Nanocząstki PLGA utworzone przez pojedynczą lub podwójną emulsję z witaminą E-TPGS

Ogólnym celem niniejszej procedury jest utworzenie nanocząsteczek polimerowych o regulowanej wielkości. Osiąga się to poprzez uprzednie rozpuszczenie polimeru w rozpuszczalniku organicznym i dodanie leku lub fluorescencyjnego substancji inkapsulowanej. Drugim krokiem jest emulsyfikacja polimeru z fazą wodną zawierającą środek emulgujący, a następnie umożliwienie utwardzenia cząsteczek w większej objętości wodnej w miarę odparowywania rozpuszczalnika.

Następnie cząstki są przemywane, zbierane poprzez wirowanie i liofilizowane w celu długoterminowego przechowywania. Ostatnim etapem jest charakterystyka rozmiaru i morfologii powierzchni nanocząstek za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej lub obrazowania SEM. Ostatecznie metoda SEM służy do wykazania, że rozmiar nanocząstek można kontrolować poprzez zmianę stężenia emulgatora.

Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię wielu ludzkich schorzeń, ponieważ cząsteczki mogą być dostosowane do enkapsulacji i dostarczania szerokiej gamy czynników terapeutycznych w celu zapewnienia długotrwałego działania w tkance docelowej. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa.

Etapy emulgowania są trudne do opanowania, ponieważ subtelne aspekty tworzenia emulsji mogą mieć znaczący wpływ na właściwości cząstek. Aby rozpocząć przygotowanie nanocząstek, należy umieścić około 100 mg kopolimeru kwasu polimlekowego i glikolowego, znanego również jako PLGA, w probówce o wymiarach 13 × 100 mm. Następnie, używając szklanej pipety serologicznej, należy przenieść 1 mL octanu etylu do próbki, przykryć górną część probówki folią aluminiową, a następnie szczelnie zabezpieczyć folię za pomocą parafilmu.

Należy szczelnie owinąć parafilm wokół górnej krawędzi fiolki i dolnej krawędzi folii, aby zapobiec odparowaniu rozpuszczalnika. Zaznaczyć poziom rozpuszczalnika na probówce i pozostawić polimer do rozpuszczenia przez noc. Następnego dnia, w przypadku odparowania, dodać dodatkową ilość rozpuszczalnika.

Przygotuj następujący sprzęt i materiały w dygestorium w pobliżu myjki ultradźwiękowej: wirówkę typu vortex, dwie małe szklane pipety Pasteura z gumowymi gruszkami oraz mieszadło magnetyczne. Dodatkowo ustaw na statywie pod myjką ultradźwiękową duży zlew z wodą z lodem.

Następnie dodaj 45 ml 0,3% w/v witaminy E-T-P-G-S do 200 ml szklanego becherka i ustaw prędkość mieszania na 360 RPM. Następnie dodaj 2 ml 0,3% w/v witaminy E-T-P-G-S do szklanej probówki o wymiarach 13 x 100 mm. Aby wymieszać czynniki hydrofobowe, dodaj substancję enkapsulującą bezpośrednio do roztworu polimeru, uważając, aby nie dopuścić do kontaktu ze ściankami probówki, a następnie wortexuj probówkę aż do homogenicznego rozproszenia substancji enkapsulującej.

W przypadku substancji hydrofilowych należy zemulgować substancję zamykaną z roztworem polimeru. Do powierzchni roztworu polimeru dodać do 50 µL leku w buforze. Mieszaninę poddać sonikacji w lodzie przez około 10 sekund lub do momentu, aż roztwór stanie się nieprzezroczysty i jednorodny.

Następnie, trzymając probówkę pionowo, wymieszaj zawartość probówki z witaminą E-T-P-G-S za pomocą wiertarki laboratoryjnej (vortexa) na wysokich obrotach. Utrzymuj szklaną pipetę pasteuryzacyjną jeden do dwóch centymetrów nad górną krawędzią mieszanej probówki i powoli dodawaj roztwór polimeru kroplami na powierzchnię cieczy w probówce. Należy uważać, aby pipeta nie dotknęła ścianek probówki, aż do momentu dodania całego roztworu polimeru.

Kontynuuj mieszanie roztworu w wirówce. Teraz twórz emulsję przez 15 sekund. Bezzwłocznie przenieś zemulgowany polimer do sonikatora.

Probówkę należy utrzymać w kąpieli wodno-lodowej i poddać emulsję sonikacji w trzech dziesięciosekundowych cyklach. Emulsję należy przesuwać w górę i w dół wzdłuż sondy, aby zapewnić równomierną sonikację, unikając jednocześnie dotykania ścianek lub dna probówki. Między każdym dziesięciosekundowym cyklem sonikacji należy zastosować przerwę trwającą od 5 do 10 s, aby roztwór mógł ostygnąć przed kontynuacją.

Następnie do emulsji należy dodać od jednego do dwóch mililitrów 0,3% vitamin E-T-P-G-S z roztworu mieszanego. Pozwoli to rozrzedzić zemulgowany polimer, ułatwiając jego wylewanie; następnie należy przelać emulsję do roztworu mieszanego. Pozostałości roztworu z probówki należy wypłukać do roztworu mieszanego.

Pozostaw nanocząstki do utwardzenia, mieszając je przez trzy godziny. Jeśli substancja otaczająca jest światłoczuła, owiń zlewkę folią aluminiową, pozostawiając górę otwartą, aby ułatwić odparowanie rozpuszczalnika. Aby zebrać nanocząstki, należy rozpocząć od rozdzielenia zawiesiny nanocząstek do dwóch probówek wirówkowych Oak Ridge o nominalnej objętości 30 ml i zrównoważyć je z dokładnością do 0,1 g. Następnie nanocząstki należy wirować w rotorze z kątem stałym przez 15 minut przy 17 000.

RC f. Dłuższy czas wirowania pozwoli na zebranie większej frakcji mniejszych nanocząsteczek. Odlej nadsącz, uważając, aby nie naruszyć osadu z nanocząsteczek.

Dodać 5 ml wody destylowanej, a następnie użyć łaźni wodnej, sonikatora i wortexa, aby całkowicie zawiesić nanocząstki. Przenieść zawartość obu probówek wirówkowych do jednej i dodać 20 ml wody destylowanej, aby uzyskać objętość całkowitą 30 ml. Następnie powtórzyć etapy wirowania i przemywania jeszcze dwa razy, tak aby łącznie przeprowadzić trzy przemycia.

Objętość cieczy w ostatniej zawiesinie resuspendowanego osadu powinna wynosić od 4 do 5 ml. Zamroź niewielką alikwot nanocząsteczek wolnych od telos do obrazowania SEM, oddzielnie od pozostałej części. Dodaj TLO w stosunku wagowym od 1:2 do polimeru jako krioprotektant, aby uzyskać jednorodną i pełną resuspendowaną zawiesinę nanocząsteczek PLGA.

Zapobiegnie to tworzeniu się kryształków lodu, które mogłyby uszkodzić powierzchnię cząstek i wywołać agregację. Przenieś nanocząstki do wcześniej zważonej probówki wirówkowej o pojemności 5 ml, a następnie zamroź w temperaturze -80 °C przez co najmniej 30 minut. Następnie otwórz probówkę i zakryj jej wierzch, mocując ręcznik papierowy za pomocą gumki recepturki.

Należy działać szybko, aby zawartość nie roztopiła się, jeśli dojdzie do procesu topnienia. Zamrozić ponownie przed umieszczeniem w liofilizatorze, a następnie liofilizować próbkę o objętości 5 mL przez 72 godziny. Następnie zakręcić nakrętkę, owinąć probówkę i przechowywać liofilizat w temperaturze -80 °C.

W dniu obrazowania naklej pasek dwustronnej taśmy węglowej na stub do SEM. Oznacz metalową część stuba permanentnym markerem w celu późniejszej identyfikacji. Używając metalnej szpatułki, pobierz niewielką ilość liofilizowanych nanocząsteczek i delikatnie rozprowadź je na powierzchni taśmy.

Przetrzyj powierzchnię stubu chusteczką laboratoryjną lub użyj sprężonego powietrza, aby usunąć luźne nanocząsteczki. Wizualizuj cząsteczki, stosując odległość roboczą wiązki od 5 do 15 mm, napięcie od 5 do 12 kV oraz rozmiar plamki od 1 do 3; wyższe natężenia wiązki mogą spowodować regionalne nagrzanie próbki, co zmieni morfologię powierzchni cząsteczek. Mikrocząsteczki obserwuje się przy powiększeniu 100-krotnym, natomiast nanocząsteczki będą rozróżnialne przy powiększeniu 3000-krotnym.

Ustawienie powiększenia i ostrość na górnej części sfery w celu zlokalizowania cząstek, które można łatwo zobrazować za pomocą SEM; należy zebrać co najmniej trzy obrazy z każdej serii, aby uzyskać reprezentatywną próbkę wielkości i morfologii cząstek. Stosując tę metodę, można wytworzyć cząstki poprzez pojedynczą emulsję, które występują jako oddzielne, niespoone sfery o gładkiej morfologii powierzchni i szerokim zakresie rozmiarów rozłożonych w całej próbce. Przedstawione tutaj mikrocząstki mają średnicę średnią 730 nanometrów.

Przedstawiono tutaj nanocząstki stworzone za pomocą pojedynczej emulsji, które enkapsulują hydrofobowy lek campin. Cząstki te okazały się jeszcze mniejsze, osiągając średnicę średnią 340 nanometrów. Wyższe stężenia emulgatora prowadziły do powstania mniejszych cząstek, których średnice średnie zmniejszały się z 2000 do 200 nanometrów.

Wraz ze wzrostem stężenia emulgatora od 0,01 do 0,3%, co obrazują przedstawione tutaj zdjęcia SEM. Jednakże, gdy stężenie witaminy E-T-P-G-S było zbyt wysokie, przy zastosowaniu 1% witaminy E-T-P-G-S nie tworzyły się oddzielne cząstki, a w całej strukturze stwierdzono obecność intensywnego zlewania się elementów i struktur przypominających blaszki. Prawda. Po opanowaniu metody wytwarzania nanocząsteczek PLG poprzez emulgowanie, można zastosować inne metody, takie jak modyfikacja powierzchni, w celu zaprojektowania nanocząsteczek zdolnych do oddziaływania ze specyficznymi typami komórek lub obszarami organizmu.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tworzenia cząsteczek o powtarzalnym i regulowanym rozmiarze metodą emulsyfikacji.