Trójwymiarowy model hodowli tkankowej do badania pierwotnego ludzkiego szpiku kostnego i jego nowotworów złośliwych
8 marca 2014
W standardowych metodach hodowli komórki są wyjmowane ze swojego fizjologicznego środowiska i hodowane na plastikowej powierzchni naczynia. Aby zbadać zachowanie pierwotnych komórek ludzkiego szpiku kostnego, stworzyliśmy system hodowli 3D, w którym komórki są hodowane w warunkach rekapitulujących natywne mikrośrodowisko tkanki.
Ogólnym celem tej procedury jest stworzenie systemu hodowli, który dokładnie podsumowuje mikrośrodowisko komórkowe i wewnątrzkomórkowe ludzkiego szpiku kostnego. Po pierwsze, powierzchnia studzienki hodowli tkankowej jest pokryta matrycą przemysłową. Następnie komórki jednojądrzaste szpiku kostnego lub inne interesujące komórki miesza się z macierzą szpiku kostnego.
Później matryca przemysłowa jest usuwana, a mieszanina macierzy komórkowej jest dodawana do studni. Gdy matryca zostanie pokryta galaretą, nakłada się na nią pożywkę wzrostową. Ostatecznie komórki mogą być wizualizowane bezpośrednio w matrycy lub mogą być izolowane w celu dalszych analiz W porównaniu z istniejącymi metodami hodowli komórek.
Na przykład standardowe metody hodowli tkankowej lub modele kohodowli, w których komórki są hodowane na plastiku. Główną zaletą stosowania metody hodowli 3D jest to, że komórki są hodowane w fizjologicznym środowisku mikro, a co za tym idzie, pozwala na badanie komórek w natywnych warunkach tkanki. Przygotuj 48-dołkową płytkę, w której zostaną posiane komórki.
Najpierw dodając 65 mikrolitrów przemysłowego roztworu powłokowego do każdego, dobrze rozprowadź roztwór równomiernie, aby pokryć całą powierzchnię studni. Ta metoda jest również skalowalna na inne powierzchnie. Pozostaw płytki do inkubacji w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 minut.
W międzyczasie przygotuj zawiesinę komórek 50 000 komórek na mikrolitr PBS. Przygotuj tyle, aby dodać 10 mikrolitrów do każdej studzienki, a następnie w probówce einor wymieszaj zawiesinę komórkową ze 100 mikrolitrami zrekonstruowanej macierzy kostnej na. Dobrze wymieszaj delikatnie i unikaj wprowadzania bąbelków.
Trzymaj mieszaninę na lodzie, aby matryca nie zżelowała się, gdy płytka jest gotowa. Podczas inkubacji usunąć całą ciecz i roztwór powlekający dote przez aspirację. Następnie do każdego dodaj 100 mikrolitrów dobrze wymieszanej zawiesiny komórkowej z matrycą.
Dobrze szybko przechyl płytkę za pomocą pipety, aby równomiernie pokryć całą powierzchnię studzienki. Mieszaj zawiesinę między studzienkami, ponieważ komórki zbrylą się po pełnym załadowaniu. Inkubować płytkę przez 30 do 60 minut bez mieszania, aż matryca zastygnie.
Następnie podgrzej pożywkę do wzrostu szpiku kostnego w łaźni wodnej ustawionej na 37 stopni Celsjusza. Po 30 minutach inkubacji sprawdź, czy matryca jest prawidłowo ustawiona. Dobra matryca tworzy miękką warstwę przypominającą żel, która nie przesuwa się, gdy płytka jest przechylona.
Gdy matryca jest gotowa, delikatnie pokryj ją mililitrem pożywki kroplami za pomocą pipety serologicznej. Następnie zmontowaną zrekonstruowaną kulturę macierzy kostnej należy umieścić w inkubatorze na okres do 30 dni bez zmian w pożywce. Jeśli wymagana jest wymiana podłoża, należy wymienić tylko połowę podłoża na raz.
Delikatnie usuń podłoże, nie naruszając warstwy matrycy. Przechylić płytkę i delikatnie odcedzić podłoże za pomocą pipety. Nie zasysaj później pożywki przez matrycę.
Podczas barwienia komórek. Użyj tej techniki do wprowadzania zmian w rozwiązaniu. W celu usunięcia pożywki ze studzienek kultury 3D bardzo ważne jest, aby zostały one usunięte z boku studni.
W przeciwnym razie matryca zostanie zakłócona, a komórki mogą zostać utracone Trzymając się tej samej techniki. Umyj komórki dwukrotnie sterylnym XPBS. Następnie dodaj do każdego pół mililitra lodowatego roztworu do odzyskiwania komórek.
Dobrze usuń całą warstwę matrycy wraz z komórkami, energicznie pipetując w górę iw dół. Dla każdego dobrze przenieś kolekcję do mikroprobówki wirówkowej i umieść ją na lodzie. Następnie dodaj dodatkowe pół mililitra roztworu regeneracyjnego do tej samej studzienki i zbierz cały pozostały materiał.
Zwiruj wszystkie kolekcje i inkubuj je przez godzinę na lodzie. W ciągu godziny wiruj rurki co 15 minut, aby ułatwić uwalnianie komórek z matrycy. Po godzinie sprawdź, czy w mieszaninie nie ma widocznych grudek matrycy.
Żaden nie powinien być obecny, ale jeśli tak, przenieś mieszaninę do większej probówki i dodaj dodatkowe dwa do pięciu mililitrów roztworu do odzyskiwania komórek. Następnie inkubuj komórki przez kolejne 30 do 60 minut. Okresowo wiruje i ponownie sprawdź, czy nie ma grudek matrycy.
Gdy matryca nie jest już zbita. Odwiruj mieszaninę z prędkością 1000 obr./min przez pięć do 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie usuń supernatant i ponownie zawieś osad komórek w mililitrze zimnego XPBS.
Powtórzyć wirowanie. Zastąp supernatant świeżym PBS i powtórz pranie. Trzeci raz.
Po trzecim płukaniu PBS odzyskaj komórki w odpowiednim roztworze do następnego zabiegu. Komórki szpiku kostnego hodowano w zrekonstruowanej macierzy kostnej przez 30 dni i okresowo obrazowano za pomocą mikroskopii świetlnej w 200-krotnym powiększeniu. Elementy zrębu zostały po raz pierwszy wykryte w piątym dniu, ale były wyraźnie widoczne w 14 dniu.
W trakcie okresu hodowli komórki migrowały przez matrycę i agregowały się w odrębne klastry. Masy komórek nowotworowych rozszerzały się z czasem, aby ocenić skład składników zrębu, które wyrastają w RBM. Oceniono morfologię komórek na przejściu między RBM a powłoką przemysłową.
Komórki wybarwiono pod kątem fibronektyny, aktyny i jąder. Wykazano, że komórki wizualizacyjne o morfologii zrębu są pres osteoblastami o wysokim poziomie aktywności fosfatazy alkalicznej. Były one zdolne do mineralizacji wapnia, co określono za pomocą czerwonego barwnika zaryny, komórki z widoczną obecnością kropelek lipidów zostały zidentyfikowane jako adipocyty na podstawie pozytywnego barwienia olejem.
Krwinki czerwone z okazjonalnymi jądrami mnogimi zostały rozpoznane jako osteoklasty i były dodatnie dla fosfatazy kwasowej opornej na winian. Po wyizolowaniu komórek z hodowli 3D możesz robić różne rzeczy. Na przykład możesz badać fenotypy komórkowe różnych komórek hodowanych w mikrośrodowisku.
Możesz badać ekspresję genów i białek, a nawet określić, jakie cząsteczki są wydzielane przez te komórki w warunkach 3D.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia trójwymiarowy (3-D) system hodowli zaprojektowany do badania pierwotnych ludzkich komórek szpiku kostnego w środowisku naśladującym ich naturalne mikrootoczenie. Metoda ta umożliwia bezpośrednią wizualizację komórek lub ich izolację do dalszych analiz.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Techniki hodowli komórkowej
- Zachowanie komórek szpiku kostnego
- Inżynieria tkankowa 3-D
Wstęp
- Standardowe metody hodowli często usuwają komórki z ich środowiska fizjologicznego.
- Komórki szpiku kostnego wymagają specyficznych warunków w celu zachowania swojej funkcjonalności.
- Systemy hodowli 3-D mogą lepiej odwzorowywać środowisko in vivo.
- Celem niniejszego badania jest poprawa zrozumienia zachowania komórek szpiku kostnego.
Cel badania
- Opracowanie systemu hodowli, który ściśle odwzorowuje mikrośrodowisko ludzkiego szpiku kostnego.
- Umożliwienie badania pierwotnych komórek ludzkiego szpiku kostnego w kontekście bardziej istotnym fizjologicznie.
- Ułatwienie późniejszych analiz hodowlanych komórek.
Zastosowane metody
- Powlekanie dołków do hodowli tkankowej macierzą przemysłową.
- Mieszanie mononuklearnych komórek szpiku kostnego z macierzą szpiku kostnego.
- Usuwanie macierzy przemysłowej po żelowaniu.
- Przykrywanie mieszaniny komórek i macierzy pożywką wzrostową.
Główne wyniki
- Komórki można wizualizować bezpośrednio w obrębie macierzy.
- Wyizolowane komórki mogą być wykorzystane do różnych analiz następczych.
- System hodowli 3-D usprawnia badanie zachowania komórek szpiku kostnego.
- Wyniki wskazują na zwiększoną istotność fizjologiczną w porównaniu z metodami tradycyjnymi.
Wnioski
- Opracowany trójwymiarowy system hodowli skutecznie naśladuje środowisko szpiku kostnego.
- Metoda ta może przyczynić się do postępów w badaniach nad funkcjonalnością komórek szpiku kostnego.
- W przyszłych badaniach system ten może zostać wykorzystany do pogłębienia wiedzy na temat hemopoezy.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Pierwotne ludzkie komórki szpiku kostnego są trudne do utrzymania ex vivo ze względu na utratę naturalnych sygnałów macierzy zewnątrzkomórkowej, co ogranicza modelowanie przedkliniczne nowotworów hematologicznych i oddziaływań stromalnych. System rBM zapewnia fizjologicznie odpowiednie mikrośrodowisko 3D, które podtrzymuje żywotność i funkcję pierwotnego szpiku kostnego do 30 dni, umożliwiając mechanistyczną redukcję ryzyka w przypadku kandydatów na leki. Wspiera to walidację celów terapeutycznych i ciągłość przedkliniczną poprzez zachowanie składu komórkowego oraz umożliwienie wizualizacji zachowania komórek i odpowiedzi na lek w macierzy w czasie rzeczywistym.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych w kontekście zrębowym zbliżonym do naturalnego, co pozwala na wyjaśnienie zależności między szlakami w pierwotnym szpiku kostnym człowieka.
- Wartość operacyjna: Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez utrzymanie fizjologicznych oddziaływań komórka-komórka oraz komórka-macierz, które są krytyczne dla fenotypów złośliwych i zrębowych.
- Wartość prognostyczna: Zwiększa pewność co do zaangażowania celu i wyników przesiewu fenotypowego poprzez redukcję artefaktów wynikających ze sztucznych warunków hodowli.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Pozwala na generowanie zestandaryzowanych i powtarzalnych kultur 3D odpowiednich do screeningu związków chemicznych z ilościowym pomiarem przeżywalności, proliferacji i morfologii komórek.
- Skalowalność: Kompatybilność z formatem płytek 48-dołkowych oraz możliwość adaptacji do przepływów o wyższej przepustowości w kampaniach identyfikacji związków wiodących.
- Wartość screeningowa: Umożliwia wiarygodną ocenę nowych preparatów terapeutycznych w systemie istotnym dla danej jednostki chorobowej, który zachowuje heterogeniczność komórek pierwotnych oraz interakcje ze stroma.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Zachowuje skład komórkowy pierwotnego szpiku kostnego od zdrowych dawców oraz pacjentów z amyloidozą i nowotworami hematologicznymi, co wspiera badania przedkliniczne zorientowane na biomarkery.
- Użyteczność przedkliniczna: Umożliwia izolację hodowlanych komórek do transplantacji in vivo, cytometrii przepływowej oraz analiz kwasów nukleinowych i białek, łącząc etap odkrycia z walidacją.
- Decyzje o skorygowanym ryzyku: Ułatwia ocenę efektów działania leków i mechanizmów oporności zależnych od stromy, co usprawnia kryteria go/no-go we wczesnej fazie rozwoju.
Integracja potoku i przepływu pracy
System rBM wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od walidacji celu, poprzez identyfikację wiodących związków, aż po ocenę przedkliniczną, w szczególności w przypadku nowotworów hematologicznych oraz terapii zależnych od mikrośrodowiska.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnalizacyjnych poprzez hodowlę pierwotnych komórek szpiku kostnego w mikrośrodowisku odtwarzającym ludzką kość.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowych, powtarzalnych wyników dotyczących żywotności komórek, ich grupowania oraz zmian morfologicznych w czasie, co umożliwia porównywanie związków.
- Analityka: Pozwala na wizualizację w czasie rzeczywistym oraz analizę końcową fenotypów komórek zrębowych i złośliwych, w tym różnicowania osteoblastów, adipocytów i osteoklastów.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość od hodowli 3D do dalszych testów funkcjonalnych, takich jak transplantacja i profilowanie molekularne.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do badania biologii pierwotnego szpiku kostnego w wielu projektach i modalnościach terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w odpowiedziach leków ukierunkowanych na szpik kostny.
- Wartość operacyjna: Dostarcza ustandaryzowany, skalowalny system z określonymi procedurami przygotowania matrycy i utrzymywania hodowli.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową poprzez umożliwienie wcześniejszego wykrycia braku skuteczności lub nieoczekiwanej toksyczności w modelach istotnych fizjologicznie.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację kandydatów skorygowaną o ryzyko, w oparciu o profile interakcji stromy oraz zachowanie komórek złośliwych w warunkach odpowiadających organizmowi człowieka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w technikach hodowli komórkowych 3D oraz w pracy z macierzą zewnątrzkomórkową.
- Zależne od dostępu do zrekonstruowanej macierzy kostnej i odpowiednich pożywek wzrostowych uzupełnionych ludzką plazmą.
- Wymaga standaryzowanego szkolenia w zakresie przygotowania macierzy, osadzania komórek i nakładania pożywki w celu zapewnienia powtarzalności.
- Wymaga adaptacji protokołów izolacji w celu odzyskania żywych komórek z macierzy żelowej bez naruszania ich żywotności lub fenotypu.
- Ograniczone koniecznością unikania zmian pożywki, które mogłyby zakłócić strukturę macierzy, co wymaga stosowania ostrożnych technik częściowej wymiany pożywki w razie potrzeby.
