Ściskanie komórek jako solidna, mikroprzepływowa platforma dostarczania wewnątrzkomórkowego
November 7th, 2013
Szybka mechaniczna deformacja komórek pojawiła się jako obiecująca, bezwektorowa metoda wewnątrzkomórkowego dostarczania makrocząsteczek i nanomateriałów. Protokół ten zawiera szczegółowe instrukcje dotyczące korzystania z systemu w szerokim zakresie zastosowań.
Ogólnym celem eksperymentu z opadaniem jest dostarczenie makrocząsteczek wolnych od wektorów do komórek docelowych za pomocą mechanicznego rozrywania. Osiąga się to poprzez uprzednie umieszczenie docelowego typu ogniwa w zawiesinie z pożądanym materiałem zasilającym i załadowanie do zbiornika specjalnie zaprojektowanego urządzenia mikroprzepływowego. W drugim etapie urządzenie mikroprzepływowe jest poddawane ciśnieniu, a komórki są napędzane przez szereg kanałów mikroprzepływowych, które ściskają komórki, aby ułatwić przejściowe przerwanie błony.
Następnie komórki mogą inkubować w obecności docelowego materiału dostawczego, aby ułatwić dyfuzyjny transport materiału do cytoplazmy komórki. Podczas gdy błona komórkowa jest naprawiana. Uzyskano wyniki, które wskazują na efektywne dostarczanie makrocząsteczek dzięki zastosowaniu cytometrii przepływowej.
Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak ation i lipo perfection, jest to, że jest ona w stanie poradzić sobie z trudnymi typami komórek i materiałami, których nie można skutecznie dostarczyć innymi metodami. Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii, takie jak to, jak poprawić programowanie komórek ponownie. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię i diagnostykę raka, ponieważ system umożliwia manipulowanie komórkami odpornościowymi w celu zwiększenia ich skuteczności przeciwnowotworowej.
Aby rozpocząć, wyprodukuj lub kup urządzenie mikroprzepływowe, uchwyt urządzenia, plastikowe zbiorniki płynów i O-ringi pokazane tutaj i wymienione ze szczegółami w dołączonym protokole tekstowym, a następnie napełnij trzy zamykane pojemniki częściowo 70% etanolem. Umieść urządzenia w pierwszym pojemniku, zbiorniki i O-ringi w drugim pojemniku, a uchwyty w trzecim. Następnie napełnij pojemniki do końca 70% etanolem.
Następnie pojemnik zawierający zbiorniki i O-ringi oraz ten zawierający uchwyty w kąpieli ultradźwiękowej na pięć do 10 minut przed użyciem. Pomoże to usunąć wszelkie cząsteczki zanieczyszczające z poprzednich eksperymentów, podczas gdy składnik sonikacyjny przeciera miejsce pracy w komorze bezpieczeństwa biologicznego 70% etanolem. Następnie wysterylizuj wszystkie wymagane materiały, w tym trzy pojemniki i pęsetę, wycierając je 70% etanolem i umieść w szafie bezpieczeństwa biologicznego, aby rozpocząć montaż.
Najpierw połóż dwie lub trzy chusteczki o niskiej zawartości kłaczków w obszarze roboczym. Następnie wyjmij plastikowe zbiorniki z pojemnika na etanol za pomocą pęsety i umieść je na chusteczkach, aby ułatwić odprowadzanie i odparowywanie etanolu z jego wewnętrznej powierzchni. Delikatnie postukaj w zbiorniki, aby pomóc w usunięciu roztworu etanolu.
W razie potrzeby użyj gazu pod ciśnieniem, aby całkowicie oczyścić zbiornik. Po wyschnięciu zbiorników włóż O-ringi w odpowiednie szczeliny w zbiornikach. Następnie użyj pęsety, aby umieścić chip stroną zadrukowaną do góry w uchwycie urządzenia.
Upewnij się, że wiór leży płasko w uchwycie i w razie potrzeby wyreguluj za pomocą pęsety. Jeśli urządzenie nie będzie prawidłowo pasować do swojego uchwytu, istnieje ryzyko, że pęknie podczas kolejnych czynności. Następnie delikatnie umieść zbiorniki na uchwycie i wyrównaj je z klipsami.
Upewnij się, że O-ringi nie wypadają ze swoich szczelin. Podczas tego procesu delikatnie dociśnij zbiorniki, aż zatrzasną się na swoim miejscu. Upewnij się, że obie strony zbiorników są zabezpieczone i że chip wydaje się być we właściwej pozycji.
Nie naciskaj na zbiorniki z nadmierną siłą. Ponieważ ciśnienie może złamać wióry w celu pierwotnego lub przylegania. Linie komórkowe, umieść komórki na jeden do dwóch dni przed eksperymentem, tak aby nie zlewały się w więcej niż 80%.
W dniu eksperymentu. Bezpośrednio przed eksperymentem zbierz komórki i zreus, zawieś je w pożywce lub innym pożądanym buforze w ilości od jednego do 10 milionów komórek na mililitr. Następnie ostrożnie przepuść zawiesinę komórek przez siatkę o grubości 40 mikronów, aby zapobiec zatykaniu urządzenia przez grudki komórek i matrycy.
Po odcedzeniu wymieszać 300 mikrolitrów zawiesiny komórek z pożądanym stężeniem materiału dostarczającego w osobnej probówce. Do tej demonstracji dwa mikrolitry dekstryny w ilości pięciu miligramów na mililitr i dwa mikrolitry Alexy. Na 50 mikrolitrów zawiesiny komórkowej dodaje się 4 88 izotopowych przeciwciał kontrolnych.
Następnie delikatnie wymieszaj 100 mikrolitrów komórek przez pipetowanie. Następnie za pomocą końcówek do ładowania żelem odpipetuj komórki i materiał doprowadzający do jednego ze zbiorników, przymocuj rurkę ciśnieniową do napełnionego zbiornika i dokręć palcem węzeł, aby zapewnić prawidłowy sufit. Następnie dostosuj ciśnienie powietrza na regulatorze do 70 PSI, aby kontrolować prędkość, z jaką komórki przemieszczają się przez urządzenie.
Ciśnienie powinno być zoptymalizowane pod kątem konkretnej kombinacji ogniw i chipów mikroprzepływowych stosowanych w każdym eksperymencie. Po przygotowaniu wszystkiego podnieś urządzenie na wysokość oczu i ustaw je tak, aby płyn w zbiorniku był dobrze widoczny. Następnie naciśnij zawór przyciskowy, aby zwiększyć ciśnienie w zbiorniku i rozpocząć przepływ komórek.
Obserwuj prędkość, z jaką płyn wypływa ze zbiornika. Jeśli płyn znacznie zwalnia w stosunku do początkowego natężenia przepływu, zamontowane urządzenie jest prawdopodobnie zatkane i wymaga wymiany. Zwiększone ścinanie spowodowane blokadą spowoduje większą niż normalnie śmierć komórki.
Gdy poziom cieczy znajdzie się około dwóch milimetrów od dna zbiornika, szybko przekręć regulator na zero PSI, aby zatrzymać przepływ. Ważne jest, aby zatrzymać przepływ powietrza przed opróżnieniem zbiornika lub przed wyrzuceniem próbki ze zbiornika zbiorczego. Następnie zbierz leczone komórki ze zbiornika odpływowego i umieść je w mikroprobówce wirówkowej.
W temperaturze pokojowej oceniane komórki będą nadal pobierać materiał przez maksymalnie 10 minut. Po 10 minutach pokryj komórki dodatkowymi pożywkami lub kontynuuj korzystanie z komórek zgodnie z potrzebami eksperymentalnymi. Powtórz te kroki, aby zebrać tyle poddanych działaniu komórek, ile jest potrzebne i wymienić chipy w razie potrzeby, jeśli zatkają i wyrzuć zatkane urządzenia C dla każdej kolejnej próbki.
Zmień kierunek przepływu, aby zminimalizować skutki zatykania. Po zakończeniu zbierania ogniw delikatnie odłącz zbiorniki od głównego uchwytu, odsuwając na bok ramiona klipsa. Następnie umieść każdą część do ponownego użycia w odpowiednim pojemniku do przechowywania i napełnij je świeżym 70% etanolem.
Na koniec umieść wszystkie zużyte wióry w osobnym pojemniku w celu prawidłowej utylizacji. Zmierzono wydajność dostarczania i żywotność komórek hela. Po serii eksperymentów przetestowano trzy różne chipy mikroprzepływowe w zakresie prędkości do 600 milimetrów na sekundę.
Testy te wykazały, że zwiększone prędkości przepływu poprawiły dostarczanie fluorescencyjnie sprzężonej dekstryny o trzech kilodaltonach do komórek dla każdego z testowanych chipów. Dodatkowo zwiększone prędkości spowodowały również spadek żywotności ogniw o około 20% w testowanych urządzeniach. Ta ilość śmierci komórek jest stosunkowo niska i często jest znacznie wyższa w niewłaściwie zaprojektowanych urządzeniach.
Wychwyt skoniugowanej dekstryny błękitu pacyficznego do populacji komórek kontrolnych pokazanej po lewej stronie jest wynikiem ograniczonego wiązania powierzchniowego i działania endocytarnego. Ponieważ komórki są wystawione na działanie materiału dostarczającego przez ten sam czas, co komórki traktowane. Po prawej stronie znajduje się populacja żywych komórek, które przechodzą przez urządzenie mikroprzepływowe, będąc wystawionym na działanie tego samego stężenia dekstryny, co komórki kontrolne.
Komórki w zacienionym obszarze są uważane za niedostarczone, a komórki po prawej stronie wiersza są definiowane jako dostarczone. Po opanowaniu tej techniki można wykonać w mniej niż godzinę, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podążając za tą procedurą, innymi metodami, można wykonać optometrię po życiu, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak wydajność dostarczania i funkcjonalność materiału Po jego opracowaniu.
Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się medycyną regeneracyjną do zbadania programowania komórek w dorosłych komórkach pierwotnych przy użyciu bezpośredniego dostarczania białek. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skonfigurować i obsługiwać system samowyciskania dla żądanego zastosowania.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł przedstawia metodę bezprzewodowej dostawy makrocząsteczek do komórek docelowych poprzez szybką deformację mechaniczną. Protokół opisuje wykorzystanie urządzenia mikrofluidycznego w celu ułatwienia tego procesu.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Mikrofluidyka
- Techniki dostarczania wewnątrzkomórkowego
Tło
- Rozruszenie mechaniczne oferuje nowatorskie podejście do dostarczania materiałów do komórek.
- Ta metoda może być ukierunkowana na trudne typy komórek, które są trudne do transfekcji.
- Ma potencjalne zastosowania w terapii raka i manipulacji komórkami odpornościowymi.
- Cytometria przepływowa jest używana do oceny skuteczności dostarczenia.
Cel badania
- Opracowanie metody efektywnego wewnątrzkomórkowego dostarczania makrocząsteczek.
- Poprawa rozumienia technik reprogramowania komórek.
- Poprawa skuteczności terapeutycznej komórek odpornościowych przeciwko guzom.
Zastosowanie metod
- Wytwarzanie i sterylizacja urządzenia mikrofluidycznego.
- Przygotowanie zawiesin komórkowych i materiałów dostarczających.
- Nadawanie ciśnienia urządzeniu mikrofluidycznemu w celu indukowania deformacji komórek.
- Analiza cytometrii przepływowej w celu oceny sukcesu dostarczenia.
Główne wyniki
- Udało się dostarczyć makrocząsteczki do komórek docelowych.
- Cytometria przepływowa potwierdziła efektywne wewnątrzkomórkowe przyjmowanie.
- Metoda wykazała zalety w porównaniu z tradycyjnymi technikami dostarczania.
- Podkreślono potencjalne zastosowania w leczeniu raka.
Wnioski
- Ta metoda mechanicznego dostarczania jest obiecującą alternatywą dla wymagających typów komórek.
- Otwiera nowe drogi badań w dziedzinie manipulacji komórkami i terapii.
- Wymagane są dalsze badania w celu zoptymalizowania techniki dla różnych zastosowań.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Vector-free intracellular delivery remains a critical bottleneck in therapeutic development, particularly for primary immune cells and hard-to-transfect cell types. This microfluidic squeezing platform enables direct cytosolic delivery of macromolecules and nanomaterials without chemical modification or specialized buffers, reducing mechanistic ambiguity in target validation. By improving delivery efficiency in challenging systems, the method supports predictive confidence in early discovery and de-risks translational pathways for immunotherapy and regenerative medicine applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional interrogation of therapeutic hypotheses in primary immune cells and reprogramming models.
- Operational Value: Provides a reproducible, buffer-free system for delivering transcription factors, antibodies, or nucleic acids to assess target engagement.
- Predictive Value: Supports go/no-go decisions by confirming intracellular delivery of effector molecules prior to functional assays.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, flow-cytometry-based readouts of delivery efficiency across cell types and material concentrations.
- Operational Value: Standardizes sample preparation through controlled shear rates and device geometry, minimizing variability in high-throughput screens.
- Assay Readiness: Outputs delivery percentage and viability metrics that enable compound or material ranking in lead identification workflows.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery-scale immune cell modulation to preclinical evaluation of enhanced anti-tumor efficacy.
- Mechanistic De-risking: Confirms cytosolic delivery of immunomodulatory proteins, reducing reliance on endogenous expression systems.
- Disease-Relevant Systems: Supports testing in primary T cells, dendritic cells, and stem cells relevant to cancer immunotherapy and regenerative medicine.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum, enabling hypothesis testing in early biology, assay-ready sample generation for screening, and mechanistic validation prior to in vivo studies.
- Discovery Biology: Facilitates target validation by delivering CRISPR components, siRNAs, or antibodies to confirm pathway involvement in immune activation or cell fate.
- Screening: Delivers libraries of nanomaterials or peptides to immune cells for uptake and functional screening under standardized shear conditions.
- Analytics: Provides flow cytometry-derived delivery efficiency and viability percentages as quantitative endpoints for condition comparison.
- Translational Research: Enables preclinical testing of engineered immune cells with delivered payloads to assess tumor-killing activity in co-culture models.
- Enterprise Reuse: Platform design allows reuse across cell types and payloads with only pressure and chip optimization, supporting scalable deployment in discovery and process development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces false negatives in target validation by achieving delivery in primary and non-dividing cells where viral or lipid-based methods fail.
- Operational Value: Eliminates need for payload conjugation, specialized buffers, or viral production, simplifying workflow and reducing cost per condition.
- Strategic Value: Increases confidence in early-stage immunomodulatory candidates by confirming intracellular delivery before resource-intensive animal studies.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of delivery-dependent biologics, such as cytokine engagers or transcription factor therapies, based on achievable cytosolic concentrations.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device handling, cell suspension preparation, and pressure regulation to avoid clogging or excessive shear-induced death.
- Depends on access to microfluidic chips, pressure regulators, reservoir systems, and flow cytometry for readout; compatible with standard biosafety cabinet workflows.
- Necessitates standardization of cell concentration (1–10 million/mL), pre-straining through 40 µm filters, and incubation time (≤10 min post-delivery) for reproducibility across users and sites.
- Requires optimization of pressure (e.g., 70 PSI) and flow speed per cell type and chip design to balance delivery efficiency and viability, with viability loss typically <20% under optimized conditions.
- Limited by potential clogging from aggregates or debris, necessitating cell straining and regular chip exchange; performance varies with cell size, membrane stiffness, and payload molecular weight.
