Name: Izolacja i charakterystyka chimerycznych ludzkich białek eksprymujących Fc przy użyciu adsorberów błonowych białka A i usprawnionego przepływu pracy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-08T14:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Poznaj izolację i charakteryzację ludzkich białek Fc przy użyciu adsorberów błonowych białka A. Ta metoda skraca czas przetwarzania i zwiększa wydajność w porównaniu do tradycyjnej chromatografii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy pragną podziękować panu Luisowi F. Delgadillo (Wydział Inżynierii Chemicznej i Biomolekularnej, Uniwersytet Ohio), panu Matthew H. Williamsowi (Wydział Inżynierii Chemicznej i Biomolekularnej, Uniwersytet Ohio) oraz dr Filiberto Cedeno-Laurent (Brigham and Women's Hospital i Harvard Medical School) za fachową pomoc techniczną. Autorzy pragną również podziękować studentom Zimy 2011 CHE 404/BME 504 oraz Jesienią 2012 CHE 4830/BME 5830 (Wydział Chemii i Biomolekularni) Engineering and Biomedical Engineering Program, Ohio University) w celu uzyskania porad technicznych i dyskusji. Praca ta była wspierana przez National Science Foundation (NSF) Major Research Instrumentation grant CBET-1039869 (MMB), NSF CBET-1106118 (MMB), Dermatology Foundation Research Grant A050422 (SRB), National Institutes of Health (NIH) NCI grant 1R15CA161830-01 (MMB), NIH Kirschstein-NRSA Postdoctoral Fellowship F32CA144219-01A1 (SRB), NIH/NCI R01CA173610 (CJD) oraz NIH NCCAM grant R01AT004628 (CJD).

1. Sprawdź powinowactwo do białka A
<ol>
	<li>Przed użyciem adsorbera błonowego białka A sprawdzić, czy białko wykazujące ekspresję Fc (rekombinowane białko fuzyjne lub przeciwciało IgG, zwane dalej "białkiem") ma akceptowalne powinowactwo do białka A14-17 i przeprowadzić próbę na obecność białka w roztworze podstawowym (np. supernatant do hodowli komórkowej klarowany przez odwirowanie w temperaturze 1 000 x g przez 5 minut w celu osadzenia zawieszonych komórek). Użyj cytometrii przepływowej, Western blot, ELISA itp. w celu wykrycia funkcji białka i/lub obecności Fc, w oparciu o preferencje laboratoryjne. Najlepiej określić ilościowo białko w supernatance hodowli komórkowej (krok 6), aby uniknąć przekroczenia pojemności adsorbera błonowego białka A. Kontynuuj, jeśli zostanie wykryte białko.</li>
</ol>
2. Przygotowanie adsorbera błonowego białka A i supernatantu hodowli komórkowej
<ol>
	<li>Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi przygotowania adsorbera membranowego. Nigdy nie pozwól, aby powietrze dostało się do adsorbera membranowego. Wszystkie roztwory przepuszczane przez adsorber membranowy powinny mieć temperaturę pokojową i być wstępnie przefiltrowane za pomocą filtra 0,22 μm. Napełnić strzykawkę o pojemności 10 ml solą fizjologiczną z filtrem 0,22 μm buforowanym fosforanem Dulbecco (DPBS) lub wybranym buforem i usunąć pęcherzyki powietrza. Wykonać perfekcję DPBS w celu usunięcia roztworu do przechowywania i zrównoważenia adsorbera membranowego bezpośrednio przed użyciem.</li>
	<li>Przefiltrować supernatant hodowli komórkowej bezpośrednio przed perfuzją przez adsorber membranowy, używając sterylnego urządzenia filtrującego o sterylnej energii 0,22 μm z napędem próżniowym.</li>
</ol>
3. Załaduj adsorber błonowy białka A
<ol>
	<li>Odessać supernatant do hodowli komórkowych do strzykawki Luer Lock (30 ml lub większej) i usunąć pęcherzyki powietrza.</li>
	<li>Zmontuj materiały i sprzęt, jak pokazano na rysunku 1. Podłączyć strzykawkę do wlotu adsorbera membranowego. Podłącz elastyczną rurkę do wylotu adsorbera membranowego. W razie potrzeby umieść filtr strzykawkowy 0,22 μm między strzykawką a adsorberem membranowym. Użyj kolby lub butelki, aby złapać przepływ (znany również jako filtrat) z adsorbera.</li>
	<li>Ustawić pompę strzykawkową na żądane objętościowe natężenie przepływu, ale nie przekraczać zalecanego przez producenta natężenia przepływu (np. 10 ml/min). Przepuścić supernatant hodowli komórkowej przez adsorber membranowy, zbierając przepływ w zlewce lub innym pojemniku. Ponownie załadować strzykawkę potrzebnymi supernatantami.</li>
	<li>W razie potrzeby przetestuj przepływ pod kątem obecności białka za pomocą cytometrii przepływowej, Western blot, ELISA itp. w oparciu o preferencje laboratoryjne. Zazwyczaj nie ma potrzeby ponownego przenikania przepływu.</li>
</ol>
4. Białko elute z adsorbera błonowego
<ol>
	<li>Przemyć adsorber membranowy 10 ml DPBS, aby usunąć wszelkie niezwiązane białka.</li>
	<li>Eluować białko z adsorbera błonowego z pożądaną szybkością przepływu (np. 1 ml/min) przy użyciu 10-15 ml buforu elucyjnego (np. buforu elucyjnego na bazie amin (pH 2,8)). Złapać eluat w probówce zawierającej bufor neutralizujący (np. 1 M Tris (pH 9,4)) przy 10% objętości elucji (1,0-1,5 ml).</li>
	<li>Alternatywnie, eluować białko w przyrostach jednego ml do probówek zawierających 100 μl buforu neutralizującego, używając całkowitej objętości 10-15 ml buforu elucyjnego. Użyj preferowanej metody charakterystyki, aby przetestować każdą frakcję na obecność białka.</li>
	<li>Zregeneruj adsorber membranowy zgodnie z instrukcjami producenta. Wprowadzić 10 ml DPBS z filtrem 0,22 μm lub wybranego buforu, następnie 10 ml 50 mM NaOH z filtrem 0,22 μm w 1 N NaCl, a na koniec 10 ml DPBS z filtrem 0,22 μm. Napełnij adsorber membranowy 20% etanolem w DPBS w celu długotrwałego przechowywania w temperaturze 4 ºC.</li>
</ol>
5. Zagęść i dializuj białko
<ol>
	<li>Umieścić cały eluat (lub frakcje elucyjne zawierające białko, jak określono w kroku 4.3) w odśrodkowym filtrze odśrodkowym o masie cząsteczkowej 10 kDa. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi wirowania.</li>
	<li>Dializować retentat w jednostce dializy o małej objętości (odcięcie masy cząsteczkowej 10 kDa) w stosunku do wybranego buforu, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Może być konieczne dodanie buforu do dializowanego materiału, jeśli problemem jest wytrącanie się białka. W razie potrzeby dializowany materiał można przechowywać w lodówce do czasu wykonania kroku 6, ale nie zaleca się długotrwałego przechowywania bez konserwantów.</li>
</ol>
6. Ilościowe określenie i charakterystyka oczyszczonego produktu w przyspieszonej procedurze Western Blotting
<ol>
	<li>Rozpuścić oczyszczone wzorce białka i Fc na wybranym żelu za pomocą SDS-PAGE, w warunkach redukujących lub nieredukujących, zgodnie z życzeniem18-20. Użyj mini żelu zamiast żelu midi, aby zminimalizować czas pracy.
		<ol>
			<li>Jeśli nie jest to jeszcze znane, określ zakres wzorców Fc, w którym sygnał pasma zmienia się liniowo w zależności od ilości załadowanego ładunku (np. 0,1-1 mg). Użyj tego samego żelu, warunków pracy, warunków przenoszenia i odczynników, które będą używane do ilościowego oznaczania i charakteryzowania oczyszczonego białka.</li>
			<li>Załaduj wiele ilości próbek oczyszczonego białka, w tym próbki rozcieńczone DPBS, aby upewnić się, że oczyszczone sygnały pasma białkowego mieszczą się w liniowym zakresie sygnałów wzorców Fc w analizie obrazu.</li>
		</ol>
	</li>
	<li>Przenieść białka z żelu do membrany z polifluorku winylidenu (PVDF) w nieciągłym układzie buforowym za pomocą półsuchej bibuły13, postępując zgodnie z instrukcjami producenta bibuły. Czas transferu to zazwyczaj 5-10 minut. W razie potrzeby Coomassie wybarwić żel po przeniesieniu, aby sprawdzić skuteczność transferu21.</li>
	<li>Przeprowadzić immunoblotting za pomocą anty-Fc lub anty-IgG sprzężonego z fosfatazą alkaliczną (AP) lub peroksydazą chrzanową (HRP), w oparciu o preferencje laboratoryjne, przy użyciu wspomaganego próżniowo systemu wykrywania białek. Czas immunoblottingu wynosi zwykle mniej niż 1 godzinę.</li>
	<li>Opracować immunoblot przy użyciu wybranego substratu i metody (np. substratu AP i wzmocnionej chemiluminescencji).</li>
	<li>Określ ilościowo oczyszczone białko za pomocą analizy obrazu. Wykonaj regresję liniową na sygnałach pasma ze standardów Fc. Jeśli R2>0,90, użyj równania dla linii, aby obliczyć ilość białka na podstawie jej sygnału (sygnałów) pasma. W razie potrzeby uwzględnić rozcieńczenie próbki. Ponieważ oznaczanie ilościowe białka przeprowadza się na podstawie Fc, należy dostosować wartość dla różnic masy cząsteczkowej między białkiem a Fc. Jeśli R2<0,90, powtórzyć krok 6 w całości.</li>
	<li>Walidacja białka za pomocą testów funkcjonalnych lub metod wykrywania Fc za pomocą cytometrii przepływowej, Western blot, ELISA itp. w oparciu o preferencje laboratoryjne.</li>
	<li>Rozcieńczyć białko do pożądanego stężenia i/lub dodać wszelkie pożądane konserwanty lub stabilizatory do oczyszczonego roztworu białkowego przed podaniem do długotrwałego przechowywania, zamrożonego lub w inny sposób.</li>
</ol>

<ol><li>Gagnon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technology+trends+in+antibody+purification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Technology trends in antibody purification.</a> J. Chromatogr. A. 1221, 57-70 (2012).</li>
<li>Gottschalk, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioseparation+in+antibody+manufacturing%3A+The+good%2C+the+bad+and+the+ugly%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Prog%22%5BJournal%5D)">Bioseparation in antibody manufacturing: The good, the bad and the ugly.</a> Biotechnol. Prog. 24, 496-503 (2008).</li>
<li>Liu, H. F., Ma, J., Winter, C., Bayer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+and+purification+process+development+for+monoclonal+antibody+production%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">Recovery and purification process development for monoclonal antibody production.</a> MAbs. 2, 480-499 (2010).</li>
<li>Low, D., O'Leary, R., Pujar, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Future+of+antibody+purification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+B+Anal.+Technol.+Biomed.+Life.+Sci%22%5BJournal%5D)">Future of antibody purification.</a> J. Chromatogr. B Anal. Technol. Biomed. Life. Sci. 848, 48-63 (2007).</li>
<li>Boi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+adsorbers+as+purification+tools+for+monoclonal+antibody+purification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+B+Anal.+Technol.+Biomed.+Life.+Sci%22%5BJournal%5D)">Membrane adsorbers as purification tools for monoclonal antibody purification.</a> J. Chromatogr. B Anal. Technol. Biomed. Life. Sci. 848, (1016).</li>
<li>Cuatrecasas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+purification+by+affinity+chromatography.+Derivatizations+of+agarose+and+polyacrylamide+beads%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein purification by affinity chromatography. Derivatizations of agarose and polyacrylamide beads.</a> J. Biol. Chem. 245, 3059-3065 (1970).</li>
<li>Shukla, A. A., Gottschalk, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-use+disposable+technologies+for+biopharmaceutical+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Single-use disposable technologies for biopharmaceutical manufacturing.</a> Trends Biotechnol. 31, 147-154 (2013).</li>
<li>Boi, C., Dimartino, S., Sarti, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+a+new+protein+a+affinity+membrane+for+the+primary+recovery+of+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Prog%22%5BJournal%5D)">Performance of a new protein a affinity membrane for the primary recovery of antibodies.</a> Biotechnol Prog. 24, 640-647 (2008).</li>
<li>Dancette, O. P., Taboureau, J., Tournier, E., Charcosset, C., Blond, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+immunoglobulins+g+by+protein+a%2Fg+afinity+membrane+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+B%22%5BJournal%5D)">Purification of immunoglobulins g by protein a/g afinity membrane chromatography.</a> J. Chromatogr. B. 723, 61-68 (1999).</li>
<li>Thommes, J., Etzel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternatives+to+chromatographic+separations%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Prog%22%5BJournal%5D)">Alternatives to chromatographic separations.</a> Biotechnol. Prog. 23, 42-45 (2007).</li>
<li>Boi, C., Dimartino, S., Sarti, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+and+simulation+of+affinity+membrane+adsorption%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Modelling and simulation of affinity membrane adsorption.</a> J. Chromatogr. A. 1162, 24-33 (2007).</li>
<li>van Beijeren, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer-aided+process+design+of+affinity+membrane+adsorbers%3A+A+case+study+on+antibodies+capturing%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Pap%22%5BJournal%5D)">Computer-aided process design of affinity membrane adsorbers: A case study on antibodies capturing.</a> Chem. Pap. 62, 458-463 (2008).</li>
<li>Lauriere, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+semidry+electroblotting+system+efficiently+transfers+both+high-+and+low-molecular-weight+proteins+separated+by+sds-page%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A semidry electroblotting system efficiently transfers both high- and low-molecular-weight proteins separated by sds-page.</a> Anal. Biochem. 212, 206-211 (1993).</li>
<li>Darcy, E., Leonard, P., Fitzgerald, J., Danaher, M., O'Kennedy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+antibodies+using+affinity+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Purification of antibodies using affinity chromatography.</a> Methods Mol. Biol. 681, 369-382 (2011).</li>
<li>Hjelm, H., Hjelm, K., Sjoquist, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+a+from+staphylococcus+aureus.+Its+isolation+by+affinity+chromatography+and+its+use+as+an+immunosorbent+for+isolation+of+immunoglobulins%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Protein a from staphylococcus aureus. Its isolation by affinity chromatography and its use as an immunosorbent for isolation of immunoglobulins.</a> FEBS Lett. 28, 73-76 (1972).</li>
<li>Hober, S., Nord, K., Linhult, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+a+chromatography+for+antibody+purification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+B+Analyt.+Technol.+Biomed.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Protein a chromatography for antibody purification.</a> J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 848, 40-47 (2007).</li>
<li>Kronvall, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+surface+component+in+group+a%2C+c%2C+and+g+streptococci+with+non-immune+reactivity+for+immunoglobulin+g%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A surface component in group a, c, and g streptococci with non-immune reactivity for immunoglobulin g.</a> J. Immunol. 111, 1401-1406 (1973).</li>
<li>Cedeno-Laurent, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+nascent+galectin-1+chimeric+molecule+for+studying+the+role+of+leukocyte+galectin-1+ligands+and+immune+disease+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Development of a nascent galectin-1 chimeric molecule for studying the role of leukocyte galectin-1 ligands and immune disease modulation.</a> J. Immunol. 185, 4659-4672 (2010).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+t4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage t4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+Procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 4350-4354 (1979).</li>
<li>Reisner, A. H., Nemes, P., Bucholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+Coomassie+brilliant+blue+g250+perchloric+acid+solution+for+staining+in+electrophoresis+and+isoelectric+focusing+on+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The use of Coomassie brilliant blue g250 perchloric acid solution for staining in electrophoresis and isoelectric focusing on polyacrylamide gels.</a> Anal. Biochem. 64, 509-516 (1975).</li>
<li>Cedeno-Laurent, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+inhibition+of+galectin-1-binding+carbohydrates+accentuates+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Metabolic inhibition of galectin-1-binding carbohydrates accentuates antitumor immunity.</a> J. Invest. Dermatol. 132, 410-420 (2012).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvolume+Protein+Concentration+Determination+using+the+NanoDrop+2000c+Spectrophotometer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer.</a> J. Vis. Exp. (33), (2009).</li>
<li>Ernst, O., Zor, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linearization+of+the+Bradford+Protein+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Linearization of the Bradford Protein Assay.</a> J. Vis. Exp. (38), (2010).</li>
<li>Simonian, M. H., Smith, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrophotometric+and+colorimetric+determination+of+protein+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Mol.+Biol.+Chapter%22%5BJournal%5D)">Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter. 10, 10-1002 (2006).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).</li>
<li>Gravel, C., Li, C., Wang, J., Hashem, A. M., Jaentschke, B., Van Domselaar, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Analyses+of+all+Influenza+Type+A+Viral+Hemagglutinins+and+Neuraminidases+using+Universal+Antibodies+in+Simple+Slot+Blot+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays.</a> J. Vis. Exp. (50), (2011).</li>
</ol>

Nie ma nic do ujawnienia.

Opisany w niniejszym dokumencie protokół został opracowany w celu szybkiego wyizolowania i scharakteryzowania chimerycznego białka fuzyjnego eksprymującego ludzki Fc (Gal-1hFc), bez znacznego uszczerbku dla odzysku produktu lub zawyżania kosztów. Kluczowymi elementami usprawnionego przepływu pracy są adsorber błonowy białka A do izolacji oraz transfer półsuchy i wspomagane próżniowo immunoblotting do scharakteryzowania za pomocą Western blot.
Dramatyczne skrócenie czasu przetwarzania w celu iz...

Izolacja przeciwciał i rekombinowanych białek wyrażających fragmenty immunoglobuliny G (IgG) Fc z supernatantów hodowli komórkowych i rozcieńczonych roztworów komórek lizowanych może być przeprowadzona za pomocą chromatografii powinowactwa białka A. W laboratoriach i przemyśle nauk podstawowych i inżynieryjnych kolumny wypełnione porowatym białkiem A, agarozą, szkłem lub kulkami polimerowymi są najczęściej używane do chromatografii powinowactwa, pomimo wysokich kosztów finansowych i długiego czasu przetwarzania1-3. Powszechnie uznaje się, że chromatografia powinowactwa stanowi największy wydatek i wąskie gardło w przetwarzaniu zarówno w warunkach laboratoryjnych, jak i przemysłowych2,4. W rezultacie opracowano liczne ulepszenia w celu obniżenia kosztów i czasu przetwarzania bez poświęcania ogólnego odzysku produktu z ciągu procesowego1,2,5-7. Szczególnie obiecująca w izolacji przeciwciał i innych białek wykazujących ekspresję Fc jest chromatografia powinowactwa z wykorzystaniem adsorbera błonowego białka A2,5,7-10. Podczas gdy wychwyt Fc w chromatografii kolumnowej jest ograniczony dyfuzją (tj. białko wykazujące ekspresję Fc musi dyfundować do i przez wewnętrzne pory, aby dotrzeć do większości białka A) przy dużym spadku ciśnienia w kolumnie, transport masy w adsorberach membranowych jest napędzany przez konwekcję masową, co skutkuje uniknięciem ograniczeń dyfuzji8,9,11,12. Ponadto spadek ciśnienia w adsorberze membranowym jest niski, co pozwala na szybsze natężenie przepływu perfuzji w porównaniu z kolumnamiwypełnionymi kulkami 8,9,11,12. W związku z tym, w przypadku izolacji na skalę laboratoryjną, przewiduje się, że chromatografia membranowa skróci czas izolacji o kilka godzin i zwiększy wychwytywanie produktu w porównaniu z chromatografią kolumnową. Ponadto zaproponowano modele matematyczne adsorpcji IgG w adsorberach membranowych8,9,11,12, umożliwiając w ten sposób użytkownikom końcowym przewidywanie wydajności w laboratorium.
Kolejnym wąskim gardłem w podstawowych laboratoriach naukowych i inżynieryjnych jest charakterystyka białka wykazującego ekspresję Fc. Jednak wybór odpowiednich metod do przeprowadzenia testów charakteryzacyjnych, takich jak Western Blot, może znacznie skrócić czas poświęcony na testowanie produktu. Na przykład półsuchy transfer w nieciągłym systemie buforowym może osiągnąć elektroforetyczny transfer białek z żelu SDS-PAGE do membrany z polifluorydu winylu (PVDF) w ciągu kilku minut, w przeciwieństwie do 1-2 godzin w zbiorniku (na mokro) w ciągłym systemie buforowym13.
Szybki, tani i skuteczny protokół do izolacji i charakteryzacji chimerycznego białka fuzyjnego wyrażającego fragment Fc ludzkiej IgG jest opisany tutaj. Większość sprzętu jest łatwo dostępna w standardowych laboratoriach podstawowych nauk biomedycznych, biologii, chemii i inżynierii (bio)chemicznej, a wszystkie odczynniki są dostępne na rynku. Chociaż reprezentatywne wyniki uzyskano na podstawie izolacji i charakterystyki mysiego chimerycznego białka fuzyjnego galektyny-1 / ludzkiego Fc (Gal-1hFc), uproszczony protokół można zastosować do izolacji innych cząsteczek, które posiadają fragment Fc. takie jak przeciwciała, same fragmenty Fc lub inne białka fuzyjne Fc. Nasze ulepszenia radykalnie skróciły czas przetwarzania (zaledwie 4 godziny, ale zazwyczaj ~9 godzin, w porównaniu do 20+ godzin pracy), jednocześnie osiągając podobny lub lepszy odzysk produktu w porównaniu ze standardowymi metodami.

<table><tbody><tr><td>Adsorber błonowy białka A (Sartobind Protein A 2 ml)&nbsp;</td><td>Sartorius-Stedim</td><td>93PRAP06HB-12--A</td><td></td></tr><tr><td>Filtr odśrodkowy Amicon Ultra, 10 kDa, 4 ml</td><td>Millipore</td><td>UFC801008</td><td>W razie potrzeby użyj objętości 15 ml</td></tr><tr><td>Sterylny filtr próżniowy, 0,22 i mikro; m, 500 ml</td><td>Millipore</td><td>SCGPU05RE</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Strzykawki z końcówkami Luer Lock</td><td>BD</td><td>301604</td><td></td></tr><tr><td>30 ml Strzykawki z końcówkami Luer Lock</td><td>BD</td><td>309650</td><td></td></tr><tr><td>Rurki laboratoryjne Tygon (1/16 cala x 1/8 cala x 50 stóp)</td><td>Cole Parmer</td><td>WU-95903-16</td><td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer MINI urządzenia do dializy (10K MWCO)</td><td>Thermo Scientific</td><td>69576</td><td></td></tr><tr><td>Tacka do pobierania przeciwciał Snap i.d.</td><td>EMD Millipore</td><td>WBAVDABTR</td><td></td></tr><tr><td>Snap i.d. uchwyt na blosy jednostudzienkowe</td><td>EMD Millipore</td><td>WBAVDBH01</td><td></td></tr><tr><td>Bufor elucyjny</td><td>Thermo Scientific</td><td>21004</td><td></td></tr><tr><td>Tris, ultra czysty</td><td>Fisher Scientific</td><td>819623</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>DPBS z Ca2+/Mg2+</td><td>Life Technologies</td><td>14080-055</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Human Fc</td><td>Bethyl Research Laboratories</td><td>P80-104</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human Fc-APC</td><td>Jackson Badania immunologiczne</td><td>109136170</td><td></td></tr><tr><td>Anty-ludzki Fc-AP</td><td>Bio-Rad</td><td>170-5018</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże fosfatazy alkalicznej</td><td>Promega</td><td>S3841</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do cytometrii przepływowej (5 ml polistyrenu lub polipropylenu)</td> <td>352054 BD</td><td>Pompa</td><td></td></tr><tr><td>strzykawkowa</td><td>Aparat Harvard</td><td>55-2226</td><td>Dopuszczalna jest również pompa perystaltyczna</td></tr><tr><td>Żel białkowy system do elektroforezy</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>552BR094876</td><td>Każdy system elektroforezy żelowej jest dopuszczalny, ale najszybsze działają mini systemy żelowe</td></tr><tr><td>Bibuła półsucha</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>690BR006163</td><td>Każdy system transferu jest dopuszczalny, ale nieciągłe systemy transferowe wykonują najszybszy transfer elektroforetyczny</td></tr><tr><td>SNAP i.d. próżniowy system wykrywania białek</td><td>EMD Millipore</td><td>WBAVDBASE</td><td>Ulepszony model zastąpił ten konkretny instrument, ale każdy z nich powinien działać równie dobrze</td></tr></tbody></table>

izolacja i charakterystyka chimerycznych ludzkich białek eksprymujących fc przy użyciu adsorberów błonowych białka a i usprawnionego przepływu pracy

Isolation and Characterization Of Chimeric Human Fc-expressing Proteins Using Protein A Membrane Adsorbers And A Streamlined Workflow

Skala laboratoryjna do skali przemysłowej Oczyszczanie biomolekuł z supernatantów hodowli komórkowych i lizowanych roztworów komórkowych można przeprowadzić za pomocą chromatografii powinowactwa. Podczas gdy chromatografia powinowactwa z użyciem porowatego białka A kulki agarozy upakowane w kolumnach jest prawdopodobnie najczęstszą metodą laboratoryjnej izolacji przeciwciał i rekombinowanych białek wyrażających fragmenty Fc IgG, może to być czasochłonny i kosztowny proces. Czas i finanse Ograniczenia są szczególnie uciążliwe w małych laboratoriach nauk podstawowych, które muszą odzyskiwać setki mikrogramów do miligramów białka z rozcieńczonych roztworów, ale nie mają dostępu do wysokociśnieniowych systemów dostarczania cieczy i/lub personelu posiadającego wiedzę specjalistyczną w zakresie bioseparacji. Co więcej, kwantyfikacja i charakterystyka produktu może również nadmiernie wydłużyć czas przetwarzania o kilka dni roboczych i zawyżać wydatki (materiały eksploatacyjne, płace itp.). Dlatego potrzebny jest szybki, niedrogi, ale skuteczny protokół do izolacji i charakterystyki przeciwciał i innych białek zawierających fragment Fc na skalę laboratoryjną. W tym celu opracowaliśmy protokół, który może być wykonany przez personel techniczny o ograniczonym doświadczeniu w czasie krótszym niż 9 godzin (mniej więcej jeden dzień roboczy) i w ciągu zaledwie 4 godzin. W przeciwieństwie do tradycyjnych metod, które wymagają 20+ godzin pracy. Większość wymaganego sprzętu jest łatwo dostępna w standardowych laboratoriach nauk biomedycznych, biochemii i inżynierii (bio)chemicznej, a wszystkie odczynniki są dostępne na rynku. Aby zademonstrować ten protokół, przedstawiono reprezentatywne wyniki, w których chimeryczna mysia galektyna-1 połączona z ludzkim Fc (Gal-1hFc) z supernatantu hodowli komórkowej została wyizolowana przy użyciu adsorbera błonowego białka A. Oczyszczony Gal-1hFc oznaczono ilościowo przy użyciu przyspieszonej procedury analizy Western blot i scharakteryzowane za pomocą cytometrii przepływowej. Usprawniony przepływ pracy można zmodyfikować dla innych białek wykazujących ekspresję Fc, takich jak przeciwciała, i/lub zmienić w celu uwzględnienia alternatywnych metod kwantyfikacji i charakterystyki.

Uproszczony protokół izolacji i charakterystyki białek wykazujących ekspresję Fc jest rutynowo stosowany do przetwarzania chimerycznej mysiej galektyny-1 połączonej z ludzkim fragmentem Fc (Gal-1hFc) z rozcieńczonych supernatantów hodowli komórkowych. Schemat blokowy na Rysunku 2 ilustruje przebieg pracy oraz czas trwania każdego etapu protokołu. Dla typowej partii 300 ml supernatantu całkowity czas przetwarzania wynosi około 9 hr, jeśli przeprowadzona zostanie opcjonalna analiza frakcji elucji za pomocą...

W porównaniu z tradycyjną chromatografią powinowactwa z użyciem kolumn wypełnionych kulkami białka A, adsorbery błonowe białka A mogą znacznie przyspieszyć laboratoryjną izolację przeciwciał i innych białek wyrażających fragmenty Fc. Odpowiednie metody analizy i kwantyfikacji mogą jeszcze bardziej przyspieszyć przetwarzanie białek, pozwalając na zakończenie izolacji/charakterystyki w ciągu jednego dnia roboczego, zamiast 20+ godzin pracy.

Izolacja i charakterystyka chimerycznych ludzkich białek eksprymujących Fc przy użyciu adsorberów błonowych białka A i usprawnionego przepływu pracy

Laboratory scale to industrial scale purification of biomolecules from cell culture supernatants and lysed cell solutions can be accomplished using ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wydajne i skuteczne izolowanie oraz charakteryzowanie chimerycznych białek ludzkiego FC przy użyciu absorbentów membranowych z białkiem A oraz usprawnionego schematu postępowania. Jest to osiągane poprzez wstępne klarowanie supernatantu z hodowli komórkowej za pomocą filtra o rozmiarze 0,22 mikrona. Drugim krokiem jest montaż układu przepływowego i rozpoczęcie perfuzji supernatantu z hodowli komórkowej przez absorbent membranowy z białkiem A.Następnie białko wykazujące ludzki fragment Fc jest eluowane z absorbera membranowego, a uzyskany eluat jest zagęszczany poprzez ultrafiltrację, po której następuje wymiana buforu za pomocą dializy. Ostatnimi krokami są cytometria przepływowa oraz western blotting w celu określenia jakości i ilości zagęszczonego białka. W końcowym rozrachunku absorbery membranowe z białkiem A, wraz z usprawnionym schematem postępowania, wykazują skrócenie czasu przetwarzania oraz potencjalny wzrost wydajności białka w porównaniu z tradycyjną chromatografią powinowactwa z wykorzystaniem kolumn Protein A AroSpeed).Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak kolumnowa chromatografia powinowact

isolation-characterization-chimeric-human-fc-expressing-proteins

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Izolacja i Charakteryzacja Chimerycznych Białek Ludzkich Fc Za Pomocą Adsorbencji Membranowej Białka A i Uproszczonego Przepływu Pracy

Przepuszczalny przez błony komórkowe czynnik sieciujący DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] stabilizuje przejściowe i nietrwałe oddziaływania in vivo, co umożliwia ich izolację przy użyciu rygorystycznych technik oczyszczania kompleksów białkowych. W niniejszym materiale przedstawiamy technikę sieciowania komórek hodowlanych, a następnie izolacji kompleksów białkowych metodą immunoprecypitacji.

Izolacja nietrwałych kompleksów wielobiałkowych za pomocą kontrolowanego sieciowania komórkowego in vivo oraz immunomagnetycznej chromatografii powinowactwa

Opracowano i szczegółowo opisano nowatorski i wysoce wydajny dwuetapowy protokół chromatografii powinowactwa. Metoda ta opiera się na niewielkim znaczniku oczyszczającym o dwóch wrodzonych powinowactwach i jest możliwa do zastosowania w odniesieniu do szerokiego zakresu białek docelowych o różnych właściwościach.<br...

Ortogonalne oczyszczanie białek wspomagane przez mały bispecyficzny znacznik powinowactwa

W erze genomiki post-humanistycznej dostępność białek rekombinowanych w natywnych konformacjach jest kluczowa dla badań i rozwoju w obszarze strukturalnym, funkcjonalnym oraz terapeutycznym. W niniejszej pracy opisujemy system ekspresji białek w skali testowej i przemysłowej z wykorzystaniem ludzkich komórek embrionalnej nerki 293T, który może być stosowany do produkcji różnorodnych białek rekombinowanych.

Wygodna i uniwersalna platforma ekspresyjna do produkcji białek wydzielanych z komórek ludzkich

Ten film demonstruje test do oczyszczania przeciwciał monoklonalnych z płynu do hodowli komórkowych pobranego z komórek jajnika chomika chińskiego. Wykorzystuje porowatą żywicę szklaną z unieruchomionym białkiem A, które wiąże się z regionem Fc przeciwciał w próbce, skutecznie oddzielając je od zanieczyszczeń. Zastosowanie buforu elucyjnego o niskim pH osłabia interakcję, ułatwiając pobieranie oczyszczonych przeciwciał.

Technika oczyszczania przeciwciał monoklonalnych wytwarzanych przez komórki jajnika chomika chińskiego

Ten film demonstruje technikę oczyszczania przeciwciał monoklonalnych z supernatantu hodowli uzyskanego z hodowli komórkowej wytwarzającej przeciwciała. Proces ten polega na wykorzystaniu matrycy usieciowanych kulek agarozy ze sprzężonym białkiem A, które unieruchamia przeciwciała w supernatancie na kulkach, co pozwala na skuteczne oddzielenie od zanieczyszczeń. Poprzez zastosowanie buforu elucyjnego o niskim pH oddziaływanie białka A z przeciwciałem zostaje rozluźnione, co ułatwia zbieranie...

Technika chromatografii powinowactwa do oczyszczania przeciwciał monoklonalnych

Strukturalnie powiązane białka często pełnią odrębne funkcje biologiczne. Wymiana równoważnych regionów tych białek w celu wytworzenia białek chimerycznych stanowi innowacyjne podejście do identyfikacji krytycznych regionów białkowych, które są odpowiedzialne za ich funkcjonalną dywergencję.

Identyfikacja funkcjonalnych regionów białkowych poprzez budowę białek chimerycznych

Opisano szczegółowy protokół oczyszczania i późniejszej analizy przeciwciała monoklonalnego z pobranego płynu do hodowli komórek (HCCF) zautomatyzowanych mikrobioreaktorów. Przedstawiono również wykorzystanie analiz do określenia krytycznych atrybutów jakości (CQA) i maksymalizacji ograniczonej objętości próbki w celu wyodrębnienia istotnych informacji.

Oczyszczanie i analiza przeciwciała monoklonalnego z komórek jajnika chomika chińskiego przy użyciu zautomatyzowanego systemu mikrobioreaktora

Metoda BSelex do identyfikacji i odzyskiwania pojedynczych przeciwciał specyficznych dla antygenu z komórek jednojądrzastych ludzkiej krwi obwodowej łączy cytometrię przepływową z PCR pojedynczych komórek i klonowaniem.

Metoda przesiewowa pojedynczych komórek w celu selekcji i odzyskiwania przeciwciał o pożądanej swoistości ze wzbogaconych populacji komórek B ludzkiej pamięci

W tej procedurze, ligand epitopowy oparty na DsRed jest unieruchamiany w celu wytworzenia wysoce selektywnej żywicy o powinowactwie do wychwytywania przeciwciał monoklonalnych z surowych ekstraktów roślinnych lub supernatantów do hodowli komórkowych, jako alternatywa dla białka A.

Aktywowana usieciowana agaroza do szybkiego rozwoju żywic chromatograficznych o powinowactwie - wychwytywanie przeciwciał jako studium przypadku

Opracowanie dwufunkcyjnego koniugatu peptydu antygenowego i mimetyki Fc-III (DCAF) jest nowatorskie dla eliminacji szkodliwych przeciwciał. W tym miejscu opisujemy szczegółowy protokół syntezy cząsteczki DCAF1, która może selektywnie blokować przeciwciało 4G2 w celu wyeliminowania efektu wzmocnienia zależnego od przeciwciał podczas infekcji wirusem dengi.

Celowane blokowanie przeciwciał przez dwufunkcyjny koniugat peptydu antygenowego i mimetyki Fc-III (DCAF)

Poznaj izolację i charakteryzację ludzkich białek Fc przy użyciu adsorberów błonowych białka A. Ta metoda skraca czas przetwarzania i zwiększa wydajność w porównaniu do tradycyjnej chromatografii.

Izolacja i charakterystyka chimerycznych ludzkich białek eksprymujących Fc przy użyciu adsorberów błonowych białka A i usprawnionego przepływu pracy (Wideo) | JoVE Journal

Izolacja i charakterystyka chimerycznych ludzkich białek eksprymujących Fc przy użyciu adsorberów błonowych białka A i usprawnionego przepływu pracy

Przeglądaj więcej filmów