych i komórek pierwotnych w celu późniejszego badania mechanizmów związanych ze zdrowiem i chorobą, w kontekście wspierającego mikrośrodowiska. Takie systemy 3D są zwykle tworzone przy użyciu zrekonstruowanych matryc i/lub pożywki uzupełnionej czynnikami wzrostu, w celu podsumowania mikrośrodowiska tkankowego w celu zbadania typów komórek będących przedmiotem zainteresowania. Pierwszy z tych trójwymiarowych (3D) modeli hodowli został opracowany w celu zbadania rozwoju gruczołu sutkowego. Aby zapewnić komórkom warunki natywne, komórki nabłonka sutka zostały osadzone w Matrigel, kolagenie IV i bogatym w lamininę źródle macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) i pokryte pożywką wzrostową. W takich warunkach komórki nabłonka sutka tworzyły skupiska przypominające aciny sutkowe, a po stymulacji hormonami laktogennymi te acini wydzielały kazeinę i inne białka mleka do pustej prześwity struktur podobnych do acini. Wydzielanie kazeiny nie obserwowano w standardowych hodowlach nawet po dodaniu prolaktyny5, co dodatkowo podkreśla rolę mikrośrodowiska w zachowaniu cech morfologicznych i fenotypowych komórek. Innym dowodem na utratę normalnych funkcji komórkowych, gdy komórki są wyjmowane z kontekstu ich fizjologicznego mikrośrodowiska, jest wykazanie, że bez wspierającego mikrośrodowiska keratynocyty nie tworzą warstwowego naskórka6. Stworzono szereg innych modeli 3D, aby umożliwić rozmnażanie ex vivo komórek pierwotnych7,8 .
Kluczowa rola mikrośrodowiska w zachowaniu komórek została elegancko zademonstrowana w badaniu, w którym komórki nabłonka sutka tworzyły acini "od wewnątrz na zewnątrz" podczas hodowli w matrycy kolagenu I, w porównaniu do prawidłowo spolaryzowanych acini, które powstały w Matrigel. Ta utrata prawidłowej morfologii została odwrócona, gdy komórki mioepitelialne wytwarzające lamininę zostały dodane do kultur kolagenu I9. Co więcej, do prawidłowej manifestacji genotypu wymagane jest prawidłowe mikrośrodowisko. Wyhodowane w naczyniu komórki raka piersi MCF7 transfekowane cząsteczką adhezyjną komórka-komórka CEACAM1 zachowują się dokładnie tak samo, jak nietransfekowane komórki ujemne CEACAM. Jednak podczas hodowli w Matrigel, w kontakcie z ECM, MCF7 typu dzikiego tworzy struktury podobne do guza, podczas gdy komórki MCF7 transfekowane CEACAM1 powrócić do normalnego fenotypu i tworzą acini z pustą światłową, jak ustalono w przypadku niezłośliwego nabłonka sutka10. Podobnie, blokowanie β1-integryny w komórkach raka piersi nie zmienia ich zachowania w standardowych warunkach hodowli, ale ten sam eksperyment przeprowadzony w hodowlach 3D pokazuje, że blokowanie β1-integryny przywraca złośliwe komórki do normalnego fenotypu11. Dlatego mikrośrodowisko tkankowe jest wymagane nie tylko do utrzymania żywotności komórek, ale także do utrzymania ich prawidłowego funkcjonowania.
Oprócz dostarczania systemu, w którym można badać zachowanie komórek w warunkach fizjologicznych, hodowle 3-D funkcjonują jako solidne i niezawodne podłoże do przedklinicznych testów nowych terapii8,12,13. Hodowla komórek w 3D umożliwia badania przesiewowe badanych związków w warunkach oporności na leki za pośrednictwem środowiska14, gdzie można ocenić udział adhezji komórka-komórka i komórka-ECM. Co więcej, toksyczność nowych związków poza celem można stwierdzić poprzez włączenie wielu przedziałów komórkowych różnych tkanek. Takie badania przesiewowe mogą być wykonywane szybciej i są bardziej opłacalne niż porównywalne badania in vivo8.
Tutaj prezentujemy konfigurację modelu 3D zrekonstruowanego szpiku kostnego (rBM), gdzie normalne i złośliwe komórki szpiku kostnego (BM) namnażają się ex vivo w systemie ściśle naśladującym mikrośrodowisko ludzkiego szpiku kostnego. Dotychczasowe próby hodowli pierwotnych ludzkich komórek BM w hodowlach 2D, płynnych lub przylegających kokulturach z różnymi składnikami zrębu BM lub 3-D, półstałych kulturach agarowych spotkały się z ograniczonym sukcesem ze względu na ich niezdolność do zaopatrywania komórek w składniki mikrośrodowiska tkankowego15-18. W tych systemach pierwotne komórki BM miały słabą żywotność i nie rozwijały się ex vivo. Innym systemem, w którym ludzkie komórki progenitorowe BM są hodowane w sferoidalnych kokulturach z komórkami zrębu BM, jest system 3D, w którym żywotność i proliferacja hematopoetycznych komórek macierzystych utrzymywała się przez co najmniej 96godzin. Jednak, chociaż system ten jest bardzo korzystny dla zrozumienia biologii układu krwiotwórczego, nie oddaje wiernie mikrośrodowiska BM ze względu na brak komponentów ECM, co ogranicza jego użyteczność. Opisany tutaj model rBM przedstawia kompleksowy system, w którym zarówno komórkowe, jak i zewnątrzkomórkowe przedziały ludzkiego BM są rekonstruowane in vitro. Wykazaliśmy, że hodowle rBM mogą wspierać wzrost ex vivo normalnych ludzkich komórek BM, a także komórek wyizolowanych od pacjentów z różnymi zaburzeniami hematologicznymi.

<table><tbody><tr><td>Zestaw do proliferacji CellTrace CFSE do cytometrii przepływowej</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektyna z ludzkiego osocza</td><td>Millipore</td><td></td> NG1884448 <td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Lifesciences</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel matryca błony podstawnej</td><td>BD Biosciences</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen z ogona szczura typu I</td><td>BD Biosciences</td><td>354249</td><td>Collagen I firmy Millipore nie polimeryzuje prawidłowo przy użyciu tego protokołu</td></tr><tr><td>VECTASHIELD Podłoże montażowe VECTASHIELD do fluorescencji (zestaw regularny)</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>SigmaFast Red TR/Napthol AS-MX tabletki</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4648</td><td>Do barwienia TRAP</td></tr><tr><td>Tabletki SigmaFast BCIP/NBT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5655</td><td>Do barwienia fosfatazą alkaliczną</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny Zeiss LSM 510&nbsp;</td><td>Oprogramowanie Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss 510</td><td>Oprogramowanie Carl Zeiss</td><td></td><td>Oprogramowanie do analizy obrazu do analizy konfokalnej</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony Zeiss Axiovert 200M&nbsp;</td><td>Oprogramowanie Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph</td> Urządzenia <td></td><td>molekularne</td> Oprogramowanie do analizy obrazu dla cytometru przepływowego <td>Axiovert 200M</td></tr><tr><td>FACSort&nbsp;</td><td>Oprogramowanie BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellQuest Pro&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Oprogramowanie do analizy danych cytometrii przepływowej</td></tr></tbody></table>

trójwymiarowy model hodowli tkankowej do badania pierwotnego ludzkiego szpiku kostnego i jego nowotworów złośliwych

A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

Hodowla tkankowa była nieocenionym narzędziem do badania wielu aspektów funkcjonowania komórek, od normalnego rozwoju po choroby. Konwencjonalne metody hodowli komórkowej opierają się na zdolności komórek do przyłączania się do stałego podłoża naczynia do hodowli tkankowej lub do wzrostu w zawiesinie w płynnym podłożu. Stworzono i wyhodowano wiele nieśmiertelnych linii komórkowych przy użyciu takich podejść, jednak metody te często zawodzą, gdy komórki pierwotne muszą być hodowane ex vivo. Takie niepowodzenie przypisuje się brakowi odpowiednich składników macierzy zewnątrzkomórkowej mikrośrodowiska tkankowego w standardowych systemach, w których plastik do hodowli tkankowych jest używany jako powierzchnia do wzrostu komórek. Macierz zewnątrzkomórkowa jest integralnym składnikiem mikrośrodowiska tkankowego, a jej obecność ma kluczowe znaczenie dla utrzymania funkcji fizjologicznych, takich jak polaryzacja komórek, przeżycie i proliferacja. W artykule przedstawiono metodę trójwymiarowej hodowli tkankowej, w której pierwotne komórki szpiku kostnego są hodowane w macierzy zewnątrzkomórkowej opracowanej w celu podsumowania mikrośrodowiska ludzkiej kości (system rBM). Osadzone w macierzy zewnątrzkomórkowej komórki są zaopatrywane w składniki odżywcze przez pożywkę uzupełnioną ludzkim osoczem, zapewniając w ten sposób kompleksowy system, w którym przeżycie i proliferacja komórek mogą być utrzymane do 30 dni przy zachowaniu składu komórkowego tkanki pierwotnej. Za pomocą systemu rBM udało nam się wyhodować pierwotne komórki szpiku kostnego od zdrowych dawców oraz pacjentów z amyloidozą i różnymi nowotworami hematologicznymi. System rBM pozwala na bezpośrednią wizualizację w czasie rzeczywistym w matrycy zachowania komórek i ocenę skuteczności przedklinicznej nowych środków terapeutycznych. Co więcej, komórki można wyizolować z rBM, a następnie wykorzystać do przeszczepu in vivo, sortowania komórek, cytometrii przepływowej oraz analizy kwasów nukleinowych i białek. Podsumowując, metoda rBM zapewnia niezawodny system wzrostu pierwotnych komórek szpiku kostnego w warunkach fizjologicznych.

Ponieważ pierwotne komórki szpiku kostnego nie namnażają się w standardowych warunkach hodowli tkankowej, system rBM został opracowany w celu ścisłego odwzorowania mikrośrodowiska kostnego, zapewniając system do hodowli i ekspansji komórek szpiku kostnego ex vivo. Główne składniki macierzy zewnątrzkomórkowej szpiku kostnego: fibronektyna, kolagen I, kolagen IV oraz laminina21, zostały włączone do macierzy rBM, aby zapewnić rusztowanie strukturalne dla tej hodowli 3-D. Endosteum, będące granicą między ...

W standardowych metodach hodowli komórki są wyjmowane ze swojego fizjologicznego środowiska i hodowane na plastikowej powierzchni naczynia. Aby zbadać zachowanie pierwotnych komórek ludzkiego szpiku kostnego, stworzyliśmy system hodowli 3D, w którym komórki są hodowane w warunkach rekapitulujących natywne mikrośrodowisko tkanki.

Trójwymiarowy model hodowli tkankowej do badania pierwotnego ludzkiego szpiku kostnego i jego nowotworów złośliwych

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest stworzenie systemu hodowlanego, który ściśle odtwarza komórkowe i wewnątrzkomórkowe mikrośrodowisko ludzkiego szpiku kostnego. W pierwszej kolejności powierzchnia dołka naczynia hodowlanego jest pokrywana macierzą przemysłową. Następnie mononuklearne komórki szpiku kostnego lub inne komórki będące przedmiotem badania są mieszane z macierzą szpiku kostnego.Następnie usuwa się macierz przemysłową, a do dołka dodaje się mieszaninę macierzy z komórkami. Po zgęstnieniu macierzy nakłada się na nią pożywkę wzrostową. Ostatecznie komórki można wizualizować bezpośrednio w macierzy lub izolować do dalszych analiz w porównaniu z istniejącymi metodami hodowli komórek.Na przykład standardowe metody hodowli tkankowej lub modele kokultury, w których komórki są hodowane na plastiku. Główną zaletą zastosowania metody hodowli 3D jest to, że komórki rozwijają się w fizjologicznym mikrośrodowisku, co pozwala na badanie komórek w warunkach natywnych dla danej tkanki. Przygotuj płytkę 48-dołkową, w której zostaną wysiane komórki.Wprowadź najpierw 65 µL roztworu powłoki przemysłowej do każdego dołka, a następnie rozprowadź roztwór równomiernie, aby pokrył całą powierzchnię dołka. Metoda ta jest skalowalna również dla innych powierzchni. Pozostaw płytki do inkubacji w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 minut.W międzyczasie należy przygotować zawiesinę komórkową o stężeniu 50 000 komórek na µL PBS. Przygotować taką ilość, aby do każdego dołka można było dodać 10 µL, a następnie w probówce typu Eppendorf wymieszać zawiesinę komórkową ze 100 µL zrekonstruowanej macierzy kostnej na dołek. Mieszać delikatnie, unikając powstawania pęcherzyków powietrza.Przechowuj mieszaninę w lodzie, aby matryca nie zgeliunowała po zakończeniu przygotowania płytki. Po inkubacji usuń cały płyn i roztwór powlekający za pomocą aspiracji. Następnie dodaj do każdej studni 100 µL dobrze wymieszanej zawiesiny komórek z matrycą.Szybko przechyl płytkę, używając pipety, aby równomiernie pokryć całą powierzchnię dołka. Mieszaj zawiesinę pomiędzy napełnianiem kolejnych dołków, ponieważ komórki będą się skupiać po pełnym załadowaniu. Inkubuj płytkę od 30 do 60 minut bez wstrząsania, aż matryca stężeje.Następnie podgrzej pożywkę do wzrostu szpiku kostnego w łaźni wodnej ustawionej na 37 °C. Po 30 minutach inkubacji sprawdź, czy matryca prawidłowo stężała. Prawidłowo uformowana matryca tworzy miękką, żelopodobną warstwę, która nie przesuwa się podczas przechylania płytki.Gdy matryca będzie gotowa, ostrożnie przykryć ją jednym mililitrem pożywki, dodając ją kroplami za pomocą pipety serologicznej. Następnie umieścić przygotowaną kulturę zrekonstruowanej matrycy kostnej w inkubatorze na okres do 30 dni bez wymiany pożywki. Jeśli wymiana pożywki okaże się konieczna, należy wymienić jednorazowo tylko połowę objętości pożywki.Ostrożnie usuń pożywkę, aby nie naruszyć warstwy macierzy. Przechyl płytkę i delikatnie odlej pożywkę za pomocą pipety. Nie aspiruj pożywki bezpośrednio nad macierzą.Podczas barwienia komórek należy stosować tę technikę do wymiany roztworów. W przypadku usuwania medium z dołków hodowli 3D niezwykle ważne jest, aby usuwać je przez ściankę boczną dołka.W przeciwnym razie matryca zostanie naruszona, a komórki mogą zostać utracone podczas stosowania tej samej techniki. Przemyj komórki dwukrotnie sterylnym 1x PBS. Następnie dodaj do każdej z nich 0,5 ml lodowatego roztworu do regeneracji komórek.Następnie usuniemy całą warstwę macierzy wraz z komórkami poprzez energiczne pipetowanie w górę i w dół. Zawartość każdego dołka przeniesiemy do probówki do mikrocentryfugi i umieścimy na lodzie. Następnie do tego samego dołka dodamy dodatkowe 0,5 mL roztworu regeneracyjnego i pobierzemy cały pozostały materiał.Wszystkie próbki należy wymieszać w wstrząsarzu wirowym (vortex), a następnie inkubować przez godzinę w lodzie. W tym czasie należy mieszać probówki w wstrząsarzu co 15 minut, aby ułatwić uwalnianie komórek z macierzy. Po godzinie należy sprawdzić, czy w mieszaninie nie pozostały widoczne grudki macierzy.Nie powinny być one obecne, lecz jeśli wystąpią, należy przenieść mieszaninę do większej probówki i dodać od 2 do 5 mL dodatkowego roztworu do odzyskiwania komórek. Następnie inkubować komórki przez kolejne 30 do 60 minut. Okresowo mieszać na wortexie i ponownie sprawdzić, czy grudki macierzy zniknęły.Gdy matryca przestanie tworzyć grudki, odwirować mieszaninę z prędkością 1000 RPM przez 5 do 10 minut w temperaturze 4 °C. Następnie usunąć nadsącz i resuspender osad komórkowy w 1 ml zimnego 1x PBS.Powtórz wirowanie. Usuń nadsącz i zastąp go świeżym PBS, a następnie powtórz płukanie. Wykonaj tę procedurę po raz trzeci.Po trzecim przemyciu w PBS, odzyskaj komórki w odpowiednim roztworze do kolejnej procedury. Komórki szpiku kostnego hodowano w zrekonstruowanej macierzy kostnej przez 30 dni i obrazowano okresowo za pomocą mikroskopii świetlnej przy powiększeniu 200 razy. Elementy zrębowe wykryto po raz pierwszy w piątym dniu, jednak stały się one wyraźnie widoczne do 14. dnia.W trakcie okresu hodowli komórki migrowały przez macierz i agregowały w wyraźne skupiska. Masy komórek nowotworowych powiększały się w czasie, aby ocenić skład komponentów zrębowych, które przerastają w RBM. Oceniono morfologię komórek w miejscu przejścia między RBM a powłoką przemysłową.Komórki barwiono w kierunku fibronektyny, aktyny i jąder komórkowych. Wykazano, że komórki o morfologii stromy są przedosteoblastami o wysokim poziomie aktywności fosfatazy alkalicznej. Były one zdolne do mineralizacji wapnia, co potwierdzono barwieniem czerwienią zarynową; komórki z widoczną obecnością kropli lipidów zidentyfikowano jako adipocyty na podstawie pozytywnego barwienia Oil Red O.Komórki czerwone z okazjonalnie występującymi wieloma jądrami zidentyfikowano jako preosteoklasty; wykazały one pozytywny wynik w kierunku fosfatazy kwaśnej odpornej na winian. Po izolacji komórek z hodowli 3D można przeprowadzić szereg analiz. Na przykład można badać fenotypy komórkowe różnych komórek hodowanych w mikrośrodowisku.Można badać ekspresję genów i białek, a nawet określić, jakie rodzaje cząsteczek są wydzielane przez te komórki w warunkach 3D.

a-three-dimensional-tissue-culture-model-to-study-primary-human-bone

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Trójwymiarowy model hodowli tkankowej do badania pierwotnego ludzkiego szpiku kostnego i jego nowotworów

Opisano trójwymiarowy (3D) system hodowli dla hematopoezy z wykorzystaniem ludzkiej krwi pępowinowej oraz komórek szpiku kostnego z białaczką. Metoda opiera się na zastosowaniu porowatego syntetycznego rusztowania z poliuretanu pokrytego białkami macierzy pozakomórkowej. Rusztowanie to można dostosować do hodowli szerokiego zakresu komórek.

Ex vivo naśladowanie prawidłowej i nieprawidłowej hematopoezy u ludzi

Opisano metody tworzenia ludzkich tkanek nowotworowych 3D jako systemów testowych. Technologie te opierają się na bezkomórkowym biologicznym rusztowaniu unaczynionym (BioVaSc), pierwotnych komórkach ludzkich i linii komórek nowotworowych, które mogą być hodowane zarówno w warunkach statycznych, jak i dynamicznych w bioreaktorze przepływowym.

Inżynieria tkankowa ludzkiego systemu badań 3D nowotworów in vitro

Opisano protokoły do badania migracji, proliferacji i kolonizacji komórek raka piersi w systemie modelowym eksplantacji ludzkiej tkanki kostnej.

Metody hodowli eksplantatów ludzkiej tkanki udowej w celu zbadania kolonizacji komórek raka piersi w niszy przerzutowej

Ludzkie komórki szpiczaka mnogiego (MM) wymagają wspierającego mikrośrodowiska komórek mezenchymalnych i składników macierzy zewnątrzkomórkowej do przetrwania i proliferacji. Stworzyliśmy model zarodka kurczaka in vivo z wszczepionym ludzkim szpiczakiem i komórkami mezenchymalnymi, aby zbadać wpływ leków przeciwnowotworowych na wzrost, inwazję i angiogenezę guza.

Opracowanie modelu ksenoprzeszczepu szpiczaka mnogiego u kurcząt w celu zbadania wzrostu, inwazji i angiogenezy guza

Przedstawiono metodę tworzenia i obrazowania na żywo różnych humanizowanych nisz szpiku kostnego u myszy. W oparciu o niszę podporową utworzoną przez ludzkie komórki mezenchymalne, dodanie ludzkich komórek śródbłonka indukuje tworzenie ludzkich naczyń, podczas gdy dodanie rhBMP-2 indukuje tworzenie chimerycznej tkanki kostnej ludzko-mysi.

Bioinżynieria humanizowanych mikrośrodowisk szpiku kostnego u myszy i ich wizualizacja za pomocą obrazowania na żywo

Ten protokół opisuje rozwój przedklinicznego modelu osteoklastogenezy in vitro z monocytów krwi obwodowej hodowanych z liniami komórkowymi raka piersi w celu naśladowania interakcji komórka rakowa - osteoklast. Model ten może zostać wykorzystany do pogłębienia naszej wiedzy na temat powstawania przerzutów do kości i poprawy opcji terapeutycznych.

Opracowanie ludzkiego przedklinicznego modelu osteoklastogenezy z monocytów krwi obwodowej hodowanych wspólnie z liniami komórkowymi raka piersi

Hodowla ex vivo eksplantatów kostnych może być cennym narzędziem do badania fizjologii kości i potencjalnej oceny leków w przebudowie kości i chorobach kości. Prezentowany protokół opisuje przygotowanie i hodowlę kalwarii wyizolowanych z czaszek nowonarodzonych myszy, a także jej zastosowania.

Pomiar przebudowy kości i odtworzenie mikrośrodowiska guz-kość przy użyciu kokultury kalwarii i histomorfometrii

Model kostnoszkieletowego mięsaka (BEM) dla kostniakomięsaka (OS) jest dobrze znany i pokazany tutaj. Może być używany jako odpowiednie rusztowanie do naśladowania wzrostu guza pierwotnego in vitro i stanowi idealny model do badania histologicznej i cytogennej heterogeniczności OS.

Trójwymiarowy model macierzy zewnątrzkomórkowej kości dla kostniakomięsaka

Tutaj opisujemy łatwy do wdrożenia, ustandaryzowany, mikrofizjologiczny system, który odzwierciedla złożoność struktury ludzkiego szpiku kostnego in vivo, dostarczając odpowiedniego modelu do precyzyjnego badania szerokiego zakresu normalnych i patologicznych zdarzeń.

Model 3D ludzkiego szpiku kostnego do badania dynamiki i interakcji między komórkami rezydentnymi w kontekście fizjologicznym lub nowotworowym

Model in vitro niszy naczyniowej szpiku kostnego jest tworzony przez wysiewanie komórek mezenchymalnych i śródbłonka na prefabrykowane hydrożele PEG 3D. Sieci śródbłonka, komponenty ECM i aktywność ALP w niszach różnią się w zależności od zastosowanego czynnika wzrostu. Platforma może być wykorzystywana do zaawansowanych modeli nowotworów.

Proste utworzenie unaczynionej niszy osteogennej szpiku kostnego za pomocą prefabrykowanych hydrożeli z poli(glikolu etylenowego) (PEG) w mikropłytce do obrazowania

Ten protokół opisuje wytwarzanie 3D konstrukcji kostnych z wykorzystaniem ludzkich osteocytów osadzanych w żelach metacrylanowych żelatyny (GelMA) uzupełnionych o decelularyzowaną macierz pozakomórkową. Metoda ta jest nisko kosztowa, skalowalna i kompatybilna z podstawowym sprzętem laboratoryjnym, zapewniając platformę translacyjną do badania procesów chorobowych układu mięśniowo-szkieletowego.

Platforma hodowli kości 3D z wykorzystaniem ludzkich osteocytów i decellularyzowanej macierzy pozakomórkowej do modelowania chorób układu mięśniowo-szkieletowego

Poznaj trójwymiarowy system hodowli tkankowej do badania pierwotnych ludzkich komórek szpiku kostnego. Ta metoda umożliwia bezpośrednią wizualizację komórek oraz ich izolację do dalszych analiz.

Trójwymiarowy model hodowli tkankowej do badania pierwotnego ludzkiego szpiku kostnego i jego nowotworów złośliwych

Przeglądaj więcej filmów