Name: Ściskanie komórek jako solidna, mikroprzepływowa platforma dostarczania wewnątrzkomórkowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-07T19:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Poznaj metodę mechanicznego dostarczania makrocząsteczek do komórek za pomocą mikroprzepływowego urządzenia z komórkami ściskanymi pod ciśnieniem. Technika ta umożliwia wektorowe dostarczanie materiałów do trudnych typów komórek z zastosowaniem w terapii przeciwnowotworowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy T. Shatova za pomocną dyskusję na temat projektowania eksperymentów i analizy danych. Z wdzięcznością dziękujemy za pomoc i wiedzę fachową G. Paradisa, personelu zajmującego się cytometrią przepływową w Instytucie Kocha oraz pracowników Laboratorium Technologii Mikrosystemów w Massachusetts Institute of Technology. Praca ta była wspierana przez National Institutes of Health Grants RC1 EB011187-02, DE013023, DE016516, EB000351 oraz częściowo przez National Cancer Institute Cancer Center Support (Core) Grants P30-CA14051 i MPP-09Call-Langer-60.

1. Przechowywanie
<ol>
	<li>Przechowuj zbiorniki, uchwyty, O-ringi i urządzenia mikroprzepływowe w 70% etanolu. Używaj pojemnika (np. słoika lub zlewki) z pokrywką, aby zapobiec parowaniu i zanieczyszczeniu kurzem lub cząstkami zewnętrznymi. Umieść urządzenia w jednym pojemniku (1), zbiorniki i O-ringi w drugim pojemniku (2), a uchwyty w trzecim (3).</li>
</ol>
Uwaga: Użycie 70% etanolu do przechowywania ma na celu utrzymanie sterylności. Jeśli jedynymi składnikami roztworu są etanol i woda (tj. bez środków denaturujących), wszystkie elementy systemu powinny być w pełni kompatybilne i nie ulegać degradacji z upływem czasu.
<ol start="2">
	<li>Zmieniaj roztwór etanolu w pojemnikach (2) i (3) przed każdym użyciem, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu między eksperymentami i zminimalizować obecność niepożądanych cząstek, które mogą powodować zatkanie.</li>
</ol>
2. Przygotowanie do eksperymentu
<ol>
	<li>Umieść pojemniki (2) i (3) w łaźni ultradźwiękowej na 5-10 minut przed każdym użyciem. Pomaga to usunąć wszelkie zanieczyszczenia z poprzednich eksperymentów.</li>
	<li>Czysta przestrzeń robocza w komorze bezpieczeństwa biologicznego z 70% roztworem etanolu.</li>
	<li>Spryskaj wszystkie materiały (3 pojemniki i pęsetę) 70% roztworem etanolu przed umieszczeniem ich w komorze bezpieczeństwa biologicznego.</li>
</ol>
3. Montaż
<ol>
	<li>Połóż 2-3 chusteczki o niskiej zawartości kłaczków w obszarze roboczym.</li>
	<li>Wyjmij plastikowe zbiorniki z pojemnika za pomocą pęsety i umieść je na chusteczkach, aby ułatwić odparowanie roztworu etanolu z wewnętrznych powierzchni. Delikatnie postukaj w zbiorniki o powierzchnię lub przedmuchaj je powietrzem, aby ułatwić usunięcie roztworu etanolu.</li>
	<li>Włóż O-ringi do odpowiedniego gniazda w zbiornikach.</li>
	<li>Wyjmij uchwyt i wióry z odpowiednich pojemników i pozwól etanolowi odparować (~1-2 min).</li>
	<li>Użyj pęsety, aby umieścić żądany wiór stroną zadrukowaną do góry (tj. otwory dostępowe do góry) w uchwycie. Podnieś uchwyt z chipem na poziom oczu, aby upewnić się, że wiór leży płasko w uchwycie i wyreguluj w razie potrzeby za pomocą pęsety. WAŻNE: Jeśli urządzenie nie będzie prawidłowo pasować do swojego uchwytu, istnieje ryzyko, że pęknie podczas kolejnych czynności.</li>
	<li>Następnie delikatnie umieść zbiorniki na uchwycie i wyrównaj je z klipsami. Należy uważać, aby O-ringi nie wypadły ze swoich szczelin podczas tego procesu.</li>
	<li>Delikatnie dociśnij zbiorniki, aż zatrzasną się na swoim miejscu. Upewnij się, że obie strony zbiorników są zabezpieczone i że chip wydaje się być we właściwej pozycji.</li>
</ol>
4. Przygotowanie komórek
<ol>
	<li>Dla komórek przylegających (linie pierwotne lub ustalone): Komórki płytki 1-2 dni przed eksperymentem tak, aby nie zlewały się w więcej niż 80% w dniu eksperymentu.</li>
	<li>Umieść komórki w zawiesinie (w PBS lub odpowiedniej pożywce) i dąż do stężenia roboczego od 1,0 x 106 komórek/ml do 1,0 x 107 komórek/ml. UWAGA: Nie zaobserwowaliśmy znaczących zmian w wydajności dostarczania ze względu na stężenie komórek.</li>
	<li>Wymieszaj komórki i żądany materiał do dostarczania w osobnej probówce, aby uzyskać pożądane stężenie materiału do eksperymentu. WAŻNE: Ponieważ opisana metoda dostarczania opiera się na dyfuzji w celu ułatwienia dostarczania, wyższe stężenie materiału zapewni wyższą dostawę. Jeśli to możliwe, zaleca się użycie roztworu 1 μM pożądanego materiału do wstępnych prób. Stężenie to można następnie zmniejszyć w przyszłych eksperymentach w razie potrzeby. Najniższe zgłoszone stężenie stosowane w tym urządzeniu to 10 nM21.</li>
</ol>
5. Operacja
<ol>
	<li>Pipetowana mieszanina komórek i materiału doprowadzającego do zbiornika (obecna konstrukcja ma maksymalną pojemność 150 μl). UWAGA: Większość konstrukcji urządzeń jest w pełni odwracalna, dlatego kierunek przepływu przez kanały nie ma znaczenia. Próbki mogą być ładowane do jednego z dwóch zbiorników.</li>
	<li>Przymocuj rurkę ciśnieniową do napełnionego zbiornika i dokręć nakrętkę, aby zapewnić prawidłowe uszczelnienie (często wystarczy dokręcenie palcami).</li>
	<li>Dostosuj ciśnienie do żądanego poziomu na regulatorze. Kontroluje to prędkość, z jaką komórki przemieszczają się przez urządzenie. Zwróć uwagę, że przepływ komórek nie rozpoczyna się, dopóki nie zostanie naciśnięty przycisk.</li>
</ol>
UWAGA: W poprzednich pracach azot lub sprężone powietrze działały równie dobrze jak gaz nośny.
<ol start="4">
	<li>Podnieś urządzenie na wysokość oczu i ustaw je tak, aby płyn w zbiorniku był dobrze widoczny. UWAGA: Śledź kolumnę cieczy, aby wyłączyć system przed opróżnieniem zbiornika.</li>
	<li>Naciśnij przycisk, aby zwiększyć ciśnienie w zbiorniku i rozpocząć przepływ komórek.</li>
	<li>Gdy poziom cieczy znajduje się około 2 mm od dna zbiornika, szybko przekręć regulator na 0 psi, aby zatrzymać przepływ. WAŻNE: Jeśli nie uda się zatrzymać przepływu przed opróżnieniem zbiornika, istnieje ryzyko wyrzucenia próbki ze zbiornika zbiorczego. Należy również pamiętać, że jeśli kolumna płynu nie porusza się w znacznym tempie lub znacznie zwolniła w stosunku do początkowego natężenia przepływu (np. 3 razy wolniej), zamontowane urządzenie jest prawdopodobnie zatkane i wymaga wymiany. Działanie zatkanego urządzenia może prowadzić do większej śmierci komórek.</li>
	<li>Zbierz leczone komórki z odpowiedniego zbiornika i umieść je w żądanej probówce/płytce do pobierania opłat. WAŻNE: Na tym etapie nie należy rozcieńczać pobranych komórek w żadnych, ponieważ porowane komórki będą nadal pobierać materiał przez okres do 10 minut20. Po upływie tego okna rozcieńczyć komórki w żądanym pożywce/buforze.</li>
	<li>Aby zebrać więcej leczonych komórek lub wypróbować alternatywne warunki eksperymentalne, w razie potrzeby powtórz kroki 5.1 - 5.7. Przypomnijmy, że chipy są odwracalne, dlatego próbki można montować w dowolnym zbiorniku. Pamiętaj, aby wymienić żetony w razie potrzeby, jeśli się zatkają. Wyrzuć zatkane urządzenia.</li>
</ol>
6. Demontaż
<ol>
	<li>Delikatnie odłącz zbiorniki od głównego uchwytu, odsuwając na bok ramiona zacisku.</li>
	<li>Umieść każdą część w odpowiednim pojemniku do przechowywania (szczegółowo w sekcji 1).</li>
	<li>Umieść zużyte wióry w osobnym pojemniku do utylizacji.</li>
</ol>

<ol><li>Schaffert, D., Wagner, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+progress+and+prospects%3A+synthetic+polymer-based+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Gene.+Ther%22%5BJournal%5D)">Gene therapy progress and prospects: synthetic polymer-based systems.</a> Gene. Ther. 15, 1131-1138 (2008).</li>
<li>Whitehead, K. A., Langer, R., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knocking+down+barriers%3A+advances+in+siRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Knocking down barriers: advances in siRNA delivery.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 8, 129-138 (2009).</li>
<li>Leader, B., Baca, Q. J., Golan, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+therapeutics%3A+a+summary+and+pharmacological+classification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Protein therapeutics: a summary and pharmacological classification.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 7, 21-39 (2008).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+by+Direct+Delivery+of+Reprogramming+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells by Direct Delivery of Reprogramming Proteins.</a> Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).</li>
<li>Dhar, S., Daniel, W. L., Giljohann, D. A., Mirkin, C. A., Lippard, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyvalent+Oligonucleotide+Gold+Nanoparticle+Conjugates+as+Delivery+Vehicles+for+Platinum%28IV%29+Warheads%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Polyvalent Oligonucleotide Gold Nanoparticle Conjugates as Delivery Vehicles for Platinum(IV) Warheads.</a> J. Am. Chem. Soc. 131, 14652-14653 (2009).</li>
<li>Jiang, Z. -X., Zhang, Z. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+PTPs+with+small+molecule+inhibitors+in+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+and+Metastasis+Reviews%22%5BJournal%5D)">Targeting PTPs with small molecule inhibitors in cancer treatment.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 27, 263-272 (2008).</li>
<li>Derfus, A. M., Chan, W. C. W., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+Delivery+of+Quantum+Dots+for+Live+Cell+Labeling+and+Organelle+Tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Intracellular Delivery of Quantum Dots for Live Cell Labeling and Organelle Tracking.</a> Adv. Mater. 16, 961-966 (2004).</li>
<li>Michalet, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantum+Dots+for+Live+Cells+in+Vivo+Imaging%2C+and+Diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantum Dots for Live Cells in Vivo Imaging, and Diagnostics.</a> Science. 307, 538-544 (2005).</li>
<li>Dahan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+Dynamics+of+Glycine+Receptors+Revealed+by+Single-Quantum+Dot+Tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Diffusion Dynamics of Glycine Receptors Revealed by Single-Quantum Dot Tracking.</a> Science. 302, 442-445 (2003).</li>
<li>Slowing, I. I., Trewyn, B. G., Lin, V. S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesoporous+Silica+Nanoparticles+for+Intracellular+Delivery+of+Membrane-Impermeable+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Mesoporous Silica Nanoparticles for Intracellular Delivery of Membrane-Impermeable Proteins.</a> J. Am. Chem. Soc. 129, 8845-8849 (2007).</li>
<li>Pack, D. W., Hoffman, A. S., Pun, S., Stayton, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+development+of+polymers+for+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Design and development of polymers for gene delivery.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 4, 581-593 (2005).</li>
<li>Joseph, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+lipids+used+in+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cationic lipids used in gene transfer.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 27 (97), 17-28 (1997).</li>
<li>Verma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface-structure-regulated+cell-membrane+penetration+by+monolayer-protected+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Surface-structure-regulated cell-membrane penetration by monolayer-protected nanoparticles.</a> Nat. Mater. 7, 588-595 (2008).</li>
<li>Yan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+intracellular+protein+delivery+platform+based+on+single-protein+nanocapsules%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nano%22%5BJournal%5D)">A novel intracellular protein delivery platform based on single-protein nanocapsules.</a> Nat. Nano. 5, 48-53 (2010).</li>
<li>Shi Kam, N. W., Jessop, T. C., Wender, P. A., Dai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanotube+Molecular+Transporters%3A+Internalization+of+Carbon+Nanotube-Protein+Conjugates+into+Mammalian+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Nanotube Molecular Transporters: Internalization of Carbon Nanotube-Protein Conjugates into Mammalian Cells.</a> J. Am. Chem. Soc. 126, 6850-6851 (2004).</li>
<li>Varkouhi, A. K., Scholte, M., Storm, G., Haisma, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosomal+escape+pathways+for+delivery+of+biologicals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Endosomal escape pathways for delivery of biologicals.</a> Journal of Controlled Release. 151, 220-228 (2011).</li>
<li>li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+Gene+Therapy%3A+New+Developments+In+Vivo+and+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Electroporation Gene Therapy: New Developments In Vivo and In Vitro.</a> Current Gene Therapy. 4, 309-316 (2004).</li>
<li>Fox, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+cells+in+microfluidic+devices%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Electroporation of cells in microfluidic devices: a review.</a> Anal. Bioanal. Chem. 385, 474-485 (2006).</li>
<li>Miller, D. L., Pislaru, S. V., Greenleaf, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonoporation%3A+Mechanical+DNA+Delivery+by+Ultrasonic+Cavitation%5BTitle%5D)+AND+%22Somatic+Cell+and+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Sonoporation: Mechanical DNA Delivery by Ultrasonic Cavitation.</a> Somatic Cell and Molecular Genetics. 27, 115-134 (2002).</li>
<li>Sharei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vector-free+microfluidic+platform+for+intracellular+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A vector-free microfluidic platform for intracellular delivery.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 2082-2087 (2013).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonendocytic+Delivery+of+Functional+Engineered+Nanoparticles+into+the+Cytoplasm+of+Live+Cells+Using+a+Novel%2C+High-Throughput+Microfluidic+Device%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Nonendocytic Delivery of Functional Engineered Nanoparticles into the Cytoplasm of Live Cells Using a Novel, High-Throughput Microfluidic Device.</a> Nano Lett. 12, 6322-6327 (2012).</li>
</ol>

Autorzy Armon Sharei, Robert Langer i Klavs F. Jensen są udziałowcami firmy SQZ Biotechnologies, która produkuje urządzenia mikroprzepływowe użyte w tym artykule.

Niektóre aspekty opisanej procedury eksperymentalnej (tj. czynniki inne niż konstrukcja chipa i szybkość operacyjna) mogą wymagać optymalizacji w zależności od typu ogniwa i materiału dostarczającego, do którego system jest stosowany. Poniższa dyskusja dotyczy niektórych z najczęstszych czynników, które należy wziąć pod uwagę podczas projektowania eksperymentów.
Aby poprawić sygnał dostarczania dla związków znakowanych fluorescencyjnie, należy zająć się źródłami fluorescencji tła. Wią...

Dostarczanie makrocząsteczek do cytoplazmy komórki jest kluczowym krokiem w zastosowaniach terapeutycznych i badawczych. Na przykład dostarczanie za pośrednictwem nanocząstek wykazało potencjał w terapii genowej1,2, podczas gdy dostarczanie białek jest obiecującym sposobem wpływania na funkcje komórkowe zarówno w warunkach klinicznych3, jak i laboratoryjnych4. Inne materiały, takie jak leki małocząsteczkowe, kropki kwantowe lub nanocząstki złota, są interesujące w zastosowaniach od terapii nowotworów5,6 po znakowanie wewnątrzkomórkowe7,8 i śledzenie pojedynczych cząsteczek9.
Błona komórkowa jest w dużej mierze nieprzepuszczalna dla makromolekuł. Wiele istniejących technik wykorzystuje nanocząstki polimerowe10,11, liposomy12 lub modyfikacje chemiczne13 w celu ułatwienia przerwania błony lub dostarczania endocytotów. W tych metodach wydajność dostarczania i żywotność komórki często zależą od struktury cząsteczki docelowej i typu komórki. Metody te mogą być skuteczne w dostarczaniu strukturalnie jednorodnych materiałów, takich jak kwasy nukleinowe, ale często nie nadają się do dostarczania materiałów o bardziej zróżnicowanej strukturze, takich jak białka14,15 i nanomateriały7. Co więcej, mechanizm rozrywania endosomów, na którym opiera się większość tych metod, jest często nieefektywny, co pozostawia wiele materiału uwięzionego w strukturach pęcherzykowych16. Wreszcie, metody, które są często opracowywane do stosowania z ustalonymi liniami komórkowymi, nie przekładają się dobrze na komórki pierwotne.
Metody poracji membrany, takie jak elektroporacja17,18 i sonoporacja19, są atrakcyjną alternatywą w niektórych zastosowaniach; jednak wiadomo, że powodują niską żywotność ogniw i mogą być ograniczone przez ładunek docelowego materiału dostarczającego.
Szybkie mechaniczne odkształcanie komórek, mikroprzepływowe podejście do dostarczania, ostatnio wykazało swoje zalety w porównaniu z obecnymi technikami w kontekście przeprogramowania komórek20 i dostarczania nanomateriałów21. Metoda ta polega na mechanicznym rozerwaniu błony komórkowej w celu ułatwienia cytozolowego dostarczania materiałów obecnych w otaczającym buforze. System wykazał potencjał w zakresie wykorzystania wcześniej trudnych typów komórek (np. pierwotnych komórek odpornościowych i komórek macierzystych) oraz materiałów (np. przeciwciał i nanorurek węglowych). W niniejszym artykule opisano ogólną procedurę stosowania tych urządzeń do wewnątrzkomórkowego dostarczania docelowych makrocząsteczek. Procedurę można uogólnić na większość typów komórek i materiałów podawczych; Zaleca się jednak przeprowadzenie krótkiej optymalizacji warunków, zgodnie z opisem w naszych wcześniej zgłoszonych wytycznych projektowych20, dla wszelkich wcześniej niezgłoszonych zastosowań. Do tej pory system był z powodzeniem wykorzystywany do dostarczania RNA, DNA, nanocząstek złota, kropek kwantowych, nanorurek węglowych, białek i polimerów dekstranu20,21.

<table><tbody><tr><td>Uchwyt na urządzenie i Zbiornik z tworzywa sztucznego</td><td>SQZ Biotechnologies</td><td>Holder</td><td></td></tr><tr><td>LSRFortessa Analyzer</td><td>Becton Dickinson</td><td>N/A</td><td>Maszyna do cytometrii przepływowej używana w Instytucie Kocha Podstawowe obiekty</td></tr><tr><td>Urządzenie mikroprzepływowe</td><td>SQZ Biotechnologies</td> O-ringi do <td>wyciskania</td><td></td>komórek</tr><tr><td></td><td>McMaster</td><td>9452K311</td><td></td></tr><tr><td>System ciśnieniowy do obsługi urządzenia</td><td>SQZ Biotechnologies</td><td>System</td><td></td>ciśnieniowy</tr><tr><td>Pęseta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel</td><td></td><td></td><td></td> ultradźwiękowa</tr></tbody></table>

Ściskanie komórek jako solidna, mikroprzepływowa platforma dostarczania wewnątrzkomórkowego

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Szybka mechaniczna deformacja komórek pojawiła się jako obiecująca, bezwektorowa metoda wewnątrzkomórkowego dostarczania makrocząsteczek i nanomateriałów. Technologia ta wykazała potencjał w radzeniu sobie z wcześniej wymagającymi zastosowaniami; w tym dostarczanie do pierwotnych komórek odpornościowych, przeprogramowywanie komórek, nanorurki węglowe i dostarczanie kropek kwantowych. Ta bezwektorowa platforma mikroprzepływowa opiera się na mechanicznym rozerwaniu błony komórkowej w celu ułatwienia cytozolowego dostarczania materiału docelowego. W niniejszym artykule opisano szczegółową metodę użycia tych urządzeń mikroprzepływowych, w tym montaż urządzenia, przygotowanie ogniw i działanie systemu. Takie podejście do dostarczania wymaga krótkiej optymalizacji typu urządzenia i warunków pracy dla wcześniej nieraportowanych aplikacji. Dostarczone instrukcje można uogólnić na większość typów komórek i materiałów podawczych, ponieważ system ten nie wymaga specjalistycznych ani etapów modyfikacji chemicznej/koniugacji. Ta praca zawiera również zalecenia dotyczące poprawy wydajności urządzenia i rozwiązywania potencjalnych problemów związanych z zatykaniem, niską wydajnością dostarczania i żywotnością komórek.

Rycina 1 zawiera opisowy schemat mikrofluidycznego systemu dostarczania. Ryciny 2a-b ilustrują typowe wyniki traktowania komórek HeLa za pomocą różnych konstrukcji urządzeń w obecności dekstranu 3 kDa sprzężonego z fluoresceincją20. Przy prawidłowym przeprowadzeniu procedury wydajność systemu będzie zależała od typu urządzenia i prędkości pracy. Należy zatem zoptymalizować te warunki dla danej aplikacji przed przystąpieniem do bardziej złożonych eksperymentów. W zakresie warun...

Szybka mechaniczna deformacja komórek pojawiła się jako obiecująca, bezwektorowa metoda wewnątrzkomórkowego dostarczania makrocząsteczek i nanomateriałów. Protokół ten zawiera szczegółowe instrukcje dotyczące korzystania z systemu w szerokim zakresie zastosowań.

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Ogólnym celem eksperymentu z wykorzystaniem metody spadkowej jest dostarczenie makrocząsteczek do komórek docelowych bez użycia wektorów, poprzez mechaniczne rozrywanie błony. Osiąga się to najpierw poprzez umieszczenie komórek docelowego typu w zawiesinie z pożądanym materiałem do dostarczenia, a następnie załadowanie ich do zbiornika specjalnie zaprojektowanego urządzenia mikrofluidycznego. W drugim kroku urządzenie mikrofluidyczne zostaje poddane ciśnieniu, a komórki są przeprowadzane przez układ kanałów mikrofluidycznych, które ściskają komórki, ułatwiając tym samym przejściowe przerwanie ciągłości błony.Następnie komórki inkubuje się w obecności materiału docelowego, aby ułatwić transport dyfuzyjny materiału do cytoplazmy komórki, podczas gdy błona komórkowa ulega naprawie. Wyniki uzyskane za pomocą cytometrii przepływowej potwierdzają efektywną dostawę makrocząsteczek.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak elektroporacja i lipofekcja, jest możliwość pracy z trudnymi typami komórek oraz materiałami, których nie można skutecznie dostarczyć za pomocą innych metod. Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania z dziedziny biologii, takie jak sposoby usprawnienia przeprogramowania komórek. Zastosowania tej techniki obejmują terapię i diagnostykę nowotworów, ponieważ system ten umożliwia manipulację komórkami odpornościowymi w celu zwiększenia ich skuteczności przeciwnowotworowej.W pierwszej kolejności należy wykonać lub zakupić urządzenie mikrofluidyczne, uchwyt urządzenia, plastikowe zbiorniczki na ciecz oraz pierścienie O-ring przedstawione tutaj i wyszczególnione w towarzyszącym protokole tekstowym, a następnie częściowo napełnić trzy szczelne pojemniki 70%ethanol. Umieść urządzenia w pierwszym pojemniku, zbiorniczki i pierścienie O-ring w drugim, a uchwyty w trzecim. Następnie dopełnij pojemniki 70%ethanol.Następnie, przed użyciem, umieść pojemnik z rezerwuarami i pierścieniami O-ring oraz pojemnik z uchwytami w kąpieli ultradźwiękowej na od 5 do 10 minut. Pomoże to usunąć wszelkie zanieczyszczające cząsteczki z poprzednich eksperymentów, podczas gdy komponenty są poddawane sonikacji, przetrzyj powierzchnię roboczą w komorze z laminarnym przepływem powietrza 70% etanolem. Następnie wysterylizuj wszystkie wymagane materiały, w tym trzy pojemniki i pęsetę, przecierając je 70% etanolem, i umieść je wewnątrz komory z laminarnym przepływem powietrza, aby rozpocząć montaż.Najpierw ułóż dwie do trzech chusteczek beztkaninowych w obszarze roboczym. Następnie za pomocą pęsety wyjmij plastikowe zbiorniczki z pojemnika z etanolem i ułóż je na chusteczkach, aby ułatwić odsysanie kapilarne i odparowanie etanolu z ich powierzchni wewnętrznych. Delikatnie ostukaj zbiorniczki, aby wspomóc usunięcie roztworu etanolu.W razie potrzeby należy użyć gazu pod ciśnieniem, aby całkowicie oczyścić zbiornik. Po wyschnięciu zbiorników należy włożyć pierścienie O-ring do odpowiednich gniazd w zbiornikach. Następnie za pomocą pęsety należy umieścić chip stroną aktywną do góry w uchwycie urządzenia.Upewnij się, że chip leży płasko w uchwycie i w razie potrzeby popraw jego ułożenie za pomocą pęsety. Jeśli urządzenie nie pasuje prawidłowo do uchwytu, istnieje ryzyko jego uszkodzenia podczas kolejnych kroków. Następnie ostrożnie umieść zbiorniki na uchwycie i wyrównaj je z zatrzaskami.Upewnij się, że uszczelki O-ring nie wypadły ze swoich gniazd. Podczas tego procesu delikatnie dociśnij zbiorniki, aż wskoczą na miejsce z charakterystycznym kliknięciem. Upewnij się, że obie strony zbiorników są stabilne, a chip znajduje się w prawidłowej pozycji.Nie należy naciskać zbiorników z nadmierną siłą, ponieważ ciśnienie może uszkodzić chipy dla linii komórkowych pierwotnych lub przylepnych. Komórki należy wysiać jeden lub dwa dni przed eksperymentem, aby ich konfluencja nie przekroczyła 80%.W dniu przeprowadzenia eksperymentu. Bezpośrednio przed badaniem zebrać komórki i resuspendować je w medium lub innym odpowiednim buforze, tak aby uzyskanym stężenie wynosiło od 1 do 10 milionów komórek na mililitr. Następnie ostrożnie przepuścić zawiesinę komórkową przez sitko komórkowe o rozmiarze oczek 40 µm, aby zapobiec zatykaniu urządzenia przez skupiska komórek i macierzy.Po odfiltrowaniu wymieszano 300 µL zawiesiny komórkowej z odpowiednim stężeniem materiału dostarczającego w osobnej probówce. W tej demonstracji na każde 50 µL zawiesiny komórkowej dodano 2 µL dekstryny o stężeniu 5 mg/mL oraz 2 µL przeciwciała kontrolnego izotypowego Alexa 488.Następnie delikatnie wymieszaj 100 µL komórek poprzez pipetowanie. Następnie, używając końcówek do nakładania żelu, nanieś komórki i materiał dostawczy do jednego z reservoirów, podłącz wężyk ciśnieniowy do wypełnionego reservoiru i mocno zaciśnij węzeł palcami, aby zapewnić szczelność. Następnie ustaw ciśnienie powietrza na regulatorze na 70 PSI, aby kontrolować prędkość przemieszczania się komórek przez urządzenie.Ciśnienie powinno zostać zoptymalizowane dla konkretnego połączenia komórek i chipa mikroprzepływowego użytego w każdym eksperymencie. Po przygotowaniu wszystkich elementów, unieś urządzenie na wysokość oczu i ustaw je tak, aby ciecz w zbiorniku była łatwo widoczna. Następnie naciśnij zawór przyciskowy, aby zwiększyć ciśnienie w zbiorniku i rozpocząć przepływ komórek.Obserwuj prędkość przepływu cieczy z zbiornika. Jeśli przepływ cieczy znacznie spowolni w stosunku do początkowego natężenia, zamontowane urządzenie jest prawdopodobnie zapchane i wymaga wymiany. Zwiększone naprężenie ścinające spowodowane blokadą doprowadzi do zwiększonej w stosunku do normy śmierci komórek.Gdy poziom cieczy znajdzie się w odległości około dwóch milimetrów od dna zbiornika, szybko przekręć regulator na zero PSI, aby zatrzymać przepływ. Ważne jest, aby zatrzymać przepływ powietrza przed całkowitym opróżnieniem zbiornika, w przeciwnym razie próbka może zostać wyrzucona ze zbiornika zbierającego. Następnie zbierz przetworzone komórki ze zbiornika odpływowego i umieść je w probówce do mikrocentryfugi.W temperaturze pokojowej komórki o określonej wydajności będą kontynuować pobieranie materiału przez maksymalnie 10 minut. Po 10 minutach wysiać komórki z dodatkową pożywką lub przystąpić do dalszego wykorzystania komórek zgodnie z potrzebami eksperymentalnymi. Powtórzyć te kroki, aby zebrać odpowiednią liczbę potraktowanych komórek, i wymieniać chipy w razie ich zapchania, utylizując zapchane urządzenia przed każdym kolejnym próbką.Zmień kierunek przepływu, aby zminimalizować efekty zapychania. Po zakończeniu zbierania komórek delikatnie odłącz zbiorniki od głównego uchwytu, odsuwając ramiona zacisku. Następnie umieść każdą część przeznaczoną do ponownego użycia w odpowiednim pojemniku do przechowywania i wypełnij je świeżym 70%ethanol.Na koniec wszystkie zużyte chipy należy umieścić w oddzielnym pojemniku w celu odpowiedniej utylizacji. Zmierzono wydajność dostarczania oraz żywotność komórek HeLa. W serii doświadczeń przetestowano trzy różne chipy mikrofluidyczne w zakresie prędkości do 600 millimeters per second.Testy te wykazały, że zwiększone prędkości przepływu poprawiły dostarczanie koniugowanej z fluoresceincą dekstryny o masie trzech kilodaltonów do komórek w każdym z badanych układów. Dodatkowo zwiększone prędkości spowodowały również spadek żywotności komórek o około 20% w badanych urządzeniach. Taki poziom śmiertelności komórek jest stosunkowo niski i często jest znacznie wyższy w urządzeniach o niewłaściwej konstrukcji.Pobieranie dekstryny sprzężonej z barwnikiem Pacific blue przez populację komórek kontrolnych pokazaną po lewej stronie jest wynikiem ograniczonego wiązania powierzchniowego oraz efektów endocytarnych. Komórki te były eksponowane na materiał dostarczający przez ten sam czas, co komórki poddane działaniu preparatu. Po prawej stronie znajduje się populacja żywych komórek, które przepływały przez urządzenie mikroprzepływowe podczas ekspozycji na tę samą stężenie dekstryny, co w przypadku komórek kontrolnych.Komórki w zacienionym obszarze są uznawane za niedostarczone, natomiast komórki po prawej stronie linii definiuje się jako dostarczone. Po opanowaniu technika ta może zostać wykonana w czasie krótszym niż jedna godzina, jeśli jest przeprowadzana prawidłowo. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak analiza pooptometryczna, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące np. wydajności dostarczania oraz funkcjonalności materiału po jego opracowaniu.Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie medycyny regeneracyjnej do eksploracji programowania komórek w pierwotnych komórkach dorosłych przy użyciu bezpośredniego dostarczania białek. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat konfiguracji i obsługi systemu samozaciskowego w wybranym zastosowaniu.

cell-squeezing-as-robust-microfluidic-intracellular-delivery

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Ściskanie komórek jako solidna platforma dostarczania do komórki mikrofluidycznej

Wychwytywanie komórek przy użyciu urządzenia mikrofluidycznego

Opracowano nowy system mikrofluidyczny wykorzystujący zjawisko pompowania pasywnego oraz sterowany przez użytkownika system dostarczania płynów. Ze względu na niski koszt, łatwość obsługi, precyzję objętościową, wysoką prędkość, powtarzalność i automatyzację, system mikrofluidyczny ten ma potencjał do zastosowania w szerokim zakresie aplikacji biologicznych.

Szybki system dostarczania oparty na kropelkach do pompowania pasywnego w urządzeniach mikroprzepływowych

Łącząc generowanie monodyspersyjnych kropli z inercyjnym porządkowaniem komórek i cząsteczek, opisujemy metodę enkapsulacji pożądanej liczby komórek lub cząsteczek w pojedynczej kropli z częstotliwością rzędu kHz. Wykazujemy wydajność dwukrotnie przekraczającą wydajność enkapsulacji nieuporządkowanej w przypadku kropli z jedną lub dwiema cząsteczkami.

Wysokoprzepustowa mikroenkapsulacja pojedynczych komórek i wielu komórek

Opracowaliśmy zautomatyzowaną platformę do hodowli komórek i przesłuchań do eksperymentów stymulacji komórek na mikroskalę.  Platforma oferuje prostą, wszechstronną i precyzyjną kontrolę w hodowli i stymulacji małych populacji komórek oraz odzyskiwaniu lizatów do analiz molekularnych.  Platforma doskonale nadaje się do badań, w których wykorzystuje się cenne komórki i/lub odczynniki.

Wszechstronna, zautomatyzowana platforma do eksperymentów ze stymulacją komórek w mikroskali

Mikroprzepływowe natryskiwanie dwuwarstwy lipidowej na granicy kropelek zapewnia niezawodny sposób generowania pęcherzyków z kontrolą nad asymetrią błony, włączeniem białek transbłonowych i enkapsulacją materiału. Technika ta może być stosowana do badania różnych systemów biologicznych, w których pożądane są biomolekuły podzielone na przedziały.

Wytwarzanie dwuwarstwowych pęcherzyków lipidowych za pomocą natryskiwania mikroprzepływowego

Platforma elektroporacji wspomagana wirami mikroprzepływowymi została opracowana do sekwencyjnego dostarczania wielu cząsteczek do identycznych populacji komórek z precyzyjną i niezależną kontrolą dawkowania. Etap oczyszczania komórek docelowych w oparciu o rozmiar, poprzedzający elektroporację, przyczynił się do zwiększenia wydajności dostarczania molekularnego i żywotności komórek przetworzonych.

Mikroskalowy elektroporator wspomagany wirami do sekwencyjnego dostarczania molekularnego

Tutaj prezentujemy protokół izolacji i hodowli pojedynczych komórek za pomocą platformy mikroprzepływowej, który wykorzystuje nową koncepcję projektowania mikrostudzienek, aby umożliwić wysokowydajną izolację pojedynczych komórek i długoterminową hodowlę klonalną.

Platforma mikroprzepływowa do wysokowydajnej izolacji i hodowli pojedynczych komórek

Mikroprzepływowy chip został stworzony do produkcji par złotych kropek do generowania pęcherzyków tandemowych i pokrytych fibronektyną wysp do tworzenia wzorów pojedynczych komórek w pobliżu. Wynikowe pole przepływu scharakteryzowano za pomocą prędkości obrazu cząstek i wykorzystano do badania różnych efektów biologicznych, w tym poracji błony komórkowej, deformacji błony i wewnątrzkomórkowej odpowiedzi wapnia.

System mikroprzepływowy z modelowaniem powierzchni do badania interakcji pęcherzyków kawitacyjnych z komórką i wynikających z niej efektów biologicznych na poziomie pojedynczej komórki

Ten protokół opisuje montaż i działanie taniego urządzenia akustofluidycznego do szybkiego dostarczania molekularnego do komórek poprzez sonoporację wywołaną przez ultradźwiękowe środki kontrastowe.

Montaż i eksploatacja urządzenia akustyczno-fluidycznego w celu lepszego dostarczania związków molekularnych do komórek

Obecny protokół opisuje projekt, produkcję i charakterystykę systemu mikroprzepływowego zdolnego do wyrównania, unieruchomienia i precyzyjnego ucisku setek zarodków Drosophila melanogaster przy minimalnym zaangażowaniu użytkownika. System ten umożliwia obrazowanie w wysokiej rozdzielczości i odzyskiwanie próbek do analizy po stymulacji i może być skalowany w celu uwzględnienia innych wielokomórkowych systemów biologicznych.

Mechanostymulacja organizmów wielokomórkowych za pomocą wysokoprzepustowego systemu kompresji mikroprzepływowej

Poznaj metodę mechanicznego dostarczania makrocząsteczek do komórek za pomocą mikroprzepływowego urządzenia z komórkami ściskanymi pod ciśnieniem. Technika ta umożliwia wektorowe dostarczanie materiałów do trudnych typów komórek z zastosowaniem w terapii przeciwnowotworowej.

Ściskanie komórek jako solidna, mikroprzepływowa platforma dostarczania wewnątrzkomórkowego

Przeglądaj więcej filmów