Izolacja i charakterystyka chimerycznych ludzkich białek eksprymujących Fc przy użyciu adsorberów błonowych białka A i usprawnionego przepływu pracy

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wydajne i skuteczne izolowanie oraz charakteryzowanie chimerycznych białek ludzkiego FC przy użyciu absorbentów membranowych z białkiem A oraz usprawnionego schematu postępowania. Jest to osiągane poprzez wstępne klarowanie supernatantu z hodowli komórkowej za pomocą filtra o rozmiarze 0,22 mikrona. Drugim krokiem jest montaż układu przepływowego i rozpoczęcie perfuzji supernatantu z hodowli komórkowej przez absorbent membranowy z białkiem A.

Następnie białko wykazujące ludzki fragment Fc jest eluowane z absorbera membranowego, a uzyskany eluat jest zagęszczany poprzez ultrafiltrację, po której następuje wymiana buforu za pomocą dializy. Ostatnimi krokami są cytometria przepływowa oraz western blotting w celu określenia jakości i ilości zagęszczonego białka. W końcowym rozrachunku absorbery membranowe z białkiem A, wraz z usprawnionym schematem postępowania, wykazują skrócenie czasu przetwarzania oraz potencjalny wzrost wydajności białka w porównaniu z tradycyjną chromatografią powinowactwa z wykorzystaniem kolumn Protein A AroSpeed).

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak kolumnowa chromatografia powinowactwa, jest to, że absorber membranowy pozwala na uzyskanie potencjalnie wyższych wydajności białka przy krótszym czasie przetwarzania. Dobór odpowiednich metod charakterystyki może również skrócić czas przetwarzania. Przygotować absorber membranowy zgodnie z instrukcją producenta, upewniając się, że wszystkie przepuszczane roztwory mają temperaturę pokojową i zostały uprzednio przefiltrowane przez filtr 0,22 mikrona. Na początek napełnić strzykawkę o pojemności 10 mililitrów przefiltrowanym przez filtr 0,22 mikrona roztworem PBS lub DPBS i usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza.

Aby zapobiec przedostaniu się powietrza do absorbera membranowego, należy przepłukać go DPBS w celu usunięcia roztworu do przechowywania i wyrównania potencjałów absorbera membranowego bezpośrednio przed użyciem. Przed wprowadzeniem nadnadczynu z hodowli komórkowej do absorbera membranowego, należy go przefiltrować przy użyciu sterylnej jednostki filtracyjnej 0,22 mikrona z napędem próżniowym w celu załadowania absorbera membranowego z białkiem A, naciągnąć nadnadczyn z hodowli komórkowej do strzykawki z systemem Luer-Lock i usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza podczas przygotowywania materiałów i sprzętu. W pierwszej kolejności należy podłączyć strzykawkę do wlotu absorbera membranowego.

W razie potrzeby podłącz elastyczny przewód do wylotu absorbera membranowego. Umieść filtr strzykawkowy 0,22 mikrona pomiędzy strzykawką a absorberem membranowym. Użyj kolby lub butelki do zbierania przesączu z absorbera.

Ustaw pompę strzykawkową na pożądane natężenie przepływu objętościowego, dbając o to, aby nie przekroczyć wartości zalecanej przez producenta. Przeprowadź perfuzję supernatantu z hodowli komórkowej przez absorbent membranowy, zbierając przesącz. W razie potrzeby ponownie napełnij strzykawkę supernatatem.

W razie potrzeby należy sprawdzić obecność białka w filtracie za pomocą cytometrii przepływowej, western błotingu lub testu ELISA, zależnie od preferencji laboratorium; zazwyczaj nie ma potrzeby ponownego przepuszczania filtratu w celu elucji białka z absorbera membranowego. Najpierw należy przemyć absorber membranowy 10 mililitrami DPBS, aby usunąć wszelkie niezwiązane białka. Następnie należy eluować białko z absorbera membranowego przy pożądanym przepływie.

Używając od 10 do 15 mililitrów buforu eluującego. Zbieraj EIT do probówki zawierającej bufor neutralizujący w ilości stanowiącej 10% objętości elucji. Po elucji białka zregeneruj absorbent membranowy zgodnie z instrukcjami producenta.

Napełnić absorber membranowy 20% etanolem w DPBS w celu długotrwałego przechowywania w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Osadzić wszystkie EIT w wirówkowej jednostce filtrującej z progiem odcięcia masy cząsteczkowej 10 kilodaltonów.

Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi dializy wirowej. Retentat należy poddać dializie w jednostce do dializy małych objętości z progiem odcięcia masy cząsteczkowej 10 kilodalton przeciwko wybranemu buforowi; do zdializowanego materiału może być konieczne dodanie buforu.

Jeśli istnieje obawa o wytrącanie białek, należy rozdzielić oczyszczone białko i standardy FC na wybranym żelu za pomocą elektroforezy SDS-PAGE w warunkach redukujących lub nieredukujących, w zależności od potrzeb. Należy użyć żelu mini zamiast żelu mini, aby zminimalizować czas biegu; należy nałożyć różne ilości oczyszczonego białka, w tym próbki rozcieńczone w DPBS, aby upewnić się, że sygnały prążków oczyszczonego białka mieszczą się w liniowym zakresie sygnału standardów FC. W analizie obrazu po rozdzieleniu na żelu, białka należy przenieść z żelu na membranę z polifluoropoliolu w nieciągłym systemie buforowym, używając blottera półsuchego zgodnie z instrukcją producenta; czas transferu wynosi zazwyczaj od 5 do 10 minut.

Żel po transferze należy zabarwić błękitem Coomassie w celu weryfikacji wydajności transferu. Należy przeprowadzić immunoblotting z użyciem przeciwciał anty-FC lub anty-IgG sprzężonych z fosfatazą alkaliczną lub peroksydazą chrzanową, wykorzystując detekcję białek wspomaganą próżniowo. Czas immunoblottingu zazwyczaj nie przekracza jednej godziny.

Przeprowadź detekcję immunoblottu, stosując wybrany substrat i metodę. Ilościowo określ zawartość oczyszczonego białka za pomocą analizy obrazu. Wykonaj regresję liniową sygnałów prążków ze standardów FC.

Jeśli współczynnik R kwadrat jest większy niż 0,90, należy wykorzystać równanie linii do obliczenia ilości białka na podstawie sygnału prążka, uwzględniając w razie potrzeby rozcieńczenie próbki. Ponieważ kwantyfikacja białka jest przeprowadzana na podstawie fc, należy skorygować wartość o różnice w masie cząsteczkowej między białkiem a fc. Jeśli współczynnik R kwadrat jest mniejszy niż 0,90, należy powtórzyć przyspieszoną procedurę western blotting.

W końcu należy zwalidować białko za pomocą testów funkcjonalnych lub metod wykrywania FC przy użyciu cytometrii przepływowej. Do sprawdzenia obecności funkcjonalnego GAL one HFC w początkowym nadsączu hodowli komórkowej wykorzystano Western blotting lub cytometrię przepływową EISA; świeże medium hodowlane, wskazane tutaj na niebieskim histogramie, służyło jako kontrola negatywna i jest przedstawione na czerwono. Nakładający się na ten histogram zielony wykres przedstawia przepływ, co wskazuje, że absorbent membranowy skutecznie wychwycił i zatrzymał GAL one HFC. GAL one HFC eluowano z absorbenta membranowego w przyrostach po 1 ml przy prędkości 1 ml/min, stosując kwaśny bufor na bazie aminy, a zneutralizowane frakcje elucyjne przetestowano następnie pod kątem obecności funkcjonalnego GG one HFC za pomocą cytometrii przepływowej. Sygnał GL one HFC następowała zwiększał się od elucji 1, która była w przybliżeniu równa kontroli negatywnej, do maksimum w EEU 3, a następnie spadł do niemal stałego poziomu w elucjach 9 i 10.

Ostateczna próba EEU 10 nie osiągnęła sygnału równoważnego z kontrolą negatywną z powodu retencji adsorbenta w niektórych próbkach. Ilościowe oznaczenie i charakterystyka oczyszczonego GL one HFC zostały przeprowadzone za pomocą procedury western blottingu, przyspieszonej przez transfer półsuchy oraz immuno-blotting wspomagany próżniowo. Poprzez porównanie sygnału GA one HFC ze standardami ilościowymi HFC określono zarówno ilość, jak i jakość oczyszczonego materiału.

Sygnały GAL one HFC oraz zdegradowane sygnały GAL one HFC mieściły się w zakresie standardów. Intensywności sygnałów pasm standardowych HFC były liniowo powiązane z ilością obecnego HFC. Stężenie oczyszczonego GAL one HFC na podstawie HFC zostało określone poprzez analizę obrazu i wynosiło 450 µg/mL.

Korygując o masę cząsteczkową G1HFC. Stężenie oczyszczonego materiału wynosiło 720 µg/mL. W przeciwieństwie do tego, na ścieżki szóstą i siódmą przedstawionego tutaj western blotu naniesiono zbyt dużo oczyszczonego GAL1HFC, co wygenerowało sygnały nasycające lub przekraczające zakres standardów HFC, uniemożliwiając tym samym kwantyfikację.

Alternatywą dla western blottingu jest barwienie żelu kumasy, które może służyć jako szybka kontrola jakości i/lub metoda kwantyfikacji. Należy zauważyć, że w zdegradowanej próbce GAL one HFC, oprócz pręg we właściwościach około 25 kilodaltons i 40 kilodaltons, obecna była pręga o masie około 10 kilodaltons. Pręga ta odpowiada zdegradowanemu GAL one HFC, który nie reagował z przeciwciałem detekcyjnym stosowanym w western blottach.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dokładną wiedzę na temat izolacji chimerycznych białek ludzkich wykazujących ekspresję FC przy użyciu absorberów membranowych oraz sposobów charakteryzacji tych białek w czasie zaledwie czterech godzin.