Name: Nanocząstki PLGA utworzone przez pojedynczą lub podwójną emulsję z witaminą E-TPGS (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-27T14:15:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: Poznaj metodę emulgacji do produkcji nanocząstek PLGA o regulowanym rozmiarze z witaminą E-TPGS jako emulgator. Technika ta umożliwia kontrolę wielkości cząstek od 220 nm do 1,98 µm poprzez zmianę stężenia emulgatora.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy nie mają żadnych podziękowań.

1. Przygotowanie nanocząstek
Wszystkie kroki związane z rozpuszczalnikiem lub rozpuszczonym/zemulgowanym polimerem powinny być wykonywane w dygestoriach chemicznych.
<ol>
	<li>Odważyć 100 mg (+/- 5 mg) kwasu poli(mlekowo-ko-glikolowego) (PLGA) i umieścić w probówce o wymiarach 13 mm x 100 mm.</li>
	<li>Przenieść 1 ml rozpuszczalnika (octanu etylu (EtAc) lub dichlorometanu (DCM)) do próbki za pomocą szklanej pipety serologicznej.</li>
	<li>Przykryj górną część probówki małym kawałkiem folii aluminiowej i bezpiecznie zafoliuj folię, upewniając się, że folia Parafilm jest szczelnie owinięta wzdłuż górnej krawędzi fiolki, jak również dolnej krawędzi folii.</li>
	<li>Zaznacz poziom rozpuszczalnika na zewnątrz probówki. Pozwól polimerowi rozpuścić się przez noc, dodając dodatkowy rozpuszczalnik następnego dnia, jeśli nastąpi parowanie. 
	Uwaga: W razie potrzeby polimer można również rozpuścić w dniu przygotowania nanocząstek. Postępuj zgodnie z krokami 1.1-1.3, a następnie wiruj na wysokich obrotach, aż cały polimer całkowicie się rozpuści (~10 min).</li>
	<li>Przygotować miejsce pracy w dygestorium z następującym sprzętem/materiałami obok ultrasonografu: wirownikiem, dwiema małymi szklanymi pipetami Pasteura z gumowymi gruszkami i magnetyczną płytką mieszającą. Umieść dużą zlewkę pełną lodowatej wody na stojaku poniżej ultradźwięków.</li>
	<li>Dodaj 45 ml 0,3% w/v witaminy E-TPGS do szklanej zlewki o pojemności 200 ml z magnetycznym mieszadłem i ustaw prędkość mieszania na 360 obr./min.</li>
	<li>Dodaj 2 ml 0,3% w/v witaminy E-TPGS do szklanej probówki o wymiarach 13 mm x 100 mm.</li>
	<li>Dodaj lek: 
	W przypadku środków hydrofobowych: dodać enkapsulant bezpośrednio do roztworu polimeru (uważając, aby uniknąć ścianek probówki) i wirować probówkę, aż kapsułka zostanie jednorodnie zdyspergowana. 
	W przypadku środków hydrofilowych: przed kontynuowaniem zemulgować kapsułkę z roztworem polimeru. Dodać do 50 μl leku w wodzie lub buforze na powierzchnię roztworu polimeru. Wykonać krótkie ultradźwięki w celu emulgowania leku z polimerem (zwykle 10 sekund lub w razie potrzeby do uzyskania jednorodnego, nieprzezroczystego roztworu). Ten etap sonikacji powinien być wykonywany na lodzie.</li>
	<li>Umieść polimer/kapsułkę z otwartą rurką w pobliżu wirownika. Trzymając probówkę zawierającą witaminę E-TPGS pionowo i na wysokim wirze, użyj szklanej pipety Pasteura, aby kroplami dodać roztwór polimeru/kapsułki. Uważaj, aby ominąć boki rurki i upuścić roztwór polimeru bezpośrednio na powierzchnię emulgatora wirowego. Po dodaniu całego 1 ml roztworu polimeru do witaminy E-TPGS, kontynuuj wirowanie roztworu (teraz emulsji) przez dodatkowe 15 sekund.</li>
	<li>Natychmiast przenieść zemulgowany polimer do ultrasonografu. Utrzymuj probówkę zanurzoną w lodowatej wodzie i sonikuj emulsję w trzech 10-sekundowych seriach (40% amplitudy dla sonikatora 700 W, rozmiar końcówki sondy 1/8). Przesuwaj emulsję w górę iw dół sondy, aby zapewnić równomierną sonikację, uważając, aby nie dotykać sondy po bokach lub na dole probówki. Zrób przerwę między każdymi dziesięciosekundowymi sonikacjami, aby roztwór ostygł przed kontynuowaniem.</li>
	<li>Dodaj 1-2 ml 0,3% witaminy E-TPGS z roztworu mieszającego do emulsji za pomocą szklanej pipety Pasteura, która rozrzedzi zemulgowany polimer, aby łatwiej się rozlewał. Opróżnij emulsję do roztworu mieszającego. Powtórz ten krok, aby wypłukać pozostały roztwór z probówki do roztworu mieszającego.</li>
	<li>Pozwól nanocząsteczkom stwardnieć, mieszając przez trzy godziny. Jeśli kapsułka jest wrażliwa na światło, zlewkę można owinąć folią aluminiową, pozostawiając górną część otwartą, aby ułatwić odparowanie rozpuszczalnika.</li>
</ol>
2. Kolekcja nanocząstek
<ol>
	<li>Podziel utwardzone nanocząstki na dwie probówki wirówkowe Oak Ridge (objętość nominalna 30 ml) i zrównoważ z dokładnością do 0,1 g.</li>
	<li>Odwiruj nanocząstki w wirniku o stałym kącie nachylenia przez 15 minut przy 17 000 x g. Dłuższe czasy wirowania spowodują zebranie większej frakcji mniejszych nanocząstek.</li>
	<li>Wyrzucić supernatant, uważając, aby nie naruszyć osadu nanocząstek (wodę można wylać lub odpipetować). Dodać 15 ml diH2O i użyć sonikatora do kąpieli wodnej i/lub wirownika, aby całkowicie zawiesić nanocząstki.</li>
	<li>Połączyć zawartość dwóch probówek wirówkowych w jedną i powtórzyć kroki 2.1-2.3 2 razy więcej, w sumie trzy razy przemyć po 30 ml diH2O za każdym razem. Objętość płynu w ostatnim wyparowaniu granulek powinna wynosić 4-5 ml. 
	W tym momencie można dodać stosunek wagowy trehalozy do polimeru 1:2 jako krioprotektantu (zamrozić niewielką porcję nanocząstek bez trehalozy do obrazowania SEM). Kryształki lodu, które tworzą się podczas procesu zamrażania, mogą uszkadzać powierzchnię cząstek i indukować agregację, a wykazano, że włączenie trehalozy poprawia równomierne i całkowite ponowne zawieszenie nanocząstek PLGA13.</li>
	<li>Przenieść nanocząstki do wstępnie zważonej probówki wirówkowej o pojemności 5 ml i zamrażać w temperaturze -80 °C przez co najmniej 30 minut.</li>
	<li>Poruszając się szybko, aby nie dopuścić do stopienia zamrożonej zawartości, odkręć probówkę i przykryj górę, zabezpieczając tkankę laboratoryjną na górze gumką. **Jeśli dojdzie do stopienia, ponownie zamrozić przed umieszczeniem w liofilizatorze.</li>
	<li>Liofilizować 72 godziny dla objętości 5 ml. Przechowywać liofilizowane cząstki w probówce owiniętej Parafilm w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
3. Wymiarowanie i morfologia powierzchni
Skaningowa mikroskopia elektronowa
<ol>
	<li>Próbki do SEM należy przygotować w dniu obrazowania. Umieść pasek dwustronnej taśmy węglowej na króćcu SEM. Marker permanentny może być użyty do oznaczenia metalowej części króćca do późniejszego wykorzystania.</li>
	<li>Za pomocą metalowej szpatułki zbierz niewielką ilość liofilizowanych nanocząstek i delikatnie rozprowadź je po powierzchni taśmy. Wyszczotkuj powierzchnię kikuta chusteczką laboratoryjną lub użyj sprężonego powietrza, aby usunąć luźne nanocząsteczki.</li>
	<li>Napyl próbkę złotem-paladium na 30-120 sekund. Dłuższy czas napylania zapewni gładszą powierzchnię do obrazowania, chociaż może to spowodować utratę drobnych szczegółów powierzchni.</li>
	<li>Typowymi parametrami wizualizacji cząstek są odległość robocza 5-15 mm, siła wiązki 5-12 kV i wielkość plamki 1-3. Wyższe natężenie wiązki może spowodować regionalne nagrzewanie próbki, co zmieni morfologię powierzchni cząstek. Mikrocząstki są obserwowane przy 100-krotnym powiększeniu, a nanocząstki będą rozróżnialne przy 3,000-krotnym powiększeniu.</li>
	<li>Idealna próbka będzie składać się z jednolitej powłoki cząstek na płaskiej powierzchni kikuta. Czasami w wyniku liofilizacji mogą powstać struktury drugorzędowe (w tym płatki lub kulki). Skupienie się na krawędzi płatka, w miejscu, w którym płatek styka się z taśmą, lub na górze kuli pomoże zlokalizować cząstki, które można łatwo zwizualizować za pomocą SEM. Zbierz co najmniej trzy obrazy na partię, aby uzyskać reprezentatywną próbkę wielkości i morfologii cząstek.</li>
</ol>

<ol><li>Peer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanocarriers+as+an+emerging+platform+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Nanocarriers as an emerging platform for cancer therapy.</a> Nat. Nanotechnol. 2, 751-760 (2007).</li>
<li>Jiang, W., Gupta, R. K., Deshpande, M. C., Schwendeman, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradable+poly%28lactic-co-glycolic+acid%29+microparticles+for+injectable+delivery+of+vaccine+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Biodegradable poly(lactic-co-glycolic acid) microparticles for injectable delivery of vaccine antigens.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 57, 391-410 (2005).</li>
<li>Haag, R., Kratz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer+therapeutics%3A+Concepts+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem%22%5BJournal%5D)">Polymer therapeutics: Concepts and applications.</a> Angew. Chem. 45, 1198-1215 (2006).</li>
<li>Tong, R., Cheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anticancer+polymeric+nanomedicines%5BTitle%5D)+AND+%22Polym.+Rev%22%5BJournal%5D)">Anticancer polymeric nanomedicines.</a> Polym. Rev. 47, 345-381 (2007).</li>
<li>Kumari, A., Yadav, S. K., Yadav, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradable+polymeric+nanoparticles+based+drug+delivery+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surf.+B+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Biodegradable polymeric nanoparticles based drug delivery systems.</a> Colloids and Surf. B Biointerfaces. 75, 1-18 (2010).</li>
<li>Anderson, J. M., Shive, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradation+and+biocompatibility+of+PLA+and+PLGA+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Biodegradation and biocompatibility of PLA and PLGA microspheres.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 28, 5-24 (1997).</li>
<li>Jain, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+manufacturing+techniques+of+various+drug+loaded+biodegradable+poly%28lactide-co-glycolide%29+%28PLGA%29+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The manufacturing techniques of various drug loaded biodegradable poly(lactide-co-glycolide) (PLGA) devices.</a> Biomaterials. 21, 2475-2490 (2000).</li>
<li>Danhier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PLGA-based+nanoparticles%3A+An+overview+of+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Rel%22%5BJournal%5D)">PLGA-based nanoparticles: An overview of biomedical applications.</a> J. Control. Rel. 161, 505-522 (2012).</li>
<li>Mu, L., Feng, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+controlled+release+formulation+for+the+anticancer+drug+paclitaxel+%28Taxol%29%3A+PLGA+nanoparticles+containing+vitamin+E+TPGS.%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Rel%22%5BJournal%5D)">A novel controlled release formulation for the anticancer drug paclitaxel (Taxol): PLGA nanoparticles containing vitamin E TPGS.</a> J. Control. Rel. 86, 33-48 (2003).</li>
<li>Mu, L., Feng, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PLGA%2FTPGS+nanoparticles+for+controlled+release+of+paclitaxel%3A+effects+of+the+emulsifier+and+drug+loading+ratio%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">PLGA/TPGS nanoparticles for controlled release of paclitaxel: effects of the emulsifier and drug loading ratio.</a> Pharm. Res. 20, 1864-1872 (2003).</li>
<li>Collnot, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+E+TPGS+P-glycoprotein+inhibition+mechanism%3A+influence+on+conformational+flexibility%2C+intracellular+ATP+levels%2C+and+role+of+time+and+site+of+access%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Vitamin E TPGS P-glycoprotein inhibition mechanism: influence on conformational flexibility, intracellular ATP levels, and role of time and site of access.</a> Mol. Pharm. 7, 642-651 (2010).</li>
<li>Dintaman, J. M., Silverman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+P-glycoprotein+by+D-alpha-tocopheryl+polyethylene+glycol+1000+succinate+%28TPGS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">Inhibition of P-glycoprotein by D-alpha-tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate (TPGS).</a> Pharm. Res. 16, 1550-1556 (1999).</li>
<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly-penetrative%2C+drug-loaded+nanocarriers+improve+treatment+of+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A.%22%5BJournal%5D)">Highly-penetrative, drug-loaded nanocarriers improve treatment of glioblastoma.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. , (2013).</li>
<li>Cartiera, M. S., Johnson, K. M., Rajendran, V., Caplan, M. J., Saltzman, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+uptake+and+intracellular+fate+of+PLGA+nanoparticles+in+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The uptake and intracellular fate of PLGA nanoparticles in epithelial cells.</a> Biomaterials. 30, 2790-2798 (2009).</li>
<li>Niwa, T., Takeuchi, H., Hino, T., Nohara, M., Kawashima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradable+submicron+carriers+for+peptide+drugs%3A+Preparation+of+dl-lactide%2Fglycolide+copolymer+%28PLGA%29+nanospheres+with+nafarelin+acetate+by+a+novel+emulsion-phase+separation+method+in+an+oil+system%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Biodegradable submicron carriers for peptide drugs: Preparation of dl-lactide/glycolide copolymer (PLGA) nanospheres with nafarelin acetate by a novel emulsion-phase separation method in an oil system.</a> Int. J. Pharm. 121, 45-54 (1995).</li>
<li>Ameller, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyester-poly%28ethylene+glycol%29+nanoparticles+loaded+with+the+pure+antiestrogen+RU+58668%3A+physicochemical+and+opsonization+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">Polyester-poly(ethylene glycol) nanoparticles loaded with the pure antiestrogen RU 58668: physicochemical and opsonization properties.</a> Pharm. Res. 20, 1063-1070 (2003).</li>
<li>Wischke, C., Schwendeman, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+encapsulating+hydrophobic+drugs+in+PLA%2FPLGA+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Principles of encapsulating hydrophobic drugs in PLA/PLGA microparticles.</a> Int. J. Pharm. 364, 298-327 (2008).</li>
<li>Batycky, R. P., Hanes, J., Langer, R., Edwards, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+theoretical+model+of+erosion+and+macromolecular+drug+release+from+biodegrading+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Sci%22%5BJournal%5D)">A theoretical model of erosion and macromolecular drug release from biodegrading microspheres.</a> J. Pharm. Sci. 86, 1464-1477 (1997).</li>
<li>Panyam, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer+degradation+and+in+vitro+release+of+a+model+protein+from+poly%28D%2CL-lactide-co-glycolide%29+nano-+and+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Rel%22%5BJournal%5D)">Polymer degradation and in vitro release of a model protein from poly(D,L-lactide-co-glycolide) nano- and microparticles.</a> J. Control. Rel. 92, 173-187 (2003).</li>
<li>Siepmann, J., Faisant, N., Akiki, J., Richard, J., Benoit, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+the+size+of+biodegradable+microparticles+on+drug+release%3A+Experiment+and+theory%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Effect of the size of biodegradable microparticles on drug release: Experiment and theory.</a> Journal of Controlled Release. 96, 123-134 (2004).</li>
<li>Desai, M. P., Labhasetwar, V., Walter, E., Levy, R. J., Amidon, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+uptake+of+biodegradable+microparticles+in+Caco-2+cells+is+size+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">The mechanism of uptake of biodegradable microparticles in Caco-2 cells is size dependent.</a> Pharm. Res. 14, 1568-1573 (1997).</li>
<li>Alexis, F., Pridgen, E., Molnar, L. K., Farokhzad, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+the+clearance+and+biodistribution+of+polymeric+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Factors affecting the clearance and biodistribution of polymeric nanoparticles.</a> Mol. Pharm. 5, 505-515 (2008).</li>
<li>Barichello, J. M., Morishita, M., Takayama, K., Nagai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation+of+hydrophilic+and+lipophilic+drugs+in+PLGA+nanoparticles+by+the+nanoprecipitation+method%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Dev.+Ind.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Encapsulation of hydrophilic and lipophilic drugs in PLGA nanoparticles by the nanoprecipitation method.</a> Drug Dev. Ind. Pharm. 25, 471-476 (1999).</li>
<li>Mundargi, R. C., Babu, V. R., Rangaswamy, V., Patel, P., Aminabhavi, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nano%2Fmicro+technologies+for+delivering+macromolecular+therapeutics+using+poly%28d%2Cl-lactide-co-glycolide%29+and+its+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Rel%22%5BJournal%5D)">Nano/micro technologies for delivering macromolecular therapeutics using poly(d,l-lactide-co-glycolide) and its derivatives.</a> J. Control. Rel. 125, 193-209 (2008).</li>
<li>Niwa, T., Takeuchi, H., Hino, T., Kunou, N., Kawashima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparations+of+biodegradable+nanospheres+of+water-soluble+and+insoluble+drugs+with+D%2CL-lactide%2Fglycolide+copolymer+by+a+novel+spontaneous+emulsification+solvent+diffusion+method%2C+and+the+drug+release+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Rel%22%5BJournal%5D)">Preparations of biodegradable nanospheres of water-soluble and insoluble drugs with D,L-lactide/glycolide copolymer by a novel spontaneous emulsification solvent diffusion method, and the drug release behavior.</a> J. Control. Rel. 25, 89-98 (1993).</li>
<li>Yang, Y. Y., Chia, H. H., Chung, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+preparation+temperature+on+the+characteristics+and+release+profiles+of+PLGA+microspheres+containing+protein+fabricated+by+double-emulsion+solvent+extraction%2Fevaporation+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Rel%22%5BJournal%5D)">Effect of preparation temperature on the characteristics and release profiles of PLGA microspheres containing protein fabricated by double-emulsion solvent extraction/evaporation method.</a> J. Control. Rel. 69, 81-96 (2000).</li>
<li>Yang, Y. Y., Chung, T. S., Ping Ng, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology%2C+drug+distribution%2C+and+in+vitro+release+profiles+of+biodegradable+polymeric+microspheres+containing+protein+fabricated+by+double-emulsion+solvent+extraction%2Fevaporation+method%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Morphology, drug distribution, and in vitro release profiles of biodegradable polymeric microspheres containing protein fabricated by double-emulsion solvent extraction/evaporation method.</a> Biomaterials. 22, 231-241 (2001).</li>
<li>Zhang, Z., Feng, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+drug+encapsulation+efficiency%2C+in+vitro+drug+release%2C+cellular+uptake+and+cytotoxicity+of+paclitaxel-loaded+poly%28lactide%29-tocopheryl+polyethylene+glycol+succinate+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The drug encapsulation efficiency, in vitro drug release, cellular uptake and cytotoxicity of paclitaxel-loaded poly(lactide)-tocopheryl polyethylene glycol succinate nanoparticles.</a> Biomaterials. 27, 4025-4033 (2006).</li>
<li>Astete, C. E., Sabliov, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+characterization+of+PLGA+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomater.+Sci.+Polym.+Ed%22%5BJournal%5D)">Synthesis and characterization of PLGA nanoparticles.</a> J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 17, 247-289 (2006).</li>
<li>Gaumet, M., Gurny, R., Delie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+biodegradable+PLGA+particles+with+narrow+size+distributions%3A+Preparation+by+means+of+selective+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Fluorescent biodegradable PLGA particles with narrow size distributions: Preparation by means of selective centrifugation.</a> Int. J. Pharm. 342, 222-230 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Cząstki PLGA są zwykle przygotowywane za pomocą pojedynczej lub podwójnej emulsji, metody, która zapewnia możliwość dostosowania cech cząstek, takich jak rozmiar, enkapsulant i właściwości powierzchni7. Te i inne właściwości zależą od wielu zmiennych, w tym rodzaju rozpuszczalnika, proporcji wsadu, metody emulgowania i rodzaju emulgatora. Jednak z naszego doświadczenia wynika, że pojedynczy eksperymentator jest w stanie wytworzyć cząstki o stałych właściwościach. Korzystając z tego samego protokołu, dobrze wyszkolony eksperymentator wyprodukował siedem oddzielnych partii nanocząstek o następujących średnich średnicach: 317 nm±99, 342 nm±112, 298 nm±104, 361 nm±110, 339 nm±115, 360 nm±123 i 364 nm±110. Uśrednienie partii dobrze wyszkolonego eksperymentatora daje średnią średnicę 340 nm±25 i średnie odchylenie standardowe wewnątrz partii 110 nm±8. Drugi eksperymentator, przeszkolony przez pierwszego, użył tego samego protokołu do wytworzenia nanocząstek o średniej średnicy 328 nm±138. Jednak trzeci eksperymentator, który przez kilka miesięcy samodzielnie wytwarzał nanocząstki, zastosował ten sam protokół, aby wyprodukować nanocząstki o średniej średnicy 220 nm±70. W ten sposób możliwe jest wytworzenie cząstek o oczekiwanym zakresie średnic, ale zależy to od dokładnego odtworzenia subtelnej techniki eksperymentalnej. Łączenie partii może umożliwić produkcję dużych ilości nanocząstek o identycznych właściwościach kruszywa. Na przykład, gdy modyfikujemy powierzchnię nanocząstek do badań in vitro lub in vivo , wiele (do 6) partii 200 mg jest przygotowywanych, mytych, zbieranych, mieszanych w jednej probówce, a następnie dzielonych w celu modyfikacji powierzchni. Gwarantuje to, że wielkość nanocząstek, obciążenie lekiem, ładunek i frakcja miejsc na powierzchni dostępnych do modyfikacji będą porównywalne między dwiema grupami badanych. W innym przykładzie, jeśli zmienną będącą przedmiotem zainteresowania jest skuteczność leku, w której różne czynniki są ładowane do różnych partii nanocząstek, ważne jest, aby mierzyć i kontrolować zmienność obciążenia leku. Niezwykle ważne jest, aby właściwości cząstek były mierzone dla każdej wyprodukowanej partii cząstek, a eksperymenty miały być projektowane i replikowane w celu kontrolowania zmienności między partiami.
Pełna emulsja fazy organicznej i wodnej ma kluczowe znaczenie dla tworzenia małych cząstek. Poli(alkohol winylowy) (PVA) jest prawdopodobnie najczęściej stosowanym emulgatorem. My i inni zastosowaliśmy różne środki emulgujące i stabilizujące, w tym witaminę E-TPGS9, PVA14, rozpiętości15 i poloksamery16 (dokładne omówienie szerokiej gamy środków stosowanych do produkcji cząstek PLGA znajduje się w przeglądzie Wischke i wsp.17). Odpowiednio zemulgowany polimer pojawi się jako jednorodny, mlecznobiały / nieprzezroczysty roztwór. Słaba (lub "złamana") emulsja będzie wykazywać makroskopową niejednorodność lub ziarnistość, a nawet może rozdzielić się na dwie wizualnie odrębne warstwy w probówce. Na ogół wskazuje to na niepowodzenie w tworzeniu nanocząstek. Emulsja może pęknąć po kroku 1.9, jeśli nie zostanie natychmiast przeniesiona do ultradźwięków. Jeśli tak się stanie, ponownie przekręć wir, aż do uzyskania jednorodności i natychmiast przejdź do sonikatora. Separacja nie powinna następować po etapie sonikacji (1.10). Po rozproszeniu cząstek do większej objętości wodnej (krok 1.11), roztwór powinien być jednolicie nieprzezroczysty lub lekko przezroczysty. Jakość półprzezroczystości będzie rosła wraz ze zmniejszaniem się wielkości cząstek, a w przypadku bardzo małych nanocząstek można zaobserwować niebieski odcień. Ten odcień może nie być obserwowany, jeśli cząsteczki otaczają lek. Jeśli emulsja nie rozproszy się równomiernie w dużej objętości wody lub wydaje się ziarnista, eksperyment nie powinien być kontynuowany. Normalne jest obserwowanie pewnych zmian w wyglądzie granulki cząstek, a także jej spójności. Niektóre granulki mogą ulec ponownemu zawieszeniu po łagodnym wirowaniu, podczas gdy inne mogą wymagać kilku minut sonikacji w kąpieli wodnej. Ponowne zawieszenie nie powinno trwać dłużej niż 5 minut. Liofilizowane cząsteczki mogą przybierać różne tekstury, od przypominających bawełnę po sypkie.
Jedną z wielu zalet PLGA jako materiału nanocząsteczkowego jest możliwość optymalizacji procesu produkcyjnego w celu uzyskania pożądanego rozmiaru cząstki dla zamierzonego zastosowania. Większe nanocząstki będą zawierały większą frakcję leku hydrofobowego (w stosunku do masy polimeru) niż małe nanocząstki, jednak kinetyka uwalniania leku może być również zaburzona18-20. Wielkość nanocząstek ma bezpośredni wpływ na mechanizmy internalizacji cząstek przez komórki, a także na ich rozmieszczenie w tkance, co może skutkować dramatycznymi różnicami w skuteczności dostarczania. Na przykład system fagocytów jednojądrzastych będzie oznaczał i usuwał czynniki w krążeniu ogólnoustrojowym, które są większe niż 1 μm. Małe nanocząstki mogą być interesujące do bezpośredniej infuzji do mózgu, gdzie większe nanocząstki zostałyby uwięzione w ciasnej macierzy zewnątrzkomórkowej; Dostarczanie małych nanocząstek może również ułatwić bierne celowanie w nowotwory dzięki wzmocnionemu efektowi przenikania i zatrzymywania. Skuteczność kapsułkowania leku jest bardzo zróżnicowana, w zależności od właściwości konkretnego leku, wielkości cząsteczki i emulgatora (tj. jego rozpuszczalności w wodzie w porównaniu z rozpuszczalnikiem). Pojedyncza lub podwójna emulsja będzie również miała wpływ na obciążenie lekiem i wielkość nanocząstek. Enkapsulacja środków hydrofobowych za pomocą pojedynczej emulsji może pomóc w produkcji ultramałych nanocząstek w porównaniu z metodą podwójnej emulsji. Kierujemy czytelnika do innych źródeł w celu obszernego omówienia tego tematu23-28. Wreszcie, dostępne są alternatywne metody emulgacji, w tym homogenizacja z dużą prędkością, a te inne podejścia mogą przynieść korzyści dla określonych rodzajów leków lub zastosowań w dostarczaniu leków29.
Metoda pojedynczej emulsji stwarza możliwość zmiany szerokiego zakresu zmiennych formulacji, z których każda jest w stanie zmienić właściwości nanocząstek. Na przykład użycie dichlorometanu (DCM) jako rozpuszczalnika na ogół spowoduje powstanie większych nanocząstek o szerszym rozkładzie wielkości. Ponieważ octan etylu (EtAc) miesza się z wodą, napięcie powierzchniowe kropli polimeru w emulsji pierwotnej ulega zmniejszeniu, co prowadzi do powstania mniejszych nanocząstek. DCM może być zastąpiony tą samą objętością EtAc. Alternatywne rozpuszczalniki lub mieszaniny rozpuszczalników mogą być stosowane w celu optymalizacji kapsułkowania leków i właściwości cząstek. Inne parametry preparatu są również zdolne do zmiany wielkości cząstek: na przykład zwiększenie objętości rozpuszczalnika, stosunku rozpuszczalnika do polimeru, intensywności sonikacji lub prędkości/czasu wirowania spowoduje zmniejszenie wielkości zebranych cząstek. Możliwe jest sortowanie frakcjonowanych cząstek poprzez sekwencyjne wirowanie (np. szybkie wirowanie z niską prędkością w celu usunięcia większych cząstek, a następnie dłuższe wirowanie w celu zebrania bardzo małych cząstek) lub filtrowanie.
W tym miejscu opisano parametry formulacji, które umożliwiają otrzymywanie cząstek PLGA o średnich średnicach w zakresie od 220 nm do 1,98 μm. Te metody wytwarzania cząstek składających się z PLGA mogą być wykorzystane do optymalizacji projektowania cząstek (rozmiar, enkapsulant i właściwości powierzchni) do przyszłego zastosowania w dostarczaniu leków in vitro lub in vivo.

Polimery stały się coraz bardziej popularnymi środkami dostarczania leków w ciągu ostatnich kilkudziesięciu lat do zastosowań od celowanej terapii nowotworów1 do modulacji układu odpornościowego2. Leki kapsułkowane lub sprzężone z polimerami są często bardziej skuteczne niż ich swobodnie dostarczane odpowiedniki, ponieważ leki związane z polimerami są chronione przed degradacją. Ochrona ta przekłada się na dłuższy biologiczny okres półtrwania i potencjalnie lepszą skuteczność przy zmniejszeniu ogólnoustrojowych skutków ubocznych3-5.
Poli(kwas mlekowo-ko-glikolowy) (PLGA) wykazuje wiele idealnych właściwości nanoskalowego systemu dostarczania, zapewniając długotrwałe uwalnianie kapsułkowanego środka i rozkładając go do biokompatybilnych produktów kwasu mlekowego i glikolowego. Małe cząsteczki, białka i kwasy nukleinowe, które są zamknięte w PLGA, wykazały zwiększoną aktywność w różnych zastosowaniach chorobowych8. Co ważne, platforma materiałowa ułatwia łatwe dostosowywanie takich funkcji, jak rozmiar, ładunek i wyświetlanie powierzchni ligandów w celu kierowania cząstek do określonych tkanek lub do celów obrazowania. Ponieważ PLGA jest już stosowana u ludzi w postaci biodegradowalnych szwów (np. Purasorb, Purac Biomaterials i Vicryl, Ethicon Inc.), potencjał translacji klinicznej jest wysoki.
Emulsja olejowo-wodna (pojedyncza) lub woda-olej-woda (podwójna) to jedna z metod, dzięki której PLGA może być używana do kapsułkowania leków hydrofobowych i hydrofilowych w formie mikro- lub nanoskali. Krótko mówiąc, PLGA rozpuszcza się w fazie organicznej (oleju), która jest emulgowana ze środkiem powierzchniowo czynnym lub stabilizatorem (wodą). Leki hydrofobowe są dodawane bezpośrednio do fazy olejowej, podczas gdy leki hydrofilowe (woda) mogą być najpierw emulgowane z roztworem polimeru przed utworzeniem cząstek. Wybuchy sonikacji o wysokiej intensywności ułatwiają tworzenie się małych kropel polimeru. Powstałą emulsję dodaje się do większej fazy wodnej i miesza przez kilka godzin, co pozwala na odparowanie rozpuszczalnika. Utwardzone nanocząstki zbiera się i przemywa przez odwirowanie (ryc. 1).
Tutaj opisujemy technikę wytwarzania nanocząstek PLGA za pomocą pojedynczej i podwójnej emulsji, z octanem etylu (EtAc) jako rozpuszczalnikiem i witaminą E-D-α-tokoferolu bursztynianem glikolu polietylenowego (TPGS) jako środkiem emulgującym. Zastosowanie witaminy E-TPGS ma kilka możliwych zalet w porównaniu z innymi rodzajami środków stabilizujących (np. poli(alkohol winylowy), PVA), w tym lepszą wydajność emulgowania i kapsułkowania. Inne grupy zgłosiły zalety witaminy E-TPGS, w tym hamowanie P-gp, transbłonowego białka wypływu, które jest często nadmiernie eksprymowane na komórkach rakowych i wiadomo, że przyczynia się do oporności na leki poprzez transport leków z komórek docelowych. Dodatkowo pokazujemy, jak scharakteryzować i zwymiarować cząstki za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) i udzielamy dalszych wskazówek dotyczących modyfikacji rozmiaru poprzez zmianę protokołu.

<table><tbody><tr><td>Kopolimer kwasu mlekowego i glikolowego (PLGA)&amp;nbsp; (PLGA)</td><td><a href="http://www.absorbables.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Lactel</a></td><td>B6010-2P</td><td>Lepkość właściwa: 0,55-0,75 dl/g</td></tr><tr><td>Octan etylu (EtAc)</td><td>Sigma</td><td>270989</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek metylenu (DCM)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TPGS witaminy E</td><td>Sigma</td><td>57668</td><td></td></tr><tr><td>Poly(alkohol winylowy)</td><td></td><td></td><td>87–89% hydrolizowane, 30 000–70 000 Da</td></tr><tr><td>Sprzęt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soniczne urządzenie do rozdrabniania</td><td>Fisher Scientific</td><td>Model 705</td><td>700 W (ultrasonikator)</td></tr><tr><td>Końcówka sonikatora</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>1/8 cala</td></tr><tr><td>Mieszalnik wiertakowy (Vortexer)</td><td>VWR</td><td>58816-121</td><td></td></tr><tr><td>Mieszadło wielomiejscowe</td><td>Corning</td><td>MP5I</td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka</td><td>Beckman-Coulter</td><td>L8-80M</td><td></td></tr><tr><td>Rotor z kątem stałym</td><td>Beckman-Coulter</td><td>50.2TI</td><td></td></tr><tr><td>Sonikator w kąpieli wodnej</td><td>Fisher Scientific</td><td>FS30</td><td></td></tr><tr><td>Liofilizator</td><td>Millrock</td><td>BT85</td><td></td></tr></tbody></table>

nanocząstki plga utworzone przez pojedynczą lub podwójną emulsję z witaminą e-tpgs

PLGA Nanoparticles Formed by Single- or Double-emulsion with Vitamin E-TPGS

Poli(kwas mlekowo-ko-glikolowy) (PLGA) jest biokompatybilnym członkiem rodziny alifatycznych polimerów poliestrowych biodegradowalnych. PLGA od dawna jest popularnym wyborem do zastosowań związanych z dostarczaniem leków, zwłaszcza że jest już zatwierdzony przez FDA do stosowania u ludzi w postaci szwów resorbowalnych. Leki hydrofobowe i hydrofilowe są kapsułkowane w cząsteczkach PLGA za pomocą pojedynczej lub podwójnej emulsji. Krótko mówiąc, lek rozpuszcza się w polimerze lub emulguje polimerem w fazie organicznej, która jest następnie emulgowana z fazą wodną. Po odparowaniu rozpuszczalnika cząstki są myte i zbierane przez wirowanie w celu liofilizacji i długotrwałego przechowywania. PLGA ulega powolnej degradacji w wyniku hydrolizy w środowisku wodnym, a zamknięte w kapsułkach środki są uwalniane w ciągu kilku tygodni do miesięcy. Chociaż PLGA jest materiałem, który ma wiele zalet w dostarczaniu leków, powtarzalne tworzenie nanocząstek może być trudne; Znaczna zmienność wynika z zastosowania różnego rodzaju sprzętu, partii odczynników i precyzyjnej metody emulgacji. W tym miejscu bardzo szczegółowo opisujemy powstawanie i charakterystykę mikrocząstek i nanocząstek powstałych w wyniku pojedynczej lub podwójnej emulsji przy użyciu środka emulgującego witamina E-TPGS. Morfologię i wielkość cząstek określa się za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM). Dostarczamy reprezentatywne obrazy SEM dla nanocząstek wytworzonych o różnym stężeniu emulgatora, a także przykłady artefaktów obrazowania i nieudanych emulgacji. Protokół ten można łatwo dostosować do stosowania alternatywnych emulgatorów (np. poli(alkohol winylowy), PVA) lub rozpuszczalników (np. dichlorometan, DCM).

Reprezentatywne obrazy SEM mikrocząsteczek i nanocząsteczek PLGA przygotowanych zgodnie z tym protokołem przedstawiono na rycinach 2a oraz 2b. Cząsteczki będą widoczne jako pojedyncze, niespojone sfery o gładkiej morfologii powierzchni i szerokim zakresie rozmiarów rozłożonych w całej próbce.
Aby wyznaczyć średnicę średnią każdej partii, dokonuje się pomiarów bezpośrednio na obrazach SEM, korzystając z funkcji „measure” w programie ImageJ. W celu uzyskania reprezentatywnego rozkładu wielkości należy wykonać minimum 150 pomiarów średnicy cząstek wybranych losowo z pola widzenia. Średni rozmiar partii cząstek zależy od parametrów formulacji. Na przykład na Rycynie 2a, mikrocząstki (średnica średnia 730 nm±370) powstały przy zastosowaniu 1 ml rozpuszczalnika na 100 mg PLGA, z wykorzystaniem 0,05% Vitamin E-TPGS w fazie emulgującej, podczas gdy na Rycynie 2b, nanocząstki (średnica średnia 340 nm±70) powstały przy zastosowaniu 4 ml rozpuszczalnika na 200 mg PLGA, z enkapsulacją hydrofobowego leku kamptotecyny i wykorzystaniem 0,3% Vitamin E-TPGS w fazie emulgującej (pełne parametry formulacji opisano w podpisie pod rycinią). Ogólnie rzecz biorąc, wyższe stężenie emulgatora prowadzi do powstania mniejszych cząstek, przy czym średnice średnie w zakresie 220-2 000 nm są osiągalne poprzez zmianę stężenia emulgatora w przedziale 0,3-0,01% (Rycina 3).
Nasze wydajności wynoszą od 74-98% (22 serie nanocząsteczek z różnymi rozpuszczalnikami, emulgatorami i warunkami emulgowania, przygotowane przez jednego eksperymentatora). Wyższe wydajności mogą być obserwowane w przypadku większych serii (&gt;150 nm), ponieważ małe nanocząsteczki są łatwo tracone podczas wirowania i etapu płukania, szczególnie gdy nadsącz z płukania jest odlewany od osadu. Ostrożne pipetowanie cieczy może pomóc uniknąć tego problemu. Wyższe prędkości i/lub dłuższe wirowanie mogą również zwiększyć wydajność, zarówno poprzez usprawnienie zbierania ultra-małej frakcji nanocząsteczek, jak i poprzez lepsze zagęszczenie osadu, co zmniejsza straty w etapie płukania. Protokół opisany tutaj koncentruje się na produkcji cząsteczek z TPGS jako środkiem emulgującym i EtAc jako rozpuszczalnikiem, jednak możliwe jest zastosowanie alternatywnych rozpuszczalników i/lub środków emulgujących. Generalnie stwierdziliśmy, że EtAc pozwala uzyskać mniejsze i bardziej jednorodnie rozmiarowane nanocząsteczki niż DCM (np. średnice 540 nm±190 w porównaniu do 2,160 nm±1,530 dla EtAc względem DCM, 100 mg/ml PLGA w rozpuszczalniku, zemulgowane w 2 ml 0,1% TPGS), prawdopodobnie dlatego, że EtAc jest mieszalny z wodą, podczas gdy DCM nie jest. PVA jest popularnym środkiem emulgującym, który był szeroko stosowany przez nas i inne grupy. Zaobserwowaliśmy zmienność nanocząsteczek przygotowanych z różnych serii komercyjnie dostępnego PVA. Zaleca się zatem, w miarę możliwości, korzystanie z tego samego zapasu PVA w celu poprawy powtarzalności. W naszych badaniach stwierdziliśmy, że PVA jest skuteczniejszym emulgatorem przy znacznie wyższych stężeniach niż TPGS (np. średnica 140 nm±48, 100 mg/ml PLGA w DCM, zemulgowane w 2 ml 5% PVA).
Charakteryzacja nanocząsteczek za pomocą SEM może być trudna ze względu na różnice w sprzęcie i procesie obrazowania. Ważne jest zatem odróżnienie cech morfologicznych wskazujących na problemy z formowaniem cząsteczek od artefaktów wprowadzonych nieumyślnie podczas obrazowania. Na obrazach SEM czasem obserwuje się zlewanie się (Rycina 4a i 4b), wgłębienia (Rycina 4c) lub pękanie (Rycina 4f) cząsteczek. Artefakty te mogą czasami wskazywać na źle uformowane cząsteczki (np. na Rycynie 4a stężenie emulgatora było zbyt wysokie, aby utworzyły się dyskretne cząsteczki), ale mogą również wynikać z artefaktów wprowadzonych przez metodę charakteryzacji (np. na Rycynie 4b próbka nagrzała się podczas napylania, a na Rycynie 4c lokalne nagrzewanie wiązką SEM zmieniło morfologię powierzchni cząsteczek podczas obrazowania). Aby uniknąć artefaktów obrazowania, czas napylania powinien być zminimalizowany, a moc wiązki utrzymana na niskim poziomie. Przy dłuższym czasie napylania obserwuje się gładszą morfologię, jednak może to prowadzić do zlewania się cząsteczek. Zbyt krótkie czasy napylania mogą utrudnić obrazowanie, ponieważ cząsteczki mogą ulec naładowaniu i przemieszczać się podczas przechwytywania obrazu. Szybkie wykonywanie zdjęć pomaga uniknąć przedłużonej ekspozycji na wiązkę i zniekształceń obrazów (Ryciny 4d i 4e). Wysoka ekspozycja na wiązkę może również prowadzić do rozszerzania i pękania powierzchni nanocząsteczek (Rycina 4f). Jeśli artefaktów morfologicznych nie można zminimalizować poprzez zmianę parametrów charakteryzacji, istnieje prawdopodobieństwo, że reprezentują one rzeczywiste problemy z samymi nanocząsteczkami. Podczas procesu wytwarzania zlewanie się może wynikać z przegrzania spowodowanego wysoką mocą ultradźwięków, niepełnego odparowania rozpuszczalnika, niepełnego resuspensionowania podczas fazy płukania lub nieudanej liofilizacji.
<img alt="Proces rozdzielania oleju i wody; sonikacja, odparowanie, zbieranie; schemat liofilizacji." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51015/51015fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51015/51015fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Schemat wytwarzania nanocząsteczek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51015/51015fig1highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz</a>.
<img alt="Struktura nanocząsteczek (SEM) i rozkład wielkości (μm, nm), wykres analizy porównawczej." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51015/51015fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51015/51015fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Obrazy SEM i odpowiadające im rozkłady wielkości mikrocząsteczek i nanocząsteczek PLGA otrzymanych metodą pojedynczej emulsji. W (A) cząstki utworzono poprzez emulgowanie 100 mg PLGA rozpuszczonego w 1ml octanu etylu w 2 ml 0,05% Vitamin E-TPGS, a następnie utwardzono w 45 ml 0,01% Vitamin E-TPGS. Odpowiadający im rozkład wielkości przedstawiono w (C). W (B) cząstki utworzono poprzez emulgowanie 200 mg PLGA i 40mg kamptotecyny rozpuszczonych w 4mL octanu etylu w 4 ml 0,3% Vitamin E-TPGS, a następnie utwardzono w 90 ml 0,3% Vitamin E-TPGS. Odpowiadający im rozkład wielkości przedstawiono w (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51015/51015fig2highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz</a>.
<img alt="Analiza wielkości cząstek; wykres słupkowy i obrazy SEM przedstawiają wpływ % TPGS na wielkość mikrosfer." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51015/51015fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51015/51015fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Wielkość cząstek zależy od stężenia emulgatora. Zwiększenie stężenia Vitamin E-TPGS doprowadziło do powstania mniejszych nanocząstek. Przedstawiono średnice oraz odpowiadające im obrazy SEM cząstek otrzymanych poprzez emulgowanie 100 mg PLGA rozpuszczonego w 1 ml octanu etylu w (A) 0,01%, (B) 0,05%, (C) 0,1% lub (D) 0,3% Vitamin E-TPGS i utwardzanie w 45 ml 0,3% Vitamin E-TPGS. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe z 200 pomiarów średnic wykonanych na 2 obrazach z jednej partii. Pasek skali reprezentuje 5 μm (A-C) oraz 200 nm (D).<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51015/51015fig3highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz</a>.
<img alt="Mikrografia SEM przedstawiająca morfologię i agregację cząstek. Analiza mikrostruktury proszku." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51015/51015fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51015/51015fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Artefakty morfologii powierzchni zaobserwowane w SEM. W (A) w całej próbce występowało silne zlewanie się i struktury przypominające arkusze. Stężenie Vitamin E-TPGS było zbyt wysokie (1%), aby utworzyły się oddzielne cząstki. W (B) niektóre obszary próbki były zlane, jednak występowały duże skupiska oddzielnych nanocząstek, szczególnie tam, gdzie występowały przerwy w napylaniu warstwy przewodzącej. Uważamy, że artefakty zlewania się wynikają z nagrzewania podczas procesu napylania. W (C) cząstki początkowo wydawały się gładkie, jednak długotrwała ekspozycja próbki na wiązkę SEM doprowadziła do powstania wgłębień i pofałdowań. (D) przedstawia obraz o niskiej rozdzielczości, zarejestrowany przy minimalnej ekspozycji próbki na wiązkę SEM; cząstki wydają się gładkie i mają okrągłą morfologię. W (E) ta sama próbka jest eksponowana przez dłuższy czas, co powoduje wyraźne zniekształcenie ich pierwotnej morfologii. W (F) długa ekspozycja na wiązkę przy wysokim ustawieniu napięcia (12 kV) spowodowała nagrzewanie i pękanie cząstek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51015/51015fig4highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz</a>.

Opisujemy produkcję i charakterystykę nanocząsteczek i mikrocząsteczek składających się z poli(kwasu mlekowo-ko-glikolowego) przy użyciu witaminy E-TPGS jako emulgatora. Dzięki różnicowaniu parametrów formulacji, takich jak stężenie emulgatora, możliwe jest wytworzenie nanocząstek o średnich średnicach w zakresie od 220 nm do 1,98 μm.

Nanocząstki PLGA utworzone przez pojedynczą lub podwójną emulsję z witaminą E-TPGS

Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) is a biocompatible member of the aliphatic polyester family of biodegradable polymers. PLGA has long been a popular ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest utworzenie nanocząsteczek polimerowych o regulowanej wielkości. Osiąga się to poprzez uprzednie rozpuszczenie polimeru w rozpuszczalniku organicznym i dodanie leku lub fluorescencyjnego substancji inkapsulowanej. Drugim krokiem jest emulsyfikacja polimeru z fazą wodną zawierającą środek emulgujący, a następnie umożliwienie utwardzenia cząsteczek w większej objętości wodnej w miarę odparowywania rozpuszczalnika.Następnie cząstki są przemywane, zbierane poprzez wirowanie i liofilizowane w celu długoterminowego przechowywania. Ostatnim etapem jest charakterystyka rozmiaru i morfologii powierzchni nanocząstek za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej lub obrazowania SEM. Ostatecznie metoda SEM służy do wykazania, że rozmiar nanocząstek można kontrolować poprzez zmianę stężenia emulgatora.Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię wielu ludzkich schorzeń, ponieważ cząsteczki mogą być dostosowane do enkapsulacji i dostarczania szerokiej gamy czynników terapeutycznych w celu zapewnienia długotrwałego działania w tkance docelowej. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa.Etapy emulgowania są trudne do opanowania, ponieważ subtelne aspekty tworzenia emulsji mogą mieć znaczący wpływ na właściwości cząstek. Aby rozpocząć przygotowanie nanocząstek, należy umieścić około 100 mg kopolimeru kwasu polimlekowego i glikolowego, znanego również jako PLGA, w probówce o wymiarach 13 × 100 mm. Następnie, używając szklanej pipety serologicznej, należy przenieść 1 mL octanu etylu do próbki, przykryć górną część probówki folią aluminiową, a następnie szczelnie zabezpieczyć folię za pomocą parafilmu.Należy szczelnie owinąć parafilm wokół górnej krawędzi fiolki i dolnej krawędzi folii, aby zapobiec odparowaniu rozpuszczalnika. Zaznaczyć poziom rozpuszczalnika na probówce i pozostawić polimer do rozpuszczenia przez noc. Następnego dnia, w przypadku odparowania, dodać dodatkową ilość rozpuszczalnika.Przygotuj następujący sprzęt i materiały w dygestorium w pobliżu myjki ultradźwiękowej: wirówkę typu vortex, dwie małe szklane pipety Pasteura z gumowymi gruszkami oraz mieszadło magnetyczne. Dodatkowo ustaw na statywie pod myjką ultradźwiękową duży zlew z wodą z lodem.Następnie dodaj 45 ml 0,3% w/v witaminy E-T-P-G-S do 200 ml szklanego becherka i ustaw prędkość mieszania na 360 RPM. Następnie dodaj 2 ml 0,3% w/v witaminy E-T-P-G-S do szklanej probówki o wymiarach 13 x 100 mm. Aby wymieszać czynniki hydrofobowe, dodaj substancję enkapsulującą bezpośrednio do roztworu polimeru, uważając, aby nie dopuścić do kontaktu ze ściankami probówki, a następnie wortexuj probówkę aż do homogenicznego rozproszenia substancji enkapsulującej.W przypadku substancji hydrofilowych należy zemulgować substancję zamykaną z roztworem polimeru. Do powierzchni roztworu polimeru dodać do 50 µL leku w buforze. Mieszaninę poddać sonikacji w lodzie przez około 10 sekund lub do momentu, aż roztwór stanie się nieprzezroczysty i jednorodny.Następnie, trzymając probówkę pionowo, wymieszaj zawartość probówki z witaminą E-T-P-G-S za pomocą wiertarki laboratoryjnej (vortexa) na wysokich obrotach. Utrzymuj szklaną pipetę pasteuryzacyjną jeden do dwóch centymetrów nad górną krawędzią mieszanej probówki i powoli dodawaj roztwór polimeru kroplami na powierzchnię cieczy w probówce. Należy uważać, aby pipeta nie dotknęła ścianek probówki, aż do momentu dodania całego roztworu polimeru.Kontynuuj mieszanie roztworu w wirówce. Teraz twórz emulsję przez 15 sekund. Bezzwłocznie przenieś zemulgowany polimer do sonikatora.Probówkę należy utrzymać w kąpieli wodno-lodowej i poddać emulsję sonikacji w trzech dziesięciosekundowych cyklach. Emulsję należy przesuwać w górę i w dół wzdłuż sondy, aby zapewnić równomierną sonikację, unikając jednocześnie dotykania ścianek lub dna probówki. Między każdym dziesięciosekundowym cyklem sonikacji należy zastosować przerwę trwającą od 5 do 10 s, aby roztwór mógł ostygnąć przed kontynuacją.Następnie do emulsji należy dodać od jednego do dwóch mililitrów 0,3% vitamin E-T-P-G-S z roztworu mieszanego. Pozwoli to rozrzedzić zemulgowany polimer, ułatwiając jego wylewanie; następnie należy przelać emulsję do roztworu mieszanego. Pozostałości roztworu z probówki należy wypłukać do roztworu mieszanego.Pozostaw nanocząstki do utwardzenia, mieszając je przez trzy godziny. Jeśli substancja otaczająca jest światłoczuła, owiń zlewkę folią aluminiową, pozostawiając górę otwartą, aby ułatwić odparowanie rozpuszczalnika. Aby zebrać nanocząstki, należy rozpocząć od rozdzielenia zawiesiny nanocząstek do dwóch probówek wirówkowych Oak Ridge o nominalnej objętości 30 ml i zrównoważyć je z dokładnością do 0,1 g. Następnie nanocząstki należy wirować w rotorze z kątem stałym przez 15 minut przy 17 000.RC f. Dłuższy czas wirowania pozwoli na zebranie większej frakcji mniejszych nanocząsteczek. Odlej nadsącz, uważając, aby nie naruszyć osadu z nanocząsteczek.Dodać 5 ml wody destylowanej, a następnie użyć łaźni wodnej, sonikatora i wortexa, aby całkowicie zawiesić nanocząstki. Przenieść zawartość obu probówek wirówkowych do jednej i dodać 20 ml wody destylowanej, aby uzyskać objętość całkowitą 30 ml. Następnie powtórzyć etapy wirowania i przemywania jeszcze dwa razy, tak aby łącznie przeprowadzić trzy przemycia.Objętość cieczy w ostatniej zawiesinie resuspendowanego osadu powinna wynosić od 4 do 5 ml. Zamroź niewielką alikwot nanocząsteczek wolnych od telos do obrazowania SEM, oddzielnie od pozostałej części. Dodaj TLO w stosunku wagowym od 1:2 do polimeru jako krioprotektant, aby uzyskać jednorodną i pełną resuspendowaną zawiesinę nanocząsteczek PLGA.Zapobiegnie to tworzeniu się kryształków lodu, które mogłyby uszkodzić powierzchnię cząstek i wywołać agregację. Przenieś nanocząstki do wcześniej zważonej probówki wirówkowej o pojemności 5 ml, a następnie zamroź w temperaturze -80 °C przez co najmniej 30 minut. Następnie otwórz probówkę i zakryj jej wierzch, mocując ręcznik papierowy za pomocą gumki recepturki.Należy działać szybko, aby zawartość nie roztopiła się, jeśli dojdzie do procesu topnienia. Zamrozić ponownie przed umieszczeniem w liofilizatorze, a następnie liofilizować próbkę o objętości 5 mL przez 72 godziny. Następnie zakręcić nakrętkę, owinąć probówkę i przechowywać liofilizat w temperaturze -80 °C.W dniu obrazowania naklej pasek dwustronnej taśmy węglowej na stub do SEM. Oznacz metalową część stuba permanentnym markerem w celu późniejszej identyfikacji. Używając metalnej szpatułki, pobierz niewielką ilość liofilizowanych nanocząsteczek i delikatnie rozprowadź je na powierzchni taśmy.Przetrzyj powierzchnię stubu chusteczką laboratoryjną lub użyj sprężonego powietrza, aby usunąć luźne nanocząsteczki. Wizualizuj cząsteczki, stosując odległość roboczą wiązki od 5 do 15 mm, napięcie od 5 do 12 kV oraz rozmiar plamki od 1 do 3; wyższe natężenia wiązki mogą spowodować regionalne nagrzanie próbki, co zmieni morfologię powierzchni cząsteczek. Mikrocząsteczki obserwuje się przy powiększeniu 100-krotnym, natomiast nanocząsteczki będą rozróżnialne przy powiększeniu 3000-krotnym.Ustawienie powiększenia i ostrość na górnej części sfery w celu zlokalizowania cząstek, które można łatwo zobrazować za pomocą SEM; należy zebrać co najmniej trzy obrazy z każdej serii, aby uzyskać reprezentatywną próbkę wielkości i morfologii cząstek. Stosując tę metodę, można wytworzyć cząstki poprzez pojedynczą emulsję, które występują jako oddzielne, niespoone sfery o gładkiej morfologii powierzchni i szerokim zakresie rozmiarów rozłożonych w całej próbce. Przedstawione tutaj mikrocząstki mają średnicę średnią 730 nanometrów.Przedstawiono tutaj nanocząstki stworzone za pomocą pojedynczej emulsji, które enkapsulują hydrofobowy lek campin. Cząstki te okazały się jeszcze mniejsze, osiągając średnicę średnią 340 nanometrów. Wyższe stężenia emulgatora prowadziły do powstania mniejszych cząstek, których średnice średnie zmniejszały się z 2000 do 200 nanometrów.Wraz ze wzrostem stężenia emulgatora od 0,01 do 0,3%, co obrazują przedstawione tutaj zdjęcia SEM. Jednakże, gdy stężenie witaminy E-T-P-G-S było zbyt wysokie, przy zastosowaniu 1% witaminy E-T-P-G-S nie tworzyły się oddzielne cząstki, a w całej strukturze stwierdzono obecność intensywnego zlewania się elementów i struktur przypominających blaszki. Prawda. Po opanowaniu metody wytwarzania nanocząsteczek PLG poprzez emulgowanie, można zastosować inne metody, takie jak modyfikacja powierzchni, w celu zaprojektowania nanocząsteczek zdolnych do oddziaływania ze specyficznymi typami komórek lub obszarami organizmu.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tworzenia cząsteczek o powtarzalnym i regulowanym rozmiarze metodą emulsyfikacji.

plga-nanoparticles-formed-single-or-double-emulsion-with-vitamin-e

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Nanocząstki PLGA uformowane przez pojedynczą lub podwójną emulsję z witaminą E-TPGS

Insonacja mikropęcherzyków jest obiecującą strategią ablacji guzów przy zredukowanej średniej mocy akustycznej, a także ukierunkowanego dostarczania leków. Celem niniejszego badania jest opracowanie strategii impulsowania ultradźwiękami o niskim cyklu pracy oraz nanonośników w celu maksymalizacji nietermicznej ablacji mikro naczyniowej i dostarczania ładunku do podskórnych glejaków C6.

Porównanie ukierunkowanego leczenia glejaków u myszy z wykorzystaniem ultradźwięków poprzez dostarczanie nanocząsteczek z lekiem oraz ablację mikro naczyniową

Niniejszy artykuł opisuje metodę nanoprecypitacji do syntezy nanocząsteczek polimerowych z wykorzystaniem kopolimerów diblokowych. Omówimy syntezę kopolimerów diblokowych, technikę nanoprecypitacji oraz potencjalne zastosowania.

Formułowanie diblokowych nanocząstek polimerowych za pomocą techniki nanoprecypitacji

Źródło: Zhu, J., et al., Przygotowanie i charakterystyka nowych nanocząstek naśladujących HDL do enkapsulacji czynnika wzrostu nerwów. J. Vis. Exp. (2017)Ten film pokazuje stopniowe składanie nanocząstek naśladujących HDL obciążonych NGF przy użyciu enkapsulacji wspomaganej protaminą i samoorganizacji opartej na lipidach w potencjalnych zastosowaniach neurotroficznych.

Kapsułkowanie czynnika wzrostu nerwów w nanocząstkach naśladujących lipoproteiny o dużej gęstości

Celem tego protokołu jest opisanie przygotowania i charakterystyki fizycznie uwięzionych, słabo rozpuszczalnych w wodzie leków w systemach dostarczania leków micelarnych składających się z amfifilowych kopolimerów blokowych.

Przygotowanie i charakterystyka pojedynczych i wielolekowych, fizycznie uwięzionych miceli polimerowych

Prosta homogenizacja została wykorzystana do przygotowania nowatorskich, wysokiej gęstości, naśladujących lipoproteiny nanocząsteczek do enkapsulacji czynnika wzrostu nerwów. W artykule opisano wyzwania, szczegółowe protokoły przygotowania nanocząstek, charakterystyki in vitro oraz badań in vivo.

Przygotowanie i charakterystyka nowych nanocząstek naśladujących HDL do enkapsulacji czynnika wzrostu nerwów

Tutaj prezentujemy protokół syntezy łożyskowych nanocząstek lipidowo-polimerowych skojarzonych z peptydem wiążącym siarczan chondroityny A (plCSA-BP) za pomocą jednoetapowej techniki sonikacji i biokoniugatu. Cząstki te stanowią nowatorskie narzędzie do ukierunkowanego dostarczania leków do większości ludzkich nowotworów i trofoblastów łożyska w leczeniu nowotworów i zaburzeń łożyska.

Synteza i charakterystyka nanocząstek lipidowo-polimerowych siarczanu chondroityny A (plCSA) ukierunkowanych na łożysko

Flash NanoPrecipitation (FNP) to skalowalne podejście do produkcji polimerowych nanocząstek typu rdzeń-powłoka. Opisano preparaty na skalę laboratoryjną do kapsułkowania terapii hydrofobowych lub hydrofilowych.

Nanoprecypitacja błyskawiczna do enkapsulacji związków hydrofobowych i hydrofilowych w nanocząstkach polimerowych

To badanie opisuje klasyczną hydratację przy użyciu metody cienkiego filmu lipidowego do przygotowania nanoliposomów, a następnie charakterystyki nanocząstek. Hydrofilowe i globularne białko o masie 47 kDa, taryna, jest z powodzeniem kapsułkowane jako strategia poprawiająca stabilność, unikająca szybkiego klirensu i promująca kontrolowane uwalnianie. Metoda może być dostosowana do enkapsulacji cząsteczek hydrofobowych.

Otrzymywanie i charakterystyka nanoliposomów do uwięzienia bioaktywnych hydrofilowych białek kulistych

Nanocząsteczki lipidowe są opracowywane przy użyciu mikroprzepływowej platformy mieszania do enkapsulacji mRNA i DNA.

Formułowanie i charakteryzowanie nanocząstek lipidowych do dostarczania genów przy użyciu platformy mieszania mikroprzepływowego

Ten protokół opisuje syntezę i formułowanie wstrzykiwalnych, supramolekularnych biomateriałów hydrożelowych polimerowo-nanocząsteczkowych (PNP). Przedstawiono zastosowania tych materiałów do dostarczania leków, stabilizacji biofarmaceutycznej oraz enkapsulacji i dostarczania komórek.

Supramolekularne hydrożele polimerowo-nanocząsteczkowe do wstrzykiwań do zastosowań w dostarczaniu komórek i leków

Aby racjonalnie zaprojektować skuteczne adiuwanty, opracowaliśmy emulsję Pickeringa stabilizowaną nanocząstkami kwasu poli-mlekowo-glikolowego (PNPE). PNPE posiadał wyjątkową miękkość i hydrofobowy interfejs zapewniający silny kontakt komórkowy i oferował ładowanie antygenem o wysokiej zawartości, poprawiając powinowactwo komórkowe systemu dostarczania do komórek prezentujących antygen i indukując wydajną internalizację antygenów.

Powinowactwo komórkowe emulsji stabilizowanej cząstkami w celu zwiększenia internalizacji antygenu

Poznaj metodę emulgacji do produkcji nanocząstek PLGA o regulowanym rozmiarze z witaminą E-TPGS jako emulgator. Technika ta umożliwia kontrolę wielkości cząstek od 220 nm do 1,98 µm poprzez zmianę stężenia emulgatora.

Nanocząstki PLGA utworzone przez pojedynczą lub podwójną emulsję z witaminą E-TPGS

Przeglądaj więcej filmów