Name: Długotrwałe przewlekłe zakażenie dróg oddechowych Pseudomonas aeruginosa u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-17T17:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 43 s
Description: Poznaj metodę kulek agarowych do wywoływania przewlekłych zakażeń Pseudomonas aeruginosa u myszy. Technika zapewnia stabilną obecność bakterii przez miesiąc, umożliwiając badanie patogenezy i testowanie terapii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Badania w laboratorium Bragonziego zostały sfinansowane przez Włoską Fundację Mukowiscydozy (CFaCore) oraz EU-F7-2009-223670. Część tych prac została wykonana w zaawansowanym laboratorium mikroskopowym ALEMBIC, a histopatologia myszy została wykonana w Zakładzie Anatomii Patologicznej (Instytut Naukowy San Raffaele).

1. Przygotowanie bakterii do infekcji przewlekłej (na trzy i dwa dni przed zakażeniem myszy)
<ol>
	<li>Wybierz odpowiedni szczep P. aeruginosa do badania.</li>
	<li>Zaszczep pętlą P. aeruginosa z kultury przechowywanej w -80 °C na płytkę z agarem sojowo-tryptykowym (TSA) i inkubuj w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
	<li>Wybierz pojedynczą kolonię i zaszczep ją do 5 ml bulionu sojowo-tryptykowego (TSB) w probówce z zakrętką typu snap o pojemności 15 ml, a następnie inkubuj w temperaturze 37 °C przez noc w inkubatorze wytrząsającym przy 200 rpm.</li>
</ol>
2. Osadzanie bakterii w kuleczkach agarowych do zakażeń przewlekłych (na jeden dzień przed zakażeniem)
<ol>
	<li>Pobrać niewielką alikwot kultur bakterii z inkubacji nocnej, rozcieńczyć 1:50 w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) i zmierzyć gęstość optyczną (OD) przy 600 nm.</li>
	<li>Rozcieńczyć nocną kulturę bakterii, dodając 2 OD do nowej probówki z zakrętką typu snap, zawierającej 20 ml świeżego TSB.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C przez około 3-4 h do osiągnięcia fazy logarytmicznej w inkubatorze wytrząsowym przy 200 rpm, aż do uzyskania całkowitego OD na poziomie 10-15.</li>
	<li>W międzyczasie przygotować TSA, składające się z TSB z 1,5% agarem, wysterylizować w autoklawie i doprowadzić do temperatury 50 °C w kąpieli wodnej. Doprowadzić 150 ml wcześniej wysterylizowanego w autoklawie ciężkiego oleju mineralnego w kolbie Erlenmeyera do temperatury 50 °C w kąpieli wodnej.</li>
	<li>Gdy P. aeruginosa osiągnie fazę logarytmiczną, zebrać komórki bakteryjne poprzez wirowanie przy 2 700 x g przez 15 min w 4 °C i usunąć nadsącz.</li>
	<li>Resuspender osad bakteryjny w 1 ml sterylnego PBS i dokładnie wymieszać na wortexie, aby całkowicie resuspender osad.</li>
	<li>Wymieszać 1 ml zawiesiny bakteryjnej z 9 ml ciekłego TSA, wcześniej doprowadzonego do temperatury 50 °C.</li>
	<li>Dodać 10 ml mieszaniny TSA-P. aeruginosa do ciężkiego oleju mineralnego (wcześniej podgrzanego do 50 °C) i natychmiast mieszać przez 6 min w temperaturze pokojowej. Mieszanie musi wywołać widoczny wir w oleju.</li>
	<li>Schłodzić mieszaninę do 4 °C, mieszając z minimalną prędkością przez 35 min (Rycina 1).</li>
	<li>Pozostawić mieszaninę agar-beads-olej na lodzie przez dodatkowe 20 min.</li>
	<li>Przenieść kuleczki agarowe (agar-beads) do probówek Falcon 50 ml i wirować przy 2 700 x g przez 15 min w 4 °C.</li>
	<li>Precyzyjnie usunąć olej mineralny i przemyć sterylnym PBS sześć razy, zgodnie z opisem w kroku 2.11. Po trzech przemyciach kuleczki można osadzać grawitacyjnie zamiast przy użyciu wirówki. Po ostatnim przemyciu resuspender kuleczki agarowe w 20-30 ml PBS.</li>
	<li>Pobrać alikwot kuleczek (około 0,5 ml) i homogenizować aseptycznie.</li>
	<li>Pobrać 100 µl homogenizowanych kuleczek i rozcieńczyć w 900 µl sterylnego PBS. Wykonać rozcieńczenia seryjne 1:10 aż do 10-6.</li>
	<li>Wykonać posiew rozcieńczeń seryjnych na płytki TSA, wliczając próbkę nierozcieńczoną oraz rozcieńczenia do 10-6, i inkubować płytki w 37 °C.</li>
	<li>Zmierzyć średnicę kuleczek za pomocą odwróconego mikroskopu świetlnego w kilku polach widzenia. Średnica kuleczek musi mieścić się w przedziale 100-200 µm (Rycina 1).</li>
	<li>Przechowywać kuleczki przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
<img alt="Proces tworzenia kulek P. aeruginosa w oleju mineralnym, schemat modelu mysiego z przewlekłą infekcją płuc." fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51019/51019fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51019/51019fig1.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Przegląd przygotowania kulek agarowych i infekcji myszy. Komórki P. aeruginosa resuspensuje się w 1 ml PBS i dodaje do 9 ml płynnego TSA (50 °C). Mieszaninę tę dodaje się do 150 ml ciężkiego oleju mineralnego w temperaturze 50 °C w kolbie i miesza z dużą prędkością przez 6 min w temperaturze pokojowej. Po schłodzeniu kolby do 4 °C przy powolnym mieszaniu przez 35 min agar krzepnie, tworząc kulki, a bakterie obecne w mieszaninie zostają uwięzione w kulkach agarowych. Szczegół kuleczki agarowej zawierającej komórki bakteryjne przedstawiono na fragmencie (A). Po usunięciu oleju mineralnego poprzez kilkukrotne przemycie sterylnym PBS, zawiesina kulek agarowych jest gotowa do inokulacji w płucach myszy za pomocą wstrzyknięcia przeztchawiczego (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51019/51019fig1highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz</a>.
3. Zakażanie myszy za pomocą kuleczek agarowych
Oświadczenie etyczne: Niniejszy protokół i eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi komisji ds. opieki nad zwierzętami i etyki San Raffaele Scientific Institute.
<ol>
	<li>Policz liczbę jednostek tworzących kolonie (CFU) na płytkach TSA, aby określić liczbę CFU/ml w zawiesinie kulek agarowych. Rozcieńcz kulki agarowe w sterylnym PBS do stężenia 2-4 x 107 CFU/ml, aby uzyskać optymalne inokulum o wartości 1-2 x 106 w 50 µl.</li>
	<li>Zanurz myszy samce szczepu C57Bl/6NCr (20-22 g, wiek 6-8 tygodni) w narkozie, stosując ketaminę (50 mg/ml) i ksylazynę (5 mg/ml) w 0,9% NaCl, podaną dootrzewnowo w objętości 0,002 ml/g masy ciała. 
	UWAGA: Znieczulenie uznaje się za odpowiednie, gdy zwierzę pozostaje spokojne i nieruchome, nie reaguje na bodźce zewnętrzne, a częstotliwość akcji serca i oddechów jest stała.</li>
	<li>Ułóż mysz na plecach. Zdezynfekuj okrycie włosowe myszy 70% etanolem.</li>
	<li>Odsłoń tchawicę, wykonując pionowe cięcie skóry, a następnie wprowadź do tchawicy sterylny, elastyczny kaniulę dożylną 22 G 0,9 mm x 25 mm, pamiętając o usunięciu prowadnika podczas wprowadzania do tchawicy. Nie wprowadzaj kaniuli zbyt głęboko do tchawicy. Zatrzymaj się przed dotarciem do kątażki (rozwidlenia).</li>
	<li>Bezzwłocznie pobierz strzykawką 1 ml objętość 50 µl zawiesiny kulek agarowych i podłącz ją do kaniuli. Delikatnie pchnij tłok strzykawki, umożliwiając implantację kulek do płuca. Zamknij cięcie za pomocą klipsów chirurgicznych.</li>
	<li>Umieść zwierzę na podgrzewaczce, aż całkowicie się obudzi.</li>
</ol>
4. Ocena myszy
<ol>
	<li>Codziennie obserwuj myszy pod kątem objawów klinicznych, w tym stanu okrywy włosowej, postawy, sposobu poruszania się oraz stopnia nawodnienia. Monitoruj codziennie masę ciała zwierząt. Myszy, które utracą ≥20% masy ciała, muszą zostać poddane eutanazji.</li>
	<li>Postępuj zgodnie z punktem 5 w celu pobrania płynu z przemywania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL) oraz z punktami 6 lub 7 w celu pobrania płuc i analizy całkowitej liczby CFU, analizy histologicznej, odpowiedzi zapalnej pod kątem całkowitej i różnicowej liczby komórek w BAL, analizy cytokin oraz aktywności mieloperoksydazy (MPO).</li>
</ol>
5. Pobieranie i analiza płynu z BAL
<ol>
	<li>Poddać myszy eutanazji poprzez wdychanie CO2.</li>
	<li>Umieścić mysz w pozycji na plecach. Zdezynfekować okrycie włosowe myszy 70% etanolem.</li>
	<li>Odsłonić tchawicę i klatkę piersiową, wykonując pionowe nacięcie skóry. Odsłonić płuca poprzez przecięcie przepony.</li>
	<li>Za pomocą pęsety wprowadzić pod tchawicę nić chirurgiczną i przeprowadzić intubację tchawicy, używając sterylnego, giętkiego kaniuli dożylnej I.V. 22 g 0,9 mm x 25 mm. Pociągnąć oba końce nici, aby przywiązać kaniulę do tchawicy, a następnie zawiązać nić wokół tchawicy.</li>
	<li>Pobrać 1 ml RPMI 1640 za pomocą strzykawki 1 ml i podłączyć ją do kaniuli. Przesunąć tłok strzykawki, aby wypłukać płuca, a następnie natychmiast odzyskać płyn, przechowując go w probówce 15 ml. 
	UWAGA: Jeśli planowana jest analiza cytokin, do RPMI 1640 należy dodać inhibitory proteaz.</li>
	<li>Powtórzyć ten krok trzykrotnie, używając łącznie 3 ml RPMI. Od tego momentu przechowywać płyn BAL w lodzie. Przejść do kroku 6 w celu pobrania i analizy płuc. 
	UWAGA: Należy pamiętać, że nie cały płyn zostanie odzyskany (maksymalnie 2,8 ml).</li>
	<li>W celu ilościowego oznaczenia bakterii obecnych w płynie BAL pobrać małą alikwot (300 µl), przeprowadzić rozcieńczenia seryjne 1:10 w sterylnym PBS, wysiać na płytki TSA i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Policzyć całkowitą liczbę komórek przy użyciu odwróconego optycznego mikroskopu świetlnego, rozcieńczając alikwot płynu BAL 1:2 roztworem Tuerka w komorze Bürkera.</li>
	<li>Wirować pozostały płyn BAL przy 330 x g przez 8 min w temperaturze 4 °C. Zebrać supernatant do analizy cytokin metodą ELISA, przechowując go w temperaturze -80 °C. Postępować zgodnie z krokami 5.10-5.13 w celu wykonania różnicowego liczenia komórek metodą cytospin.</li>
	<li>Jeśli osad ma czerwony kolor, zlizować erytrocyty, resuspendując osad w 250-300 µl buforu do lizy RBC rozcieńczonego 1:10 w ultra-czystej wodzie destylowanej przez 3 min. Zneutralizować 2 ml PBS i wirować przy 330 x g przez 8 min w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odlać supernatant i resuspendować osad w RPMI z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS). Użyć objętości, która zapewni stężenie 1 x 106 komórek/ml, w oparciu o całkowitą liczbę komórek.</li>
	<li>Umieścić szkiełka przedmiotowe i filtry w odpowiednich szczelinach cytospinu, tak aby filtry tekturowe były skierowane w stronę środka urządzenia. Pipetować 150 µl każdej próbki do odpowiednich dołków cytospinu i wirować w cyto-wirówce przy 300 x g przez 5 min.</li>
	<li>Przebarwić szkiełka metodą Romanowsky, używając komercyjnego zestawu, zgodnie z instrukcjami producenta i jak opisano wcześniej12. Postępować zgodnie z krokami 5.14-5.17 w celu analizy aktywności MPO.</li>
	<li>Wirować pozostałą objętość BAL przy 380 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C. Odlać supernatant i resuspendować osad w 250 µl 0,5% chlorku heksadecylotrimetylammonium w ultra-czystej wodzie destylowanej w celu lizy komórek. Zawiesinę można zamrozić w temperaturze -20 °C na kilka dni przed wykonaniem testu.</li>
	<li>Wirować przy 16 000 x g przez 30 min w temperaturze 4 °C i użyć supernatantu do wykonania testu MPO na płytkach 96-dołkowych, dodając próbkę w dubletach do każdego dołka, a w razie potrzeby również odpowiednie rozcieńczenia próbki.</li>
	<li>Do każdej próbki w dołkach dodać taką samą objętość 3,3',5,5'-tetrametylobenzydyny (TMB) jako substratu dla peroksydazy. Pozostawić odczynnik do reakcji w ciemności przez co najmniej 5 min, aż do całkowitego wybarwienia.</li>
	<li>Zatrzymać reakcję poprzez dodanie 2 M H2SO4 i zmierzyć OD przy 450 nm. Wartość OD będzie bezpośrednio proporcjonalna do aktywności peroksydazy.</li>
</ol>
6. Pomiar ładunku bakteryjnego w płucach i analiza cytokin
<ol>
	<li>Natychmiast po pobraniu płynu BAL wyciąć płuca myszy, wypłukać je w sterylnym PBS, oddzielić płaty, umieścić je w probówce o okrągłym dnie z 2 ml sterylnego PBS i przechowywać w lodzie. 
	UWAGA: Jeśli planowana jest analiza cytokin, do PBS w probówkach należy dodać inhibitory proteaz.</li>
	<li>Homogenizować płuca w warunkach aseptycznych, pobrać małą aLIKwot (300 µl) z homogenatu, rozcieńczyć seryjnie 1:10 w PBS, wysiać na płytki TSA i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc. Należy pamiętać, że całkowita ładunek bakteryjny dróg oddechowych będzie sumą CFU znalezionych w płynie BAL i w płucach.</li>
	<li>Wirować pozostały homogenat przy 16,000 x g przez 30 min w temperaturze 4 °C. Pobrać supernatant do analizy cytokin metodą ELISA i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
7. Badanie histologiczne
<ol>
	<li>Przeprowadź analizę histologiczną wyłącznie w płucach, z których nie pobrano płynu BAL, aby zachować wygląd i właściwości tkanki płucnej.</li>
	<li>Uśmierć mysz poprzez inhalację CO2.</li>
	<li>Odsłoń klatkę piersiową, wykonując pionowe nacięcie skóry, a następnie odsłoń płuca poprzez przecięcie przepony.</li>
	<li>Wyciśnij płuca, wypłucz je w PBS, oddziel płaty, umieść w probówce zawierającej 5-10 ml 10% neutralnego buforu formalinowego (4% formaldehydu) i przechowuj w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem.</li>
	<li>Zatop płuca w parafinie, stosując standardowe procedury.</li>
	<li>Wykonaj skrawki o grubości 5 µm za pomocą mikrotomu.</li>
	<li>Przebarw preparaty hematoksyliną i eozyną, a następnie przykryj je szkiełkiem cover-slip, zgodnie ze standardowymi procedurami.</li>
	<li>Zbadaj preparaty przy użyciu odwróconego mikroskopu w świetle przechodzącym i wykonaj zdjęcia, podłączając mikroskop do kamery.</li>
</ol>

<ol><li>Gibson, R., Burns, J. L., Ramsey, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+and+management+of+pulmonary+infections+in+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology and management of pulmonary infections in cystic fibrosis.</a> Am. J. Respir. Crit. Care. 168, 918-951 (2003).</li>
<li>Bragonzi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+models+of+acute+and+chronic+lung+infection+with+cystic+fibrosis+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22IJMM%22%5BJournal%5D)">Murine models of acute and chronic lung infection with cystic fibrosis pathogens.</a> IJMM. 300, 584-593 (2010).</li>
<li>Cash, H. A., McCullough, B., Johanson, W. G. Jr, Bass, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rat+model+of+chronic+respiratory+infection+with+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+Rev.+Respir.+Dis%22%5BJournal%5D)">A rat model of chronic respiratory infection with Pseudomonas aeruginosa.</a> Am. Rev. Respir. Dis. 119, 453-459 (1979).</li>
<li>Starke, J. R., Langston, C., Baker, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+of+chronic+pulmonary+infection+with+Pseudomonas+aeruginosa+and+Pseudomonas+cepacia%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr.+Res%22%5BJournal%5D)">A mouse model of chronic pulmonary infection with Pseudomonas aeruginosa and Pseudomonas cepacia.</a> Pediatr. Res. 22, 698-702 (1987).</li>
<li>Pedersen, S. S., Hansen, B. L., Hansen, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+experimental+chronic+Pseudomonas+aeruginosa+lung+infection+with+P.+aeruginosa+entrapped+in+alginate+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22APMIS%22%5BJournal%5D)">Induction of experimental chronic Pseudomonas aeruginosa lung infection with P. aeruginosa entrapped in alginate microspheres.</a> APMIS. 98, 203-211 (1990).</li>
<li>Bragonzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonmucoid+Pseudomonas+aeruginosa+expresses+alginate+in+the+lungs+of+patients+with+cystic+fibrosis+and+in+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Nonmucoid Pseudomonas aeruginosa expresses alginate in the lungs of patients with cystic fibrosis and in a mouse model.</a> J. Infect. Dis. 192, 410-419 (2005).</li>
<li>van Heeckeren, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+models+of+chronic+Pseudomonas+aeruginosa+lung+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Anim%22%5BJournal%5D)">Murine models of chronic Pseudomonas aeruginosa lung infection.</a> Lab. Anim. 36, 291-312 (2002).</li>
<li>Bragonzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+microevolution+during+cystic+fibrosis+lung+infection+establishes+clones+with+adapted+virulence+AJRCCM%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa microevolution during cystic fibrosis lung infection establishes clones with adapted virulence AJRCCM.</a> 180, 138-145 (2009).</li>
<li>Kukavica-Ibrulj, I., Facchini, M., Cigana, C., Levesque, R. C., Bragonzi, A. Assessing Pseudomonas aeruginosa virulence and the host response using murine models of acute and chronic lung infection. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKukavica-Ibrulj%2C+I+%22Methods+in+Pseudomonas+aeruginosa%3A+Humana+Press%22">Methods in Pseudomonas aeruginosa: Humana Press</a>. Filloux, S., Ramos, J. L. , (2014).</li>
<li>Moalli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Therapeutic+Potential+of+the+Humoral+Pattern+Recognition+Molecule+PTX3+in+Chronic+Lung+Infection+Caused+by+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The Therapeutic Potential of the Humoral Pattern Recognition Molecule PTX3 in Chronic Lung Infection Caused by Pseudomonas aeruginosa.</a> J. Immunol. 186, 5425-5534 Forthcoming.</li>
<li>Paroni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+CFTR-deficient+mice+to+long-term+Pseudomonas+aeruginosa+chronic+infection+and+PTX3+therapeutic+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Response of CFTR-deficient mice to long-term Pseudomonas aeruginosa chronic infection and PTX3 therapeutic treatment.</a> J. Infect. Dis. In press, Forthcoming.</li>
<li>Maxeiner, J., Karwot, R., Hausding, M., Sauer, K. A., Scholtes, P., Finotto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+to+enable+the+investigation+of+murine+bronchial+immune+cells%2C+their+cytokines+and+mediators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A method to enable the investigation of murine bronchial immune cells, their cytokines and mediators.</a> Nat. Protoc. 2, 105-112 (2007).</li>
<li>Bragonzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+microevolution+during+cystic+fibrosis+lung+infection+establishes+clones+with+adapted+virulence.%5BTitle%5D)+AND+%22AJRCCM%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa microevolution during cystic fibrosis lung infection establishes clones with adapted virulence.</a> AJRCCM. In press, (2009).</li>
<li>Pirone, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burkholderia+cenocepacia+strains+isolated+from+cystic+fibrosis+patients+are+apparently+more+invasive+and+more+virulent+than+rhizosphere+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Burkholderia cenocepacia strains isolated from cystic fibrosis patients are apparently more invasive and more virulent than rhizosphere strains.</a> Environ. Microbiol. 10, 2773-2784 (2008).</li>
<li>Bragonzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+co-infection+of+the+cystic+fibrosis+lung+by+Pseudomonas+aeruginosa+and+Burkholderia+cenocepacia+reveals+influences+on+biofilm+formation+and+host+response%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Modelling co-infection of the cystic fibrosis lung by Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cenocepacia reveals influences on biofilm formation and host response.</a> PLoS One. 7, Forthcoming.</li>
<li>Bianconi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+signature-tagged+mutagenesis+in+Pseudomonas+aeruginosa%3A+tracking+patho-adaptive+mutations+promoting+long-term+airways+chronic+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog.%22%5BJournal%5D)">Positive signature-tagged mutagenesis in Pseudomonas aeruginosa: tracking patho-adaptive mutations promoting long-term airways chronic infection.</a> PLoS Pathog.. 7, (2011).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Poniżej przedstawiono kluczowe etapy przygotowania koralików P . aeruginosa i prowokacji myszy.
Szczep P. aeruginosa stosowany do prowokacji myszy ma kluczowe znaczenie. Śmiertelność, przewlekłe zakażenie lub klirens mogą się znacznie różnić w zależności od szczepu bakteryjnego użytego do prowokacji. Szczep kliniczny P. aeruginosa RP73 był preferowany w stosunku do referencyjnego szczepu laboratoryjnego PAO1, ponieważ skutkował stosunkowo niższą śmiertelnością, poważ...

Mukowiscydoza (CF) jest chorobą genetyczną spowodowaną mutacjami w genie CFTR (transmembrane conductance regulator). Gen ten koduje kanał chlorkowy ulegający ekspresji na błonie większości komórek nabłonkowych. Rozstrzenie oskrzeli, zatykanie śluzu i niszczenie miąższu spowodowane głównie przez zakażenia Pseudomonas aeruginosa stopniowo prowadzą do ciężkiej choroby płuc i śmiertelności u większości pacjentów z mukowiscydozą1. Zrozumienie patogenezy mukowiscydozy i dalszy rozwój nowych terapii opierają się na modelu zwierzęcym o charakterystycznych cechach mukowiscydozy. Wygenerowano kilka myszy, genetycznie zmodyfikowanych pod kątem genu CFTR, ale szeroko udokumentowano ograniczenia w zdolności tych gatunków do rekapitulacji choroby płuc podobnej do mukowiscydozy i kilku innych nieprawidłowości narządowych obserwowanych u pacjentów z mukowiscydozą2.
	
Rozwój infekcji jest jednym z głównych wyzwań w modelu zwierzęcym mukowiscydozy. Literatura wyraźnie sugeruje, że przewlekła infekcja trwająca dłużej niż miesiąc może być osiągnięta tylko wtedy, gdy myszy zostaną zaszczepione bakteriami osadzonymi w środku unieruchamiającym, takim jak agar, agaroza lub alginian wodorostów3-5. Te czynniki unieruchamiające zapewniają warunki mikrotlenowe/beztlenowe, które umożliwiają rozwój bakterii w postaci mikrokolonii, podobnie jak wzrost śluzu u pacjentów z mukowiscydozą6. Ten model przewlekłej infekcji prowadzi do utrzymywania się bakterii w płucach, powodując zapalenie i uszkodzenie dróg oddechowych7. Jednak w zależności od zastosowanej metody, szczepu bakteryjnego i dawki zaszczepionej w płucach, odsetek przewlekle zakażonych myszy i ładunek bakteryjny odzyskany w płucach w różnych punktach czasowych mogą się znacznie różnić. W szczególności głównym wyzwaniem dla długotrwałego przewlekłego zakażenia pozostaje niskie obciążenie bakteryjne P. aeruginosa i niski odsetek zakażonych myszy kilka tygodni po prowokacji, co wskazuje, że komórki bakteryjne są stopniowo usuwane przez gospodarza. Wybierając szczep kliniczny P. aeruginosa RP73 z kolekcji izolatów mukowiscydozy8, udało nam się uzyskać niską śmiertelność, cięższe zmiany i wysoki odsetek przewlekłych infekcji ze stabilnym obciążeniem bakteryjnym do jednego miesiąca u myszy C57Bl / 6NCrl.
	
Ten artykuł szczegółowo opisuje metodologię osadzania P. aeruginosa w kulkach agarowych; zainfekowaliśmy myszy przez wkroplenie dotchawicze, zmierzyliśmy ładunek bakteryjny i cytokiny w płucach, pobraliśmy płyn BAL i przeprowadziliśmy badanie histologiczne. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten pomoże naukowcom w odpowiedzi na fundamentalnie ważne pytania dotyczące patogenezy8,9 i testowaniu nowych terapii przeciwko P. Aeruginosa przewlekłe zakażenie 10,11.

<table><tbody><tr><td>Bacto Tryptic Rosół sojowy</td><td>Becton Dickinson</td><td>211823</td><td></td></tr><tr><td>Difco Agar, granulowany</td><td>Becton Dickinson</td><td>214510</td><td></td></tr><tr><td>Ciężki olej mineralny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>330760-1L</td><td></td></tr><tr><td>S-(+)-Chlorowodorek ketaminy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K1884</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek ksylazyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X1251</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 1 ml 25 G 5/8 cala&nbsp; Cewnik 3071250300350 0,5 mm x 16</td><td></td><td></td> mm 22 G 0,9 mm x 25 mm Kleszcze Becton Dickinson 381223 Graefe - końcówki 0,5 mm Zakrzywione narzędzia do nauki 11152-10 Nożyczki, przysłona, 11 cm, proste Świat Instrumenty precyzyjne 501758 Klipsy do szwów Fine Science Tools 12040-01 Szew <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> gwint</td><td>Fine Science Tools</td><td>18020-40</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza</td><td>BE12-167F</td><td></td></tr><tr><td>Kompletny koktajl inhibitorów proteazy</td><td>Roche</td><td>11836145001</td><td></td></tr><tr><td>Fast-Read 102 Jednorazowa komora Burker</td><td>Biosigma</td><td>390497</td><td></td></tr><tr><td>roztwór Tuerk</td><td>Fluka</td><td>93770</td><td></td></tr><tr><td>RBC bufor do lizy</td><td>Biolegend</td><td>420301</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Lonza</td><td>DE14-801F</td><td></td></tr><tr><td>EZ cytolejek</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78710021</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe Superfrost ultra plus</td> Zestaw do barwienia <td>Thermo Scientific</td><td>J3800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Diff-Quik Romanowsky</td><td>Medion Diagnostics</td><td>130832</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek heksadecylotrimetyloamoniowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>52366-10G</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka EIA/RIA</td><td>Costar</td><td>3590</td><td></td></tr><tr><td>3,3',5,5'- Tetrametylobenzydyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8665-1L</td><td></td></tr><tr><td>Kwas siarkowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320501-1L</td><td></td></tr><tr><td>10% Neutralna buforowana formalina</td><td>Bio-Optica</td><td>05-01005Q</td><td></td></tr><tr><td>Hematoksylina Harris non Papanicolau</td><td>Bio-Optica</td><td>05-M06004</td><td></td></tr><tr><td>Eozyna plus roztwór alkoholowy</td><td>Bio-Optica</td><td>05-M11007</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Inkubator do wytrząsania</td><td>Amerex Instruments</td><td>Steady Shake 757</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel wodna</td><td>Grant</td><td>SUB14</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizator</td><td>Ystral</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waga precyzyjna</td><td>KERN</td><td>440-47N</td><td></td></tr><tr><td>Cytowirówka</td><td>Thermo Scientific A78300003</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tania poduszka grzewcza</td><td>2biol</td><td>LCHP</td><td></td></tr><tr><td>Sonda homogenizująca</td><td>Ystral</td><td>2366925 (mała)</td><td></td></tr> <tr><td>Odwrócony mikroskop optyczny</td><td>Kamera Zeiss</td><td>Axioplan2</td><td></td></tr><tr><td>(mikroskop)</td><td>Zeiss</td><td>Axiocam MRc5</td><td></td></tr><tr><td>Rotary mikrotom</td><td>Leica</td><td>RM2255</td><td></td></tr></tbody></table>

długotrwałe przewlekłe zakażenie dróg oddechowych pseudomonas aeruginosa u myszy

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Mysi model przewlekłej infekcji dróg oddechowych jest kluczowym atutem w badaniach nad mukowiscydozą (CF), chociaż istnieje wiele obaw dotyczących samego modelu. Wczesne fazy zapalenia i infekcji były szeroko badane przy użyciu mysiego modelu perełek agarowych Pseudomonas aeruginosa, podczas gdy tylko nieliczne doniesienia koncentrowały się na długotrwałej przewlekłej infekcji in vivo. Głównym wyzwaniem dla długotrwałej przewlekłej infekcji pozostaje niskie obciążenie bakteryjne P. aeruginosa i niski odsetek zakażonych myszy kilka tygodni po prowokacji, co wskazuje, że komórki bakteryjne są stopniowo usuwane przez gospodarza.
Ten artykuł przedstawia metodę uzyskiwania skutecznej, długotrwałej przewlekłej infekcji u myszy. Metoda ta opiera się na osadzeniu szczepów klinicznych P. aeruginosa w kulkach agarowych in vitro, a następnie wkropleniu dotchawiczym u myszy C57Bl / 6NCrl. Obustronne zakażenie płuc wiąże się z kilkoma mierzalnymi odczytami, w tym utratą masy ciała, śmiertelnością, przewlekłą infekcją i reakcją zapalną. Szczep kliniczny P. aeruginosa RP73 był preferowany w stosunku do referencyjnego szczepu laboratoryjnego PAO1, ponieważ skutkował stosunkowo niższą śmiertelnością, poważniejszymi zmianami i wyższą przewlekłą infekcją. Kolonizacja P. aeruginosa może utrzymywać się w płucach przez ponad trzy miesiące. Patologia płuc u myszy przypomina patologię pacjentów z mukowiscydozą z zaawansowaną przewlekłą chorobą płuc.
Ten mysi model najwierniej naśladuje przebieg choroby u człowieka i może być używany zarówno do badań nad patogenezą, jak i do oceny nowych terapii.

Po prawidłowym wykonaniu protokołu kuleczki agarowe z P. aeruginosa będą miały rozmiar od 100-200 µm i można je obserwować za pomocą odwróconego mikroskopu świetlnego, nanosząc niewielką objętość zawiesiny kuleczek agarowych na szkiełko. Pojedyncze komórki bakteryjne są widoczne w kuleczkach agarowych, co szczegółowo przedstawiono na Rysunku 1.
Wybór szczepu P. aeruginosa wykorzystanego do przygotowania kulek agarowych jest kluczowy. Rysunek 2</strong...

Opisujemy metodę koralików agarowych w celu ustalenia trwałego, długotrwałego przewlekłego zakażenia dróg oddechowych Pseudomonas aeruginosa w modelu mysim.

Długotrwałe przewlekłe zakażenie dróg oddechowych Pseudomonas aeruginosa u myszy

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Ogólnym celem tej procedury jest wywołanie u myszy trwałej, długotrwałej przewlekłej infekcji dróg oddechowych wywołanej przez Pseudomonas aerogen. Osiąga się to poprzez najpierw wyhodowanie wybranego szczepu bakterii Pseudomonas aerogen. Drugim krokiem jest zamknięcie bakterii w małych kuleczkach agarowych poprzez zmieszanie bakterii z agarem i olejem mineralnym w temperaturze 50°C, a następnie schłodzenie mieszaniny do 4°C przy powolnym, ciągłym mieszaniu.Następnie olej mineralny usuwa się poprzez kilkukrotne przemycie buforem PBS, a część kulek agarowych homogenizuje i wysiewa na płytki z agarem. Aby określić zawartość bakterii, ostatnim krokiem jest wstrzyknięcie kilku mikrolitrów zawiesiny kulek agarowych do tchawicy myszy w celu wywołania przewlekłej infekcji płuc Pseudomonas aerogen. Ostatecznie, w różnych odstępach czasu od zakażenia, można pobrać płyn z przemywania pęcherzyków płucnych oraz płuca, a następnie wysiać je na płytki z agarem, aby określić odsetek myszy z przewlekłą infekcją oraz ładunek bakteryjny w drogach oddechowych przeżywających zwierząt. Główną zaletą metod z wykorzystaniem kulek agarowych w porównaniu do istniejących metod jest to, że pozwalają one na s

long-term-chronic-pseudomonas-aeruginosa-airway-infection-in-mice

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Długotrwała przewlekła Pseudomonas aeruginosa infekcja dróg oddechowych u myszy

Utworzenie chronicznego modelu mysiego z infekcją bakteryjną z trwałą kolonizacją jelit przez Salmonella typhimurium przez 27 tygodni.

Model myszy z przewlekłą infekcją Salmonella

Źródło: de Vries, C. R., et.al. Model opóźnionej inokulacji przewlekłej infekcji rany Pseudomonas aeruginosa . J. Vis. Exp. (2020)Ten film pokazuje opóźnione szczepienie luminescencyjnego Pseudomonas aeruginosa u myszy noszącej dwie pełnogrube rany grzbietowe pokryte przezroczystym opatrunkiem foliowym. Ułatwia to powstawanie biofilmu i powstawanie przewlekłych infekcji. Regularne monitorowanie bioluminescencji umożliwia ilościowe określenie obciążenia bakteriami oraz śledzenie postępu infekcji...

Opracowywanie mysiego modelu przewlekłej infekcji skóry Pseudomonas aeruginosa 

Opracowaliśmy model uszkodzenia płuc myszy poprzez wstrzyknięcie do tchawicy bakterii Pseudomonas aeruginosa. Model ten naśladuje uszkodzenie płuc podczas zapalenia płuc i ma znaczenie kliniczne.

Pseudomonas aeruginosa Model indukowanego uszkodzenia płuc

Podczas gdy badania in vitro interakcji gospodarz-patogen pozwalają na scharakteryzowanie specyficznych odpowiedzi immunologicznych, modele in vivo są wymagane do obserwacji efektów złożonych odpowiedzi. Wykorzystując ekspozycję na Candida albicans, a następnie infekcję płuc za pośrednictwem Pseudomonas aeruginosa, ustaliliśmy mysi model interakcji mikrobiologicznych zaangażowanych w patogenność zapalenia płuc związaną z respiratorem.

Badanie społeczności drobnoustrojów in vivo: model interakcji między Candida albicans i Pseudomonas aeruginosa w drogach oddechowych za pośrednictwem gospodarza

W literaturze opisano kilka metod modelowania bakteryjnego zapalenia płuc u myszy. W niniejszym artykule opisano nieinwazyjną, niedrogą i szybką metodę wywoływania zapalenia płuc poprzez aspirację (tj. wdychanie) inokulum bakteryjnego pipetowanego do jamy ustnej i gardła. Szczegółowo opisano również dalsze metody oceny wrodzonej odpowiedzi immunologicznej płuc.

Nieinwazyjna i technicznie nieintensywna metoda indukcji i fenotypowania eksperymentalnego bakteryjnego zapalenia płuc u myszy

To badanie opisuje udane wygenerowanie nowego modelu zwierzęcego przewlekłej obturacyjnej choroby płuc (POChP) poprzez wielokrotne wystawianie myszy na działanie wysokich stężeń ozonu.

Generowanie modelu przewlekłej obturacyjnej choroby płuc u myszy poprzez powtarzającą się ekspozycję na ozon

Tutaj przedstawiamy powszechne metody analizy funkcji fagocytarnej mysich makrofagów pęcherzykowych i klirensu bakteryjnego z płuc. Metody te badają fagocytozę in vitro kulek izotiocyjanianu fluoresceiny oraz fagocytozę in vivo białka zielonej fluorescencji Pseudomonas aeruginosa.  Opisujemy również metodę usuwania P. aeruginosa u myszy.

Fagocytoza makrofagów pęcherzykowych i klirens bakteryjny u myszy

Opisujemy protokół opóźnionej inokulacji do generowania przewlekłych infekcji ran u myszy immunokompetentnych.

Model opóźnionej inokulacji przewlekłego zakażenia ran Pseudomonas aeruginosa

Ten manuskrypt opisuje stworzenie zakaźnego modelu zapalenia płuc u myszy i odpowiednią charakterystykę leczenia urazów wraz z metodami hodowli bakterii i wkraplania dotchawiczego. Opisano również nowatorskie podejście wykorzystujące wysokowymiarową cytometrię przepływową do oceny krajobrazu immunologicznego.

Eksperymentalny model do oceny ustąpienia zapalenia płuc

Myszy są ogólnie odporne na infekcje Mycobacterium abscessus, co komplikuje odkrycie i opracowanie bardzo potrzebnych antybiotyków przeciwko infekcjom płuc. W tym miejscu opisujemy metodę przygotowania inokulum i zakażenia dotchawiczego, która, jak wykazano, zapewnia trwałą infekcję u myszy immunokompetentnych.

Przygotowanie Mycobacterium abscessus osadzonego w paciorkach agarowych w celu śródtchawiczego inokulacji myszy immunokompetentnych

Tu przedstawiamy protokół do ustanowienia modelu immunosupresji z powodu wstrzyknięcia Klebsiella pneumoniae do nosa u myszy i zweryfikowaliśmy model za pomocą różnych wskaźników.

Ustanowienie modelu immunosupresji wywołanej przez sepsy u myszy poprzez wewnątrznosowe wprowadzanie bakterii

Poznaj metodę kulek agarowych do wywoływania przewlekłych zakażeń Pseudomonas aeruginosa u myszy. Technika zapewnia stabilną obecność bakterii przez miesiąc, umożliwiając badanie patogenezy i testowanie terapii.

Długotrwałe przewlekłe zakażenie dróg oddechowych Pseudomonas aeruginosa u myszy

Przeglądaj więcej filmów