Name: Immunoterapia dolimfatyczna i szczepienie u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Poznaj metodę immunoterapii dolimfatycznej u myszy poprzez bezpośrednie wstrzyknięcie szczepionki do węzłów chłonnych pachwinowych. Technika ta znacznie zwiększa skuteczność szczepienia w porównaniu do tradycyjnych metod podskórnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy są wdzięczni za eksperymentalną pomoc w opracowaniu metody immunizacji dolimfatycznej u myszy od Iris Erdmann, Barbary von Beust i Julii Marii Martínez-Gómez. Dziękujemy również Maggy Arras i Nikoli Cesarovic za to, że pozwoliły nam wykorzystać swoją salę operacyjną do tej produkcji wideo.

1. Znieczulenie myszy
<ol>
	<li>Przygotuj środki znieczulające, mieszając ketaminę (znieczulenie dysocjacyjne) i ksylazynę (uspokajające i przeciwbólowe) w buforowanej soli fizjologicznej. Stężenia ketaminy i ksylazyny w roztworze końcowym wynoszą odpowiednio 12,5 i 2 mg/ml.</li>
	<li>Wstrzyknąć środki znieczulające myszom po podaniu dootrzewnowym za pomocą strzykawki z igłą 25-30 G. Stosować 0,1 ml/10 g masy ciała.</li>
	<li>Nałóż maść okulistyczną na oczy myszy, aby zapobiec wysuszeniu rogówki.</li>
	<li>Upewnij się, że mysz jest wystarczająco znieczulona, ściskając jej stopę lub palec u nogi kleszczami. Jeśli mysz nie reaguje odruchowo na szczypanie, przystąp do operacji. Jeśli mysz zareaguje na szczypanie odruchami lub skurczami mięśni, odczekaj 1-2 minuty i powtórz test szczypania. Jeśli mysz nadal reaguje, zastąp ją nowym zwierzęciem i powtórz procedury od kroku 1.2.</li>
</ol>
2. Chirurgiczne nacięcie okolicy pachwinowej myszy
<ol>
	<li>Umieść mysz na plecach.</li>
	<li>Zwilż jedną okolicę pachwinową dezynfekującym etanolem (70%). Aby zapewnić lepszą dezynfekcję, okolicę pachwinową można ogolić w celu usunięcia sierści przed dezynfekcją etanolem.</li>
	<li>Chwyć tylną nogę i zegnij staw biodrowy, aby uzyskać kąt stawu biodrowego pod kątem około 90°.</li>
	<li>Za pomocą zakrzywionych kleszczy do mikropreparacji weź skórę myszy w okolicy pachwinowej, w której zgięty jest staw biodrowy i lekko pociągnij zwilżoną skórę do góry.</li>
	<li>Przytrzymując skórę kleszczami, wytnij małe nacięcie (<5 mm) na wylot skóry za pomocą nożyczek chirurgicznych.</li>
	<li>Umieść końcówkę zamkniętych nożyczek w nacięciu i dalej otwórz nacięcie, otwierając nożyczki, trzymając je wewnątrz nacięcia. Spowoduje to rozerwanie się skóry i powinno mieć średnicę mniejszą niż 10 mm. Uwaga: W celu poprawy widoczności można użyć zimnego źródła światła z elastycznymi światłowodami. U starszych myszy, zwłaszcza samców, identyfikacja węzła chłonnego może być trudna ze względu na dużą ilość tkanki tłuszczowej w okolicy pachwinowej.</li>
</ol>
3. Wstrzyknięcie dolimfatyczne
<ol>
	<li>Przygotować strzykawkę (0,5 ml lub mniej) z igłą podskórną o sile 28-30 g; krótkie skos może być lepszy niż długi skos. Pobrać 10 μl szczepionki do wstrzyknięcia i upewnić się, że strzykawka jest wolna od powietrza.</li>
	<li>Zlokalizuj pachwinowy węzeł chłonny za pomocą zakrzywionych kleszczy i końcówki zamkniętych nożyczek. Węzeł chłonny będzie wyglądał na szarawy w bardziej białawej tkance tłuszczowej i może być dalej identyfikowany przez naczynia włosowate doprowadzające i odprowadzające wchodzące i wychodzące z węzła chłonnego.</li>
	<li>Unieruchomić węzeł chłonny, trzymając go między gałęziami zakrzywionych kleszczy.</li>
	<li>Wziąć strzykawkę i wprowadzić igłę do węzła chłonnego skosem skierowanym do góry, upewniając się, że cały skos wchodzi do węzła chłonnego.</li>
	<li>Wstrzyknąć szczepionkę (10 μl). Jeśli węzeł chłonny puchnie (powiększa się), można założyć, że wstrzyknięcie się powiodło. Jeśli igła nie zostanie umieszczona wystarczająco głęboko w węźle chłonnym, część lub cała szczepionka może wycieknąć i nie dostać się do węzła chłonnego. Jeśli igła zostanie wprowadzona zbyt głęboko, wstrzyknięta szczepionka zostanie uwolniona podskórnie poniżej węzła chłonnego. W tym drugim przypadku należy powtórzyć wstrzyknięcie lub wymienić mysz na nową, nieleczoną mysz.</li>
</ol>
4. Zamykanie nacięcia przez zszywanie
<ol>
	<li>Otwórz opakowanie sterylnych szwów chirurgicznych.</li>
	<li>Chwycić igłę do szycia za pomocą uchwytu igły w dystalnej części korpusu igły. Dokręcić uchwyt igły, ściskając go, aż pierwsza grzechotka się złapie.</li>
	<li>Chwyć skórę po jednej stronie nacięcia za pomocą kleszczy (w zależności od preferencji chirurga można użyć kleszczy zębatych lub nieząbkowanych lub haczyków do skóry). Wbić igłę ok. 2-3 mm od krawędzi nacięcia, wchodząc od zewnątrz skóry.</li>
	<li>Poluzuj uchwyt skóry kleszczami i chwyć kleszczami przeciwną stronę nacięcia. Wbić igłę ok. 2-3 mm od krawędzi nacięcia, wchodząc od wewnętrznej strony skóry.</li>
	<li>Poluzować uchwyt igły i chwycić koniec igły kleszkami. Przeciągnij igłę z bieżnikiem przez skórę, pozostawiając dogodną długość bieżnika poza pierwszym punktem wkłucia igły (jeśli ma być leczonych kilka myszy, pozostaw krótszy koniec; 5-10 myszy można operować za pomocą jednej igły/bieżnika do szycia).</li>
	<li>Wykonaj preferowany węzeł zgodnie ze standardowymi protokołami chirurga. Jeden szew jest wystarczający, jeśli nacięcie nie jest większe niż 10 mm. W przypadku większych nacięć wykonaj drugi ścieg.</li>
</ol>
5. Leczenie pooperacyjne
<ol>
	<li>Umieść mysz w klatce i przykryj chusteczkami, aby się ogrzały. Podczas leczenia wielu myszy umieść je blisko siebie, aby się ogrzać. Alternatywnie umieść myszy na ciepłej podkładce, aż się obudzą.</li>
	<li>Obserwuj myszy, aż się obudzą.</li>
	<li>Obserwuj myszy codziennie pod kątem gojenia się ran, a także innych objawów klinicznych, takich jak infekcje ran. Rana jest zazwyczaj wystarczająco zamknięta w ciągu dwóch dni i zagojona w ciągu siedmiu dni od zabiegu.</li>
</ol>

<ol><li>Johansen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+intralymphatic+injection+of+peptide+vaccines+enhances+immunogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Direct intralymphatic injection of peptide vaccines enhances immunogenicity.</a> Eur. J. Immunol. 35, 568-574 (2005).</li>
<li>Maloy, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intralymphatic+immunization+enhances+DNA+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Intralymphatic immunization enhances DNA vaccination.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 3299-3303 (2001).</li>
<li>Smith, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+DNA+vaccination+by+sequential+injection+of+lymph+nodes+with+plasmid+vectors+and+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Enhancing DNA vaccination by sequential injection of lymph nodes with plasmid vectors and peptides.</a> Vaccine. 27, 2603-2615 (2009).</li>
<li>Kreiter, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranodal+vaccination+with+naked+antigen-encoding+RNA+elicits+potent+prophylactic+and+therapeutic+antitumoral+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Intranodal vaccination with naked antigen-encoding RNA elicits potent prophylactic and therapeutic antitumoral immunity.</a> Cancer Res. 70, 9031-9040 (2010).</li>
<li>Johansen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+kinetics+determines+immune+reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Antigen kinetics determines immune reactivity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5189-5194 (2008).</li>
<li>Smith, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph+node-targeted+immunotherapy+mediates+potent+immunity+resulting+in+regression+of+isolated+or+metastatic+human+papillomavirus-transformed+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Lymph node-targeted immunotherapy mediates potent immunity resulting in regression of isolated or metastatic human papillomavirus-transformed tumors.</a> Clin. Cancer Res. 15, 6167-6176 (2009).</li>
<li>Johansen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+ligands+as+adjuvants+in+allergen-specific+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Allergy%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor ligands as adjuvants in allergen-specific immunotherapy.</a> Clin. Exp. Allergy. 35, 1591-1598 (2005).</li>
<li>Johansen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+denaturation%2C+a+simple+method+to+improve+the+immunotherapeutic+potential+of+allergens%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Heat denaturation, a simple method to improve the immunotherapeutic potential of allergens.</a> Eur. J. Immunol. 35, 3591-3598 (2005).</li>
<li>Martinez-Gomez, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intralymphatic+injections+as+a+new+administration+route+for+allergen-specific+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Arch.+Allergy+Immunol%22%5BJournal%5D)">Intralymphatic injections as a new administration route for allergen-specific immunotherapy.</a> Int. Arch. Allergy Immunol. 150, 59-65 (2009).</li>
<li>Martinez-Gomez, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+MHC+class+II+pathway+of+antigen+presentation+enhances+immunogenicity+and+safety+of+allergen+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Allergy%22%5BJournal%5D)">Targeting the MHC class II pathway of antigen presentation enhances immunogenicity and safety of allergen immunotherapy.</a> Allergy. 64, 172-178 (2009).</li>
<li>Mohanan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Administration+routes+affect+the+quality+of+immune+responses%3A+A+cross-sectional+evaluation+of+particulate+antigen-delivery+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Administration routes affect the quality of immune responses: A cross-sectional evaluation of particulate antigen-delivery systems.</a> J. Control Release. 147, 342-349 (2010).</li>
<li>Waeckerle-Men, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph+node+targeting+of+BCG+vaccines+amplifies+CD4+and+CD8+T-cell+responses+and+protection+against+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Lymph node targeting of BCG vaccines amplifies CD4 and CD8 T-cell responses and protection against Mycobacterium tuberculosis.</a> Vaccine. 31, 1057-1064 (2013).</li>
<li>von Beust, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+therapeutic+index+of+CpG+oligodeoxynucleotides+by+intralymphatic+administration%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Improving the therapeutic index of CpG oligodeoxynucleotides by intralymphatic administration.</a> Eur. J. Immunol. 35, 1869-1876 (2005).</li>
<li>Senti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intralymphatic+immunotherapy+for+cat+allergy+induces+tolerance+after+only+3+injections%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Allergy+Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Intralymphatic immunotherapy for cat allergy induces tolerance after only 3 injections.</a> J. Allergy Clin. Immunol. 129, 1290-1296 (2012).</li>
<li>Senti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intralymphatic+allergen+administration+renders+specific+immunotherapy+faster+and+safer%3A+a+randomized+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Intralymphatic allergen administration renders specific immunotherapy faster and safer: a randomized controlled trial.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 17908-17912 (2008).</li>
<li>Lesterhuis, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Route+of+administration+modulates+the+induction+of+dendritic+cell+vaccine-induced+antigen-specific+T+cells+in+advanced+melanoma+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Route of administration modulates the induction of dendritic cell vaccine-induced antigen-specific T cells in advanced melanoma patients.</a> Clin. Cancer Res. 17, 5725-5735 (2011).</li>
<li>Fadul, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+response+in+patients+with+newly+diagnosed+glioblastoma+multiforme+treated+with+intranodal+autologous+tumor+lysate-dendritic+cell+vaccination+after+radiation+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunother%22%5BJournal%5D)">Immune response in patients with newly diagnosed glioblastoma multiforme treated with intranodal autologous tumor lysate-dendritic cell vaccination after radiation chemotherapy.</a> J. Immunother. 34, 382-389 (2011).</li>
<li>Eizenberg, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acceptance+of+Intanza%28R%29+9+mug+intradermal+influenza+vaccine+in+routine+clinical+practice+in+Australia+and+Argentina%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Ther%22%5BJournal%5D)">Acceptance of Intanza(R) 9 mug intradermal influenza vaccine in routine clinical practice in Australia and Argentina.</a> Adv. Ther. 28, 640-649 (2011).</li>
<li>Durando, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adjuvants+and+alternative+routes+of+administration+towards+the+development+of+the+ideal+influenza+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Vaccin%22%5BJournal%5D)">Adjuvants and alternative routes of administration towards the development of the ideal influenza vaccine.</a> Hum. Vaccin. 7, 29-40 (2011).</li>
<li>Barth, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+randomized+trial+of+ex+vivo+CD40L+activation+of+a+dendritic+cell+vaccine+in+colorectal+cancer+patients%3A+tumor-specific+immune+responses+are+associated+with+improved+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A randomized trial of ex vivo CD40L activation of a dendritic cell vaccine in colorectal cancer patients: tumor-specific immune responses are associated with improved survival.</a> Clin. Cancer Res. 16, 5548-5556 (2010).</li>
<li>Schwaab, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+immunologic+effects+of+intranodal+autologous+tumor+lysate-dendritic+cell+vaccine+with+Aldesleukin+%28Interleukin+2%29+and+IFN-%7Balpha%7D2a+therapy+in+metastatic+renal+cell+carcinoma+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Clinical and immunologic effects of intranodal autologous tumor lysate-dendritic cell vaccine with Aldesleukin (Interleukin 2) and IFN-{alpha}2a therapy in metastatic renal cell carcinoma patients.</a> Clin. Cancer Res. 15, 4986-4992 (2009).</li>
<li>Senti, G., Johansen, P., Kundig, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intralymphatic+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Allergy+Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Intralymphatic immunotherapy.</a> Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. 9, 537-543 (2009).</li>
<li>Catron, D. M., Itano, A. A., Pape, K. A., Mueller, D. L., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+first+50+hr+of+the+primary+immune+response+to+a+soluble+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Visualizing the first 50 hr of the primary immune response to a soluble antigen.</a> Immunity. 21, 341-347 (2004).</li>
<li>Itano, A. A., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+presentation+to+naive+CD4+T+cells+in+the+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antigen presentation to naive CD4 T cells in the lymph node.</a> Nat. Immunol. 4, 733-739 (2003).</li>
<li>Johansen, P., Mohanan, D., Martinez-Gomez, J. M., Kundig, T. M., Gander, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lympho-geographical+concepts+in+vaccine+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Lympho-geographical concepts in vaccine delivery.</a> J. Control Release. 148, 56-62 (2010).</li>
<li>Johansen, P., von Moos, S., Mohanan, D., Kundig, T. M., Senti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+routes+for+allergen+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Vacc.+Immunother%22%5BJournal%5D)">New routes for allergen immunotherapy.</a> Hum. Vacc. Immunother. 8, 1525-1533 (2012).</li>
<li>Senti, G., Johansen, P., Kundig, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intralymphatic+immunotherapy%3A+from+the+rationale+to+human+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top.+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Intralymphatic immunotherapy: from the rationale to human applications.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 352, 71-84 (2011).</li>
<li>Duthie, M. S., Windish, H. P., Fox, C. B., Reed, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+defined+TLR+ligands+as+adjuvants+within+human+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Use of defined TLR ligands as adjuvants within human vaccines.</a> Immunol. Rev. 239, 178-196 (2011).</li>
<li>Ribas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-lymph+node+prime-boost+vaccination+against+Melan+A+and+tyrosinase+for+the+treatment+of+metastatic+melanoma%3A+results+of+a+phase+1+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Intra-lymph node prime-boost vaccination against Melan A and tyrosinase for the treatment of metastatic melanoma: results of a phase 1 clinical trial.</a> Clin. Cancer Res. 17, 2987-2996 (2011).</li>
<li>Bedrosian, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranodal+administration+of+peptide-pulsed+mature+dendritic+cell+vaccines+results+in+superior+CD8%2B+T-cell+function+in+melanoma+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Intranodal administration of peptide-pulsed mature dendritic cell vaccines results in superior CD8+ T-cell function in melanoma patients.</a> J. Clin. Oncol. 21, 3826-3835 (2003).</li>
<li>Lesimple, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injection+by+various+routes+of+melanoma+antigen-associated+macrophages%3A+biodistribution+and+clinical+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol.+Immunother%22%5BJournal%5D)">Injection by various routes of melanoma antigen-associated macrophages: biodistribution and clinical effects.</a> Cancer Immunol. Immunother. 52, 438-444 (2003).</li>
<li>Brown, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-transduced+dendritic+cells+injected+into+skin+or+lymph+node+prime+potent+simian+immunodeficiency+virus-specific+T+cell+immunity+in+monkeys%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-transduced dendritic cells injected into skin or lymph node prime potent simian immunodeficiency virus-specific T cell immunity in monkeys.</a> J. Immunol. 171, 6875-6882 (2003).</li>
<li>Fong, L., Brockstedt, D., Benike, C., Wu, L., Engleman, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+injected+via+different+routes+induce+immunity+in+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells injected via different routes induce immunity in cancer patients.</a> J. Immunol. 166, 4254-4259 (2001).</li>
</ol>

TMK jest wymieniony jako wynalazca patentów dotyczących immunoterapii dolimfatycznej u ludzi. TMK był doradcą naukowym i otrzymał zwrot kosztów podróży od ImVisioN GmbH, Cytos Biotechnology, MannKind Corporation i XBiotech USA Inc. PJ nie ma żadnych sprzecznych interesów, aby ujawnić.

Wykazano, że immunizacja dolimfatyczna i immunoterapia są odpowiednie do stymulacji zarówno odpowiedzi przeciwciał, jak i odpowiedzi limfocytów T. Jak wykazano w tym artykule wideo, dolimfatyczna procedura szczepienia jest szybką i łatwą metodą stymulowania silnej odpowiedzi immunologicznej u myszy. Przeszkolony chirurg może wykonać zabieg w ciągu 3-4 minut. Sesja może być również dzielona między dwóch chirurgów, z których jeden zazwyczaj wykonuje znieczulenie i szycie, a drugi chirurg wykonuje nacięcie i wstrzyknięcie. ...

Szczepionki są zazwyczaj wstrzykiwane podskórnie lub domięśniowo w celu stymulacji odpowiedzi immunologicznej. Powodzenie tej procedury wymaga skutecznego drenażu szczepionki do węzłów chłonnych, gdzie komórki prezentujące antygen mogą wchodzić w interakcje z limfocytami w celu wytworzenia odpowiedzi limfocytów T i B. Ponadto siła i rodzaj wywołanych odpowiedzi immunologicznych zależą również od gęstości lub częstotliwości takich interakcji, a także od samego mikrośrodowiska, a zwłaszcza od zawartości cytokin. Ponieważ tylko niewielka część szczepionki wstrzyknięta do tkanki obwodowej dociera do węzła chłonnego, przeprowadzono szczepienia myszy i ludzi poprzez bezpośrednie wstrzyknięcie szczepionki do węzłów chłonnych, w miejscu, w którym generowana jest odpowiedź immunologiczna. U człowieka procedura jest prowadzona przez ultradźwięki, procedurę stosowaną również do podawania środków obrazowych do wizualizacji i diagnostyki w układzie limfatycznym. U myszy zabieg jest inwazyjny. Tutaj wykonuje się małe (5-10 mm) nacięcie w okolicy pachwinowej znieczulonych zwierząt1, węzeł chłonny jest lokalizowany i unieruchamiany kleszczami, a objętość 10-20 μl szczepionki wstrzykuje się pod kontrolą wzrokową; 10 μl stosuje się do pierwszych wstrzyknięć i u młodych myszy z małymi węzłami chłonnymi, podczas gdy 20 μl można wstrzyknąć do węzłów chłonnych starszych lub już przygotowanych myszy, które mają większe węzły chłonne. Nacięcie można zamknąć pojedynczym szwem za pomocą szwów chirurgicznych. Dzięki tej metodzie myszy zaszczepiono plazmidowym DNA2,3, informacyjnym RNA4, peptydem1,3,5,6, białkiem7-10, cząstkami11, bakteriami12 oraz adiuwantami7,13 i zaobserwowano silną poprawę odpowiedzi immunologicznej przeciwko wszystkim typom szczepionek. Metoda szczepienia dolimfatycznego jest szczególnie odpowiednia w sytuacjach, gdy konwencjonalne szczepienie powoduje niewystarczającą odporność lub gdy ilość dostępnej szczepionki jest ograniczona lub bardzo kosztowna. U ludzi dolimfatyczną metodę immunizacji zastosowano u pacjentów z alergią14,15 lub u pacjentów z rakiem16-21. Chociaż obecnie uważa się, że metoda dolimfatyczna jest bardziej inwazyjna niż inne metody iniekcyjne, takie jak wstrzyknięcia domięśniowe i podskórne, odczuwanie bólu nie jest wyższe niż po punkcji żylnej15. Oczekuje się, że szczepienie dolimfatyczne stanie się alternatywą lub uzupełnieniem innych metod szczepień profilaktycznych, a zwłaszcza terapeutycznych. W tym artykule szczegółowo opisano, w jaki sposób przeprowadza się procedurę szczepienia dolimfatycznego u myszy. Wszystkie opisane procedury zostały zatwierdzone przez Kantonalną Agencję Weterynaryjną w Zurychu i wykonane zgodnie ze szwajcarskimi wytycznymi federalnymi i dyrektywami dotyczącymi ochrony zwierząt wykorzystywanych do celów naukowych.

<table><tbody><tr><td>Ketamina (Ketasol-100)</td><td>Graeub AG, Szwajcaria</td><td></td><td>Środki znieczulające</td></tr><tr><td>Ksylazyna (Rompun)</td><td>Bayer, Niemcy</td><td></td><td>Środki znieczulające</td></tr><tr><td>Viscotears Żel pod oczy</td><td>Novartis, Szwajcaria</td><td></td><td>Aby zapobiec wysuszeniu oczu podczas znieczulenia.</td></tr><tr><td>BD Micro-Fine 0,5 ml</td><td>BD Medical, Francja</td><td></td><td>29 G Strzykawki insulinowe z igłami przymocowanymi na stałe</td></tr><tr><td>6-0 Dermalon Monofilament Nylon</td><td>Covidien, MA, USA</td><td></td><td>Do szwów (0,7 metrycznych, 18 G, 45 cm, niebieskich)</td></tr><tr><td>Kleszcze zakrzywione, 4,5 cala</td><td>Polymed, Szwajcaria</td><td></td><td>Do nacinania i trzymania węzła chłonnego</td></tr><tr><td>Proste nożyczki chirurgiczne, 4.5 w</td><td>Polymed, Szwajcaria</td><td></td><td>Do nacięcia</td></tr><tr><td>Uchwyt igły, 5,5 cala</td><td>Polymed, Szwajcaria</td><td></td><td>Aby zamknąć nacięcie szwem</td></tr></tbody></table>

immunoterapia dolimfatyczna i szczepienie u myszy

Intralymphatic Immunotherapy and Vaccination in Mice

Szczepionki są zazwyczaj wstrzykiwane podskórnie lub domięśniowo w celu stymulacji odpowiedzi immunologicznej. Powodzenie tego procesu wymaga skutecznego drenażu szczepionki do węzłów chłonnych, w których komórki prezentujące antygen mogą wchodzić w interakcje z limfocytami w celu wytworzenia pożądanej odpowiedzi immunologicznej. Siła i rodzaj indukowanych odpowiedzi immunologicznych zależą również od gęstości lub częstotliwości oddziaływań, a także od mikrośrodowiska, a zwłaszcza zawartości cytokin. Ponieważ tylko niewielka część szczepionek wstrzykiwanych obwodowo dociera do węzłów chłonnych, szczepienia myszy i ludzi wykonywano poprzez bezpośrednie wstrzyknięcie szczepionki do pachwinowych węzłów chłonnych, tj. wstrzyknięcie dolimfatyczne. U człowieka procedura jest prowadzona przez ultradźwięki. U myszy wykonuje się małe (5-10 mm) nacięcie w okolicy pachwinowej znieczulonych zwierząt, węzeł chłonny jest lokalizowany i unieruchamiany kleszczami, a objętość 10-20 μl szczepionki wstrzykuje się pod kontrolą wzrokową. Nacięcie zamyka się pojedynczym szwem za pomocą szwów chirurgicznych. Myszy zaszczepiono plazmidowym DNA, RNA, peptydem, białkiem, cząstkami i bakteriami, a także adiuwantami i zaobserwowano silną poprawę odpowiedzi immunologicznej przeciwko wszystkim typom szczepionek. Metoda szczepienia dolimfatycznego jest szczególnie odpowiednia w sytuacjach, gdy konwencjonalne szczepienie powoduje niewystarczającą odporność lub gdy ilość dostępnej szczepionki jest ograniczona.

Procedura wtryskiwania wewnątrzlimfatycznego u myszy, mimo swojego chirurgicznego charakteru, jest prosta i stosunkowo szybka. Przeszkolona osoba może przeprowadzić tę procedurę w 3-4 min. Cięcie zamknięte jednym szwem zazwyczaj goi się w ciągu dwóch dni (Rysunek 1)
Szczepienia lub immunizację wewnątrzlimfatyczną przeprowadzano z wykorzystaniem mRNA, plazmidowego DNA, peptydów, białek, wirusów oraz bakterii. Rysunek 2 przedstawia produkcję przeciwciał po immun...

Profilaktyczne i terapeutyczne szczepienia często nie stymulują silnej odpowiedzi immunologicznej z powodu tygodniowego drenażu szczepionki do węzłów chłonnych, a w konsekwencji słabego zaangażowania komórek odpornościowych. Poprzez bezpośrednie wstrzyknięcie szczepionki do węzłów chłonnych, tzw. wstrzyknięcie dolimfatyczne, można znacznie poprawić skuteczność szczepionki i zmniejszyć dawki szczepionki.

Immunoterapia dolimfatyczna i szczepienie u myszy

Vaccines are typically injected subcutaneously or intramuscularly for stimulation of immune responses. The success of this requires efficient drainage of ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest stymulowanie odpowiedzi immunologicznej myszy poprzez bezpośrednie wstrzyknięcie szczepionki do węzłów chłonnych. Jest to realizowane poprzez uprzednie znieczulenie myszy i wykonanie niewielkiego nacięcia w okolicy pachwinowej. Następnie należy zlokalizować i unieruchomić pachwinowe węzły chłonne.Ostatnim krokiem jest wstrzyknięcie szczepionki do węzła chłonnego pachwinowego. Ostatecznie podanie szczepionki do układu limfatycznego można ocenić poprzez pomiar odpowiedzi na nią i porównanie z tradycyjnymi metodami podania, takimi jak iniekcje podskórne. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mają trudności z precyzyjnym wprowadzeniem szczepionki do węzła chłonnego.Koordynacja unieruchomienia węzła chłonnego, wprowadzenia igły i wstrzyknięcia szczepionki może wymagać pewnej wprawy, ponieważ igła łatwo wysuwa się z właściwej pozycji, co prowadzi do podania szczepionki poza węzeł chłonny. W pierwszej kolejności należy znieczulić mysz zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym. Jak najszybciej należy nałożyć maść oftalmiczną do oczu myszy, aby zapobiec wysychaniu rogówek.Następnie ułóż mysz na grzbiecie i uciśnij stopę myszy pęsetą, aby sprawdzić, czy zwierzę jest dostatecznie znieczulone. Jeśli nie zaobserwowano reakcji, przykryj głowę myszy tkaniną w celu ochrony przed światłem i zdezynfekuj jeden z obszarów pachwinowych 70% ethanol. Następnie unieś tylną kończynę i zgnij staw biodrowy pod kątem 90 stopni.Następnie, używając zakrzywionej pęsety mikrochirurgicznej, unieś skórę w zgięciu i wykonaj niewielkie nacięcie. Następnie wprowadź końcówkę zamkniętych nożyczek w miejsce nacięcia. Rozewrzyj nożyczki, aby utworzyć otwór o średnicy mniej niż 10 mm w okolicy pachwinowej.Zidentyfikuj węzeł chłonny po jego sferycznym kształcie i szarym wyglądzie na tle bielszej otaczającej tkanki tłuszczowej. Użyj strzykawki o pojemności 0,5 ml z krótkoszczelinową igłą podskórną o rozmiarze 28 G, aby pobrać 10 µL szczepionki do wstrzyknięcia. Następnie unieruchom węzeł chłonny pomiędzy ramionami zakrzywionej pęsety.Następnie, kierując ścięciem igły ku górze, wprowadź igłę strzykawki do węzła chłonnego. Upewnij się, że całe ścięcie znajduje się wewnątrz węzła chłonnego. Wstrzyknij szczepionkę i obserwuj pojawienie się obrzęku, który wskazuje na prawidłowe wykonanie iniekcji.Otwórz opakowanie sterylnego szwu chirurgicznego za pomocą uchwytu do igieł. Chwyć igłę szewną w dystalnej części jej korpusu. Następnie zaciśnij uchwyt do igieł, aż zablokuje go pierwszy ząbek zapadki, i wyciągnij nić.Następnie chwyć skórę po jednej stronie nacięcia. Wprowadź igłę przez skórę od zewnątrz, na krawędzi nacięcia. Teraz rozluźnij uścisk na skórze i chwyć przeciwną stronę nacięcia pęsetą.Wprowadź igłę od wewnątrz skóry, około dwa do trzech milimetrów od krawędzi nacięcia. Ponownie chwyć igłę pęsetą i rozluźnij uchwyt igielny.Przeciągnij igłę z nicią przez skórę, pozostawiając odpowiednią długość nici na zewnątrz pierwszego punktu wkłucia igły. Wykonaj preferowany węzeł chirurgiczny. Jeśli nacięcie jest większe niż 10 mm.Wykonaj drugi szew, gdy nacięcie zostanie w wystarczającym stopniu zamknięte. Przenieś mysz na podkładkę grzewczą w celu rekonwalescencji. Codziennie monitoruj myszy pod kątem gojenia rany oraz innych objawów klinicznych, takich jak infekcja.Te wewnątrzlimfatyczne iniekcje u myszy są proste i stosunkowo szybkie. Nacięcie zamknięte jednym szwem zazwyczaj goi się w ciągu dwóch dni. Tutaj produkcję przeciwciał zmierzono po immunizacji białkiem fosfolipazą A2.Główny alergen jadu pszczoły. Stymulacja korzenia limfatycznego przy użyciu wstrzykniętej dawki 0,01 µg PLA₂ wywołała silną odpowiedź przeciwciał. W przypadku podania podskórnego PLA₂ wymagana była dawka 10 µg, aby uzyskać odpowiednią odpowiedź.W tym doświadczeniu zastosowano szczepienie wewnątrzlimfatyczne w celu stymulacji odpowiedzi cytotoksycznych limfocytów T. Pojedyncze wstrzyknięcie podskórne G 33 u myszy TCR 3 1 8 wywołało oczekiwaną odpowiedź cytotoksycznych limfocytów T. Została ona wzmocniona około sześć rzędów wielkości po wstrzyknięciu wewnątrzlimfatycznym. Funkcje limfocytów T CD 4 zostały również przetestowane w teście z wyzwaniem nowotworowym.Po wewnątrzżylnym podaniu myszom immunizowanym komórek syngeneicznego guza EL four wykazujących ekspresję NP 52, u zwierząt rozwinął się chłoniak systemowy. Immunizacja drogą wewnątrzlimfatyczną skutkowała znacznie dłuższym przeżyciem niż immunizacja drogą podskórną. U ludzi.Podawanie szczepionki do naczyń limfatycznych wykonuje się przy pomocy ultradźwięków poprzez lokalizację podskórnych węzłów chłonnych. Co ciekawe, u ludzi znaczniki białkowe znakowane izotopami promieniotwórczymi wskazują, że wstrzyknięcia podskórne wykazują słabą biodystrybucję do węzłów chłonnych, podczas gdy bezpośrednie wstrzyknięcie do układu limfatycznego ułatwia efektywne dostarczenie antygenu do komórek odpornościowych w celu stymulacji odpowiedzi immunologicznej. Po opanowaniu techniki, ta procedura szczepienia wewnątrzlimfatycznego może być przeprowadzona w czasie około dwóch do trzech minut na mysz.

intralymphatic-immunotherapy-and-vaccination-in-mice

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Immunoterapia wewnątrznaczyniowa i szczepienia na myszach

Prezentujemy metodę niechirurgicznego podawania materiałów testowych do płuc znieczulonych myszy poprzez tchawicę. Metoda ta umożliwia ekspozycję płuc na patogeny bakteryjne i wirusowe, cytokiny, przeciwciała, koraliki, związki chemiczne lub barwniki. Ponadto opisujemy proces pobierania i przygotowania płuc oraz drenujących je węzłów chłonnych (LDLNs) do analizy metodą cytometrii przepływowej.

Niesurgicalna instylacja endotrachealna u myszy z analizą płuc oraz drenujących płuca węzłów chłonnych za pomocą cytometrii przepływowej

Ten film demonstruje metodę obrazowania do wizualizacji in situ wydzielania interferonu gamma (IFN-γ) w śledzionie myszy. Po zakażeniu bakteryjnym i indukcji akumulacji IFN-γ w limfocytach T i komórkach NK pobiera się śledzionę od myszy. Po uzyskaniu skrawków tkanek wykonuje się barwienie immunologiczne w celu uwidocznienia IFN-γ wewnątrz komórek.

Test do identyfikacji wydzielania interferonu gamma w mysich narządach limfatycznych

Ten film demonstruje test szczepienia nowotworów na bazie komórek. Mysz, której śródskórnie wstrzyknięto komórki czerniaka B16-F10 w celu powstania guza, jest szczepiona komórkami B16-F10 wydzielającymi cytokinę Flt3L w pobliżu rozwiniętego guza. Wydzielany Flt3L ze szczepionki wspomaga dojrzewanie i proliferację komórek dendrytycznych, które następnie prezentują antygeny nowotworowe limfocytom T w węzłach chłonnych, wywołując ukierunkowaną przeciwnowotworową odpowiedź immunologiczną.

Implantacja guza i wstrzyknięcie szczepionki przeciwnowotworowej w modelu mysim

Węzły chłonne to tkanki immunologiczne, które koordynują odpowiedź immunologiczną i są kluczowym celem dla szczepionek. Biomateriały zostały wykorzystane do lepszego celowania w węzły chłonne i kontrolowania dostarczania antygenów lub adiuwantów. W artykule opisano technikę łączącą te idee w celu wstrzykiwania biokompatybilnych cząstek polimeru do węzłów chłonnych.

Iniekcja do węzłów chłonnych biodegradowalnych cząstek polimeru

Obecna praca ilustruje wygodę stosowania immunoterapii podjęzykowej w celu wzmocnienia wrodzonej odpowiedzi immunologicznej w płucach i zapewnienia ochrony przed ostrym pneumokokowym zapaleniem płuc u myszy.

Immunoterapia podjęzykowa jako alternatywa dla indukowania ochrony przed ostrymi infekcjami dróg oddechowych

Szczegółowo opisujemy metodologię stosowaną do porównania skuteczności ochronnej i odpowiedzi immunologicznej płuc indukowanej przez donosowe i podskórne szczepienie z BCG w modelu mysim. Nasze wyniki pokazują korzyści płynące ze szczepienia płuc i sugerują rolę odpowiedzi za pośrednictwem IL17 w ochronie indukowanej szczepionką.

Skuteczność ochronna i odpowiedź immunologiczna płuc po podaniu podskórnym i donosowym BCG myszom

Opisano przygotowanie antygenowych nanocząsteczek liposomalnych i ich zastosowanie w stymulowaniu aktywacji komórek B in vitro i in vivo. Spójne i silne odpowiedzi przeciwciał doprowadziły do opracowania nowego modelu alergii na orzeszki ziemne. Protokół generowania liposomów antygenowych można rozszerzyć na różne antygeny i modele immunizacji.

Liposomy antygenowe do wytwarzania przeciwciał specyficznych dla choroby

Wprowadzony tutaj protokół pozwala na scharakteryzowanie zdolności naprowadzania płuc pierwotnych ludzkich limfocytów w warunkach zapalnych in vivo. Naciek płucny adoptywnie przeniesionych ludzkich komórek odpornościowych w mysim modelu alergicznego zapalenia można zobrazować i określić ilościowo za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej arkusza świetlnego chemicznie oczyszczonej tkanki płucnej.

Zaawansowane obrazowanie ludzkich limfocytów naprowadzających płuca w eksperymentalnym modelu zapalenia alergicznego in vivo opartym na mikroskopii arkuszowej światła

Protokół przedstawia model immunoterapii nowotworów za pomocą komórkowego szczepienia guza z ekspresją Flt3L czerniaka B16-F10. Protokół ten demonstruje procedury, w tym przygotowanie hodowanych komórek nowotworowych, implantację guza, napromienianie komórek, pomiar wzrostu guza, izolację wewnątrznowotworowych komórek odpornościowych i analizę cytometrii przepływowej.

Eksperymentalny model immunoterapii czerniaka z wykorzystaniem szczepienia przeciwnowotworowego cytokiną krwiotwórczą

Obecny protokół opisuje procedurę radiologii interwencyjnej ustaloną dla iniekcji dograsiczych u myszy, aby uniknąć ryzyka otwartej operacji i poprawić dokładność ślepych iniekcji przezskórnych.

Minimalnie inwazyjna, dokładna i wydajna technika wstrzykiwania dograsiczego u myszy

Badanie pokazuje rolę skóry w modulacji odpowiedzi immunologicznych u myszy poprzez immunizację epikutanną (EC). Szczepienie EC antygenem białkowym może hamować odpowiedzi immunologiczne w przypadku nadwrażliwości kontaktowej lub odwracać supresję indukowaną przez skórę, gdy jest połączona z molekularnymi wzorcami związanymi z patogenem. Szczepienia EC wykazują obiecujące zastosowanie jako skuteczne, bezigłowe podejście do immunoterapii.

Model murinowy immunomodulacji indukowanej przez skórę

Poznaj metodę immunoterapii dolimfatycznej u myszy poprzez bezpośrednie wstrzyknięcie szczepionki do węzłów chłonnych pachwinowych. Technika ta znacznie zwiększa skuteczność szczepienia w porównaniu do tradycyjnych metod podskórnych.

Immunoterapia dolimfatyczna i szczepienie u myszy

Przeglądaj więcej filmów