Name: Procedura wszczepiania zorganizowanych układów mikroprzewodów do nagrań pojedynczych jednostek u obudzonych, zachowujących się zwierząt (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-14T14:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Poznaj technikę implantacji mikroprzewodów do rejestracji pojedynczych neuronów u przebudzonych, zachowujących się zwierząt. Metoda umożliwia precyzyjne badanie aktywności neuronalnej z wysoką selektywnością przestrzenną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez National Institute on Drug Abuse przyznaje DA 006886 (MOW) i DA 032270 (DJB).

Należy zachować najwyższą ostrożność w celu utrzymania warunków aseptycznych (opisanych w Przewodniku do opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych9) podczas przygotowywania i przeprowadzania następującej procedury. Poniższy protokół jest zgodny z Przewodnikiem opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych i został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Rutgers. Szacuje się, że wykonanie kolejnych zabiegów zajmie od 3 do 6 godzin.
Implantowanie układu mikroprzewodów:
<ol>
	<li>Umieścić zwierzęta pod narkozą przy użyciu 50 mg/kg pentobarbitalu sodu (i.p) i podać 10 mg/kg azotanu metylu atropiny (IP; Można zastąpić glikopirolan i 0,25 mg penicyliny (300 000 U/ml i.m.) w celu utrzymania funkcji układu oddechowego i zapobiegania infekcjom><.
	Uwaga: Przy długości 3-6 godzin tej operacji implantacji stosuje się pentobarbital sodu, ponieważ jest on opłacalny i ogranicza narażenie ludzi na środki znieczulające (co może wystąpić przy długotrwałym stosowaniu środków znieczulających gazowych), zapewniając jednocześnie długotrwałe znieczulenie. Dopuszczalna jest substytucja innych środków znieczulających.</li>
	<li>Przed kontynuowaniem sprawdź, czy znieczulenie zadziałało, korzystając z testu szczypania ogona.</li>
	<li>W razie potrzeby należy podawać naprzemienne wstrzyknięcia chlorowodorku ketaminy (60 mg/kg IP) i pentobarbitalu sodu (5-10 mg/kg IP) w celu utrzymania znieczulenia przez cały czas trwania operacji.</li>
	<li>Ogol skórę głowy za pomocą ostrza skalpela #22.</li>
	<li>Zdezynfekuj ogoloną skórę głowy jodem powidonu.</li>
	<li>Podać podskórnie wstrzyknięcia bupiwakainy (~1 mg/kg podskórnie rozłożone na 4 miejsca wstrzyknięcia) w celu miejscowego znieczulenia skóry głowy. Odczekaj 5-10 minut, aby znieczulenie miejscowe zaczęło działać.</li>
	<li>Umieść lubrykant okulistyczny na oczach, aby utrzymać wilgoć podczas znieczulenia.</li>
	<li>Przymocuj zwierzę do nauszników i nosa clamp aparatu stereotaktycznego.</li>
	<li>Użyj wizualnych punktów orientacyjnych (np. poziomego paska na ramie stereotaktycznej), aby w przybliżeniu wypoziomować głowę zwierzęcia. Ten krok ma na celu tylko przybliżone wyrównanie czaszki.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie wzdłuż linii środkowej skóry głowy za pomocą ostrza skalpela #11 zamontowanego na uchwycie skalpela. Nacięcie musi rozciągać się tuż za uszami do tylnej części kości nosowej.</li>
	<li>Za pomocą szpatułki preparacyjnej oczyść czaszkę z całej pozostałej tkanki, aż zostaną osiągnięte zarówno boczne grzbiety czaszki, jak i tylny grzbiet czaszki.</li>
	<li>Odciągnij skórę wokół nacięcia za pomocą kilku hemostatów (6x).</li>
	<li>Oczyść czaszkę z krwi i pozwól jej wyschnąć. Jeśli wystąpi jakiekolwiek pozostałe krwawienie, zakończ resztkowe krwawienie małym narzędziem kauteryzującym. Upewnienie się, że czaszka pozostaje czysta i sucha, pozwala akrylowi dentystycznemu używanemu w kolejnych krokach na trwałe związać się z czaszką.</li>
	<li>Oznacz bregmę i lambdę (ryc. 2D) poprzez interpolację przecięcia szwów czaszki. Mikroskop preparacyjny jest niezbędny do dokładnego oznaczenia tych pozycji.</li>
	<li>Przymocuj mały spiczasty przedmiot (np. szpilkę lub wiertło dentystyczne) do ramienia stereotaktycznego i opuść go, aby określić współrzędną grzbietową/brzuszną (DV) bregmy i lambdy.</li>
	<li>Wyreguluj końcówkę clamp do momentu, gdy współrzędne DV dla bregmy i lambdy będą w odległości 100 μm (0.1 mm) od siebie.</li>
	<li>Po wyrównaniu zapisz współrzędne przednie/tylne (AP), przyśrodkowe/boczne (ML) i DV bregmy wraz z położeniem zacisku nosowego. Dokładnie sprawdź współrzędne pod kątem dokładności, ponieważ pozostała część operacji zależy od precyzji tych współrzędnych.</li>
	<li>Użyj zmierzonych współrzędnych, aby obliczyć współrzędne ML i AP dla czterech rogów "okna czaszki" względem bregmy (tj. kraniotomii; Rysunek 1). Okienko czaszki to precyzyjnie ustawiony prostokąt, przez który przejdzie układ mikroprzewodów.</li>
	<li>Użyj obliczonych współrzędnych, aby oznaczyć współrzędne okna czaszki na czaszce za pomocą spiczastej nasadki stereotaktycznej i atramentu pióra wiecznego. Aby uzyskać precyzyjne znaki, nałóż tylko niewielką ilość tuszu na końcówkę narzędzia do znakowania za pomocą bawełnianego aplikatora.</li>
	<li>Wywierć okno czaszki, usuwając kość w szeregu małych warstw.
	<ol>
		<li>Zacznij od wywiercenia zaznaczonych rogów okna, w których zostały umieszczone oznaczenia.</li>
		<li>Następnie połącz rogi i obrysuj okno.</li>
		<li>Na koniec oczyść obszar w konturze aż do głębokości opony twardej. Otwór musi być szerszy (tj. ścięty) poniżej powierzchownych warstw czaszki, aby zapewnić, że okno zachowuje odpowiednią szerokość od góry do dołu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj mikrokleszczy, aby ostrożnie usunąć wszelkie pozostałe wióry kostne, zanieczyszczenia lub oponę twardą wewnątrz okienka czaszki. Ten krok jest niezwykle ważny, ponieważ te kawałki materiału mogą zagrozić integralności matrycy podczas opuszczania. Po oczyszczeniu należy utrzymywać okno wilgotne z bakteriostatycznym roztworem soli fizjologicznej przez pozostałą część zabiegu.</li>
	<li>Umieść na czaszce oznaczenia dla 5 czaszki i 1 przewodu uziemiającego (Rysunek 1). Pozycje te będą się różnić w zależności od docelowego obszaru mózgu. Scena czołowa będzie najbezpieczniejsza, jeśli jedna śruba zostanie umieszczona na każdej z 5 kości czaszki. Umieść zarówno czaszki, jak i przewód uziemiający w miejscach, które nie będą przeszkadzać w umieszczeniu układu mikroprzewodów.</li>
	<li>Wywierć otwory na czaszki i zabezpiecz na miejscu. należy opuścić do momentu, gdy pokażą się tylko 3-4 gwinty (lub, jeśli używasz innych niż zalecane, wystarczająco głęboko, aby przejść przez grubość czaszki, aby zapewnić stabilność układu, ale nie za głęboko, aby uszkodzić korę). Oczyść gwinty po umieszczeniu.</li>
	<li>Wywierć otwór na przewód uziemiający. Powoli opuść drut (przez 1-2 minuty) do docelowej współrzędnej DV i przymocuj drut na miejscu za pomocą akrylu dentystycznego.</li>
	<li>Dodaj akryl wokół gwintów czaszki. Zanim akryl wyschnie, usuń nadmiar cementu, który spływa z przewodu uziemiającego lub czaszkowych. Odczekaj 15 minut, aż akryl dentystyczny wyschnie/stwardnieje.</li>
	<li>Przymocuj matrycę do ramienia stereotaktycznego. Wypoziomuj tablicę i ustaw ją tak, aby przeszła prostopadle przez granice okna czaszki.</li>
	<li>Umieść sól fizjologiczną w okienku czaszki tak, aby znajdowała się na poziomie czaszki. Obniż tablicę, aż utworzy wgłębienie w soli fizjologicznej. Ta współrzędna jest używana jako poziom czaszki dla tablicy. Ta wartość służy do obliczania końcowej współrzędnej DV tablicy.</li>
	<li>Powoli opuszczaj macierz, aż osiągnie ostateczną współrzędną DV. Zatrzymaj co 1 mm obniżania i odczekaj kilka minut, aby tkanka mózgowa mogła się zregenerować po wgłębieniach i rozpuścić dolną część glikolu polietylenowego (PEG) na matrycy (PEG służy do tymczasowego utrzymywania drutów w ich konformacie podczas opuszczania i powoli rozpuszcza się w soli fizjologicznej).</li>
	<li>Gdy tablica znajduje się w odległości 1 mm od celu, opuść ją wolniej, aż do osiągnięcia ostatecznego celu. Obniżanie o 0,1-0,2 mm na raz przed pozostawieniem tkance na odpoczynek przez okres 5 minut ma na celu zachowanie tkanki w miejscu docelowym, a także bliższych połączeń synaptycznych. Jeśli sprzęt jest dostępny, precyzyjne opuszczanie matrycy może być wspomagane za pomocą zmotoryzowanego manipulatora.</li>
	<li>Rozpuść pozostały PEG i użyj akrylu dentystycznego, aby zacementować mikrodruty na miejscu. Dodaj wiele warstw cementu, aby upewnić się, że druty są bezpieczne, a następnie odczekaj 15-20 minut, aż cement stwardnieje, zanim przejdziesz dalej. Gwarantuje to, że druty nie zostaną wypchnięte z ich ostatecznego ułożenia.</li>
	<li>Zbuduj pozostałą część głowy zwierzęcia za pomocą akrylu dentystycznego. Użyj akrylu, aby obudować czaszki, przewód uziemiający i złącze do mikroprzewodów. Poczekaj, aż akrylowa czapka wystarczająco stwardnieje, zanim przejdziesz dalej.</li>
	<li>Zszyj nacięcie skóry głowy za pomocą wchłanialnych szwów i podaj 2 ml bakteriostatycznej soli fizjologicznej (s.c.), aby przywrócić nawodnienie po operacji.</li>
	<li>Wyjmij zwierzę z nauszników i umieść obiekt w czystym miejscu. Należy często obserwować zwierzę podczas rekonwalescencji pooperacyjnej, aż do czasu odzyskania termoregulacji i lokomocji. Po wyzdrowieniu ze znieczulenia należy przenieść zwierzę do pojedynczego pomieszczenia na pozostałą część rekonwalescencji pooperacyjnej.</li>
	<li>Zapewnij zwierzętom codzienne monitorowanie i opiekę pooperacyjną w dniach następujących po zabiegu. Rekonwalescencja po tej procedurze jest optymalna, gdy dozwolone jest siedem lub więcej dni.</li>
	<li>Podawać zwierzętom zastrzyki z karprofenu (5 mg/kg) i enrofloksacyny (5-10 mg/kg) lub ich odpowiedników podczas rekonwalescencji zgodnie z harmonogramem zalecanym przez lekarza weterynarii.</li>
</ol>

<ol><li>Carter, M., Shieh, J. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCarter%2C+M+%22Electrophysiology+In%3A+Guide+to+research+techniques+in+neuroscience%22">Electrophysiology In: Guide to research techniques in neuroscience</a>. , Academic Press. (2009).</li>
<li>Aston-Jones, G., Siggins, G. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAston-Jones%2C+G+%22Electrophysiology.+In%3A+Psychopharmacology%3A+The+Fourth+Generation+of+Progress%22">Electrophysiology. In: Psychopharmacology: The Fourth Generation of Progress</a>. Kupfer, D., Bloom, F. E. , Raven Press. (1995).</li>
<li>Root, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+roles+of+ventral+pallidum+subregions+during+cocaine+self-administration+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Differential roles of ventral pallidum subregions during cocaine self-administration behaviors.</a> J. Comp. Neurol. 521 (3), 558-588 (2013).</li>
<li>Cardin, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+local+circuits+in+vivo%3A+integrated+optogenetic+and+electrophysiology+approaches+for+exploring+inhibitory+regulation+of+cortical+activity%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Dissecting local circuits in vivo: integrated optogenetic and electrophysiology approaches for exploring inhibitory regulation of cortical activity.</a> (3-4), 106-103 (2012).</li>
<li>Ma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphetamine%27s+dose-dependent+effects+on+dorsolateral+striatum+sensorimotor+neuron+firing%5BTitle%5D)+AND+%22Behav.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Amphetamine's dose-dependent effects on dorsolateral striatum sensorimotor neuron firing.</a> Behav. Brain Res. , (2013).</li>
<li>Ghitza, U. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+cue-evoked+activity+of+accumbens+neurons+after+prolonged+abstinence+from+self-administered+cocaine%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Persistent cue-evoked activity of accumbens neurons after prolonged abstinence from self-administered cocaine.</a> J. Neurosci. 23 (19), 7239-7245 (2003).</li>
<li>Tang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+activity+of+the+striatum+during+formation+of+a+motor+habit%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Changes in activity of the striatum during formation of a motor habit.</a> Eur. J. Neurosci. 25 (4), 1212-1227 (2007).</li>
<li>Tang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose+and+rate-dependent+effects+of+cocaine+on+striatal+firing+related+to+licking%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Dose and rate-dependent effects of cocaine on striatal firing related to licking.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 324 (2), 701-713 (2008).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((National+Research+Council%5BTitle%5D)+AND+%22Guide+for+the+Care+and+Use+of+Laboratory+Animals%3A+Eighth+Edition%22%5BJournal%5D)">National Research Council.</a> Guide for the Care and Use of Laboratory Animals: Eighth Edition. , The National Academies Press. Washington, DC. (2011).</li>
<li>Fabbricatore, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+evidence+of+mediolateral+functional+dichotomy+in+the+rat+accumbens+during+cocaine+self-administration%3A+tonic+firing+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological evidence of mediolateral functional dichotomy in the rat accumbens during cocaine self-administration: tonic firing patterns.</a> Eur. J. Neurosci. 30 (12), 2387-2400 (2009).</li>
<li>Root, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+phasic+and+tonic+activity+of+ventral+pallidal+neurons+during+cocaine+self-administration%5BTitle%5D)+AND+%22Synapse%22%5BJournal%5D)">Slow phasic and tonic activity of ventral pallidal neurons during cocaine self-administration.</a> Synapse. 66 (2), 106-127 (2012).</li>
<li>Root, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid-phasic+activity+of+ventral+pallidal+neurons+during+cocaine+self-administration%5BTitle%5D)+AND+%22Synapse%22%5BJournal%5D)">Rapid-phasic activity of ventral pallidal neurons during cocaine self-administration.</a> Synapse. 64 (9), 704-713 (2010).</li>
<li>Tang, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+firing+of+striatal+neurons+related+to+licking+during+acquisition+and+overtraining+of+a+licking+task%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Decreased firing of striatal neurons related to licking during acquisition and overtraining of a licking task.</a> J. Neurosci. 29 (44), 12952-12961 Forthcoming.</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Rat+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , Academic Press/Elsevier. (1997).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konkurencyjnych interesów finansowych do ujawnienia.

Nagrania zewnątrzkomórkowe stanowią potężną technikę eksperymentalną, którą można włączyć do prawie każdego preparatu eksperymentalnego w neurobiologii. Przewody, które zostały wszczepione w zorganizowane układy, mogą być śledzone, gdy ich trzony przechodzą przez mózg i do regionu docelowego (ryc. 5A). Kiedy na nieizolowanej końcówce mikrodrutu powstaje mała, poeksperymentalna zmiana, która tworzy niewielki osad żelaza z drutu ze stali nierdzewnej, można precyzyjnie zaznaczyć położenie nieizolowanej końc...

Zapisy elektrofizjologiczne pozwalają naukowcom badać właściwości elektryczne komórek biologicznych. W ośrodkowym układzie nerwowym, gdzie impulsy elektryczne służą jako mechanizm sygnalizacyjny, nagrania te mają szczególne znaczenie dla zrozumienia funkcji neuronalnych1-2. Podczas zapisów pojedynczych jednostek u zachowujących się zwierząt, mikroelektroda, która została wprowadzona do mózgu, jest w stanie rejestrować zmiany w generowaniu potencjałów czynnościowych neuronu w czasie.
Podczas gdy wiele technik pozwala rejestrować aktywność mózgu, elektrofizjologia jednojednostkowa jest jedną z najbardziej precyzyjnych metod, pozwalając na rozdzielczość na poziomie pojedynczego neuronu. Gdy pożądany jest wysoki stopień specyficzności przestrzennej, mikrodruty mogą być używane do celowania w dyskretne podjądra lub zespoły komórek w mózgu3. Nagrania jednoczęściowe korzystają również z wysokiej rozdzielczości czasowej, ponieważ nagrania są dokładne na poziomie mikrosekund. A zapisy czuwania in vivo pozwalają na nienaruszone interakcje obwodów, z naturalnym środowiskiem projekcji aferentnych i odprowadzających, ogólnoustrojowych wpływów chemicznych i hormonalnych oraz parametrów fizjologicznych. Sygnały neuronalne pochodzą z bodźców sensorycznych, zachowań motorycznych, przetwarzania poznawczego, neurochemii/farmakologii lub jakiejś kombinacji. W związku z tym segregacja wpływów sensorycznych, motorycznych, poznawczych i chemicznych wymaga dobrze przemyślanych eksperymentów ze skutecznymi nieprzewidzianych okolicznościami i kontrolami, które mogą pozwolić na ocenę każdego z wyżej wymienionych wpływów. Podsumowując, nagrania zachowujących się zwierząt pozwalają eksperymentatorom obserwować integrację wielu źródeł informacji w funkcjonującym obwodzie i uzyskać bardziej wszechstronny model funkcji obwodu.
Nagrania pojedynczej jednostki również mają szereg wad, o których każdy eksperymentator powinien wiedzieć. Przede wszystkim nagrania mogą być trudne do przeprowadzenia. Rzeczywiście, właściwości wzmacniaczy sceny czołowej i wszczepionych mikroprzewodów, które pozwalają na przestrzenną i czasową specyfikę tych nagrań, sprawiają również, że nagrania są podatne na wpływ obcych sygnałów elektrycznych (tj. "szumu" elektrycznego). W związku z tym zdolność do rozwiązywania problemów w systemie elektrofizjologicznym wymaga dobrze rozwiniętego technicznego zrozumienia zasad i aparatury elektrofizjologicznej. Ważne jest również, aby zauważyć, że w pewnych okolicznościach zarejestrowane sygnały elektryczne w nagraniach zewnątrzkomórkowych mogą reprezentować sumę wielu sygnałów neuronowych. Co więcej, możliwość uogólnienia aktywności pojedynczej jednostki na aktywność populacji w regionie docelowym może być często ograniczona przez stopień heterogeniczności komórkowej w regionie docelowym (ale patrz Cardin4). Na przykład elektrody mogą być nastawione na rejestrowanie neuronów wyjściowych o wysokiej amplitudzie zamiast innych komórek. Interpretowalność nagrań jednojednostkowych zwiększa się poprzez łączenie nagrań z innymi technikami, w tym między innymi ze stymulacją elektryczną (ortodromiczną lub antydromiczną), chemiczną (np. receptor jonoforetyczny lub designerski)lub optogenetyczną 4, tymczasowe dezaktywacje neuronalne, badania sensomotoryczne5, procedury rozłączania lub immunohistochemię3.
W następnym protokole wyliczymy materiały i kroki niezbędne do wszczepienia szczurowi zorganizowanego zestawu mikroprzewodów (chociaż protokół może być dostosowany do użycia u innych gatunków). Procedura i styl stałych matryc stosowanych w naszym laboratorium okazały się niezawodne w przypadku zapisów podłużnych i mogą utrzymać nagrania tego samego neuronu przez ponad miesiąc przez 6-8 lat. To sprawia, że procedura ta jest idealna do badania reakcji fazowych na bodźce eksperymentalne, zmian plastycznych w odpowiedziach neuronalnych lub mechanizmów uczenia się i motywacji.

<table><tbody><tr><td><silny>Tabela 1. Lista materiałów chirurgicznych.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gauze</td><td>Fisher (MooreBrand)</td><td>19-898-144</td><td></td></tr><tr><td>Waciki bawełniane</td><td>Fisher (purytanin)</td><td>S304659</td><td></td></tr><tr><td>Nembutal (pentobarbital)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3761</td><td></td></tr><tr><td>Azotan metylu atropiny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A0382</td><td></td></tr><tr><td>Baytril (enrofloksacyna)</td><td>Butler Shein ( Bayer)</td><td>1040007</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek ketaminy</td><td>Butler Shein</td><td>SKU# 023061</td><td></td></tr><tr><td>Betadine (powidon-jod)</td><td>Fisher (Perdue)</td><td>19-066452</td><td></td></tr><tr><td>Stereotax</td><td>Kopf</td><td>Model 900</td><td></td></tr><tr><td>Narzędzie do kauteryzacji</td><td>Stoelting</td><td>59017</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Nikon</td><td>SMZ445</td><td></td></tr><tr><td>Wiertło dentystyczne</td><td>Buffalo</td><td>37800</td><td></td></tr><tr><td>Bakteriostatyczna sól fizjologiczna</td><td>Bulter Schein</td><td>8973</td><td></td></tr><tr><td>Jewlers</td><td>Stoelting</td><td>51457</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosondy</td><td>Microwire Array</td><td>Niestandardowe (elastyczne)</td><td></td></tr> <tr><td>Przewód uziemiający</td><td>Omnetics</td><td>Niestandardowa wtyczka</td><td></td></tr><tr><td>Dental Acrylic</td><td>Fisher (BAS)</td><td>50-854-402</td><td></td></tr><tr><td>Szwy wchłanialne</td><td>Fisher (Ethicon)</td><td>NC0258473</td><td></td></tr><tr><td>Puralube (maść okulistyczna/lubrykant)</td><td>Fisher (Henry Schein)</td><td>008897</td><td></td></tr><tr><td>Tabela 2. Lista narzędzi chirurgicznych.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2x Mikrokleszcze</td><td>George Tiemann Co.</td><td>#160-57</td><td>Wielozadaniowe (np. usuwanie gruzu w oknie czaszki)</td></tr><tr><td>2x Kleszcze</td><td>George Tiemann Co.</td><td>#160-93</td><td>Wielorazowe (np. szwy do wiązania)</td></tr><tr><td>6x Hemostats</td><td>George Tiemann Co.</td><td>#105-1125</td><td>Zacisk i otwarte nacięcie</td></tr><tr><td>1x Małe nożyczki</td><td>George Tiemann Co.</td><td>#105-411</td><td>Przetnij szwy po zawiązaniu</td></tr><tr><td>1x Kleszczyki do tkanek</td><td>George Tiemann Co.</td><td>#105-222</td><td>Trzymanie tkanki podczas szycia</td></tr><tr><td>1x Uchwyt na igłę</td><td>George Tiemann Co.</td><td>#105-1259</td><td>Trzymanie igły do szwów</td></tr><tr><td>1x Uchwyt na skalpel (z ostrzem #11)</td><td>George Tiemann Co.</td><td>#105-80 (z ostrzem #105-71)</td><td>Wykonywanie nacięcia czaszki</td></tr><tr><td>1x #22 Ostrze skalpela</td><td>George Tiemann Co.</td><td>#160-381</td><td>Golenie skóry głowy</td></tr><tr><td>1x Szpatułka chirurgiczna</td><td>George Tiemann Co.</td><td>#160-718</td><td>Skrobanie czaszki w celu oczyszczenia tkanki z czaszki</td></tr><tr><td>maszynowe/jubilerskie</td><td>różne</td><td>Nie</td> dotyczy <td>0/A 0/80 x 1/8"</td></tr><tr><td><silny>Tabela 3. Lista urządzeń do rejestracji sygnałów elektrofizjologicznych.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microwire Array & Złącze</td><td>Micro Probe, Inc. (Gaithersburg, MD)</td><td>Nie dotyczy (nr części na podstawie charakterystyki matrycy)</td><td>Czaszkowo wszczepione w docelowy obszar nagrywania. Tablice są dostosowywane w oparciu o pożądane odstępy między drutami, długość, etc.</td></tr><tr><td>Unity-Gain Harness/Headstage</td><td>M.B. Projekty pod klucz (Hillsborough, NJ)</td><td>Proj 1200</td><td>Wstępne wzmocnienie sygnału neuronowego; pozwala na propagację małych sygnałów neuronowych.</td></tr><tr><td>Komutator (i opcjonalny krętlik płynu)</td><td>Plastics One, Inc. (Roanoke, VA)</td><td>SL18C</td><td>Umożliwia zwierzętom swobodne obracanie się podczas propagacji sygnału elektrycznego do przedwzmacniacza</td></tr><tr><td></td><td>Przedwzmacniacz M.B. Turnkey Designs (Hillsborough, NJ)</td><td>Proj 1198</td><td>Różnicowo wzmacnia sygnały neuronowe względem elektrody referencyjnej.</td></tr><tr><td>Filtr i wzmacniacz</td><td>M.B. Turnkey Designs (Hillsborough, NJ)</td><td>Proj 1199</td><td>Filtry pasmowo-przepustowe i dodatkowo wzmacnia różnicowo wzmocniony sygnał.</td></tr><tr><td>Acquisition Computer</td><td>EnGen (Phoenix, AZ)</td><td>N/A (Custom Build)</td><td>Uruchamia oprogramowanie i sprzęt do pozyskiwania danych behawioralnych i neuronowych.</td></tr><tr><td>Karta A/D&nbsp;</td><td>Translacja danych (Marlboro, MA)</td><td>DT-3010</td><td>Digitalizuje sygnały neuronowe do próbkowania komputerowego.</td></tr><tr><td>Cyfrowa karta I/O</td><td>Measurement Computing (Norton, MA)</td><td>PCI CTR-05</td><td>Rejestruje behawioralne wejścia i wyjścia</td></tr></tbody></table>

procedura wszczepiania zorganizowanych układów mikroprzewodów do nagrań pojedynczych jednostek u obudzonych, zachowujących się zwierząt

A Procedure for Implanting Organized Arrays of Microwires for Single-unit Recordings in Awake, Behaving Animals

Zapisy elektrofizjologiczne in vivo u przebudzonego, zachowującego się zwierzęcia stanowią potężną metodę zrozumienia sygnalizacji neuronalnej na poziomie pojedynczej komórki. Technika ta pozwala eksperymentatorom na zbadanie czasowo i regionalnie specyficznych wzorców odpalania w celu skorelowania zarejestrowanych potencjałów czynnościowych z trwającym zachowaniem. Co więcej, nagrania pojedynczej jednostki można łączyć z mnóstwem innych technik w celu uzyskania kompleksowych wyjaśnień funkcji neuronalnych. W tym artykule opisujemy znieczulenie i przygotowanie do wszczepienia mikrodrutu. Następnie wymieniamy niezbędny sprzęt i kroki chirurgiczne, aby dokładnie wprowadzić matrycę mikrodrutową do docelowej struktury. Na koniec pokrótce opisujemy sprzęt używany do nagrywania z każdej pojedynczej elektrody w układzie. Opisane stałe matryce mikroprzewodów dobrze nadają się do przewlekłej implantacji i pozwalają na podłużne zapisy danych neuronowych w prawie każdym preparacie behawioralnym. Omawiamy śledzenie ścieżek elektrod w celu triangulacji pozycji mikroprzewodów, a także sposoby łączenia implantacji mikroprzewodów z technikami immunohistochemicznymi w celu zwiększenia swoistości anatomicznej rejestrowanych wyników.

Listę sprzętu wykorzystywanego w tym laboratorium do rejestracji sygnałów elektrofizjologicznych przedstawiono w Tabeli 3. Po rekonwalescencji po zabiegu chirurgicznym, rejestracja pojedynczych jednostek jest prowadzona poprzez podłączenie przedwzmacniacza głowicowego o wzmocnieniu jednostkowym do wszczepionego złącza. Głowica ta jest połączona kablem z komutatorem, który dzięki zastosowaniu pierścieni ślizgowych umożliwia swobodny obrót bez przerw w rejestracji elektrofizjologicznej. Komutator pozwala b...

Wszczepianie zorganizowanych układów mikroprzewodów do użycia w jednojednostkowych zapisach elektrofizjologicznych stanowi szereg wyzwań technicznych. Opisano również metody wykonywania tej techniki i niezbędny sprzęt. Omówiono również korzystne wykorzystanie zorganizowanych układów mikroprzewodów do nagrywania z różnych podregionów neuronowych o wysokiej selektywności przestrzennej.

Procedura wszczepiania zorganizowanych układów mikroprzewodów do nagrań pojedynczych jednostek u obudzonych, zachowujących się zwierząt

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest dokładna implantacja macierzy mikrowłókien do docelowych obszarów mózgu. Osiąga się to najpierw poprzez precyzyjny pomiar i zaznaczenie współrzędnych na czaszce w celu wykonania kraniotomii. Drugim krokiem procedury jest powolne usuwanie warstw czaszki za pomocą wiertarki stomatologicznej, aby precyzyjnie przeprowadzić kraniotomię.Trzecim krokiem jest ustawienie macierzy mikrowire tak, aby przeszła ona prostopadle przez obręb czaszki i znajdowała się na jej poziomie. Ostatnim krokiem jest powolne opuszczanie macierzy, aż dotrze ona do celu. W rezultacie można uzyskać implantowane macierze mikrowire.Zastosowanie tej procedury pozwala na ukierunkowanie działań na dyskretne podregiony mózgu i uzyskanie wysokiej wydajności neuronalnej, którą można utrzymać podczas rejestracji podłużnych. Matryce mikrodrutowe umożliwiają neurobiologom badanie wzorców wyładowań pojedynczych neuronów z wysoką specyficznością przestrzenną i czasową, niezależnie od tego, czy są stosowane samodzielnie, czy w połączeniu z innymi technikami. Rejestracje pojedynczych jednostek z matryc mikrodrutowych dostarczają wglądu w procesy przetwarzania informacji w mózgu.Rejestrowanie sygnałów neuronalnych podczas zachowania jest kluczowe dla zrozumienia funkcji mózgu. W moim laboratorium wykorzystywano elektrofizjologię pojedynczych jednostek do badania procesów prawidłowych, takich jak mapowanie somatotopowe i uczenie motoryczne, a także procesów chorobowych, takich jak choroba Parkinsona i uzależnienie od narkotyków. Elektrofizjologia in vivo to wysoce wyspecjalizowana umiejętność, której opanowanie zajmuje lata.Wizualna demonstracja tej techniki skraca czas potrzebny do prawidłowego przeprowadzenia operacji. Po znieczuleniu zwierzęcia pentobarbitalem, podaj atropinę, azotyn metylu oraz penicylinę w celu utrzymania funkcji oddechowych i zapobiegania infekcji. Przed przejściem do dalszych niezbędnych czynności zweryfikuj stan znieczulenia za pomocą testu ucisku ogona.Podawaj naprzemiennie iniekcje ketaminy, chlorowodorku oraz pentobarbany sodu, aby utrzymać znieczulenie przez cały czas trwania operacji. Następnie ogol skórę głowy, używając ostrza skalpela nr 22, a następnie odkaź obszar powidonem jodkowym. Wykonaj cztery iniekcje bupiwakainy podskórnie w celu miejscowego znieczulenia skóry głowy.Odczekać od 5 do 10 minut, aż znieczulenie miejscowe zacznie działać. Następnie należy zastosować lubrykant oftalmiczny do oczu i unieruchomić zwierzę w prętach usznych oraz zacisku nosowym aparatu stereotaktycznego, kontrolując pozycję za pomocą oczu. Ustawić głowę zwierzęcia w pozycji zbliżonej do poziomej.Następnie za pomocą skalpela wykonaj nacięcie wzdłuż linii środkowej skóry głowy. Nacięcie musi rozciągać się od tylnej części kości nosowej do miejsca tuż za uszami. Używając szpatułki do dyssekcji, oczyść czaszkę z pozostałych tkanek, aż do osiągnięcia obu bocznych grzebieni czaszki oraz tylnego grzebienia czaszki.Odciągnąć skórę wokół nacięcia, używając około sześciu kleszczyków hemostatycznych. Następnie oczyścić czaszkę z krwi i pozostawić do wyschnięcia, aby akryl dentystyczny mógł się do niej później przywrzyć. W dalszej kolejności, używając mikroskopu sekcyjnego, zaznaczyć BMA oraz lambda poprzez interpolację przecięcia szwów czaszkowych.Do ramienia stereotaktycznego przymocuj niewielki przedmiot o ostrym zakończeniu, np. wiertło stomatologiczne, i opuść go, aby wyznaczyć współrzędne grzbietowo-brzuszne (DV) punktów bregma i lambda. Następnie dostosuj zacisk nosowy tak, aby współrzędne DV dla bregma i lambda różniły się od siebie o nie więcej niż 100 µm. Po wyrównaniu zapisz współrzędne bregma wraz z położeniem zacisku nosowego.Ponownie sprawdź te współrzędne, gdyż zależą od nich operacja. Teraz wykorzystaj zmierzone współrzędne do obliczenia współrzędnych przyśrodkowo-bocznych oraz przednio-tylnych dla czterech narożników kraniotomii względem bregmy. Na podstawie obliczeń zaznacz narożniki na czaszce za pomocą ostrego przyrządu stereotaksycznego pokrytego czarnym tuszem.Następnie należy wywiercić okno w czaszce, usuwając kość w serii cienkich warstw. Rozpocznij od wywiercenia zaznaczonych narożników okna w miejscach, gdzie naniesiono oznaczenia. Następnie połącz narożniki, obrysowując kształt okna.Na koniec oczyść obszar wewnątrz obrysu do poziomu opony twardej. Otwór musi być ścięty, rozszerzając się poniżej powierzchownych warstw czaszki. Używając mikrochwytaków, ostrożnie usuń wszelkie pozostałe odłamki kostne, zanieczyszczenia lub fragmenty opony twardej wewnątrz okna czaszkowego.Jest to niezwykle istotne, ponieważ zanieczyszczenia mogą naruszyć integralność matrycy podczas implantacji. Po oczyszczeniu okno musi pozostać wilgotne dzięki zastosowaniu soli fizjologicznej z dodatkiem bakteriostatyka. W dalszej części operacji rozpocznij implantację od zaznaczenia miejsc rozmieszczenia pięciu śrub czaszkowych oraz przewodu uziemiającego.W idealnym przypadku każda śruba powinna znajdować się w innej kości czaszki. Jednakże ich rozmieszczenie nie może kolidować z umieszczeniem matrycy. Następnie należy wywiercić otwory na śruby czaszkowe i zamocować śruby na miejscu.Wkręcaj śruby, aż trzy lub cztery gwinty będą wystawać na głębokość wystarczającą do przejścia przez grubość czaszki. Po umieszczeniu śrub oczyść ich gwinty. Następnie wywierć otwór dla drutu uziemiającego i powoli, w czasie od jednej do dwóch minut, wprowadź drut do docelowej współrzędnej DV. Przymocuj drut na miejscu za pomocą akrylu stomatologicznego.Następnie, zanim akryl wyschnie, nałóż go wokół gwintów śrub czaszkowych. Usuń nadmiar akrylu z przewodu uziemiającego lub śrub czaszkowych. Pozostaw akryl dentystyczny do wyschnięcia na 15 minut.W międzyczasie przymocuj matrycę do ramienia stereotaktycznego. Wypoziomuj matrycę i ustaw ją tak, aby przeszła prostopadle przez otwór w czaszce. Gdy akryl wyschnie, całkowicie wypełnij otwór w czaszce solą fizjologiczną.Następnie należy opuścić matrycę, aż utworzy ona wgłębienie w soli fizjologicznej. Współrzędna ta służy jako poziom czaszki dla matrycy. Wartość tę należy wykorzystać do obliczenia końcowej współrzędnej DV matrycy.Powoli opuść matrycę do końcowej wartości dv. Zkoordynuj zatrzymanie i odczekaj kilka minut. Z każdym przebytym milimetrem sterylna sól fizjologiczna będzie rozpuszczać glikol polietylenowy na matrycy, który tymczasowo utrzymuje druty w ich konfiguracji.Gdy macierz znajdzie się w odległości jednego milimetra od celu, należy ją opuszczać wolniej, w odstępach co 0,1 mm, aż do osiągnięcia docelowego położenia. Po ustawieniu macierzy należy pozostawić tkankę do odpoczynku na pięć minut. Po tym czasie należy rozpuścić pozostały kołek, aplikując więcej soli fizjologicznej.Następnie należy użyć akrylu stomatologicznego, aby przymocować mikrodruty na miejscu. Należy nałożyć kilka warstw akrylu i odczekać od 15 do 20 minut do ich utwardzenia. W dalszej kolejności należy uzupełnić pozostałą część uchwytu głowowego zwierzęcia za pomocą akrylu stomatologicznego, uwzględniając śruby czaszkowe, przewód uziemiający oraz złącze dla mikrodrutów.Proszę zapoznać się z protokołem tekstowym dotyczącym procedur pooperacyjnych. Następnie należy wyjąć zwierzę z uchwytów do uszu i umieścić je w czystym miejscu. Należy często obserwować zwierzę, aż do momentu powrotu termoregulacji i zdolności lokomozyjnych.Po wybudzeniu zwierzę należy przenieść do osobnych klatek. Należy monitorować rekonwalescencję zwierzęcia przez siedem lub więcej dni i podawać iniekcje karprofenu oraz enrofloksacyny zgodnie z zaleceniami lekarza weterynarii; zmierzony ładunek neuronalny z wszczepionego układu mikrodrutów był skorelowany z zdarzeniami behawioralnymi.Na przykład, toniczne wyładowania tej komórki w jądrze przymodomózgowiu przedstawione w 32-sekundowych przedziałach czasowych mierzono podczas samopodawania kokainy przez zwierzę. Zauważamy, że aktywność komórki zostaje zahamowana wraz ze wzrostem poziomu kokainy w organizmie zwierzęcia. Jednak komórka powraca do swojej pierwotnej częstotliwości wyładowań.Gdy kokaina opada po zakończeniu warunków samopodawania. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby sprawdzić precyzję okna czaszki i zweryfikować wyrównanie matrycy w celu zapewnienia dokładności celowania. Należy pamiętać, że matryce micro I są szczególnie delikatne, a integralność matrycy ma krytyczne znaczenie dla prawidłowej implantacji.Należy zachować ostrożność podczas obsługi pojedynczej jednostki do wymazywania. Rejestrację można łączyć z wieloma innymi technikami, takimi jak immunohistochemia czy optogenetyka. Po połączeniu tych metod z odpowiednim paradygmatem behawioralnym mogą one dostarczyć głębokich spostrzeżeń na temat złożoności funkcji mózgu.

a-procedure-for-implanting-organized-arrays-microwires-for-single

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Procedura wszczepiania uporządkowanych tablic mikrodrotów do pojedynczych nagrań u zbudzonych, zachowujących się zwierząt

W niniejszym protokole demonstrujemy sposób wykonania macierzy mikrodrajwerów do chronicznych rejestracji elektrofizjologicznych u szczurów.

Układ mikro-napędów do przewlekłych pomiarów in vivo: Konstrukcja napędu

Ten film demonstruje szczegółową procedurę przygotowania znieczulonego szczura do elektrofizjologicznych zapisów aktywności mózgu z wielu miejsc. Skóra głowy jest preparowana w celu uzyskania dostępu do czaszki, a otwory są wiercone w precyzyjnych miejscach, aby zainstalować i zabezpieczyć elektrody. Elektrody wolframowe są następnie umieszczane w docelowym miejscu w celu zarejestrowania danych.

Elektrofizjologiczne zapisy in vivo aktywności mózgu z wielu miejsc u szczurów

Film demonstruje procedurę wszczepienia bezprzewodowej dwukierunkowej wielokanałowej elektrody do mózgu szczura w celu nagrywania i stymulowania wielokanałowych sieci neuronowych.

Wszczepienie bezprzewodowego dwukierunkowego systemu mikroelektrod do mózgu szczura

Ten film przedstawia protokół wszczepienia wielozębowej liniowej sondy krzemowej do mózgu myszy w celu pomiaru lokalnych potencjałów pola. Procedura polega na przymocowaniu sondy do jednostki stereotaktycznej, ustawieniu jej dokładnie nad docelowym obszarem mózgu, wprowadzeniu jej do mózgu i zabezpieczeniu cementem dentystycznym. Po implantacji zespół zabezpieczany jest obudową. Po powrocie do zdrowia konfiguracja pozwala na rejestrowanie lokalnych potencjałów pola, zapewniając wgląd w...

Rejestrowanie aktywności elektrycznej mózgu u zachowujących się myszy za pomocą liniowych sond krzemowych z wieloma zębami

Wideo demonstruje jednoczesny zapis elektrofizjologiczny z wielu obszarów mózgu u szczura przy użyciu zintegrowanego układu mikronapędów. Elektrody rejestrujące są umieszczone w opuszce węchowej, elektrody referencyjne w korze czołowej, a elektrody układu mikronapędów w hipokampie. Szczur może swobodnie żerować, a jednoczesny zapis ze wszystkich wszczepionych elektrod jest rejestrowany za pomocą matrycy.

Metoda Micro-drive Array do zapisu elektrofizjologicznego z wielu obszarów mózgu

Ten film demonstruje technikę wszczepiania zespołu elektrod do mózgu myszy. Zespół zawiera elektrody bipolarne do rejestrowania aktywności z hipokampa i elektrodę odniesienia do uzyskiwania podstawowej aktywności z móżdżku. Znieczuloną mysz umieszcza się na stereotaktycznej ramie, a zespół elektrod wszczepia się w docelowy obszar mózgu. Następnie zwierzę może dojść do siebie przed wykonaniem zapisu elektrofizjologicznego.

Wszczepienie zespołu elektrod do mózgu myszy w celu zapisu elektrofizjologicznego

Opisano projektowanie i montaż mikronapędów do elektrofizjologicznych zapisów in vivo sygnałów mózgowych od myszy. Dzięki przymocowaniu wiązek mikroelektrod do wytrzymałych nośników napędzanych, techniki te pozwalają na długotrwałe i stabilne zapisy neuronowe. Lekka konstrukcja pozwala na nieograniczoną wydajność behawioralną zwierzęcia po wszczepieniu napędu.

Budowa macierzy mikronapędów do przewlekłych nagrań neuronowych u myszy zachowujących się w stanie czuwania

Wprowadzono bezprzewodowy, dwukierunkowy system do wielokanałowych zapisów neuronowych i stymulacji u swobodnie zachowujących się szczurów. System jest lekki i kompaktowy, dzięki czemu ma minimalny wpływ na repertuar behawioralny zwierzęcia. Co więcej, ten dwukierunkowy system zapewnia wyrafinowane narzędzie do oceny związków przyczynowo-skutkowych między wzorcami aktywacji mózgu a zachowaniem.

Bezprzewodowy, dwukierunkowy interfejs do rejestrowania in vivo i stymulacji aktywności neuronalnej u swobodnie zachowujących się szczurów

Ta praca przedstawia protokół do przeprowadzenia stereotaktycznego, neurochirurgicznego wszczepienia matryc mikroelektrod u marmozety pospolitej. Metoda ta umożliwia zapisy elektrofizjologiczne u swobodnie zachowujących się zwierząt, ale może być łatwo dostosowana do każdej innej podobnej interwencji neurochirurgicznej u tego gatunku (np. kaniula do podawania leków lub elektrody do stymulacji mózgu).

Chirurgia stereotaktyczna do implantacji układów mikroelektrod w marmozecie zwyczajnej (Callithrix jacchus)

Opisujemy tutaj metodę wytwarzania matryc mikroelektrod Ti3C2 MXene i wykorzystywania ich do rejestracji neuronowej in vivo.

Produkcja matryc mikroelektrod Ti3C2 MXene do rejestracji neuronowej in vivo

Protokół ten przedstawia skrzynkę behawioralną opartą na mikrokontrolerze do oceny hamowania przedimpulsowego (PPI) poprzez zbieranie danych o przyspieszeniu z czujnika znajdującego się pod skrzynką. Dane te oceniają deficyty bramkowania sensorycznego u społecznie izolowanych szczurów, z dodatkową metodą synchronizacji danych z aktywnością neuronalną w celu przyspieszenia badań neurofizjologicznych nad zaburzeniami zachowania.

Opracowanie pudełka behawioralnego do oceny hamowania prepulsu i aktywności neuronalnej w psychiatrycznych modelach zwierzęcych

Poznaj technikę implantacji mikroprzewodów do rejestracji pojedynczych neuronów u przebudzonych, zachowujących się zwierząt. Metoda umożliwia precyzyjne badanie aktywności neuronalnej z wysoką selektywnością przestrzenną.

Procedura wszczepiania zorganizowanych układów mikroprzewodów do nagrań pojedynczych jednostek u obudzonych, zachowujących się zwierząt (Wideo) | JoVE Journal

Procedura wszczepiania zorganizowanych układów mikroprzewodów do nagrań pojedynczych jednostek u obudzonych, zachowujących się zwierząt

Przeglądaj więcej filmów