Name: Technika zacisku napięciowego z otwartą szczeliną wazelinową Xenopus z fluorometrią (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-11T14:55:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Poznaj technikę zacisku napięciowego z otwartą szczeliną wazelinową w oocytach Xenopus do rejestracji prądów jonowych z wysoką rozdzielczością czasową. Ta metoda umożliwia precyzyjne badanie kinetyki kanałów jonowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wszyscy członkowie Laboratorium Inżynierii Molekularnej Uniwersytetu Waszyngtońskiego w St. Louis. Nagroda Burroughs Welcome Fund Career Award na Scientific Interface - 1010299 (dla J.S.).

<ol><li>Kalstrup, T., Blunck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+internal+pore+opening+in+KV+channels+probed+by+a+fluorescent+unnatural+amino+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dynamics of internal pore opening in KV channels probed by a fluorescent unnatural amino acid.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 8272-8277 (2013).</li>
<li>Stefani, E., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cut-open+oocyte+voltage-clamp+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Cut-open oocyte voltage-clamp technique.</a> Methods Enzymol. 293, 300-318 (1998).</li>
<li>Muroi, Y., Chanda, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+anesthetics+disrupt+energetic+coupling+between+the+voltage-sensing+segments+of+a+sodium+channel%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Local anesthetics disrupt energetic coupling between the voltage-sensing segments of a sodium channel.</a> J. Gen. Physiol. 133, 1-15 (2009).</li>
<li>Stefani, E., Toro, L., Perozo, E., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gating+of+Shaker+K%2B+channels%3A+I.+Ionic+and+gating+currents%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Gating of Shaker K+ channels: I. Ionic and gating currents.</a> Biophys. J. 66, 996-1010 (1994).</li>
<li>Wang, S., Liu, S., Morales, M. J., Strauss, H. C., Rasmusson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+analysis+of+the+activation+and+inactivation+kinetics+of+HERG+expressed+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiolt%22%5BJournal%5D)">A quantitative analysis of the activation and inactivation kinetics of HERG expressed in Xenopus oocytes.</a> J. Physiolt. 502 (Pt 1), 45-60 (1997).</li>
<li>Neely, A., Garcia-Olivares, J., Voswinkel, S., Horstkott, H., Hidalgo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+of+active+calcium+channel+beta%281b%29+-subunit+by+size-exclusion+chromatography+and+its+role+on+channel+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Folding of active calcium channel beta(1b) -subunit by size-exclusion chromatography and its role on channel function.</a> J. Biol. Chem. 279, 21689-21694 (2004).</li>
<li>Silva, J. R., Goldstein, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-sensor+movements+describe+slow+inactivation+of+voltage-gated+sodium+channels+I%3A+wild-type+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Na%28V%291.4.+J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Voltage-sensor movements describe slow inactivation of voltage-gated sodium channels I: wild-type skeletal muscle.</a> Na(V)1.4. J. Gen. Physiol. 141, 309-321 (2013).</li>
<li>Silva, J. R., Goldstein, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-sensor+movements+describe+slow+inactivation+of+voltage-gated+sodium+channels+II%3A+a+periodic+paralysis+mutation+in+Na%28V%291.4+%28L689I%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Voltage-sensor movements describe slow inactivation of voltage-gated sodium channels II: a periodic paralysis mutation in Na(V)1.4 (L689I).</a> J. Gen. Physiol. 141, 323-334 (2013).</li>
<li>Taglialatela, M., Toro, L., Stefani, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+voltage+clamp+to+record+small%2C+fast+currents+from+ion+channels+expressed+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Novel voltage clamp to record small, fast currents from ion channels expressed in Xenopus oocytes.</a> Biophys. J. 61, 78-82 (1992).</li>
<li>Clare, J. J., Trezise, D. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aClare%2C+JJ+%22Expression+and+analysis+of+recombinant+ion+channels+%3A+from+structural+studies+to+pharmacological+screening%22">Expression and analysis of recombinant ion channels : from structural studies to pharmacological screening</a>. , Wiley-VCH. (2006).</li>
<li>Susan, G. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCha%2C+A+%22Methods+in+enzymology%22">Methods in enzymology</a>. 296, Academic Press. 566-578 (1998).</li>
<li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLakowicz%2C+JR+%22Principles+of+fluorescence+spectroscopy.+3rd+edn%22">Principles of fluorescence spectroscopy. 3rd edn</a>. , Springer. (2006).</li>
<li>Cha, A., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+voltage-dependent+conformational+changes+in+the+Shaker+K%2B+channel+with+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Characterizing voltage-dependent conformational changes in the Shaker K+ channel with fluorescence.</a> Neuron. 19, 1127-1140 (1997).</li>
<li>Richards, R., Dempski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examining+the+conformational+dynamics+of+membrane+proteins+in+situ+with+site-directed+fluorescence+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Examining the conformational dynamics of membrane proteins in situ with site-directed fluorescence labeling.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li>
<li>Cohen, S., Au, S., Pante, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+Xenopus+laevis+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of Xenopus laevis oocytes.</a> J. Vis. Exp. , (2009).</li>
<li>Techniques for Chloriding Silver Wires. , Available from: 
 
 <a target="_blank" href="http://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/chloriding_wire.pdf">http://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/chloriding_wire.pdf</a> (1999).</li>
<li>Raynauld, J. P., Laviolette, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+silver-silver+chloride+electrode%3A+a+possible+generator+of+offset+voltages+and+currents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">The silver-silver chloride electrode: a possible generator of offset voltages and currents.</a> J. Neurosci. Methods. 19, 249-255 (1987).</li>
<li>Gagnon, D. G., Bissonnette, P., Lapointe, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+disulfide+bridge+linking+the+fourth+and+the+seventh+extracellular+loops+of+the+Na%2B%2Fglucose+cotransporter%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Identification of a disulfide bridge linking the fourth and the seventh extracellular loops of the Na+/glucose cotransporter.</a> J. Gen. Physiol. 127, 145-158 (2006).</li>
<li>Pantazis, A., Olcese, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPantazis%2C+A+%22Cut-Open+Oocyte+Voltage-Clamp+Technique.+In%3A+Roberts+G.+%28Ed.%29+Encyclopedia+of+Biophysics%3A+SpringerReference%22">Cut-Open Oocyte Voltage-Clamp Technique. In: Roberts G. (Ed.) Encyclopedia of Biophysics: SpringerReference</a>. Roberts, G. , Springer-Verlag Berlin Heidelberg. New York. (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Technika zacisku napięciowego z przerwą wazelinową w oocytach pozwala na szybkie rozdzielenie danych, niski poziom szumów, zwiększoną kontrolę nad wewnętrznym i zewnętrznym składem roztworu oraz stabilne zapisy w stosunkowo długich protokołach19. Te zalety odróżniają tę technikę od standardowych technik dwuelektrodowych zacisków napięciowych i zacisków krosowych. Chociaż wymagany jest specjalistyczny sprzęt, a protokół jest stosunkowo trudny, po zoptymalizowaniu systemu pojawia się bardzo niewiele problemów. P...

Specjalistyczne techniki zaciskania napięcia pozwalają na rejestrację prądów jonowych przy kontrolowanych potencjałach błonowych. Powszechnie stosowane techniki zaciskania napięcia dwuelektrodowego (TEVC) oraz patch clamp dostarczają wiarygodnych informacji elektrofizjologicznych na temat właściwości wielu kanałów jonowych. Jednak obie te metody posiadają wady, które uniemożliwiają pozyskanie wiarygodnych danych dla szybkich napięciowo zależnych kanałów sodowych oraz innych szybko aktywujących się kanałów w błonach, takich jak błony oocytów Xenopus. W związku z tym laboratoria Bezanilli i Stefaniego opracowały technikę zaciskania napięcia z przerwą wazelinową w oocytach rozciętym (COVG)2. Technika ta była szeroko stosowana do rejestracji kanałów Na+, K+ i Ca2+3-8.
Podczas rejestracji COVG membrana oocyta wykazującego ekspresję białka heterologicznego jest podzielona na trzy regiony. Dane dotyczące prądu jonowego są rejestrowane z górnego regionu oocyta, podczas gdy kąpiel otaczająca ten region jest utrwalona do potencjału sterującego, który można łatwo i szybko zmieniać. Region środkowy zapobiega prądom upływu poprzez utrwalenie go do tego samego potencjału co region górny9. Region dolny to miejsce, w którym następuje otwarcie oocyta (metoda cut-open) przy użyciu roztworu saponiny lub kaniuli. Chemiczne lub manualne otwarcie membrany w regionie dolnym umożliwia kontrolę potencjału wewnętrznego, który jest utrwalony do masy, i sprawia, że wnętrze komórki staje się ciągłe z roztworem w dolnej komorze. Perfuzja roztworów do dolnej komory pozwala na regulację właściwości środowiska wewnętrznego, natomiast wymiana roztworu w górnej komorze zmienia otoczenie zewnętrzne. 
<img alt="Schemat konstrukcji komory przedstawiający wymiary sekcji górnej, środkowej i dolnej z oznakowanymi komorami." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51040/51040fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51040/51040fig1.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schemat układu kąpieli do utrwalania napięcia z otwartym oocytem (Cut-Open Voltage-Clamp). (A) Widok z góry na trzy oddzielone od siebie kąpiele. Wymiary komór dla COVG są przedstawione na rysunku. (B) Widok z boku układu kąpieli w pozycji testowej. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/51040/51040fig1highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz</a>.
Zalety techniki COVG obejmują niski szum prądowy (1 nA przy 3 kHz), kontrolę składu jonowego mediów zewnętrznych, możliwość modulowania mediów wewnętrznych, wysoką rozdzielczość czasową (stała czasu zaniku przejściowego pojemności wynosząca 20-100 μsec) oraz stabilne rejestracje przez kilka godzin9. Wadami jest konieczność zastosowania specjalistycznego sprzętu oraz większy stopień trudności w wykonaniu w porównaniu do dwuelektrodowej rejestracji napięciowej (TEVC)10.
Chociaż podejście COVG wymaga wysoce specjalistycznego sprzętu i skomplikowanych elementów proceduralnych, pozwala ono na pozyskanie cennych danych elektrofizjologicznych. Dane te, takie jak prądy bramkowania o szybkiej kinetyce oraz prądy ogonowe4, mogą być rejestrowane bez niektórych problemów związanych z innymi protokołami clampingu napięciowego, w tym bez zjawiska run-downu kanałów. Niewielkie modyfikacje układu COVG mogą umożliwić zastosowanie kontrolerów temperatury oraz fluorometrii z clampingiem napięciowym (VCF). Włączenie elementów fluorometrii z clampingiem napięciowym do zestawu COVG może zwiększyć ilość uzyskanych danych, zapewniając możliwość monitorowania zmian konformacyjnych białek przy jednoczesnej rejestracji prądu11-13.

<table><tbody><tr>Numer <td>katalogowy</td> <td>marki rozwiązania zewnętrznego</td><td></td> <td>[ostateczna], waga lub objętość</td></tr><tr><td>N-metylo-D-glukamina (NMDG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2004</td><td>25mM</td></tr><tr><td>MES Sól sodowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5057</td><td>90mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Research Products International</td><td>H75030</td><td>20mM</td></tr><tr><td>Wodorotlenek wapnia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>239232</td><td>2mM</td></tr><tr><td>MES Hydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8250</td><td>zmienna (pH do 7,4)</td></tr><tr><td>Roztwór</td><td></td><td></td><td></td>wewnętrzny</tr><tr><td>N-metylo-D-glukamina (NMDG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2004</td><td>105mM</td></tr><tr><td>MES Sól sodowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5057</td><td>10mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Research Products International</td><td>H75030</td><td>20mM</td></tr><tr><td>Kwas glikolu etylenowego-bis(2-aminoetyloeter)-N,N,N',N'-tetraoctowy (EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td>2mM</td></tr><tr><td>MES Hydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8250</td><td>zmienny (pH do 7,4)</td></tr><tr><td>Roztwór</td><td></td><td></td><td></td>depolaryzujący</tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221473</td><td>110mM</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>1,5mM</td></tr><tr><td>Keson chlorku wapnia</td><td></td><td>C021</td><td>0,8 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Research Products International</td><td>H75030</td><td>10mM</td></tr><tr><td>roztwór do pipet</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221473</td><td>3M</td></tr><tr><td>roztwór</td><td></td><td></td><td></td>saponiny</tr><tr><td>Saponina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td>0,125g</td></tr><tr><td>wewnętrzna Roztwór</td><td>Patrz wyżej</td><td></td><td>50 ml</td></tr><tr><td>roztworu</td><td></td><td></td><td></td>mostka agarowego</tr><tr><td>N-metylo-D-glukamina (NMDG)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>M2004</td><td>100 ml 1M</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Research Products International</td><td>H75030</td><td>1,2 g</td></tr><tr><td>MES Hydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8250</td><td>zmienna (pH do 7,4)</td></tr> <tr>Produkty badawcze <td>z agaru granulowanego</td><td> Międzynarodowy</td> roztwór do przechowywania <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> A20250 3% NMDG <tr><td>NMDG, HEPES, MES Roztwór hydratu</td><td>patrz wyżej</td><td></td><td>40 ml</td></tr><tr><td>wody</td><td></td><td></td><td>60 ml</td></tr><tr><td>Nazwa materiału / sprzętu</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze/Opis</td></tr><tr><td>Wysokowydajny zacisk oocytów</td><td>Dagan</td><td>CA-1B</td><td></td></tr><tr><td>System akwizycji danych</td><td>Axon CNS&</td><td>nbsp; Oscyloskop Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Tektronix&nbsp;</td><td>TDS 210</td><td></td></tr><tr><td>Filtr zasilania do montażu w szafie</td><td>APC&nbsp;</td><td>G5</td><td></td></tr><tr><td>Regulator temperatury kąpieli grzewczej/chłodzącej</td><td>Dagan</td><td>HCC-100A</td><td></td></tr><tr><td>PC</td><td>Dell</td><td>Optiplex 990</td><td></td></tr><tr><td>pCLAMP 10.3 Oprogramowanie do cęgów napięciowych</td><td>Molecular Devices, LLC</td><td>pCLAMP10.3</td><td></td></tr><tr><td>TMC Platforma stołowa do kontroli wibracji</td><td>TMC</td><td>SERIA</td><td></td>64</tr><tr><td>TMC Stół powietrzny do kontroli wibracji</td><td>TMC</td><td><a name="ZAKRES! Seria C10">20&nbsp; Kolektor danych elektrody </a></td><td></td></tr><tr><td>V1/I</td><td>Dagan</td><td>część mikromanipulatora CA-1B</td><td></td></tr><tr><td>MX10L</td><td>Siskiyou</td><td>MX10L</td><td></td></tr><tr><td>Bath/Guard (I/V) Headstage (z odpowiednimi złączami)</td><td>Dagan</td><td>część mikroskopu CA-1B</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Omano</td><td>OM2300S-JW11</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel z kontrolą temperatury</td><td>Custom lub Dagan</td><td>Custom lub HE-204C</td><td>Komora niestandardowa wykonana z materiałów z Cool Polymers (seria D). Dagan zapewnia również etap prefeabrowany (HE-204C).</td></tr><tr><td>Niestandardowy pojemnik na pelety AgCl</td><td>Niestandardowy Niestandardowy</td><td></td><td>Specjalnie obrabiana</td></tr><tr><td>elektroda Ag / AgCl, pelety, 2,0 mm</td><td>Warner</td><td>E-206</td><td></td></tr><tr><td>Zewnętrzna kąpiel oocytów</td><td>Niestandardowa lub Dagan</td><td>Niestandardowa lub CC-1-T-LB</td><td>Niestandardowa obrabiana lub zakupiona od Dagan</td></tr><tr><td>Internal Oocyte Bath</td><td>Custom lub</td><td>Dagan Custom lub CC-TG-ND</td><td>Niestandardowa obrobiona lub zakupiona od Dagan</td></tr><tr><td>Kapilary do mostków agarowych i elektrod ciągniętych</td><td>Warner</td><td>G150T-4</td><td></td></tr><tr><td>Obrotowe mocowania do mikroskopu, mikromanipulatora i kąpieli</td><td>Siskiyou</td><td>SD-1280P</td><td></td></tr><tr><td>Fiber-Lite</td><td>Dolan-Jenner</td><td>LMI-600</td><td></td></tr><tr><td>Regularny wybielacz</td><td>Clorox</td><td>470174-764</td><td></td></tr><tr><td>Oocyty Xenopus laevis</td><td>Nasco</td><td>LM535M (dojrzałe płciowo samice)</td><td></td></tr><tr><td>90 Na+ Rozwiązanie zewnętrzne</td><td>Zobacz kartę</td><td></td><td></td>rozwiązań</tr><tr><td>10 Na+ Rozwiązanie wewnętrzne</td><td>Zobacz kartę</td><td></td><td></td>rozwiązań</tr><tr><td>3 M KCL</td><td>Zobacz kartę</td><td></td><td></td>rozwiązań</tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>NMDG Storage Solution</td><td>Zobacz kartę rozwiązań</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pigazki transferowe 5 ml</td><td>SciMart</td><td>GS-52</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowany wtryskiwacz elektrod KCl</td><td>BD</td><td>309659</td><td>Plastikowa końcówka strzykawki stopiona, aby umożliwić wstrzykiwanie roztworu do elektrod. Alternatywnie można zakupić Microfil firmy WPI.</td></tr><tr><td>Microvaccum</td><td>Niestandardowe</td><td>niestandardowe</td><td></td></tr><tr><td>kleszcze</td><td>VWR</td><td>63040-458</td><td></td></tr><tr><td>Narzędzia do obsługi oocytów (pompa do pipet)</td><td>VWR</td><td>53502-222</td><td></td></tr><tr><td>Butelka z dejonizowaną wodą do spryskiwania</td><td>VWR</td><td>16649-911</td><td></td></tr><tr><td>Wazelina Petroleum Jelly</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-086-291&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dodatkowe materiały wymagane do nagrań VCF:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop VCF</td><td>Nikon</td><td>Eclipse FN1</td><td></td></tr><tr><td>Nikon CFI APO 40XW NIR Obiektyw System</td> tłumacza <td>Nikon</td><td>N40X-NIR</td><td></td></tr><tr><td>X-Y do mikroskopów pionowych Sutter</td><td>Instruments</td><td>MT500-586</td><td></td></tr><tr><td>Zewnętrzna kąpiel oocytów VCF</td><td>na zamówienie</td><td></td><td>Obrabiane na zamówienie. Wymiary komory to 2,7 x 1,9 x 0,4 cm.</td></tr><tr><td>Wewnętrzna kąpiel oocytów VCF</td><td>Niestandardowa</td><td></td><td>obrabiana na zamówienie. Wymiary komory to 1,6 x 1,6 x 0,4 cm.</td></tr><tr><td>Zmodyfikowana kąpiel z kontrolą temperatury</td><td>Niestandardowa</td><td></td><td>komora wykonana z materiałów z chłodnych polimerów (seria D). Wymiary komory wanny ze zmodyfikowanym regulatorem temperatury wynoszą 2,7 x 1,9 x 0,3 cm dla komory poziomej i 1 x 2,5 x 0,5 cm dla komory pionowej.</td></tr></tbody></table>

technika zacisku napięciowego z otwartą szczeliną wazelinową xenopus z fluorometrią

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

Technika zacisku napięcia z przerwą wazelinową oocytów (COVG) pozwala na analizę właściwości elektrofizjologicznych i kinetycznych heterologicznych kanałów jonowych w oocytach. Nagrania z konfiguracji cut-open są szczególnie przydatne do rozwiązywania prądów bramkowania o niskiej wielkości, szybkiej aktywacji i dezaktywacji prądów jonowych. Główne zalety w porównaniu z techniką dwuelektrodowego zacisku napięciowego (TEVC) obejmują zwiększoną prędkość cęgowania, lepszy stosunek sygnału do szumu oraz możliwość modulowania środowiska wewnątrzkomórkowego i zewnątrzkomórkowego.
Tutaj wykorzystujemy kanał sodowy ludzkiego serca (hNaV1.5), wyrażany w oocytach Xenopus, aby zademonstrować układ i protokół typu cut-open, a także modyfikacje, które są wymagane do dodania możliwości fluorometrii zacisków napięciowych.
Właściwości szybko aktywujących kanałów jonowych, takich jak hNaV1.5, nie mogą być w pełni rozwiązane w pobliżu temperatury pokojowej za pomocą TEVC, w którym cała błona oocytu jest zaciśnięta, co utrudnia kontrolę napięcia. Jednak w technice cut-open izolacja tylko niewielkiej części błony komórkowej pozwala na szybkie zaciskanie wymagane do dokładnego rejestrowania szybkiej kinetyki, jednocześnie zapobiegając spływaniu kanału w dół związanym z technikami zaciskania krosowego.
W połączeniu z techniką COVG, kinetyka kanałów jonowych i właściwości elektrofizjologiczne mogą być dalej badane za pomocą fluorometrii zacisków napięcia, gdzie ruch białka jest śledzony poprzez koniugację cysteiny z zewnątrzkomórkowo zaaplikowanymi fluoroforami, insercję genetycznie kodowanych białek fluorescencyjnych lub włączenie nienaturalnych aminokwasów do obszaru zainteresowania1. Te dodatkowe dane dostarczają informacji kinetycznych na temat zależnych od napięcia reorganizacji konformacyjnych białka poprzez zmiany w mikrośrodowisku otaczającym cząsteczkę fluorescencyjną.

Rysunek 4 przedstawia zmianę przepuszczalności oocytu po naniesieniu roztworu saponiny na dolną część oocytu. Rysunek 5 obrazuje tempo wymiany roztworu wewnątrzkomórkowego drogą dyfuzji po permeabilizacji saponiną. Do osiągnięcia stanu stacjonarnego wymagane jest 20-40 min2,18.
Rycina 6A przedstawia przebiegi uzyskane zgodnie z protokołem rejestracji. Na rycinie widoczne są prądy jonowe (po odjęciu prądu przeciekowego P/-8) w odpowi...

Metoda "cut-open Vaseline gap" służy do uzyskiwania niskoszumowych zapisów prądów jonowych i bramkujących z zależnych od napięcia kanałów jonowych wyrażonych w oocytach Xenopus z wysoką rozdzielczością kinetyki szybkich kanałów. Przy niewielkich modyfikacjach fluorometria cęgów napięciowych może być sprzężona z protokołem rozcięcia oocytów.

Technika zacisku napięciowego z otwartą szczeliną wazelinową Xenopus z fluorometrią

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest uzyskanie rejestracji prądów jonowych i prądów bramkowania o niskim poziomie szumów z napięciowo zależnych kanałów jonowych ekspresowanych w cytach zap, przy zachowaniu wysokiej rozdzielczości czasowej dla szybkiej kinetyki kanałów. Cel ten osiąga się poprzez wstrzykiwanie zarejestrowanego mRNA kanału jonowego do oocytów żaby. Drugim krokiem jest stworzenie mostków agarowych poprzez ukształtowanie kapilar i wypełnienie ich roztworem agaru zawierającym sól.Następnie przygotowuje się przeciętą platformę do eksperymentu, umieszczając wszystkie komponenty, w tym miejsce UO oraz mostki agarowe, w wyznaczonych lokalizacjach. Ostatnim krokiem jest wprowadzenie mikroelektrody do miejsca UO w celu umożliwienia rejestracji metodą voltage clamp. Ostatecznie protokół rejestracji służy do wykazania prądów jonowych przepływających przez kanały jonowe zlokalizowane w błonie oocyta.Główną zaletą techniki clampowania napięcia z przecięciem otworu (cut open voltage clamp) jest możliwość uzyskania stabilnych zapisów o niskim poziomie szumów dla bardzo dużej populacji kanałów jonowych. Pozwala ona również na szybkie rozdzielenie kinetyki kanałów. Wizualna demons

the-xenopus-oocyte-cut-open-vaseline-gap-voltage-clamp-technique-with

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Xenopus technika napięciowego obciążenia szyjki jajnika namaszczonej wazeliną

Niniejszy materiał stanowi wprowadzenie do rejestracji metodą patch clamp z oocytów Xenopus laevis. Obejmuje on usuwanie błony witelinowej, tworzenie uszczelnienia gigaomowego (gigaseal) oraz opcjonalną konwersję patcha do topologii outside-out.

Rejestracja metodą patch clamp kanałów jonowych ekspresowanych w oocytach Xenopus

Prąd jonowy kanałów BK rejestruje się przy użyciu technik patch clamp. Kanały BK są eksprymowane w oocytach Xenopus poprzez wstrzykiwanie mRNA. Roztwór wewnątrzkomórkowy podczas pomiarów patch clamp jest kontrolowany przez system perfuzyjny.

Techniki patch clamp i perfuzji do badania kanałów jonowych ekspresowanych w oocytach Xenopus

Opiszemy metodę służącą do pomiaru kinetyki transportu jonów przez białka błonowe wraz z analizą zmian konformacyjnych w konkretnych miejscach z wykorzystaniem fluorescencji w pojedynczych komórkach. Technika ta jest możliwa do zastosowania w przypadku kanałów jonowych, transporterów i pomp jonowych, a także może być wykorzystana do określenia ograniczeń odległości między podjednostkami białek.

Badanie dynamiki konformacyjnej białek błonowych in situ z wykorzystaniem ukierunkowanego znakowania fluorescencyjnego

Opisujemy metodę ilościowego określania aktywności przeciwtransportujących K+ ATPaz typu P poprzez heterologiczną ekspresję enzymów w oocytach Xenopus i mierzenie absorpcji Rb+ lub Li+ do pojedynczych komórek za pomocą atomowej spektrofotometrii absorpcyjnej. Metoda ta stanowi czułą i bezpieczną alternatywę dla eksperymentów ze strumieniem radioizotopów, ułatwiając złożone badania kinetyczne.

Pomiar transportu kationów przez Na,K- i H,K-ATPazę w oocytach Xenopus za pomocą spektrofotometrii absorpcji atomowej: alternatywa dla testów radioizotopowych

Aby uzupełnić powszechnie stosowane metody badania TRPV4, opisano dwie metody: Jego mechanowrażliwość może być badana za pomocą luminometrii Ca2+-aequorin w transgenicznych drożdżach po prowokacji hypo-osmotycznej.  Można go również badać w oocytach Xenopus z wstrzyknięciem TRPV4-RNA za pomocą dwuelektrodowego zacisku napięciowego całej komórki lub zacisku krosowego w trybie on-cell lub wyciętym.

Luminometryczne badania elektrofizjologiczne oocytów drożdży i oocytów Xenopus molekularnej mechanowrażliwości TRPV4

Opisano metodę obrazowania zmian potencjału błonowego za pomocą genetycznie kodowanych wskaźników napięcia.

Obrazowanie potencjału błony za pomocą dwóch typów genetycznie kodowanych fluorescencyjnych czujników napięcia

Opisano zoptymalizowane procedury izolacji pojedynczych pęcherzyków, mikroiniekcji cytoplazmatycznego RNA, usuwania otaczających warstw komórek i ekspresji białek w oocytach Xenopus. Ponadto przedstawiono prostą metodę szybkiej zmiany roztworu w eksperymentach elektrofizjologicznych z kanałami jonowymi bramkowanymi ligandem.

Ksenopus (Ksenopus) Oocyty: zoptymalizowane metody mikroiniekcji, usuwania warstw komórek pęcherzykowych i szybkiej zmiany roztworu w eksperymentach elektrofizjologicznych

Ten artykuł opisuje ulepszenie konwencjonalnej fluorometrii zaciskowej (VCF), gdzie zamiast barwników maleimidowych stosuje się fluorescencyjne nienaturalne aminokwasy (fUAA), aby badać strukturalne przegrupowania w kanałach jonowych. Procedura obejmuje iniekcję DNA oocytów Xenopus, koiniekcję RNA/fUAA oraz jednoczesne pomiary prądu i fluorescencji.

Fluorometria zaciskowa napięcia w oocytach Xenopus przy użyciu fluorescencyjnych nienaturalnych aminokwasów

Zapisy całokomórkowe z fotoreceptorów Drosophila melanogaster umożliwiają pomiar spontanicznych ciemnych guzków, wybrzuszeń kwantowych, makroskopowych reakcji na światło i zależności prąd-napięcie w różnych warunkach. W połączeniu z narzędziami manipulacji genetycznej D. melanogaster, metoda ta umożliwia badanie wszechobecnego szlaku sygnałowego inozytol-lipid i jego celu, czyli kanału TRP.

Metoda elektrofizjologiczna dla zapisów cęgów napięcia w całej komórce z fotoreceptorów Drosophila

Opisujemy metodę przygotowania i obrazowania na żywo nierozcieńczonych ekstraktów cytoplazmatycznych z jaj Xenopus laevis.

Xenopus laevis (Xenopus laevis) Przygotowanie ekstraktu z jaj i metody obrazowania na żywo do wizualizacji dynamicznej organizacji cytoplazmy

Tutaj prezentujemy protokół do wyrażania białek połączeniowych w oocytach Xenopus i rejestrowania prądu połączeniowego między dwoma przypisanymi oocytami za pomocą komercyjnego wzmacniacza zaprojektowanego do zapisów napięcia z dwoma oocytami w trybie pomiaru wysokiego prądu bocznego.

Rejestrowanie prądu złącza szczelinowego z oocytów Xenopus

Poznaj technikę zacisku napięciowego z otwartą szczeliną wazelinową w oocytach Xenopus do rejestracji prądów jonowych z wysoką rozdzielczością czasową. Ta metoda umożliwia precyzyjne badanie kinetyki kanałów jonowych.

Technika zacisku napięciowego z otwartą szczeliną wazelinową Xenopus z fluorometrią

Przeglądaj więcej filmów