Ściskanie komórek jako solidna, mikroprzepływowa platforma dostarczania wewnątrzkomórkowego
7 listopada 2013
Szybka mechaniczna deformacja komórek pojawiła się jako obiecująca, bezwektorowa metoda wewnątrzkomórkowego dostarczania makrocząsteczek i nanomateriałów. Protokół ten zawiera szczegółowe instrukcje dotyczące korzystania z systemu w szerokim zakresie zastosowań.
Ogólnym celem eksperymentu z wykorzystaniem metody spadkowej jest dostarczenie makrocząsteczek do komórek docelowych bez użycia wektorów, poprzez mechaniczne rozrywanie błony. Osiąga się to najpierw poprzez umieszczenie komórek docelowego typu w zawiesinie z pożądanym materiałem do dostarczenia, a następnie załadowanie ich do zbiornika specjalnie zaprojektowanego urządzenia mikrofluidycznego. W drugim kroku urządzenie mikrofluidyczne zostaje poddane ciśnieniu, a komórki są przeprowadzane przez układ kanałów mikrofluidycznych, które ściskają komórki, ułatwiając tym samym przejściowe przerwanie ciągłości błony.
Następnie komórki inkubuje się w obecności materiału docelowego, aby ułatwić transport dyfuzyjny materiału do cytoplazmy komórki, podczas gdy błona komórkowa ulega naprawie. Wyniki uzyskane za pomocą cytometrii przepływowej potwierdzają efektywną dostawę makrocząsteczek.
Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak elektroporacja i lipofekcja, jest możliwość pracy z trudnymi typami komórek oraz materiałami, których nie można skutecznie dostarczyć za pomocą innych metod. Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania z dziedziny biologii, takie jak sposoby usprawnienia przeprogramowania komórek. Zastosowania tej techniki obejmują terapię i diagnostykę nowotworów, ponieważ system ten umożliwia manipulację komórkami odpornościowymi w celu zwiększenia ich skuteczności przeciwnowotworowej.
W pierwszej kolejności należy wykonać lub zakupić urządzenie mikrofluidyczne, uchwyt urządzenia, plastikowe zbiorniczki na ciecz oraz pierścienie O-ring przedstawione tutaj i wyszczególnione w towarzyszącym protokole tekstowym, a następnie częściowo napełnić trzy szczelne pojemniki 70%ethanol. Umieść urządzenia w pierwszym pojemniku, zbiorniczki i pierścienie O-ring w drugim, a uchwyty w trzecim. Następnie dopełnij pojemniki 70%ethanol.
Następnie, przed użyciem, umieść pojemnik z rezerwuarami i pierścieniami O-ring oraz pojemnik z uchwytami w kąpieli ultradźwiękowej na od 5 do 10 minut. Pomoże to usunąć wszelkie zanieczyszczające cząsteczki z poprzednich eksperymentów, podczas gdy komponenty są poddawane sonikacji, przetrzyj powierzchnię roboczą w komorze z laminarnym przepływem powietrza 70% etanolem. Następnie wysterylizuj wszystkie wymagane materiały, w tym trzy pojemniki i pęsetę, przecierając je 70% etanolem, i umieść je wewnątrz komory z laminarnym przepływem powietrza, aby rozpocząć montaż.
Najpierw ułóż dwie do trzech chusteczek beztkaninowych w obszarze roboczym. Następnie za pomocą pęsety wyjmij plastikowe zbiorniczki z pojemnika z etanolem i ułóż je na chusteczkach, aby ułatwić odsysanie kapilarne i odparowanie etanolu z ich powierzchni wewnętrznych. Delikatnie ostukaj zbiorniczki, aby wspomóc usunięcie roztworu etanolu.
W razie potrzeby należy użyć gazu pod ciśnieniem, aby całkowicie oczyścić zbiornik. Po wyschnięciu zbiorników należy włożyć pierścienie O-ring do odpowiednich gniazd w zbiornikach. Następnie za pomocą pęsety należy umieścić chip stroną aktywną do góry w uchwycie urządzenia.
Upewnij się, że chip leży płasko w uchwycie i w razie potrzeby popraw jego ułożenie za pomocą pęsety. Jeśli urządzenie nie pasuje prawidłowo do uchwytu, istnieje ryzyko jego uszkodzenia podczas kolejnych kroków. Następnie ostrożnie umieść zbiorniki na uchwycie i wyrównaj je z zatrzaskami.
Upewnij się, że uszczelki O-ring nie wypadły ze swoich gniazd. Podczas tego procesu delikatnie dociśnij zbiorniki, aż wskoczą na miejsce z charakterystycznym kliknięciem. Upewnij się, że obie strony zbiorników są stabilne, a chip znajduje się w prawidłowej pozycji.
Nie należy naciskać zbiorników z nadmierną siłą, ponieważ ciśnienie może uszkodzić chipy dla linii komórkowych pierwotnych lub przylepnych. Komórki należy wysiać jeden lub dwa dni przed eksperymentem, aby ich konfluencja nie przekroczyła 80%.
W dniu przeprowadzenia eksperymentu. Bezpośrednio przed badaniem zebrać komórki i resuspendować je w medium lub innym odpowiednim buforze, tak aby uzyskanym stężenie wynosiło od 1 do 10 milionów komórek na mililitr. Następnie ostrożnie przepuścić zawiesinę komórkową przez sitko komórkowe o rozmiarze oczek 40 µm, aby zapobiec zatykaniu urządzenia przez skupiska komórek i macierzy.
Po odfiltrowaniu wymieszano 300 µL zawiesiny komórkowej z odpowiednim stężeniem materiału dostarczającego w osobnej probówce. W tej demonstracji na każde 50 µL zawiesiny komórkowej dodano 2 µL dekstryny o stężeniu 5 mg/mL oraz 2 µL przeciwciała kontrolnego izotypowego Alexa 488.
Następnie delikatnie wymieszaj 100 µL komórek poprzez pipetowanie. Następnie, używając końcówek do nakładania żelu, nanieś komórki i materiał dostawczy do jednego z reservoirów, podłącz wężyk ciśnieniowy do wypełnionego reservoiru i mocno zaciśnij węzeł palcami, aby zapewnić szczelność. Następnie ustaw ciśnienie powietrza na regulatorze na 70 PSI, aby kontrolować prędkość przemieszczania się komórek przez urządzenie.
Ciśnienie powinno zostać zoptymalizowane dla konkretnego połączenia komórek i chipa mikroprzepływowego użytego w każdym eksperymencie. Po przygotowaniu wszystkich elementów, unieś urządzenie na wysokość oczu i ustaw je tak, aby ciecz w zbiorniku była łatwo widoczna. Następnie naciśnij zawór przyciskowy, aby zwiększyć ciśnienie w zbiorniku i rozpocząć przepływ komórek.
Obserwuj prędkość przepływu cieczy z zbiornika. Jeśli przepływ cieczy znacznie spowolni w stosunku do początkowego natężenia, zamontowane urządzenie jest prawdopodobnie zapchane i wymaga wymiany. Zwiększone naprężenie ścinające spowodowane blokadą doprowadzi do zwiększonej w stosunku do normy śmierci komórek.
Gdy poziom cieczy znajdzie się w odległości około dwóch milimetrów od dna zbiornika, szybko przekręć regulator na zero PSI, aby zatrzymać przepływ. Ważne jest, aby zatrzymać przepływ powietrza przed całkowitym opróżnieniem zbiornika, w przeciwnym razie próbka może zostać wyrzucona ze zbiornika zbierającego. Następnie zbierz przetworzone komórki ze zbiornika odpływowego i umieść je w probówce do mikrocentryfugi.
W temperaturze pokojowej komórki o określonej wydajności będą kontynuować pobieranie materiału przez maksymalnie 10 minut. Po 10 minutach wysiać komórki z dodatkową pożywką lub przystąpić do dalszego wykorzystania komórek zgodnie z potrzebami eksperymentalnymi. Powtórzyć te kroki, aby zebrać odpowiednią liczbę potraktowanych komórek, i wymieniać chipy w razie ich zapchania, utylizując zapchane urządzenia przed każdym kolejnym próbką.
Zmień kierunek przepływu, aby zminimalizować efekty zapychania. Po zakończeniu zbierania komórek delikatnie odłącz zbiorniki od głównego uchwytu, odsuwając ramiona zacisku. Następnie umieść każdą część przeznaczoną do ponownego użycia w odpowiednim pojemniku do przechowywania i wypełnij je świeżym 70%ethanol.
Na koniec wszystkie zużyte chipy należy umieścić w oddzielnym pojemniku w celu odpowiedniej utylizacji. Zmierzono wydajność dostarczania oraz żywotność komórek HeLa. W serii doświadczeń przetestowano trzy różne chipy mikrofluidyczne w zakresie prędkości do 600 millimeters per second.
Testy te wykazały, że zwiększone prędkości przepływu poprawiły dostarczanie koniugowanej z fluoresceincą dekstryny o masie trzech kilodaltonów do komórek w każdym z badanych układów. Dodatkowo zwiększone prędkości spowodowały również spadek żywotności komórek o około 20% w badanych urządzeniach. Taki poziom śmiertelności komórek jest stosunkowo niski i często jest znacznie wyższy w urządzeniach o niewłaściwej konstrukcji.
Pobieranie dekstryny sprzężonej z barwnikiem Pacific blue przez populację komórek kontrolnych pokazaną po lewej stronie jest wynikiem ograniczonego wiązania powierzchniowego oraz efektów endocytarnych. Komórki te były eksponowane na materiał dostarczający przez ten sam czas, co komórki poddane działaniu preparatu. Po prawej stronie znajduje się populacja żywych komórek, które przepływały przez urządzenie mikroprzepływowe podczas ekspozycji na tę samą stężenie dekstryny, co w przypadku komórek kontrolnych.
Komórki w zacienionym obszarze są uznawane za niedostarczone, natomiast komórki po prawej stronie linii definiuje się jako dostarczone. Po opanowaniu technika ta może zostać wykonana w czasie krótszym niż jedna godzina, jeśli jest przeprowadzana prawidłowo. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak analiza pooptometryczna, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące np. wydajności dostarczania oraz funkcjonalności materiału po jego opracowaniu.
Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie medycyny regeneracyjnej do eksploracji programowania komórek w pierwotnych komórkach dorosłych przy użyciu bezpośredniego dostarczania białek. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat konfiguracji i obsługi systemu samozaciskowego w wybranym zastosowaniu.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia metodę bezwektorowego dostarczania makrocząsteczek do komórek docelowych poprzez szybką deformację mechaniczną. Protokół opisuje zastosowanie urządzenia mikroprzepływowego w celu ułatwienia tego procesu.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Mikrofluidyka
- Techniki dostarczania wewnątrzkomórkowego
Wstęp
- Mechaniczne rozbijanie stanowi nowatorskie podejście do dostarczania materiałów do wnętrza komórek.
- Metoda ta może być stosowana w odniesieniu do trudnych typów komórek, które są oporne na transfekcję.
- Posiada ona potencjalne zastosowania w terapii nowotworowej oraz manipulacji komórkami odpornościowymi.
- Do oceny skuteczności dostarczania wykorzystuje się cytometrię przepływową.
Cel badania
- Opracowanie metody wydajnego dostarczania makrocząsteczek do wnętrza komórek.
- Poprawa zrozumienia technik przeprogramowania komórek.
- Zwiększenie skuteczności terapeutycznej komórek odpornościowych przeciwko nowotworom.
Zastosowane metody
- Wytwarzanie i sterylizacja urządzenia mikroprzepływowego.
- Przygotowanie zawiesin komórkowych i materiałów dostarczanych.
- Kondycjonowanie urządzenia mikroprzepływowego pod ciśnieniem w celu wywołania deformacji komórek.
- Analiza cytometryczna w celu oceny skuteczności dostarczania.
Główne wyniki
- Osiągnięto sukces w dostarczaniu makrocząsteczek do komórek docelowych.
- Cytometria przepływowa potwierdziła efektywne pobieranie wewnątrzkomórkowe.
- Metoda wykazała przewagę nad tradycyjnymi technikami dostarczania.
- Wskazano na potencjalne zastosowania w leczeniu nowotworów.
Wnioski
- Ta mechaniczna metoda dostarczania stanowi obiecującą alternatywę dla trudnych do transdukcji typów komórek.
- Otwiera ona nowe możliwości badawcze w zakresie manipulacji komórkowych i terapii.
- Konieczne są dalsze badania w celu optymalizacji techniki dla różnych zastosowań.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Wewnątrzkomórkowe dostarczanie bez użycia wektorów pozostaje krytycznym wąskim gardłem w rozwoju terapii, szczególnie w przypadku pierwotnych komórek odpornościowych i typów komórek trudnych do transfekcji. Ta mikrofluidyczna platforma do ściskania umożliwia bezpośrednie dostarczanie makrocząsteczek i nanomateriałów do cytozolu bez konieczności modyfikacji chemicznej lub stosowania specjalistycznych buforów, co ogranicza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów. Poprzez poprawę wydajności dostarczania w wymagających systemach, metoda ta zwiększa pewność predykcyjną we wczesnej fazie odkrywania oraz zmniejsza ryzyko w procesach translacyjnych dla zastosowań w immunoterapii i medycynie regeneracyjnej.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia funkcjonalną weryfikację hipotez terapeutycznych w pierwotnych komórkach odpornościowych oraz w modelach reprogramowania.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalny system bez użycia buforów do dostarczania czynników transkrypcyjnych, przeciwciał lub kwasów nukleinowych w celu oceny stopnia zaangażowania celu.
- Wartość prognostyczna: Wspiera podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez potwierdzenie wewnątrzkomórkowego dostarczenia cząsteczek efektorowych przed przeprowadzeniem testów funkcjonalnych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Generuje ilościowe odczyty wydajności dostarczania oparte na cytometrii przepływowej dla różnych typów komórek i stężeń materiałów.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przygotowanie próbek poprzez kontrolowane szybkości ścinania i geometrię urządzenia, minimalizując zmienność w badaniach wysokoprzepustowych.
- Gotowość do analizy: Dostarcza wskaźniki procentowe dostarczenia oraz przeżywalności, które umożliwiają ranking związków lub materiałów w procesach identyfikacji wiodących kandydatów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy modulację komórek odpornościowych w skali odkryć z przedkliniczną oceną zwiększonej skuteczności przeciwnowotworowej.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Potwierdza dostarczenie białek immunomodulujących do cytozolu, zmniejszając zależność od endogennych systemów ekspresji.
- Układy istotne dla choroby: Umożliwia testowanie w pierwotnych limfocytach T, komórkach dendrytycznych oraz komórkach macierzystych istotnych dla immunoterapii nowotworów i medycyny regeneracyjnej.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum od odkrycia do badań przedklinicznych, umożliwiając testowanie hipotez we wczesnych badaniach biologicznych, generowanie próbek gotowych do analiz w badaniach przesiewowych oraz walidację mechanistyczną przed badaniami in vivo.
- Biologia odkrywcza: Ułatwia walidację celu poprzez dostarczanie komponentów CRISPR, siRNA lub przeciwciał w celu potwierdzenia udziału ścieżek sygnałowych w aktywacji immunologicznej lub losach komórek.
- Przesiewanie: Dostarcza biblioteki nanomateriałów lub peptydów do komórek odpornościowych w celu ich pobrania i przesiewania funkcjonalnego w ustandaryzowanych warunkach ścinania.
- Analityka: Zapewnia wyznaczone metodą cytometrii przepływowej wartości procentowe wydajności dostarczania i żywotności jako ilościowe punkty końcowe do porównania warunków.
- Badania translacyjne: Umożliwia testy przedkliniczne zmodyfikowanych komórek odpornościowych z dostarczonym ładunkiem w celu oceny aktywności przeciwnowotworowej w modelach kokultury.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Projekt platformy pozwala na ponowne wykorzystanie w różnych typach komórek i ładunków przy optymalizacji jedynie ciśnienia oraz układu chipa, co wspiera skalowalne wdrożenie w badaniach odkrywczych i rozwoju procesów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Redukuje liczbę wyników fałszywie ujemnych w walidacji celu poprzez zapewnienie dostarczenia do komórek pierwotnych i niedzielących się, w których metody wirusowe lub lipidowe zawodzą.
- Wartość operacyjna: Eliminuje konieczność koniugacji ładunku, stosowania specjalistycznych buforów lub produkcji wirusów, co upraszcza proces i obniża koszt dla każdego wariantu badawczego.
- Wartość strategiczna: Zwiększa pewność w odniesieniu do wczesnych kandydatów immunomodulujących poprzez potwierdzenie dostarczenia wewnątrzkomórkowego przed przeprowadzeniem kosztownych i zasobochłonnych badań na zwierzętach.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację biologików zależnych od dostarczenia, takich jak cytokinowe cząsteczki angażujące lub terapie czynnikami transkrypcyjnymi, w oparciu o analizę ryzyka i osiągalne stężenia cytozolowe.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obsłudze urządzeń mikroprzepływowych, przygotowywaniu zawiesin komórkowych oraz regulacji ciśnienia w celu uniknięcia zatorów lub nadmiernej śmierci komórek wywołanej siłami ścinania.
- Zależne od dostępu do chipów mikroprzepływowych, regulatorów ciśnienia, systemów zbiorników oraz cytometrii przepływowej do odczytu wyników; kompatybilne ze standardowymi procedurami w komorach z laminarnym przepływem powietrza.
- Wymaga standaryzacji stężenia komórek (1–10 milionów/mL), wstępnego filtrowania przez filtry 40 µm oraz czasu inkubacji (≤10 min po dostarczeniu) w celu zapewnienia powtarzalności między różnymi użytkownikami i ośrodkami.
- Wymaga optymalizacji ciśnienia (np. 70 PSI) i prędkości przepływu dla każdego typu komórek i konstrukcji chipa, aby zrównoważyć wydajność dostarczania i żywotność, przy czym utrata żywotności w warunkach zoptymalizowanych wynosi zazwyczaj <20%.
- Ograniczone przez ryzyko zatorów spowodowanych agregatami lub zanieczyszczeniami, co wymusza filtrowanie komórek i regularną wymianę chipów; wydajność różni się w zależności od wielkości komórek, sztywności błony oraz masy cząsteczkowej dostarczanego ładunku.
