Name: Produkcja makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-22T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Naucz się różnicować makrofagi ze szpiku kostnego myszy w celach immunologicznych. Ta metoda pozwala uzyskać duże ilości pierwotnych makrofagów do badań nad odpowiedzią immunologiczną i interakcjami z patogenami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez CNRS (PICS 2012-2014 dla E.G.) oraz przez grant od Regione Campania (L.R. n.5, 28.03.2002 dla Giovanny Mottola). Filippo Conti jest stypendystą Fundacji Współpracy Naukowej "Infectiopole Sud". Nicola Boucherit jest stypendystką francuskiego Ministerstwa Badań Naukowych i Technologii. Źródła finansowania nie odgrywały żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu danych, analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowywaniu manuskryptu.

Oświadczenie etyczne
Protokół postępowania ze zwierzętami został zatwierdzony przez naszą instytucjonalną Komisję Etyki Zwierząt "Conseil Scientifique du Centre de Formation et de Recherche Experimental Médico-Chirurgical" (CFREMC, Project permit 10-300122013 dla Erica Ghigo) z Uniwersytetu Aix-Marseille zgodnie z zasadami Décret No° 87-848 z 19.10.1987. Eksperymenty przeprowadzono w Faculté de Médecine de la Timone (pozwolenie na eksperymenty numer 13.385 dla Erica Ghigo).
1. Przygotowanie materiałów i pożywek kulturowych
<ol>
	<li>Wysterylizuj dwa kleszcze, dwie nożyczki, dwa ostrza chirurgiczne, moździerz i tłuczek.</li>
	<li>Uzyskać kompletny DMEM zawierający 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS), 2 mM glutaminy, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny.</li>
	<li>Rozcieńczyć 10x PBS w sterylnej wodzie destylowanej, aby uzyskać 1x PBS.</li>
	<li>Uzyskać lodowaty 1x PBS, lodowaty kompletny DMEM, kompletny DMEM podgrzany do 37 °C.</li>
</ol>
2. Przygotowanie supernatantów komórkowych L929
<ol>
	<li>Hodować komórki L929 do konfluencji (dwadzieścia kolbo długości 175 cm 2) w kompletnym DMEM w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
</ol>
Uwaga: Czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF) jest niezbędny do wywołania różnicowania komórek krwiotwórczych w makrofagi12. Komórki L929 wytwarzają GM-CSF.
<ol start="2">
	<li>Przy zbiegu zastąp pożywkę hodowlaną świeżym, kompletnym DMEM. Przenieść kolby do temperatury 32 °C, 5% CO2 na 10 dni.</li>
	<li>Zebrać, zebrać i odwirować supernatanty w stężeniu 750 x g przez 10 minut. Wyrzucić granulki komórek.</li>
	<li>Przechowywać supernatanty w probówkach o pojemności 15 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
3. Przygotowanie makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego (BMDM)
<ol>
	<li>Poświęć 1 mysz przez zwichnięcie szyjki macicy.
	<ol>
		<li>Używaj sterylnych ostrzy chirurgicznych przez cały czas trwania eksperymentu. Zdezynfekuj skórę 70% alkoholem. Wykonaj nacięcie na górze każdej tylnej nogi i pociągnij skórę w dół w kierunku stopy, aby odsłonić mięsień.</li>
		<li>Odetnij tylne nogi, usuń skórę sterylnymi nożyczkami i sterylnymi kleszczami. Umieść nogi na sterylnej szalce Petriego (35/10 mm) zawierającej sterylny, lodowaty 1x PBS (5 ml).</li>
		<li>Usuń mięso i mięśnie, które przylegają do kości, za pomocą sterylnych nożyczek i kleszczy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieść kości na nową, sterylną szalkę Petriego (35/10 mm) zawierającą lodowato, sterylny 1x PBS (5 ml). Umyj kości dwa razy 5 ml lodowatego, sterylnego 1x PBS.</li>
	<li>Przenieść kość do sterylnego moździerza zawierającego 5 ml lodowatego, sterylnego 1x PBS.</li>
	<li>Odetnij kość piszczelową od kości udowej w stawie sterylnymi nożyczkami. Delikatnie rozbij kości w sterylnym moździerzu zawierającym 5 ml lodowatego, sterylnego 1x PBS za pomocą tłuczka.</li>
	<li>Zebrać supernatant w lodowato zimnych probówkach o pojemności 15 ml. Powtórz ten krok 3 razy.</li>
	<li>Przefiltruj przez sitko z nylonu o średnicy 70 μm, aby usunąć fragmenty stałe. Odwirować filtrat o sile 450 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Delikatnie odrzucić supernatant. Oddzielić osad w 10 ml buforu do lizy czerwonych krwinek przez 30 sekund. Dodaj 20 ml lodowatego, kompletnego DMEM.</li>
</ol>
Uwaga: Celem tego kroku jest usunięcie zanieczyszczających czerwonych krwinek; dlatego ten krok musi być wykonany w ciągu 2 minut, aby uniknąć zmian w komórkach krwiotwórczych przez bufor do lizy czerwonych krwinek.
<ol start="8">
	<li>Wirować przy 450 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Delikatnie odrzucić supernatant. Rozdzielić osad w 20 ml kompletnego DMEM, który został ogrzany do 37 °C.</li>
	<li>Przenieś zdysocjowane komórki na 2 szalki Petriego (100/20 mm). Inkubować je przez 4 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Zebrać supernatanty w probówkach o pojemności 50 ml w temperaturze pokojowej. Wyrzuć szalki zawierające rezydujące makrofagi.</li>
</ol>
Uwaga: Celem tego kroku jest wyeliminowanie rezydujących makrofagów szpiku kostnego poprzez ich zdolność do przylegania do plastiku poddanego hodowli. Te rezydujące makrofagi mogą być wykorzystane w innych eksperymentach.
<ol start="11">
	<li>Odwirować zebrane supernatanty o stężeniu 450 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Delikatnie rozdzielić osad w 10 ml kompletnego DMEM zawierającego 15% supernatantu komórkowego L929. Przefiltruj komórki przez nylonowe sitko o średnicy 40 μm.</li>
	<li>Odzyskać filtrat. Dodać zebrany filtrat (10 ml) do 140 ml kompletnego DMEM, który został uzupełniony 15% pożywką komórkową L929.</li>
	<li>Rozprowadzić 10 ml zawiesiny komórek na szalce Petriego (15 szalek Petriego, 100/20 mm). Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
	<li>Hoduj komórki przez 3 dni</li>
	<li>Dodać 10 ml kompletnego DMEM, który został uzupełniony o 15% L929. Inkubuj komórki przez dodatkowe 4 dni.</li>
</ol>
Uwaga: Monitoruj wzrost komórek okresowo za pomocą odwróconego mikroskopu (kroki 3.14-3.16). Przylegające makrofagi będą obserwowane po 3 dniach hodowli.
4. Zbieranie BMDM
<ol>
	<li>Usunąć supernatant. Umyj BMDM 2 razy za pomocą kompletnego DMEM</li>
	<li>Dodać 5 ml kompletnego DMEM, który został podgrzany do temperatury 37 °C. Odczepić BMDM, delikatnie zeskrobując gumowym policjantem.</li>
	<li>Zebrać BMDM do probówek o pojemności 50 ml i odwirować przy 450 x g przez 10 minut. Delikatnie zdysocjować granulki komórek w 20 ml kompletnego DMEM.</li>
	<li>Policz BMDM w obecności błękitu trypanowego (nie należy zaobserwować więcej niż 10% śmiertelności).</li>
</ol>
Uwaga: Generalnie, około 6-7,5 x 107 makrofagów otrzymuje się z 15 szalek Petriego (100/20 mm) makrofagów. Istnieje około 4-5 x 106 makrofagów/szalkę Petriego (100/20 mm).
<ol start="5">
	<li>Przygotuj BMDM zgodnie z wymaganiami eksperymentu. Po 16 godzinach w kompletnych pożywkach w temperaturze 37 °C, 5% CO2 makrofagi ponownie przylegają do nośnika.</li>
</ol>
5. Przechowywanie BMDM
<ol>
	<li>Zbierz izolowane BMDM (krok 4.3). Wirować przy 450 x g przez 10 min. Uwaga: BMDM mogą być zamrażane w ciekłym azocie.</li>
	<li>Zawiesić granulki komórkowe w pożywce do zamrażania składającej się z 10% DMSO i 90% FCS o końcowym stężeniu 4 x 106 komórek/ml i odpipetować 1 ml do każdej ampułki.</li>
	<li>Zamrozić komórki z szybkością chłodzenia 1 °C/min. Po 24 godzinach przenieść ampułkę do pojemnika z ciekłym azotem w celu długotrwałego przechowywania.</li>
</ol>

<ol><li>Rutherford, M. S., Witsell, A., Schook, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+generating+functionally+heterogeneous+macrophages%3A+chaos+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukocyte+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms generating functionally heterogeneous macrophages: chaos revisited.</a> J. Leukocyte Biol. 53, 602-618 (1993).</li>
<li>Van Furth, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVan+Furth%2C+R+%22Inflammation%3A+Basic+Principles+and+Clinical+Correlates%22">Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates</a>. Gallin, J. I., Goldstein, I. M., Snyderman, R. 112, Raven Press. 325-336 (1992).</li>
<li>Adams, D., Halmiton, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAdams%2C+D+%22Inflammation%3A+Basic+Principles+and+Clinical+Correlates%22">Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates</a>. Gallin, J. I., Goldstein, I. M., Snyderman, R. 112, Raven Press. 325-336 (1992).</li>
<li>Morris, L., Graham, C. F., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+in+haemopoietic+and+other+tissues+of+the+developing+mouse+detected+by+the+monoclonal+antibody+F4%2F80%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Macrophages in haemopoietic and other tissues of the developing mouse detected by the monoclonal antibody F4/80.</a> Development. 112, 517-526 (1991).</li>
<li>Haas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phagosome%3A+compartment+with+a+license+to+kill%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">The phagosome: compartment with a license to kill.</a> Traffic. 8, 311-330 (2007).</li>
<li>Underhill, D. M., Ozinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis+of+microbes%3A+complexity+in+action%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis of microbes: complexity in action.</a> Annu. Rev. Immunol. 20, 825-852 (2002).</li>
<li>Castagna, A., Polati, R., Bossi, A. M., Girelli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte%2Fmacrophage+proteomics%3A+recent+findings+and+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Monocyte/macrophage proteomics: recent findings and biomedical applications.</a> Expert Rev. Proteomics. 9, 201-215 (2012).</li>
<li>Benoit, M., Desnues, B., Mege, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+polarization+in+bacterial+infections%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage polarization in bacterial infections.</a> J. Immunol. 181, 3733-3739 (2008).</li>
<li>Barry, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+stimulation+of+p38alpha-MAPK%2FVps41-HOPS+by+LPS+from+pathogenic+Coxiella+burnetii+prevents+trafficking+to+microbicidal+phagolysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Impaired stimulation of p38alpha-MAPK/Vps41-HOPS by LPS from pathogenic Coxiella burnetii prevents trafficking to microbicidal phagolysosomes.</a> Cell Host Microbe. 12, 751-763 (2012).</li>
<li>Henry, R. M., Hoppe, A. D., Joshi, N., Swanson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+uniformity+of+phagosome+maturation+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The uniformity of phagosome maturation in macrophages.</a> J. Cell Biol. 164, 185-194 (2004).</li>
<li>Sundaramurthy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+Chemical+and+RNAi+Multiparametric+Profiles+Identifies+Triggers+of+Intracellular+Mycobacterial+Killing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Integration of Chemical and RNAi Multiparametric Profiles Identifies Triggers of Intracellular Mycobacterial Killing.</a> Cell Host Microbe. 13, 129-142 (2013).</li>
<li>Boltz-Nitulescu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+rat+bone+marrow+cells+into+macrophages+under+the+influence+of+mouse+L929+cell+supernatant%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukocyte+Biol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of rat bone marrow cells into macrophages under the influence of mouse L929 cell supernatant.</a> J. Leukocyte Biol. 41, 83-91 (1987).</li>
</ol>

Nie ma zadeklarowanych konfliktów interesów.

Opisany tutaj protokół szczegółowo opisuje metodę wytwarzania dużej liczby BMDM. BMDM są komórkami pierwotnymi i mają biologiczną funkcję i właściwości makrofagów zróżnicowanych od monocytów, ponieważ istnieją dojrzałe, w przeciwieństwie do linii komórkowych makrofagów, które są niedojrzałe. BMDM mogą być stosowane do genetycznych badań przesiewowych (RNAi), badań przesiewowych leków, badań funkcjonalnych, badań interakcji gospodarz-patogen i wielu innych obszarów badań.
Przedstawiona w niniej...

Istotnym aspektem funkcji makrofagów jest ich rola w odporności wrodzonej i nabytej. Ze względu na ich zdolność do fagocytozy obojętnych cząstek, bakterii lub pasożytów, makrofagi są pierwszą linią obrony przed obcymi najeźdźcami. Po internalizacji drobnoustroje są degradowane w fagolizosomach. Makrofagi wysyłają również sygnały rekrutacyjne i prezentują antygeny innym komórkom odpornościowym, takim jak limfocyty T. Makrofagi pochodzą z monocytów. Monocyty powstają w szpiku kostnym z mieloidalnych komórek macierzystych i migrują do krwi obwodowej i różnych tkanek, gdzie różnicują się w makrofagi. Szacuje się, że zdrowa dorosła mysz zawiera około10-8 makrofagów, które są rozmieszczone w całym ciele w różnych narządach i tkankach (Tabela 1)1,2. Makrofagi wykazują dużą różnorodność fenotypową i funkcjonalną ze względu na ich zdolność do przystosowania się do mikrośrodowiska3,4. Najważniejszą właściwością makrofagów jest ich aktywność bakteriobójcza, która określa się jako zdolność do fagocytozy drobnoustrojów i ich niszczenia. Odpowiedź fagocytarna jest definiowana przez aktywację złożonych sieci sygnalizacyjnych, które są stymulowane przez kontakt mikrobiologiczny; W ten sposób makrofagi odpowiednio modulują ekspresję genów w odpowiedzi na różne bodźce. Po fagocytozie drobnoustroje są eliminowane w strukturze zwanej fagolizosomem; Jednak wiele drobnoustrojów chorobotwórczych opracowało strategie mające na celu osłabienie mikrobójczej funkcji makrofagów5. Różnorodność mechanizmów wywrotowych, które są wykorzystywane przez różne gatunki drobnoustrojów, świadczy o złożoności procesu fagocytarnego6 i biogenezy fagolizosomów. Choroby zakaźne są poważnym problemem zdrowotnym człowieka, a liczne mechanizmy i cząsteczki uczestniczą w działaniu przeciwdrobnoustrojowym makrofagów. Co więcej, cele właściwości mikrobójczych, które są przejmowane przez drobnoustroje, pozostają nieznane; W związku z tym następuje eksplozja zainteresowania ewolucyjnymi, genetycznymi i biochemicznymi aspektami interakcji gospodarz-patogen, która ponownie zwróciła uwagę naukowców na makrofagi. Obecnie większość badań w tej dziedzinie prowadzona jest na liniach komórkowych makrofagów, które różnią się od pierwotnych makrofagów aktywnością fagocytarną, produkcją cytokin i regulacją wybuchu oksydacyjnego. Ponadto mniej nadają się do mikroskopii. Do zbadania interakcji makrofagi-patogeny zaleca się stosowanie makrofagów pierwotnych, takich jak makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego (BMDM), które wykazują więcej cech fizjologicznych. Co więcej, możliwe jest prowadzenie prac nad genetycznie zmodyfikowanymi BMDM, ponieważ makrofagi te mogą być izolowane bezpośrednio od myszy transgenicznych, a dzięki dostępności nowych technologii, takich jak transfekcja lentiwirusowa, ich profil ekspresji genów może zostać zmieniony przez nadekspresję genów lub interferencję RNA. W tym miejscu opisujemy procedurę różnicowania mysiego szpiku kostnego na makrofagi, która dostarczy dużą liczbę makrofagów w ciągu 7 dni do różnych analiz funkcjonalnych, takich jak proteomika7, transkryptomika8, badania transportu wewnątrzkomórkowego9, badania dynamiczne10, genetyczne badania przesiewowe (RNAi) i badania przesiewowe leków11.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>21969-035</td><td></td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>10270</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>15070</td><td></td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>PBS (10x)</td><td>Lonza</td><td>BEM515F</td><td></td></tr><tr><td>Liza Czerwone Krwinki bufor</td><td>Sigma</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>Sitko do komórek 70 &mu; m Nylon</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Sitko do komórek 40 &mu; m Nylon</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Probówki 50 ml</td><td>dowolny dostawca</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Probówki 15 ml</td><td>dowolna dostawca</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>szalek Petriego (100/20 mm)</td><td>dowolny dostawca</td><td>nie</td> dotyczy Szalki Petriego <td>poddane hodowli</td></tr><tr><td>(35/10 mm)</td><td>dowolny dostawca</td><td>nie dotyczy</td><td></td></tr></tbody></table>

produkcja makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Makrofagi są kluczowymi składnikami wrodzonej i adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej, i stanowią pierwszą linię obrony przed obcymi najeźdźcami ze względu na ich silne działanie bakteriobójcze. Makrofagi są szeroko rozpowszechnione w całym ciele i są obecne w narządach limfatycznych, wątrobie, płucach, przewodzie pokarmowym, ośrodkowym układzie nerwowym, kościach i skórze. Ze względu na ich repartycję uczestniczą w szerokim zakresie procesów fizjologicznych i patologicznych. Makrofagi to bardzo wszechstronne komórki, które są w stanie rozpoznawać zmiany mikrośrodowiskowe i utrzymywać homeostazę tkanek. Wiele patogenów wyewoluowało mechanizmy wykorzystujące makrofagi jako konie trojańskie do przetrwania, replikacji i zakażania zarówno ludzi, jak i zwierząt oraz do rozprzestrzeniania się w całym ciele. Niedawna eksplozja zainteresowania ewolucyjnymi, genetycznymi i biochemicznymi aspektami interakcji gospodarz-patogen odnowiła uwagę naukowców na makrofagi. W tym miejscu opisujemy procedurę izolacji i hodowli makrofagów z mysiego szpiku kostnego, która zapewni dużą liczbę makrofagów do badania interakcji gospodarz-patogen, a także innych procesów.

Celem niniejszej metody było łatwe uzyskanie dużej liczby makrofagów w ciągu kilku dni. Przygotowanie komórek szpiku kostnego przedstawiono na Rysunku 1. Kości z tylnej kończyny zostały zebrane i rozdrobnione w moździerzu. Po usunięciu makrofagów rezydentnych z preparatu komórek szpiku kostnego, komórki szpiku inkubowano z GM-CSF (Dzień 0). Po 3 dniach komórki, które przed hodowlą były okrągłe i nieadherentne, zaczynają różnicować się w makrofagi i przytwierdzają do podłoża (Rysunek 1A)....

Makrofagi od dawna są uznawane za kluczowy składnik wrodzonej i adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej. Niedawna eksplozja wiedzy dotyczącej ewolucyjnych, genetycznych i biochemicznych aspektów interakcji między makrofagami a mikroorganizmami ponownie zwróciła uwagę naukowców na makrofagi. W artykule opisano metodę różnicowania makrofagów od szpiku kostnego myszy.

Produkcja makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest generowanie makrofagów z hodowli komórek pochodzących z szpiku kostnego. Osiąga się to najpierw poprzez ekstrakcję szpiku kostnego z tylnych kończyn myszy. W drugim kroku usuwane są makrofagi rezydentne w szpiku kostnym, a następnie komórki szpiku kostnego są poddawane dalszej hodowli w warunkach różnicowania w makrofagi.Następnie, gdy komórki szpiku kostnego zróżnicują się w makrofagi, można je zebrać do analizy eksperymentalnej. Ostatecznie mikroskopia konfokalna może zostać wykorzystana do wykazania lokalizacji bakteryjnego LPS wewnątrz kwasowych przedziałów makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak hodowle linii komórkowych makrofagów, jest możliwość uzyskania dużej liczby pierwotnych makrofagów.Wizualna demonstracja metody jest kluczowa, ponieważ kroki samodzielnego wykonania są trudne do opanowania i wymagają praktyki. Aby osiągnąć sukces, należy zdezynfekować skórę uśpionej myszy 70% etanolem. Wykonać nacięcie w górnej części każdej tylnej kończyny i odsunąć skórę w dół w kierunku stopy, aby odsłonić mięsień. Następnie odciąć tylne kończyny, używając sterylnych nożyczek i pincety.Aby usunąć skórę, umieść kończyny w sterylnym 35 milimetrowym naczyniu Petri zawierającym pięć mililitrów sterylnego schłodzonego PBS.Zimny, sterylny PBS. Przemyć kości dwukrotnie, używając kolejnych pięciu mililitrów PBS, a następnie przenieść je do sterylnego moździerza zawierającego pięć mililitrów zimnego, sterylnego PBS.Następnie oddziel kość piszczelową od kości udowej w stawie i za pomocą tłuczka delikatnie rozkrusz kości. Trzykrotnie zbierz nadsącz do schłodzonych w lodzie probówek o pojemności 15 mililitrów. Następnie przefiltruj zawiesinę tkankową przez nylonowe sito komórkowe o oczkach 70 micron.Aby usunąć fragmenty stałe, odwiruj filtrat i delikatnie odlej nadsącz. Rozbij osad za pomocą buforu do lizy erytrocytów, dodając 20 ml lodowatego, kompletnego DMEM po 30 sekundach w celu zatrzymania reakcji. Po odwirowaniu komórek zawiesić osad w 20 ml kompletnego DMEM o temperaturze 37 °C, a następnie rozdzielić zawiesinę komórkową pomiędzy dwie płytki Petriego o średnicy 100 mm. Inkubować płytki przez cztery godziny w temperaturze 37 °C, a następnie zebrać nadsączki do probówek o pojemności 50 ml w temperaturze pokojowej.Po odwirowaniu supernatantów, resuspenduj pellet w 10 mililitrach kompletnego DMEM uzupełnionego wcześniej przygotowanym supernatatem z komórek L 9 29, a następnie przefiltruj komórki przez nylonowe sitko komórkowe o oczkach 40 mikron. Dodaj filtrat do 140 mililitrów kompletnego DMEM i pożywki dla komórek L 9 29, a następnie rozdziel po 10 mililitrów zawiesiny komórkowej na każdą z 15 płytek Petriego o średnicy 100 milimetrów. Po inkubacji komórek przez trzy dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% carbon dioxide, dodaj 10 mililitrów kompletnego DMEM z supernatatem L 9 29 i inkubuj komórki przez kolejne cztery dni.Okresowo monitoruj wzrost komórek za pomocą mikroskopu odwróconego, a następnie, aby zebrać makrofagi pochodzące z szpiku kostnego, odessaj i odrzuć supernatant. Następnie dwukrotnie przemyj szalki Petriego kompletnym DMEM. W kolejnym kroku dodaj 5 ml kompletnego DMEM o temperaturze 37 °C i użyj gumowego skrobaka (policemana), aby delikatnie odkleić komórki, zbierz makrofagi pochodzące z z szpiku kostnego do probówek o pojemności 50 ml, a następnie odwiruj komórki.Resuspenduj osad w 20 ml kompletnego medium DMEM. Na koniec policz komórki metodą wykluczania błękitu trypanu. Stosując tę metodę, w ciągu zaledwie kilku dni po izolacji i wysianiu okrągłych, nieprzylegających komórek szpiku kostnego, z wyłączeniem rezydentnych makrofagów szpiku kostnego, zgodnie z powyższą instrukcją, można uzyskać dużą liczbę makrofagów.Te reprezentatywne komórki prekursorowe BMDM inkubowano z G-M-C-S-F. Po trzech dniach komórki zaczęły przylegać i różnicować się w makrofagi. Po siedmiu dniach zaobserwowano konfluencyjną monowarstwę makrofagów pochodzących z szpiku kostnego.Analiza cytometryczna dla F4/80 i HLA-DR wykazała, że makrofagi pochodzące z szpiku kostnego wykazują ekspresję obu markerów, co potwierdza różnicowanie komórek szpiku kostnego w makrofagi. Aby ocenić zdolności fagocytarne makrofagów pochodzących z szpiku kostnego, monitorowano zdolność komórek do internalizacji kulek lateksowych, co przebiegło zgodnie z oczekiwaniami.Liczbę kulek na komórkę określano w czasie, aby ocenić ich potencjał endocytyczny. Makrofagi pochodzące z szpiku kostnego współhodowano również z Coxiella. Zaobserwowano, że LPS z oka Burnett (kolor czerwony) lokalizuje się w przedziale zawierającym białko błonowe związane z lizosomami 1 (LAMP-1, kolor niebieski), ale nie katepsynę D (kolor zielony), co dowodzi, że LPS znajdował się w późnych endosomach, które – zgodnie z oczekiwaniami w przypadku makrofagów pochodzących z szpiku kostnego – nie są w stanie połączyć się z lizosomami.Interakcje patogenów bakteryjnych przeanalizowano dalej poprzez ich infekcję w TMA Wiley eye. Zgodnie z oczekiwaniami, bakterie zaznaczone na czerwono nie zlokalizowały się w przedziale zawierającym KPS i D, który ponownie pojawia się na zielono. Na tym reprezentatywnym immunoblocie oceniono szlaki transdukcji sygnału w makrofagach pochodzących z szpiku kostnego, wykazując, że makrofagi pochodzące z szpiku kostnego, podobnie jak makrofagi izolowane z tkanek, zwiększają poziom fosforylowanej kinazy MAP P38 alfa w odpowiedzi na stymulację LPS z esia coli.Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie mikrobiologii komórkowej, takie jak ustalenie, w którym przedziale wewnątrzkomórkowym zlokalizowany jest dany mikroorganizm.

bone-marrow-derived-macrophage-production

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Produkcja makrofagów pochodzących z rdzenia kostnego

W tym filmie pokazujemy aktywację makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego w odpowiedzi na bakteryjny lipopolisacharyd i dożylną immunoglobulinę.

Aktywacja makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego myszy w odpowiedzi na przeciwciała

Artykuł opisuje łatwy w użyciu adaptacyjny model in vitro do badania polaryzacji makrofagów. W obecności GM-CSF/M-CSF krwiotwórcze komórki macierzyste/progenitorowe ze szpiku kostnego są kierowane do różnicowania monocytowego, a następnie stymulacji M1 lub M2. Stan aktywacji można śledzić za pomocą zmian w antygenach powierzchniowych komórki, ekspresji genów i szlakach sygnalizacji komórkowej.

Badanie polaryzacji makrofagów przy użyciu makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego

Prezentujemy prosty i skuteczny protokół do generowania ludzkich makrofagów. Płaszcze kożuchowe są przetwarzane przez wirowanie gradientowe o podwójnej gęstości, a izolowane monocyty są następnie różnicowane do makrofagów w workach do hodowli komórkowych pokrytych teflonem. Maksymalizuje to wydajność makrofagów i ułatwia pobieranie komórek do kolejnych eksperymentów.

Izolacja ludzkich monocytów przez wirowanie z podwójnym gradientem i ich różnicowanie do makrofagów w workach do hodowli komórkowych pokrytych teflonem

Opisujemy tutaj prosty protokół izolacji mysich makrofagów otrzewnowych. Po tej procedurze następuje ekstrakcja RNA w celu przeprowadzenia analizy ekspresji genów po stymulacji receptorów Toll-podobnych.

Izolacja mysich makrofagów otrzewnowej w celu przeprowadzenia analizy ekspresji genów po stymulacji receptorów toll-podobnych

Przeprogramowanie metaboliczne jest cechą charakterystyczną i warunkiem wstępnym polaryzacji makrofagów M1 i M2. Niniejszy manuskrypt opisuje test do pomiaru podstawowych parametrów glikolizy i funkcji mitochondriów w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego myszy. Narzędzie to można zastosować do zbadania, w jaki sposób poszczególne czynniki wpływają na metabolizm i fenotyp makrofagów.

Charakterystyka metaboliczna spolaryzowanych makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego M1 i M2 przy użyciu analizy strumienia zewnątrzkomórkowego w czasie rzeczywistym

Komórki szpiku kostnego hodowane za pomocą czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów granulocytów (GM-CSF) generują heterogeniczną hodowlę zawierającą makrofagi i komórki dendrytyczne (DC). Metoda ta kładzie nacisk na wykorzystanie wiązania MHCII i hialuronianu (HA) w celu odróżnienia makrofagów od DC w kulturze GM-CSF. Makrofagi w tej kulturze mają wiele podobieństw do makrofagów pęcherzykowych.

Generowanie i identyfikacja makrofagów i komórek dendrytycznych pochodzących z GM-CSF

Przedstawiono protokół dla hodowli komórkowej makrofagów makrofagów stymulujących tworzenie kolonii (M-CSF) zróżnicowanych ludzkich makrocytów pochodzących z monocytów. Protokół wykorzystuje krioprezerwację monocytów w połączeniu z ich masowym różnicowaniem do makrofagów. Następnie zebrane makrofagi można następnie wysiać w studzienkach hodowlanych o wymaganej gęstości komórek do przeprowadzenia eksperymentów.

Posiew czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów Zróżnicowane ludzkie makrofagi pochodzące z monocytów

Ten protokół opisuje solidne generowanie makrofagów z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych oraz metody ich późniejszej charakterystyki. Ekspresja markerów powierzchniowych komórek, ekspresja genów i testy funkcjonalne są wykorzystywane do oceny fenotypu i funkcji tych makrofagów pochodzących z iPSC.

Produkcja i charakterystyka ludzkich makrofagów z pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten protokół został opracowany do hodowli tetrahydrobiopteryny (BH4) i indukowanej syntazy tlenku azotu (iNOS) z niedoborem pierwotnych mysich makrofagów do badania biologii NO-redoks. Badania koncentrują się na zmniejszeniu potencjalnego zanieczyszczenia BH4 i innych artefaktów znalezionych w tradycyjnych metodach izolacji i hodowli, które mogą zakłócić wyniki eksperymentów i interpretację wyników.

Izolacja i hodowla in vitro makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego do badania biologii NO-redoks

Obecny protokół opisuje izolację i hodowlę makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego od myszy.

Izolacja i hodowla makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego od myszy

Ten protokół opisuje nieenzymatyczną i prostą metodę izolowania 7-9-dniowych komórek szpiku kostnego myszy noworodków i generowania zróżnicowanych makrofagów przy użyciu supernatantu komórek L929 jako źródła czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów (M-CSF). Makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego poddano dalszej analizie pod kątem antygenów powierzchniowych F4/80, CD206, CD11b i kompetencji funkcjonalnych.

Izolacja szpiku kostnego noworodków myszy i przygotowanie makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego

Naucz się różnicować makrofagi ze szpiku kostnego myszy w celach immunologicznych. Ta metoda pozwala uzyskać duże ilości pierwotnych makrofagów do badań nad odpowiedzią immunologiczną i interakcjami z patogenami.

Produkcja makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego

Przeglądaj więcej filmów