Name: Wykorzystanie Galleria mellonella jako organizmu modelowego do badania zakażenia Legionella pneumophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 30 s
Description: Poznaj metodę inokulacji i analizy patogenezy Legionella pneumophila przy użyciu larw Galleria mellonella. Technika umożliwia szybką ocenę wirulencji bakterii w organizmie żywym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

C.R. Harding był wspierany przez WT086724 stypendialny Wellcome Trust.

1. Przygotowanie L. pneumophila do zakażenia
<ol>
	<li>Przygotuj płytki z ekstraktem drożdżowym z węgla drzewnego (CYE) (2 g/L węgla aktywnego, 10 g/L ekstraktu drożdżowego, 13 g/L agaru, 10 g/L kwasu N-(2-acetamido)-2-aminotanesulfoninowego (ACES), 1 g/L α-ketoglutaran, 0,4 g/L L-cysteiny HCl i 0,25 g/L pirofosforanu żelaza, pH 6,9). 
	Uwaga: W razie potrzeby dodać kanamycynę (25 μg/ml) i/lub chloramfenikol (6 μg/ml) do płytek CYE.
	<ol>
		<li>Wszystkie prace związane z L. pneumophila należy wykonywać na poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2) w komorze bezpieczeństwa mikrobiologicznego (MSC) zgodnie z lokalnymi przepisami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Smuga L. pneumophila z -80 °C glicerolu na płytki CYE</li>
	<li>Inkubować płytki przez 4 dni w temperaturze 37 °C. 
	Uwaga: Inkubacja płytek przez 4 dni znacznie zwiększa zjadliwość L. pneumophila w G. mellonella w porównaniu z inkubacją przez 3 dni.</li>
	<li>Na dzień przed zakażeniem ponownie zawiesić jedną pętlę pełną bakterii (zawierającą kilka kolonii) w 1 ml podgrzanego (37 °C) bulionu z ekstraktu drożdżowego ACES (AYE) i zmierzyć absorbancję przy 600 nm (OD600) za pomocą spektrofotometru.</li>
	<li>Zaszczepić świeżą 3 ml kultury AYE (antybiotykami, jeśli jest to wymagane) do końcowego OD600 0,1.
	<ol>
		<li>Dołącz kontrolę tylko podłoża, aby zapewnić sterylność podłoża.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsaniem przy 200 obr./min przez 21 godz. 
	Uwaga: Bakterie powinny być hodowane do fazy postwykładniczej w przypadku infekcji38. Uprawa przez 21 godzin pozwala na standaryzację eksperymentów. 
	Uwaga: Jeśli jest to wymagane do indukcji białka, dodać 0,5 mM izopropylu β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG) na noc.</li>
	<li>Zmierz OD600 (bakterie powinny być w fazie wzrostu wykładniczego, OD600 2,5-3).</li>
	<li>Rozcieńczyć kulturę bakteryjną, aby uzyskać 1 x 109 jtk/ml w sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem Dulbecco (D-PBS). 
	Uwaga: Na podstawie poprzednich wyników, OD600 równe 1 odpowiada 1 x 109 jtk/ml, jednak powinno to zostać potwierdzone dla różnych szczepów L. pneumophila. 
	Uwaga: jeśli wymagana jest indukcja białka z plazmidu, dodać 1 mM IPTG do inokulum.</li>
	<li>Ułożyć inokulum na płytce zgodnie z opisem w sekcji 9 jako kontrolę, aby upewnić się, że oczekiwana jtkówka jest obecna w inokulum.</li>
</ol>
2. Przygotowanie larw
<ol>
	<li>Kup wystarczającą ilość larw G. mellonella od komercyjnego dostawcy. Larwy są wysyłane w 5. lub 6.stadium rozwojowym (około 2-3 cm długości) i nadają się do natychmiastowego użycia. 
	Uwaga: Metoda opisująca sposób hodowli larw została opisana wcześniej39 . 
	Uwaga: Larwy mogą być przechowywane w temperaturze pokojowej do dwóch tygodni i nie wymagają jedzenia. Natychmiast wyrzuć wszystkie larwy wykazujące oznaki przepoczwarzenia.</li>
	<li>Przygotuj pojemnik na larwy, umieszczając okrąg z 10 cm bibuły filtracyjnej na dnie 10 cm szalki Petriego.</li>
	<li>Za pomocą pęsety z końcówką umieść dziesięć zdrowych larw o mniej więcej podobnej wielkości na szalce Petriego. 
	Uwaga: Wyrzuć niezdrowe brązowe lub plamiste owady. Zdrowe larwy są jednolicie kremowo ubarwione, bez obszarów ciemnych przebarwień i są w stanie szybko się wyprostować po odwróceniu.</li>
</ol>
3. Zakażenie larw G. mellonella
<ol>
	<li>Przygotować platformę iniekcyjną, przyklejając krąg bibuły filtracyjnej do powierzchni.</li>
	<li>Bezpiecznie przyklej końcówkę P1000 poziomo do bibuły filtracyjnej, aby utworzyć platformę iniekcyjną. To nie musi być sterylne.</li>
	<li>Wysterylizuj strzykawkę o pojemności 20 μl do mikromiareczkowania, odsysając 70% etanolu i inkubując przez co najmniej 10 minut.
	<ol>
		<li>Podczas wstrzykiwania należy nosić rękawice odporne na przebicie,</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usuń resztki etanolu, kilkakrotnie zasysając i wydmuchując sterylną wodę.</li>
	<li>Za pomocą strzykawki odessać 10 μl zawiesiny L. pneumophila 1 x 109 jtk/ml.</li>
	<li>Weź jedną larwę i delikatnie, ale stanowczo obróć ją na plecy, pochyl się nad końcówką P1000.</li>
	<li>Umieścić końcówkę strzykawki na przednim, prawym przednim odnóżu larwy.</li>
	<li>Delikatnie wprowadzić końcówkę igły do nogi, upewniając się, że znajduje się ona wewnątrz larw, a następnie delikatnie wstrzyknąć całą zawartość strzykawki. 
	Uwaga: Jeśli strzykawka jest prawidłowo włożona, powinno być możliwe pobranie larw za pomocą samej strzykawki w celu umieszczenia jej w komorze.
	<ol>
		<li>Po wstrzyknięciu należy obserwować larwy przez kilka sekund. Larwy zaczną pełzać po kilku sekundach, ale nie powinny wydalać płynu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Krótko obserwować larwy kilka godzin po zakażeniu; zakażenie 107 CFU L. pneumophila 130b nie powoduje żadnych objawów w ciągu pierwszych 5-8 godzin p.i. Dlatego, jeśli larwy zmienią kolor na szary/przed tym momentem, eksperyment należy przerwać. 
	Uwaga: Inokulacja larw 1 mM IPTG nie wpływa na żywotność larw w trakcie trwania eksperymentu.</li>
	<li>W ten sam sposób wstrzyknąć łącznie 10 larw na stan, w tym 10 larw, którym wstrzyknięto D-PBS, aby służyły jako kontrola do analizy śmiertelności larw.</li>
	<li>Zakleić taśmą szalki Petriego i umieścić je w wtórnym zabezpieczeniu.</li>
	<li>Inkubować w standardowym inkubatorze bakteryjnym w temperaturze 37 °C przez czas trwania doświadczenia.</li>
</ol>
4. Wstępne leczenie larw inhibitorem chemicznym
<ol>
	<li>Przed zakażeniem należy przygotować larwy do wstrzyknięć w sposób opisany w punkcie 3.1-3.6.</li>
	<li>Wstrzyknąć 10 μl 100 μM roztworu cytochalazyny D w przednią, lewą nogę 10 larw. 
	Uwaga: Inhibitor jest wstrzykiwany do innego prolegu z zawiesiny bakteryjnej w celu zmniejszenia uszkodzenia larw.</li>
	<li>Wstrzyknąć 10 μl DMSO do 10 larw jako kontrolę.</li>
	<li>Inkubować larwy w temperaturze 37 °C przez 4 godziny.</li>
	<li>Wstrzyknąć wstępnie leczone larwy zgodnie z opisem w sekcji 3 w przednią, prawą nogę za pomocą 1 x 107 CFU WT L. pneumophila lub kontrolnej PBS.</li>
</ol>
5. Analiza śmiertelności larw
<ol>
	<li>Po 18 godzinach od zakażenia (p.i.) zbadaj wszystkie zakażone larwy pod kątem śmiertelności.</li>
	<li>Aby sprawdzić śmiertelność, użyj pęsety z końcówką, aby przewrócić larwy i poszukać ruchu nóg, zdrowe larwy powinny szybko się wyprostować. Pigmentacja wskazuje na silną reakcję immunologiczną na infekcję. Jeśli jest jakiś ruch, licz jako żywy.</li>
	<li>Rekordowa liczba martwych i żywych larw.</li>
	<li>Powtórz ten proces we wszystkich pozostałych wybranych punktach czasowych. 
	Uwaga: Jeśli inkubacja jest kontynuowana przez więcej niż trzy dni, można zobaczyć poczwarki. Usunąć poczwarki i poddać eutanazji przez zamrożenie w temperaturze -20 °C, zanim dojdzie do metamorfozy.</li>
</ol>
6. Ekstrakcja hemolimfy
<ol>
	<li>Losowo wybierz trzy larwy i umieść je w probówce o pojemności 14 ml w wybranych punktach czasowych, takich jak 5 i 18 godzin p.i.,</li>
	<li>Umieść tę rurkę na lodzie na 5-10 minut, aż nie będzie można zaobserwować ruchu nóg larw.</li>
	<li>Umieść znieczulone larwy na szalce Petriego i za pomocą skalpela wykonaj nacięcie między dwoma segmentami w pobliżu ogona larwy.</li>
	<li>Wyciśnij larwy do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml, aby zebrać hemolimfę.
	<ol>
		<li>Basen hemolimfa od co najmniej trzech osobników. Jedna larwa daje od 15 do 50 μl hemolimfy w zależności od wielkości. 
		Uwaga: Podczas ekstrakcji hemolimfy bardzo łatwo jest zakłócić pracę jelit, co prowadzi do potencjalnego zanieczyszczenia próbek. Zmniejsz zanieczyszczenie, odcinając larwy w pobliżu ogona (z dala od jelita), jednak podczas posiewu bakterii zawsze będzie wymagany dobór antybiotyków. 
		Uwaga: Aby zapobiec brązowieniu i koagulacji hemolimfy, przetwórz hemolimfę w ciągu 10 minut po pobraniu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyrzucić ciało larwy do nowej probówki Falcon o pojemności 14 ml, zamknąć i umieścić w temperaturze -20 °C na noc, aby upewnić się, że larwy są martwe.</li>
	<li>Martwe larwy należy sterylizować w autoklawie i utylizować zgodnie z lokalnymi przepisami.</li>
</ol>
7. Określenie żywotności hemocytów
<ol>
	<li>Wyciągnij hemolimfę, jak opisano powyżej.</li>
	<li>Wymieszać 20 μl wyekstrahowanej hemolimfy z 20 μl 0,02% (v/v) błękitu trypanowego w PBS w jednym dołku na 96-dołkowej płytce.</li>
	<li>Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Załaduj 10 μl hemolimfy na hemocytometr i policz żywotne (nie niebieskie) komórki.</li>
	<li>Policz każdą próbkę w trzech egzemplarzach, aby zmniejszyć błąd.</li>
</ol>
8. Przetwarzanie wyekstrahowanych hemocytów do mikroskopii immunofluorescencyjnej
<ol>
	<li>Wymieszać zebraną hemolimfę wyekstrahowaną z co najmniej trzech larw i odpipetować na szklanym szkiełku nakrywkowym o średnicy 10-15 mm na 24-dołkowej płytce. 
	Uwaga: Szkiełka nakrywkowe nie wymagają leczenia, ponieważ hemocyty mogą przylegać do szkła.</li>
	<li>Dodać 0,5 ml D-PBS i dobrze wymieszać, pipetując w górę i w dół.</li>
	<li>Wirować płytkę przez 10 minut przy 500 x g w temperaturze pokojowej (RT) za pomocą aerozolowego uchwytu na płytkę wirówkową.</li>
	<li>Zbadaj każdą studzienkę za pomocą odwróconego mikroskopu, aby sprawdzić, czy hemocyty przylegają.</li>
	<li>Usunąć supernatant i ostrożnie umyć komórki trzy razy, dodając 0,5 ml D-PBS do ścianki studzienki, kołysząc płytką 2-3 razy i usuwając D-PBS za pomocą pipety.</li>
	<li>Utrwalić komórki przez dodanie 0,5 ml 4% (v/v) paraformaldehydu (PFA) w PBS.</li>
	<li>Inkubować komórki przez 20-30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyj komórki trzykrotnie D-PBS, tak jak poprzednio.</li>
	<li>Dodać 0,5 ml 15 mM NH4Cl do PBS w celu ugaszenia pozostałości PFA i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.</li>
	<li>Umyj komórki trzykrotnie za pomocą D-PBS. 
	Uwaga: Na tym etapie szkiełka nakrywkowe można przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Dodać 0,5 ml 0,1% Triton X-100 do PBS i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu przepuszczalności komórek.</li>
	<li>Blokuj przez 1 godzinę roztworem blokującym (2% (w/v) BSA w PBS).</li>
	<li>Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności z pierwszorzędowym przeciwciałem rozcieńczonym w roztworze blokującym w rozcieńczeniu określonym przez producenta.</li>
	<li>Umyj 3x PBS.</li>
	<li>Inkubować przez 1 godzinę z przeciwciałem drugorzędowym i DAPI w celu wizualizacji bakterii, jak powyżej.</li>
	<li>Umyj 3x PBS.</li>
	<li>Zamontuj szkiełka nakrywkowe za pomocą jednej kropli odczynnika montażowego na szkiełkach podstawowych.</li>
	<li>Inkubować przez noc w ciemności w temperaturze pokojowej, aby całkowicie wysuszyć roztwór montażowy.</li>
	<li>Szkiełka obrazowe na mikroskopie fluorescencyjnym.</li>
</ol>
9. Kwantyfikacja bakteryjnej CFU
<ol>
	<li>Dodać 100 μg/ml spektynomycyny do płytek CYE, aby uniknąć zanieczyszczenia przez florę jelitową. L. pneumophila szczep 130b jest naturalnie odporny na spektynomycynę40.</li>
	<li>Przed ekstrakcją hemolimfy odważyć 1,5 ml probówek wirówkowych.</li>
	<li>Wyekstrahować hemolimfę zgodnie z opisem w sekcji 6 i umieścić w zważonych probówkach, dodać 1 μl 5 mg/ml digitoniny, dobrze wymieszać i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu lizy hemocytów.</li>
	<li>Ponownie zważyć probówkę z hemolimfą i określić masę wyekstrahowanej hemolimfy.</li>
	<li>Wykonaj dziesięciokrotne seryjne rozcieńczenia hemolimfy w sterylnych pożywkach AYE.</li>
	<li>Za pomocą długopisu podziel podstawę płytki CYE na sześć równych sektorów i oznacz etykietą.</li>
	<li>Umieścić na płytce trzy krople po 25 μl każdego rozcieńczenia (zaczynając od najbardziej rozcieńczonego) w każdej sekcji płytki.</li>
	<li>Inkubować płytki z pokrywkami skierowanymi do góry przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Po całkowitym wyschnięciu kropli odwrócić płytkę i inkubować w temperaturze 37 °C przez co najmniej kolejne dwa dni.</li>
	<li>Określ ilościowo wyekstrahowane bakterie, licząc kolonie przy każdym rozcieńczeniu i znormalizuj do masy wyekstrahowanej hemolimfy.</li>
</ol>
10. Wyznaczanie Indeksu Konkurencyjności (CI)
<ol>
	<li>Upewnij się, że oba szczepy rosną równie dobrze w kulturze bulionowej i na płytkach agarowych CYE przed próbą uzyskania indeksu konkurencyjnego.</li>
	<li>Przygotować zawiesiny zmutowanych bakterii odpornych na WT lub kanamycynę, jak opisano w punkcie 1 i wymieszać w stosunku 1:1.
	<ol>
		<li>Płytki seryjne rozcieńczenia inokulum na spektynomycynę CYE (100 μg/ml) i spektynomycynę CYE / kanamycynę</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zainfekuj larwy i wyekstrahuj hemolimfę w odpowiednich punktach czasowych, jak opisano powyżej.</li>
	<li>Określ żywotne liczby, ekstrahując hemolimfę i posiewając seryjne rozcieńczenia na spektynomycynę CYE i spektynomycynę CYE / kanamycynę.</li>
	<li>Obliczyć wskaźnik konkurencyjności (CI) w następujący sposób: CI = (produkcja mutanta/produkcja WT)/(zmutowany inokulum/inokulum WT).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Model larwalny Galleria mellonella dla zakażenia Legionella pneumophila jest użytecznym narzędziem do badań patogenezy in vivo . Wykazano tutaj, że wiele aspektów infekcji makrofagami można podsumować w modelu G. mellonella , w tym rolę Dot/Icm T4BSS w wirulencji i replikacji bakterii oraz lokalizację efektora Dot/Icm SidC. Ponadto wykazaliśmy, że chemiczny inhibitor polimeryzacji aktyny znacznie zmniejsza śmiertelność larw, naśladując wyniki uzyskane w macofagach47 i potwierdzając dowody na to, że internalizacja bakterii jest wymagana, aby spowodować śmiertelność larw. Wcześniej wykazano, że różnice w zjadliwości między szczepami L. pneumophila obserwowane w innych modelach infekcji można zweryfikować u G. mellonella i że indukcja czynników wirulencji w fazie wzrostu po wykładniczym wzroście jest wymagana dla zjadliwości bakterii36, potwierdzając, że G. mellonella jest odpowiednim modelem zakażenia L. pneumophila .
Określenie CFU L. pneumophila na podstawie larw zakażonych pojedynczo lub w zakażeniach mieszanych znacznie zwiększa użyteczność modelu. Wcześniej odkryto kilka czynników, które mają subtelny wpływ na replikację bakterii w jednym lub więcej modelach infekcji29,48-51. Chociaż larwy nie posiadają adaptacyjnego układu odpornościowego, obecność wrodzonej odpowiedzi immunologicznej zapewnia silniejszą selekcję w porównaniu z samymi makrofagami, co może służyć do wzmacniania subtelnych fenotypów. W związku z tym możliwe jest, że chociaż szczepy te prawdopodobnie nie wpłyną znacząco na śmiertelność larw, mogą wykazywać zmniejszoną replikację lub dopasowanie bakterii w modelu G. mellonella . Oprócz replikacji L. pneumophila w larwach, wykazaliśmy znaczne wyczerpanie hemocytów pod koniec infekcji. Ponieważ oczekuje się, że L. pneumophila będzie lizować komórki gospodarza pod koniec cyklu replikacji, pomiar wyczerpania hemocytów może również służyć jako pośredni pomiar replikacji bakterii. Wyczerpanie hemocytów było wcześniej skorelowane ze śmiertelnością owadów w infekcji3,52, chociaż ostatnie wyniki sugerują, że obraz ten jest bardziej złożony niż początkowo sądzono. Ostatnio wykazano, że głód larw prowadzi do zwiększonej podatności na infekcje poprzez tłumienie odpowiedzi immunologicznej53. W opisanych tutaj testach larwy nie były karmione przez cały czas trwania badania i nie wiadomo, jak dobrze odżywione larwy zareagowałyby na zakażenie L. pneumophila .
Jedną z zalet G. mellonella jako organizmu modelowego jest łatwość ekstrakcji i oznaczania ilościowego hemocytów z zakażonych larw. Poprzednie filmy pokazywały różne metody ekstrakcji hemocytów z owadów54,55, jednak przedstawiona tutaj metoda jest prosta i nadaje się do natychmiastowego przetwarzania. Po ekstrakcji hemocyty można łatwo określić ilościowo, wykorzystać do immunofluorescencji, transmisyjnej mikroskopii elektronowej36 lub cytometrii przepływowej56 lub hodować i zakażać ex vivo3, co pozwala na szczegółowe zbadanie odpowiedzi komórek na zakażenie. To znacznie zwiększa elastyczność modelu. Jednym z zastrzeżeń dotyczących immunofluorescencji u G. mellonella jest ograniczona podaż przeciwciał zwalidowanych przeciwko białkom G. mellonella. Jednak badania wykazały tworzenie przeciwciał przeciwko białkom larwalnym57 i stwierdzono, że przeciwciała przeciwko ludzkim białkom związanym z odpornością rozpoznają białka G. mellonella 11, co wskazuje na potencjał immunofluorescencji hemocytów G. mellonella.
Łatwość zakażenia G. mellonella pozwala na szybkie, średnio przepustowe badania przesiewowe, które można wykorzystać do porównania zjadliwości różnych gatunków i szczepów Legionella oraz można je wykorzystać do dalszej analizy wcześniej zidentyfikowanych czynników wirulencji, takich jak cząsteczki adhezyjne58 lub system wydzielania typu 259, które są wymagane do zjadliwości w innych modelach. Ponadto zastosowanie tego modelu pozwoli na identyfikację i dalszą charakterystykę nowych czynników wirulencji, w tym wydzielanych i translokowanych białek efektorowych. Ostatnio wykazano, że aktywność fosfolipazy C L. pneumophila odgrywa rolę w wirulencji G. mellonella 60 i że białko efektorowe Dot/Icm SdhA jest wymagane do zjadliwości37. Ponadto niedawno wykazaliśmy, że istnieje korelacja między fenotypami obserwowanymi u G. mellonella i w mysim szczepie A/J37.
Podkreśla to wartość tego narzędzia jako uzupełnienia środowiskowych modeli zakażeń pierwotniakami oraz jednokomórkowymi dawcami i mysimi gospodarzami. Model G. mellonella stanie się jeszcze bardziej wartościowy w przyszłości, gdy dostępna będzie sekwencja genomowa larw i stworzonych zostanie więcej narzędzi genetycznych. Kroki w tym kierunku obejmują niedawną publikację szczegółowo opisującą transkryptom61 związany z odpornością oraz utworzenie inicjatywy mającej na celu przyspieszenie wyciszania genów u Lepidoptera spp62.
Korzystając z larw G. mellonella , mamy szereg prostych, szybkich odczytów zjadliwości bakterii, które można wykorzystać do zbadania patogenezy L. pneumophila. Opracowanie tych testów i szersze badania przesiewowe szczepów i grup serologicznych L. pneumophila zwiększy użyteczność tego nowego narzędzia i przyczyni się do lepszego zrozumienia patogenezy L. pneumophila .

Zwierzęce modele infekcji okazały się nieocenione w określaniu czynników wirulencji bakterii. Jednak modele bezkręgowców zyskały coraz większą uwagę jako realna alternatywa dla tradycyjnych modeli infekcji ssaków. Larwy woskowej Galleria mellonella są coraz częściej wykorzystywane do badania wielu ważnych patogenów ludzkich, w tym bakterii Gram-dodatnich1 i Gram-ujemnych2,3 oraz kilku grzybów chorobotwórczych4,5. Korzystanie z modelu owada ma wiele zalet w porównaniu z tradycyjnymi modelami ssaków, jako bezkręgowiec, G. mellonella nie podlega ograniczeniom etycznym modeli ssaków. Ponadto larwy mogą być łatwo utrzymywane w organizmie, zakażone przez wstrzyknięcie bez znieczulenia, poddawane wstępnej obróbce inhibitorami chemicznymi6 i utrzymywane w inkubacji w temperaturze 37 °C7. Co ciekawe, ustalono dobrą korelację między patogennością kilku mikroorganizmów u G. mellonella a modelami infekcji ssaków2,8. Lepsze zrozumienie układu odpornościowego G. mellonella pomogło również w scharakteryzowaniu tego organizmu modelowego. Chociaż owady nie mają adaptacyjnego układu odpornościowego, jak u ssaków, mają wyrafinowane mechanizmy obronne komórkowe i ramienne, w tym produkcję peptydów przeciwdrobnoustrojowych9. Hemocyty są głównym mediatorem obrony komórkowej i są najliczniejszym typem komórek występującym w hemolimfie (lub krwi) G. mellonella10, Komórki te są profesjonalnymi fagocytami i pełnią podobne funkcje do ludzkich makrofagów i neutrofili, zarówno pobierając, jak i rozkładając bakterie w przedziale fago-lizosomalnym10,11 i tworząc guzki wokół atakujących bakterii, Fizyczne ograniczanie replikacji bakterii12.
Legionella pneumophila to patogen układu oddechowego, który powoduje ciężkie zapalenie płuc (chorobę legionistów) w populacjach podatnych, takich jak osoby starsze lub z obniżoną odpornością13. Legionella występuje powszechnie zarówno w środowiskowych, jak i sztucznych źródłach wody, gdzie jest patogenem różnych gatunków ameb słodkowodnych14,15. Legionella przeżywa i replikuje się w tych profesjonalnych fagocytach, wykorzystując wielobiałkowy kompleks znany jako system wydzielania typu 4 Dot / Icm (wadliwy w transporcie organelli / namnażaniu wewnątrzkomórkowym) (T4SS) do translokacji ponad 275 białek efektorowych do komórki gospodarza16-20. Białka te służą do obalenia normalnych szlaków fagocytarnych komórek gospodarza, prowadząc do powstania wakuoli zawierającej Legionellę (LCV). LCV unika fuzji z lizosomami, a zamiast tego rekrutuje pęcherzyki pochodzące z retikulum endoplazmatycznego (ER), co skutkuje wyspecjalizowanym przedziałem, który przypomina szorstki ER21,22. L. pneumophila jest uważana za przypadkowy ludzki patogen; Te same strategie, które pozwalają mu na replikację w obrębie ameb, umożliwiają również replikację w ludzkich makrofagach pęcherzykowych23.
Żywiciele ssaków zostali scharakteryzowani jako modele dla ludzkiej infekcji Legionella, w tym myszy i świnki morskie24,25. Jednak większość szczepów myszy jest odporna na zakażenie Legionellą 26, z wyjątkiem wsobnej myszy albinosa A/J, u której rozwija się łagodna, samoograniczająca się infekcja24. Chociaż model świnki morskiej bardziej przypomina chorobę człowieka25, brak mutantów i zwiększone koszty zniechęcają do ich stosowania27. Ponadto opracowano kilka modeli bezkręgowców pod kątem zakażenia Legionella pneumophila, w tym Caenorhabditis elegans28, Drosophila melanogaster29 i kilka gatunków ameb30-32. Modele te mają jednak słabe strony, zjadliwość w układzie C. elegans nie jest zależna od Dot/Icm28, co ogranicza użyteczność tego modelu. Model Drosophila okazał się skuteczny w badaniu bakteryjnych czynników wirulencji29 i wydaje się być obiecujący, jednak model ten nie został w pełni scharakteryzowany. Jednokomórkowe ameby są żywicielami środowiskowymi L. pneumophila i są idealne do badania działania czynników wirulencji na poziomie molekularnym33, jednak brakuje im kilku ważnych mediatorów odpowiedzi komórek gospodarza ssaków na infekcję, takich jak kaspazy34. Słabości istniejących modeli, wraz z wysokimi kosztami i obawami etycznymi związanymi z eksperymentami na ssakach, doprowadziły do poszukiwania innych odpowiednich organizmów modelowych29,35.
Ostatnio wykazaliśmy, że G. mellonella jest odpowiednim modelem dla patogenezy L. pneumophila 36,37. Protokół ten szczegółowo opisuje techniki eksperymentalne stosowane do infekowania larw G. mellonella, analizowania moralności larw, ekstrakcji hemocytów do liczenia i immunofluorescencji oraz określania replikacji przez żywotną liczbę CFU od zakażonych larw.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Materiał/ Sprzęt</td></tr><tr><td>ACES ekstrakt drożdżowy (AYE) bulion</td><td></td><td></td><td>4 g ACES, 4 g ekstraktu drożdżowego, 0,4 g &#945;-ketoglutaran, pH 6,9, 400 ml H2O, autoklawowany, 4 ml roztworu żelaza*, 4 ml roztworu cysteiny* *dodaj sterylne składniki po autoklawowaniu</td></tr><tr><td>Płytki</td><td></td><td></td> <td>z ekstraktem drożdżowym buforowanym węglem drzewnym (CYE)Jak wyżej, z dodatkiem 0,6 g węgla aktywnego i 6 g agaru</td></tr><tr><td>Sterylny roztwór żelaza (pirofosforan żelaza)</td><td>Sigma</td><td>P6526</td><td>0,6 mM roztwór, sterylnie filtrowany</td></tr><tr><td>Sterylny roztwór cysteiny</td><td>Sigma</td><td>C7880</td><td>3,3 mM, sterylny filtrowany</td></tr><tr><td>G. mellonella (waxworms)</td><td>Livefood UK</td><td>W250</td><td></td></tr><tr><td>Izotiocyjanian anty-HA-tetrametylodaminy rodaminy ( TRITC)</td><td>Sigma</td><td>H9037</td><td></td></tr><tr><td>Anty-Legionella LPS</td><td>Cambridge Biosciences</td><td>PA1-7227</td><td></td></tr><tr><td>IgG przeciw królikom Alexa488</td><td>Jackson Immunoreach</td><td>711-485-152</td><td></td></tr><tr><td>Izopropyl &#946;-D-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG)</td><td>Sigma</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbeccos (D-PBS)</td><td>Sigma</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Agar Scientific</td><td>R1026</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek amonu (NH4Cl)</td><td>Sigma</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanowego</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Digitonina</td><td>Sigma</td><td>D141</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalazyna D</td><td>Biomol International</td><td>BML-T109-0001</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[nagłówek]</td></tr><tr><td colspan="4">Materiał</td></tr><tr><td>Strzykawka do mikromiareczkowania</td><td>Sigma</td><td>24544</td><td></td></tr><tr><td>Licznik komórek, podwójny, Ulepszony Neubauer </td><td>VWR</td><td>631-0926</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td></td><td></td><td>Do płytek wirujących </td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td></td><td></td> fluorescencyjny <td>Dowolny mikroskop z odpowiednimi filtrami dla wymaganych fluoroforów</td></tr><tr><td>Odwrócony mikroskop</td><td></td><td></td><td>Do żywego liczenia komórek </td></tr><tr><td>Rękawica odporna na przebicie</td><td>Turtleskin</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wykorzystanie galleria mellonella jako organizmu modelowego do badania zakażenia legionella pneumophila

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Legionella pneumophila, czynnik wywołujący ciężkie zapalenie płuc zwane chorobą legionistów, jest ważnym ludzkim patogenem, który infekuje i replikuje się w makrofagach pęcherzykowych. Jego zjadliwość zależy od systemu wydzielania Dot / Icm typu IV (T4SS), który jest niezbędny do ustanowienia dopuszczającej replikację wakuoli znanej jako wakuola zawierająca Legionella (LCV). Zakażenie L. pneumophila można modelować u myszy, jednak większość szczepów myszy nie jest pobłażliwa, co prowadzi do poszukiwania nowych modeli infekcji. Niedawno wykazaliśmy, że larwy woskowej Galleria mellonella nadają się do badania zakażenia L. pneumophila. G. mellonella jest coraz częściej stosowana jako model infekcji ludzkimi patogenami i istnieje dobra korelacja między zjadliwością kilku gatunków bakterii u owadów i w modelach ssaków. Kluczowym elementem obrony immunologicznej larw są hemocyty, profesjonalne fagocyty, które zabierają i niszczą najeźdźców. L. pneumophila jest zdolna do infekowania, tworzenia LCV i replikacji w tych komórkach. Tutaj pokazujemy protokoły analizy wirulencji L. pneumophila w modelu G. mellonella, w tym sposób hodowli zakaźnej L. pneumophila, wstępnego leczenia larw inhibitorami, infekowania larw oraz ekstrakcji zakażonych komórek do oceny ilościowej i mikroskopii immunofluorescencyjnej. Opisujemy również, jak określić ilościowo replikację i dopasowanie bakterii w testach zawodniczych. Podejścia te pozwalają na szybkie badania przesiewowe mutantów w celu określenia czynników ważnych dla zjadliwości L. pneumophila, opisując nowe narzędzie, które pomoże nam zrozumieć ten złożony patogen.

W niniejszym doświadczeniu wykazano, że G. mellonella jest odpowiednim i łatwym w użyciu modelem do badania infekcji L. pneumophila. Wcześniej wykazano, że wirulencja L. pneumophila w makrofagach, amebach i modelach ssaków zależy od obecności systemu sekrecji Dot/Icm 41-43. Larwy G. mellonella zainfekowano zgodnie z powyższym opisem, a następnie porównano wirulencję szczepu dzikiego (WT) oraz szczepu z defektem Dot/Icm. Infekcja dawką 107 CFU szczepu 130b L. pneumophila spowodowała 100% śmiertelność w ciągu 24 h po infekcji (p.i.). Jednak szczep L. pneumophila ΔdotA, który nie posiada funkcjonalnego systemu sekrecji T4SS Dot/Icm, był awirulentny w tym badaniu (Rycina 1). Dowodzi to, że wirulencja L. pneumophila u G. mellonella zależy od translokacji efektorów Dot/Icm, co czyni ten model odpowiednim do charakteryzacji funkcji tych białek.
Niedawno wykazano, że hamowanie fagocytozy za pomocą cytochalazyny zwiększyło podatność larw na zakażenie drożdżakami Candida albicans6. Ponieważ L. pneumophila jest patogenem wewnątrzkomórkowym, postanowiono sprawdzić, czy pobieranie bakterii jest kluczowe w jej patogenezie w tym modelu. Larwy poddano wstępnej obróbce 10 μl 100 μM cytochalazyny D (CyD) przez 4 hr w temperaturze 37 °C, a następnie zainfekowano 107 CFU szczepu WT L. pneumophila 130b i monitorowano śmiertelność po 24 hr p.i. Podanie samego inhibitora nie wpłynęło na przeżywalność larw. Jednakże larwy poddane wstępnej obróbce i zakażone wykazały znacznie wyższą przeżywalność (P = 0,0066, nieparzysty test T) w porównaniu do zainfekowanych owadów traktowanych DMSO (Rysunek 2). Efekt działania CyD zniknął po 48 hr p.i. (wyniki nie zostały przedstawione); może to wynikać z okresu półtrwania leku u G. mellonella. Dowodzi to, że pobieranie L. pneumophila do hemocytów G. mellonella jest kluczowym aspektem wirulencji bakterii.
W celu walidacji ekspresji oraz określenia lokalizacji subkomórkowej białka efektorowego u G. mellonella, wyekstrahowano hemocyty i poddano je obróbce do mikroskopii immunofluorescencyjnej. Larwy zainfekowano szczepami WT oraz ΔdotA L. pneumophila 130b wykazującymi ekspresję fragmentu dobrze poznanego efektora T4SS, SidC41-918, zfuzowanego z czterema znacznikami HA na N-końcu. Wykazano, że efektor ten wiąże się z LCV poprzez domenę wiążącą fosfoinozytolo-4-fosforan44. Przy użyciu przeciwciał anty-HA (czerwony) i anty-Legionella (zielony), białko 4HA-SidC41-918 zlokalizowano w LCV w zainfekowanych hemocytach (Rysunek 3). Lokalizacja ta została wcześniej wykazana w amebach Dictyostelium discoideum oraz w makrofagach ssaków44,45, co potwierdza porównywalność tego modelu.
Znaczenie białek dla wirulencji określa się zazwyczaj poprzez porównanie kinetyki wzrostu bakterii typu dzikiego i mutantów. Aby monitorować kinetykę replikacji bakteryjnej w przebiegu infekcji, w każdym punkcie czasowym (0, 5, 18 i 24 h p.i.) uśmiercano trzy larwy, pobierano i łączono hemolimfę, a następnie wyznaczano liczbę CFU/0,1g wyekstrahowanej hemolimfy. Po początkowym spadku w 5 h p.i., liczba CFU bakterii typu WT wzrasta aż do 24 h p.i., natomiast szczep ΔdotA nie replikuje się i zostaje całkowicie usunięty do 18 h p.i. (Ryc. 4).
Zdolność L. pneumophila do wywoływania lizy makrofagów w sposób zależny od T4SS jest udokumentowana od dawna46, jednak nie przeprowadzono podobnych badań in vivo. Stężenie krążących hemocytów określono w 5, 18 i 24 h p.i. Larwy zainfekowano szczepem WT lub ΔdotA L. pneumophila 130b, hemocyty wyekstrahowano z zainfekowanych owadów, a żywe komórki policzono metodą wykluczania trypan blue. W 5 h p.i. nie stwierdzono różnic w liczbie hemocytów pomiędzy szczepami (Rycina 5). Jednak w 18 h p.i. odnotowano istotny spadek stężenia hemocytów w larwach zainfekowanych szczepem WT, ale nie w przypadku ΔdotA. Różnica ta utrzymywała się w 24 h p.i. Spadek liczby hemocytów, w połączeniu z obecnością bakterii wewnątrzkomórkowych widoczną w immunofluorescencji, sugeruje, że L. pneumophila replikuje się wewnątrz hemocytów, a następnie powoduje ich lizę, co umożliwia bakteriom przejście kilku cykli replikacji.
<img alt="Wykres analizy przeżywalności; % przeżywalności względem godzin po wstrzyknięciu; wpływ WT, ΔDotA i PBS na wskaźniki przeżywalności." fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/50964/50964fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Zakażenie L. pneumophila indukuje zależną od Dot/Icm śmiertelność larw. 10 larw zainfekowano samym PBS lub 107 CFU szczepu dzikiego (WT) lub ΔdotA L. pneumophila 130b, inkubowano w 37 °C przez 72 hr i rejestrowano czas śmierci larw. Wszystkie larwy zainfekowane szczepem WT zginęły w ciągu 24 hr po zakażeniu (p.i.), natomiast nie odnotowano śmiertelności w larwach inokulowanych samym PBS lub szczepem ΔdotA. Wyniki stanowią średnią z trzech oddzielnych eksperymentów, ± odchylenie standardowe.
<img alt="Wykres słupkowy przeżywalności; grupy badawcze: PBS, DMSO WT, 100μM CyD WT; analiza danych statystycznych." fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/50964/50964fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
Rysunek 2. Śmiertelność zależy od internalizacji bakterii. 10 larw L. pneumophila poddano wstępnej obróbce 10 μl 100 μM cytochalazyny D (CyD) przez 4 hr w 37 °C, a następnie zainfekowano 107 WT i monitorowano śmiertelność 24 hr p.i. Larwy poddane wstępnej obróbce wykazały istotnie (P = 0.0066, nieparzysty test T) zmniejszoną śmiertelność. Wyniki stanowią średnią z co najmniej czterech niezależnych eksperymentów ± odchylenia standardowe przy 10 larwach na warunek.
<img alt="Mikroskopia konfokalna infekcji Legionella z barwieniem DAPI, pokazująca wyniki dla szczepu WT i mutanta ΔdotA." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50964/50964fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Obrazowanie immunofluorescencyjne białek efektorowych w wyizolowanych hemocytach. Hemocyty wyizolowano z larw zainfekowanych szczepem L. pneumophila 130b WT lub ΔdotA wykazującym ekspresję 4HA-SidC41-918 w 5 hr p.i. Komórki barwiono przeciwciałami anty-HA (czerwony) i anty-Legionella (zielony) oraz barwnikiem DAPI do DNA (niebieski) w celu wizualizacji jąder. Zaobserwowano, że 4HA-SidC41-918 otaczał bakterie WT, ale nie ΔdotA. Pasek skali 5 μm.
<img alt="Wykres wzrostu CFU L. pneumophila, szczepy WT vs ΔdotA, godziny po iniekcji, analiza bakteryjna." fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/50964/50964fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. L. pneumophila replikuje się wewnątrz G. mellonella w sposób zależny od Dot/Icm. Larwy zainfekowano szczepami WT lub ΔdotA L. pneumophila, a w 0, 5, 18 i 24 h p.i. hemolimfę z trzech zainfekowanych owadów połączono, wysiano na płytki CYE, a następnie określono liczbę CFU i znormalizowano ją do inokulum oraz do masy wyekstrahowanej hemolimfy. WT L. pneumophila replikował się w trakcie eksperymentu, podczas gdy szczep ΔdotA został wyeliminowany w ciągu 18 h p.i. Wyniki stanowią średnią z trzech oddzielnych eksperymentów ± odchylenie standardowe.
<img alt="Porównanie wzrostu Legionella; wykres słupkowy; żywe komórki w czasie; szczepy WT vs ΔdotA; wynik eksperymentu." fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/50964/50964fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5. Zakażenie WT L. pneumophila prowadzi do znacznego zniszczenia hemocytów. Hemocyty wyizolowano w 5., 18. i 24. godzinie p.i. z larw zainfekowanych WT lub ΔdotA L. pneumophila, a liczbę żywych komórek policzono za pomocą hemocytometru. W 5. godzinie p.i. nie stwierdzono różnic w liczbie komórek między szczepami, natomiast w 18. godzinie p.i. w larwach zainfekowanych szczepem WT pozostało jedynie około 15% hemocytów w porównaniu ze szczepem ΔdotA. Wyniki stanowią średnią z trzech oddzielnych eksperymentów, ± odchylenie standardowe.

Larwa woskowej Galleria mellonella została niedawno ustanowiona jako model in vivo do badania infekcji Legionella pneumophila. W tym miejscu demonstrujemy podstawowe techniki charakteryzujące patogenezę Legionelli w larwach, w tym inokulację, pomiar zjadliwości i replikacji bakterii, a także ekstrakcję i analizę zakażonych hemocytów.

Wykorzystanie Galleria mellonella jako organizmu modelowego do badania zakażenia Legionella pneumophila

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykorzystanie larw moli woskowki Galleria melanoma do analizy patogenezy bakteryjnego patogenu Legionella pneumophila. W celu rozpoczęcia procesu, larwy zostaną zainfekowane szczepami L. pneumophila poprzez wstrzyknięcie w ciągu kolejnych 72 godzin.Indukcja śmiertelności larw jest sygnalizowana przez utratę mobilności oraz pojawienie się czarnej pigmentacji; larwy są uśmiercane w celu pobrania hemolimfy w różnych punktach czasowych. Następnie hemolimfę wysiewa się na płytki, aby zliczyć bakterie i zwizualizować komórki owada. Ostatecznie analiza wzrostu bakterii oraz zastosowanie mikroskopii immunofluorescencyjnej pozwalają uzyskać wgląd w niszę wewnątrzkomórkową, którą legionella utworzyła podczas infekcji in vivo, a także w różnice w wirulencji pomiędzy poszczególnymi szczepami.Główną zaletą tej techniki w porównaniu do modeli mysich i hodowli komórkowych Legionella jest to, że jest ona bardziej akceptowalna etycznie oraz pozwala na szybką i kosztowo efektywną analizę dużej liczby szczepów Legionella w organizmie wielokomórkowym, co sprawi, że procedura będzie przejrzysta. Harding, doktorant z mojego laboratorium, zawsze pracuje z L. pneumophila na poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 w komorach z laminarnym przepływem powietrza zgodnie z lokalnymi przepisami; najpierw inkubuje płytki z bakteriami przez cztery dni. Następnie, jeden dzień przed zainfekowaniem larw, resuspenduje jedną pętlę bakterii zawierającą kilka kolonii w jednym mililitrze podgrzanego bulionu AYE i mierzy absorbancję zawiesiny przy 600 nanometrach.Następnie zaszczep 3 ml świeżej kultury YE przy OD 600 wynoszącej 0,1. Inkubuj kultury w temperaturze 37 °C na wytrząsarce przy 200 RPM przez 21 godzin do fazy poeksponencjalnej, aby można było ich użyć do infekcji. Zmierz absorbancję zawiesiny przy 600 nm.Następnie rozcieńcz kulturę, aby uzyskać miliard CFU na mililitr. W DPBS przygotuj naczynie dla larw melanoma G, umieszczając okrągły papier filtracyjny o średnicy 10 centymetrów na dnie szalki Petriego o średnicy 10 centymetrów, używając pęsety z tępym zakończeniem. Umieść na papierze filtracyjnym 10 zdrowych larw o zbliżonej wielkości, odrzucając owady niezdrowe, o brązowym kolorze lub z plamami.Zdrowe larwy mają jednolity kremowy kolor, bez obszarów ciemnych przebarwień i potrafią szybko się poruszać. Jeśli larwy się odwrócą, przygotuj platformę do iniekcji, przyklejając taśmą papier filtracyjny do komory bezpieczeństwa. Następnie przyklej taśmą końcówkę P 1000 do papieru filtracyjnego.Następnie wysterylizuj strzykawkę mikrotitracyjną o pojemności 20 µL, pobierając 70% etanol i inkubując strzykawkę w 70% etanolu przez co najmniej 10 minut. Usuń pozostały w strzykawce etanol, kilkukrotnie pobierając i wyrzucając sterylną wodę. Następnie pobierz 10 µL zawiesiny L. pneumophila o stężeniu 1 miliarda CFU na ml.Przejmij jedną larwę i delikatnie, lecz pewnie, odwróć ją grzbietem do dołu na końcówkę pipety P 1000.Umieść końcówkę strzykawki nad przednią prawą odnóżką gąsienicy. Następnie delikatnie wprowadź końcówkę igły do odnóżki. Upewnij się, że igła znajduje się wewnątrz larwy i została wprowadzona płynnie.Wstrzyknij cały bolus o objętości 10 µL. Jeśli strzykawka została prawidłowo wprowadzona, powinno być możliwe pobranie larwy za pomocą samej strzykawki i przeniesienie jej do komory. Wstrzyknij łącznie 10 larw na każdą kondycję oraz kolejne 10 larw z samym DPBS jako kontrolę.Proces wstrzykiwania jest najbardziej wymagającym technicznie etapem procedury i będzie wymagał wprawy. Na koniec zaklej szczelnie szalki taśmą i umieść je w pojemniku wtórnym. Przechowuj je w temperaturze 37 °C przez cały czas trwania eksperymentu.Śmiertelność należy analizować w kilku punktach po zakażeniu. Aby zbadać śmiertelność zakażonych larw, należy użyć pęsety z tępymi końcami, aby odwrócić larwy i sprawdzić, czy poruszają odnóżami. Zdrowe larwy powinny szybko się wyprostować.Pigmentacja wskazuje na silną reakcję immunologiczną na infekcję. Jeśli występuje jakikolwiek ruch, należy uznać larwy za żywe w różnych odstępach czasu. Losowo wybierz trzy larwy i umieść je w probówce o pojemności 14 ml.Umieścić probówkę na lodzie na 5 do 10 minut, aż do momentu ustania ruchów odnóży. Następnie przenieść larwy do szalki Petriego. Za pomocą skalpela wykonać nacięcie pomiędzy dwoma segmentami w pobliżu odwłoka, aby zebrać hemolimfę z każdej larwy.Należy wykonywać nacięcia z dala od przewodu pokarmowego, aby zapobiec kontaminacji bakteriami jelitowymi. Wyciśnij hemolimfę z larw do sterylnej probówki do wirowania o pojemności 1,5 mililitra. Jedna larwa daje od 15 do 50 mikrolitrów hemolimfy.Hemolimfa musi zostać wykorzystana w ciągu 10 minut, aby zapobiec jej krzepnięciu i umożliwić określenie żywotności owada. W jednym dołku płytki 96-dołkowej wymieszaj 20 µL hemolimfy z 20 µL roztworu błękitu trypanowego; w ten sposób przygotuj trzy dołki. Inkubuj reakcje przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Następnie dla każdej reakcji wykorzystaj 10 µL w celu policzenia żywych komórek niebieskich za pomocą komory countingowej (hemo-cytometru). Aby przygotować hemocyty do badania mikroskopowego, pipetuj zebraną hemolimfę na szkiełko nakrywkę o średnicy od 10 do 15 mm w płytce 24-dołkowej.Następnie dodaj 0,5 ml DPBS i dokładnie wymieszaj hemolimfę, delikatnie potrząsając. Używając szczelnego uchwytu do płytek do wirówki, wiruj płytkę przez 10 minut przy 500 G w temperaturze pokojowej. Następnie sprawdź każdą studnię za pomocą mikroskopu odwróconego, aby potwierdzić, że hemocyty przywarły do powierzchni.Następnie należy usunąć nadsącz i ostrożnie wypłukać komórki trzykrotnie, dodając 0,5 ml DPBS na ściankę studzienki. Kilka razy delikatnie poruszyć płytką i odessać DPBS. Szczegółowe informacje na temat utrwalania i barwienia znajdują się w protokole tekstowym.Aby określić liczbę bakterii CFU, należy wykonać seryjne rozcieńczenia dziesięciokrotne hemolimfy w sterylnym medium YE. Następnie podziel podstawę płytki CYE zawierającej SPECTmycynę na sześć równych sektorów. Na każdą sekcję płytki naniesie się po trzy krople o objętości 25 µL z każdego rozcieńczenia, zaczynając od rozcieńczenia najmniejszego.Inkubuj te płytki, a następnie policz kolonie. Larwy G melan zainfekowano szczepami typu dzikiego oraz szczepami L pneumophila z defektem ICM. Infekcja 10 milionami CFU szczepu one 30 B spowodowała 100% śmiertelność w ciągu 24 godzin.Jednak szczep delta A, który nie posiada funkcjonalnego systemu sekrecji ICM T four SS, był zjadliwy, co pozwoliło ustalić, czy pobieranie bakterii jest kluczowe w jego patogenezie. W tym modelu larwy poddano wstępnemu opracowaniu z cyto D, a następnie zainfekowano; samo podanie inhibitora nie wpłynęło na przeżywalność po 24 godzinach, natomiast zainfekowane larwy po wstępnym opracowaniu wykazały znacznie większą przeżywalność w porównaniu z grupą kontrolną. W celu walidacji ekspresji i określenia lokalizacji subkomórkowej białka efektorowego w g Melan Legionella wykazującej ekspresję fragmentu dobrze zdefiniowanego efektora zlokalizowanego w LCV.Do zakażania larw użyto SID C połączonego z czterema i terminalnymi znacznikami HA, a następnie przeanalizowano je metodą mikroskopową w celu śledzenia kinetyki replikacji bakteryjnej. Larwy uśmiercano w kilku punktach czasowych po zakażeniu, a następnie oznaczano CFU na gram wyekstrahowanej hemolimfy. Po początkowym spadku w piątej godzinie, liczba CFU bakterii typu dzikiego wzrasta. Jednak szczep delta a nie ulega replikacji i zostaje usunięty do 18 godziny. Z zakażonych owadów wyekstrahowano hemocyty, a liczbę żywych komórek określono metodą wykluczania błękitu trypanu. W piątej godzinie po zakażeniu nie stwierdzono różnic.Liczba hemocytów między szczepami. Jednak w 18. godzinie odnotowano znaczący spadek stężenia hemocytów u larw typu dzikiego, czego nie zaobserwowano u larw zainfekowanych szczepem delta A. Ten wynik in vivo sugeruje, że L. pneumophila replikuje się wewnątrz hemocytów, a następnie doprowadza do ich lizy.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak przeprowadzić infekcję larw, pobrać hemolimfę oraz przetworzyć hemocyty w celu analizy różnych aspektów patogenezy legionelli.

use-galleria-mellonella-as-model-organism-to-study-legionella

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Zastosowanie Galleria mellonella jako organizmu modelowego do badania infekcji Legionella pneumophila

Opisano doustną i wewnątrzhemokoliczną infekcję larw mchowca dużego Galleria mellonella. Owad ten może być wykorzystywany do badania czynników wirulencji bakterii entomopatogennych, a także oportunistycznych bakterii ssaków. Opisano hodowlę owadów, metody infekcji oraz przykłady analiz in vivo.

Owad Galleria mellonella jako potężny model infekcji do badania patogenezy bakteryjnej

Ta technika dostarcza metody zbierania, normalizacji i ilościowego określania wzrostu wewnątrzkomórkowego patogenów bakteryjnych, które są wstępnie hodowane w naturalnych komórkach gospodarza pierwotniaków przed infekcjami komórek ssaków. Metodę tę można zmodyfikować w celu uwzględnienia szerokiej gamy komórek gospodarza na etapie zasysania, a także typów komórek docelowych.

Możliwe do leczenia infekcje komórek ssaków bakteriami zaszczepionymi przez pierwotniaki

Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół dla modelu doustnego podawania z użyciem larw Galleria mellonella i jak scharakteryzować indukowane wrodzone reakcje immunologiczne. Korzystając z tego protokołu, naukowcy bez praktycznego doświadczenia będą mogli stosować metodę wymuszonego karmienia G. mellonella.

Model doustnego podawania Galleria mellonella do badania wrodzonych odpowiedzi immunologicznych wywołanych komensalem

Galleria mellonella została niedawno uznana za powtarzalny, tani i etycznie akceptowalny model infekcji dla kompleksu Mycobacterium tuberculosis. W tym miejscu opisujemy i demonstrujemy kroki podjęte w celu ustalenia skutecznego zakażenia G. mellonella bioluminescencyjnym Mycobacterium bovis BCG lux.

Wykorzystanie bezkręgowców Galleria mellonella jako modelu infekcji do badania kompleksu Mycobacterium tuberculosis

Obrazowanie komórek bakteryjnych to nowe podejście do biologii systemowej, skoncentrowane na definiowaniu statycznych i dynamicznych procesów, które dyktują funkcjonowanie dużych maszyn makromolekularnych. W tym przypadku integracja ilościowego obrazowania żywych komórek i tomografii krioelektronowej jest wykorzystywana do badania architektury i funkcji systemu wydzielania Legionella pneumophila typu IV.

Zastosowanie obrazowania żywych komórek i tomografii krioelektronowej w celu określenia czasoprzestrzennych cech systemu wydzielania kropk/icm Legionella pneumophila

Niniejsze badanie przedstawia ustandaryzowane ramy optymalizacji modeli zakażenia G. mellonella do zastosowań w przedklinicznej ocenie antybakteryjnej. Zastosowanie modelu G. mellonella w ramach przedklinicznego procesu rozwoju środków przeciwdrobnoustrojowych może zmniejszyć liczbę nieskutecznych związków przechodzących do badań klinicznych.

Galleria mellonella jako model przesiewowy przeciwdrobnoustrojów

Podczas procesu infekcji kluczowym etapem jest adhezja patogenów do komórek gospodarza. W większości przypadków etap adhezji ten zachodzi w obecności stresu mechanicznego generowanego przez przepływającą ciecz. Opisujemy technikę, która wprowadza naprężenie ścinające jako istotny parametr w badaniu adhezji bakteryjnej.

Wprowadzenie naprężenia ścinającego w badaniach nad adhezją bakteryjną

Metoda ta umożliwia charakteryzację rozszerzonej kokultury bakteryjnej z EpiAirways, czyli pierwotną ludzką tkanką nabłonkową dróg oddechowych hodowaną na granicy faz powietrze-ciecz, która stanowi biologicznie istotny model in vitro. Podejście to można zastosować w przypadku każdego mikroorganizmu nadającego się do długotrwałej kokultury.

Wykorzystanie modelu EpiAirway do charakteryzacji długotrwałych interakcji gospodarz-patogen

Obecna diagnostyka testów wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe opiera się na wzroście planktonicznym izolatów w bogatych w składniki odżywcze warunkach tlenowych. W niniejszej pracy wykorzystujemy alternatywne sztuczne podłoże plwociny, aby zbadać wrażliwość biofilmów Pseudomonas aeruginosa na środki przeciwdrobnoustrojowe zarówno w warunkach tlenowych, jak i mikroaerofilnych, które są bardziej reprezentatywne dla płuc w mukowiscydozie.

Wykorzystanie sztucznej pożywki plwocin do badania skuteczności antybiotyków przeciwko Pseudomonas aeruginosa w warunkach bardziej odpowiadających płucom w mukowiscydozie

Makrofagi pochodzące z monocytów są ważnymi komórkami wrodzonego układu odpornościowego. W tym miejscu opisujemy łatwy w użyciu model in vitro do generowania tych komórek. Korzystając z wirowania gradientowego, izolacji ujemnych kulek i określonych warunków hodowli komórek, można wygenerować makrofagi pochodzące z monocytów do badań fenotypowych i funkcjonalnych.

Model in vitro do badania heterogeniczności różnicowania i polaryzacji ludzkich makrofagów

Poznaj metodę inokulacji i analizy patogenezy Legionella pneumophila przy użyciu larw Galleria mellonella. Technika umożliwia szybką ocenę wirulencji bakterii w organizmie żywym.

Wykorzystanie Galleria mellonella jako organizmu modelowego do badania zakażenia Legionella pneumophila

Przeglądaj więcej filmów