Produkcja makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego

Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie makrofagów z moczu, hodowli komórek pochodzących ze szpiku kostnego. Osiąga się to najpierw poprzez ekstrakcję szpiku kostnego z tylnych nóg myszy. W drugim etapie makrofagi rezydujące w szpiku kostnym są usuwane, a następnie komórki szpiku kostnego są dalej hodowane w warunkach różnicowania makrofagów.

Następnie, gdy komórki szpiku kostnego zróżnicują się w makrofagi, można je pobrać do analizy eksperymentalnej. Ostatecznie mikroskopia konfokalna może być wykorzystana do wykazania lokalizacji bakteryjnego LPS w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego, końcowych przedziałach kwasowych. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak hodowla makrofagów, linii komórkowych, jest duża liczba, dzięki czemu można uzyskać pierwotne makrofagi.

Wizualna demonstracja metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy samodzielnej produkcji są trudne do nauczenia i wymagają praktyki, a aby osiągnąć sukces, zdezynfekuj skórę myszy poddanej eutanazji 70% etanolem. Wykonaj nacięcie na górze każdej tylnej nogi i pociągnij skórę w dół w kierunku stopy, aby odsłonić mięsień. Następnie odetnij tylne nogi i użyj sterylnych nożyczek i kleszczy.

Aby usunąć skórę, umieść nogi na sterylnej 35-milimetrowej szalce Petriego zawierającej pięć mililitrów sterylnego lodu. Zimny PBS. Usuń wszelką skórę i mięśnie przyczepione do kości, a następnie przenieś kości na nową sterylną szalkę Petriego zawierającą pięć mililitrów lodu.

Zimny, sterylny PBS. Umyj kości dwukrotnie pięcioma dodatkowymi mililitrami PBS, a następnie przenieś je do sterylnego moździerza zawierającego pięć mililitrów lodu. Zimny, sterylny PBS.

Teraz odetnij kość piszczelową od kości udowej w stawie i użyj tłuczka, aby delikatnie rozbić kości. Zebrać supernatant w lodowatych probówkach o pojemności 15 mililitrów trzy razy. Następnie przefiltruj zawiesinę tkankową przez sitko z nylonu o grubości 70 mikronów.

Aby usunąć stałe fragmenty, należy odwirować filtrat i delikatnie wyrzucić supernatant. Dysocjuj osad za pomocą buforu do lizy czerwonych krwinek, dodając 20 mililitrów lodowatego kompletnego DMEM po 30 sekundach, aby zatrzymać reakcję po odwirowaniu komórek, zawieszamy osad w 20 mililitrach 37 stopni Celsjusza, uzupełniamy DMEM, a następnie dzielimy zawiesinę komórek między dwie 100-milimetrowe szalki Petriego. Inkubuj naczynia przez cztery godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie zbierz supernatanty do 50-mililitrowych probówek o temperaturze pokojowej.

Po odwirowaniu supernatantów ponownie zawiesić osad w 10 mililitrach kompletnego DMEM uzupełnionego wcześniej przygotowanym supernatantem komórkowym L 9 29, a następnie przefiltrować komórki przez sitko do komórek nylonowych o grubości 40 mikronów. Dodaj filtrat do 140 mililitrów kompletnego DMEM i pożywki komórkowej L 9 29, a następnie rozprowadź 10 mililitrów zawiesiny komórkowej na misce na 15 100-milimetrowych szalek Petriego. Po inkubacji komórek przez trzy dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla w 10 mililitrach kompletnego DMEM plus L 9, 29 supernatantu i inkubuj komórki przez dodatkowe cztery dni.

Okresowe monitorowanie wzrostu komórek za pomocą odwróconego mikroskopu w celu pobrania makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego najpierw aspiruje i odrzuca supernatant. Następnie umyj szalki Petriego dwa razy za pomocą kompletnego DMEM. Następnie dodaj pięć mililitrów kompletnego DMEM o temperaturze 37 stopni Celsjusza i użyj gumowego policjanta, aby delikatnie odłączyć komórki, zebrać makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego w 50-mililitrowych probówkach, a następnie odwirować komórki.

Resus zawieszający pelety w 20 mililitrach kompletnego DMEM. Na koniec policz komórki według wykluczenia triam blue. Stosując tę metodę, można uzyskać dużą liczbę makrofagów w ciągu zaledwie kilku dni po wyizolowaniu i posianiu okrągłych, nieprzylegających komórek szpiku kostnego bez makrofagów rezydujących w szpiku kostnym, jak właśnie pokazano.

Te reprezentatywne komórki prekursorowe BMDM inkubowano z G-M-C-S-F. Po trzech dniach komórki zaczęły przylegać i różnicować się w makrofagi. Po siedmiu dniach zaobserwowano zlewającą się monowarstwę makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego.

Analiza cytometryczna przepływowa dla F four 80 i H-L-A-D-R wykazała, że makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego wykazywały ekspresję obu markerów potwierdzających różnicowanie komórek szpiku kostnego w makrofagi. Ocena zdolności kwasowych PHA makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego. Zdolność komórek do internalizacji prędkości lateksu była monitorowana zgodnie z oczekiwaniami.

Stwierdzono, że liczba kulek na komórkę wzrasta w czasie, aby ocenić ich potencjał endocytarny. Makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego były również hodowane wspólnie z Coxiella. Zaobserwowano, że LPS oka Burnetta w kolorze czerwonym jest zlokalizowany w przedziale, w którym znajduje się białko błonowe związane z lizosomami na niebiesko, ale nie katepsyna D na zielono, co pokazuje, że LPS był obecny w późnych endosomach, które nie są w stanie połączyć się z lizosomami zgodnie z oczekiwaniami makrofagami pochodzącymi ze szpiku kostnego.

Interakcje patogenów bakteryjnych były dalej analizowane poprzez ich infekcję przez oko TMA Wiley. Zgodnie z oczekiwaniami, bakterie w kolorze czerwonym nie były zlokalizowane w komorze, w której znajdują się KPS i D, które pojawiają się ponownie na zielono. W tym reprezentatywnym immuno blot oceniono szlaki transdukcji sygnału makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego, wykazując, że makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego, takie jak tkanki, izolowane makrofagi regulują w górę poziom fosforylowanej kinazy P 38 alfa map w odpowiedzi na stymulację LPS esia coli.

Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie mikrobiologii komórkowej, takie jak to, który mikro przedział wewnątrzkomórkowy jest zlokalizowany.