Name: Obrazowanie wydzielania InlC w celu zbadania zakażenia komórkowego patogenem bakteryjnym Listeria monocytogenes (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-19T22:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 5 s
Description: Poznaj mikroskopową metodę wykrywania zakażenia Listeria monocytogenes poprzez fluorescencyjne znakowanie białka InlC. Technika umożliwia wysokoprzepustowe badania interakcji patogen-gospodarz.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania w laboratorium P. Cossart są wspierane przez Instytut Pasteura, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233348), Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE-SignRupVac), Fundację Louis-Jeantet oraz Fundację Le Roch Les Mousquetaires. A.K. jest stypendystą Międzynarodowego Doktoratu Uniwersytetu Pasteura Program/Institut Carnot Maladies Infectieuses. Dziękujemy za wsparcie grantem 51RT 0_126008 dla projektu badawczo-rozwojowego (RTD) InfectX w ramach SystemsX.ch, Szwajcarskiej Inicjatywy na rzecz Biologii Systemów (do C.D.).

1. Przygotowanie kultur komórkowych i bakteryjnych, narzędzi do transfekcji i pierwotnych przeciwciał
<ol>
	<li>Przygotować świeżą płytkę agarową w celu wyizolowania pojedynczych kolonii L. monocytogenes z bakteryjnego glicerolu (50% glicerolu/50% nasyconej cieczy bakteryjnej, hodowla przez noc) przechowywanego w temperaturze -80 °C.
	<ol>
		<li>Za pomocą aluminiowego stojaka (utrzymywanego w temperaturze -80 °C) do transportu zamrożonego bulionu bakteryjnego glicerynowego, rozprowadź bakterie na płytce agarowej Brain Heart Infusion (BHI).</li>
		<li>Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 48 godzin (lub do momentu, gdy będzie można wyizolować poszczególne kolonie bakterii).</li>
		<li>Tę płytkę roboczą należy następnie przechowywać w temperaturze 4 °C przez maksymalny okres 1 miesiąca (będzie ona używana do wysiewu płynnych kultur).</li>
		<li>W naszym protokole używamy szczepu L. monocytogenes serotyp 1/2a EGDe.PrfA*, ale jak pokazano na rysunku 1, L. monocytogenes serotyp 4b P14. Szczep PrfA* daje podobne wyniki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Komórki HeLa ATCC CCL2 są hodowane w pożywce Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) przy braku antybiotyków.</li>
	<li>Niezależne pule zaszyfrowanych (kontrolnych) i anty-Met siRNA są ładowane do czarnych 384-dołkowych płytek do hodowli komórkowych pod mikroskopią.
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć 160 pmol siRNA w 500 μl wody wolnej od RNaz i dodać 5 μl tego roztworu do dołka (stężenie końcowe: 1,6 pmol).</li>
		<li>Płytkę należy przechowywać w temperaturze -20 °C maksymalnie przez okres 1 roku.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Poliklonalne przeciwciała królika przeciwko białku bakteryjnemu InlC uzyskano przez immunizację przy użyciu rekombinowanego białka InlC-GST, jak opisano wcześniej25.</li>
</ol>
2. Odwrotna transfekcja komórek siRNA
<ol>
	<li>72 godziny przed zakażeniem doprowadzić do temperatury pokojowej czarną 384-dołkową płytkę do hodowli komórkowej zawierającą 1,6 pmol siRNA w 5 μl wody wolnej od RNaz w każdym dołku.</li>
	<li>Wirować płytkę przez 3 minuty w temperaturze 300 rcf w temperaturze pokojowej, aby obniżyć siRNA, które mogło zostać osadzone w ścianach studzienek.</li>
	<li>Przygotować DMEM w temperaturze pokojowej uzupełniony 0,4% lipofektaminą RNAiMAX.</li>
	<li>Dodać 25 μl pożywki do transfekcji DMEM/RNAiMAX do każdej studzienki (nie inkubować pożywki transfekcyjnej dłużej niż 20 minut przed dodaniem jej do siRNA).</li>
	<li>Przesuwaj płytkę w przód i w tył, aby wymieszać siRNA z roztworem do transfekcji, a następnie trzymaj płytkę przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, aby umożliwić utworzenie kompleksów siRNA-lipofekcaminy.</li>
	<li>Przemyć komórki HeLa z kolby do hodowli komórek zlewających się lub subkonfluentnych jednorazowo 10 ml wstępnie ogrzanego PBS o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Odłączyć komórki HeLa, dodając 1 ml wstępnie podgrzanej trypsyny o temperaturze 37 °C do kolby do hodowli komórkowej i inkubować przez 3-5 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 10 ml 37 °C wstępnie podgrzanym DMEM uzupełnionym 16% FBS.</li>
	<li>Policz komórki i przygotuj zawiesinę komórek 12 000 komórek na ml w DMEM uzupełnioną 16% FBS.</li>
	<li>Dodać 50 μl zawiesiny komórkowej do każdego dołka w płytce 384-dołkowej.</li>
	<li>Szybko przesuwaj płytkę do przodu i do tyłu, aby rozprowadzić komórki i pozwól komórkom osiąść na 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Uszczelnić płytkę Parafilmem i przechowywać ją przez 72 godziny w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO2 w temperaturze 37 °C.</li>
</ol>
3. Infekcja komórkowa i barwienie
<ol>
	<li>Dzień przed zakażeniem należy pobrać pojedynczą kolonię L. monocytogenes z płytki agarowej BHI i ponownie zawiesić ją w 5 ml płynnej pożywki BHI w probówce polistyrenowej o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w urządzeniu do zawieszania, aby umożliwić rozwój bakterii.</li>
	<li>W dniu zakażenia przepłukać 1 ml nocnej kultury L. monocytogenes przez odwirowanie przez 2 minuty w temperaturze 10 600 rcf na wirówce stołowej.</li>
	<li>Odrzucić supernatant (który zawiera wydzielaną cytotoksynę listeriolizynę O) i ponownie zawiesić osad w 1 ml PBS (powtórzyć etap płukania jeszcze 3 razy).</li>
	<li>Odczytaj gęstość optyczną bakterii przy 600 nm i oszacuj liczbę bakterii (OD=1 odpowiada 1E9 bakteriom/ml).</li>
	<li>Przygotować odpowiednie rozcieńczenie L. monocytogenes w DMEM uzupełnionym 1% FBS: używając wysoce inwazyjnych szczepów, takich jak EGDe.PrfA*, sugerujemy użycie bakterii 5E4 w 30 μl pożywki na studzienkę (mnogość infekcji szacuje się na 25 na 2000 komórek).</li>
	<li>Usunąć pożywkę do hodowli komórkowych z każdej studzienki (80 μl) i zastąpić ją dodając 30 μl pożywki zawierającej L. monocytogenes.</li>
	<li>Odwirować płytkę w temperaturze 200 rcf przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby zsynchronizować proces infekcji.</li>
	<li>Inkubować płytkę przez 1 godzinę w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO2 w temperaturze 37 °C na wstępnie ogrzanym bloku aluminiowym.</li>
	<li>Usunąć pożywkę zawierającą L. monocytogenes z każdej studzienki i dodać 30 μl wstępnie podgrzanego DMEM uzupełnionego 10% FBS i 40 μg/ml gentamycyny w celu zabicia zewnątrzkomórkowego L. monocytogenes.</li>
	<li>Inkubować przez 4 godziny w atmosferze zawierającej 5% CO2 w temperaturze 37 °C na wstępnie ogrzanym metalowym bloku.</li>
	<li>Przygotować roztwór PBS uzupełniony 8% formaldehydem (roztwór ten należy przygotować na świeżo, tak aby użyć monomerów formaldehydu, a nie polimerów paraformaldehydu).</li>
	<li>Nie odrzucając pożywki do hodowli komórkowych, dodać 30 μl PBS uzupełnionego 8% formaldehydem (końcowe stężenie: 4%) i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usunąć utrwalacz i przemyć komórki trzykrotnie 80 μl PBS na studzienkę (utrzymać komórki w końcowej objętości 80 μl PBS na studzienkę).</li>
	<li>Przygotować rozcieńczenie 1:250 surowicy anty-InlC królika w PBS uzupełnionym 0,2% saponiną.</li>
	<li>Dodać 10 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego do każdego dołka po usunięciu PBS i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odrzucić pierwszorzędowy roztwór przeciwciała i przemyć czterokrotnie 40 μl PBS na studzienkę.</li>
	<li>Rozcieńczyć drugorzędowe przeciwciało anty-królicze sprzężone z Alexa Fluor 546 (1:250), roztwór DAPI (1:1,500) i falloidynę-Dy647 (1:150) w PBS uzupełnionym 0,2% saponiną.</li>
	<li>Dodać 10 μl tego wtórnego roztworu barwiącego do każdej studzienki i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odrzucić wtórny roztwór barwiący i przemyć czterokrotnie 40 μl PBS na studzienkę (pozostawić końcową objętość 40 μl w każdym dołku i uszczelnić płytkę).</li>
	<li>Płytkę można natychmiast zobrazować lub przechowywać w temperaturze 4 °C w celu ochrony przed światłem (przykrycie folią aluminiową) w celu późniejszej analizy.</li>
</ol>
4. Akwizycja i analiza obrazu
<ol>
	<li>Uzyskuj obrazy w trzech różnych kanałach (350 nm, 546 nm i 647 nm) za pomocą obiektywu 10X zamontowanego na automatycznym mikroskopie (uzyskaj preferencyjnie 9 obrazów na dołek).</li>
	<li>Sygnał InlC można mierzyć za pomocą oprogramowania do analizy obrazu, takiego jak CellProfiler, które umożliwia automatyczną segmentację jąder i ciał komórkowych za pomocą odpowiednio DAPI i barwienia falloidyną.</li>
</ol>

<ol><li>Pizarro-Cerdá, J., Kühbacher, A., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entry+of+Listeria+monocytogenes+in+mammalian+epithelial+cells%3A+an+updated+view%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Entry of Listeria monocytogenes in mammalian epithelial cells: an updated view.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2, 1-17 (2012).</li>
<li>Mackaness, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+resistance+to+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cellular resistance to infection.</a> Journal of Experimental Medicine. 116, 381-406 (1962).</li>
<li>Tilney, L. G., Portnoy, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+filaments+and+the+growth%2C+movement%2C+and+spread+of+the+intracellular+bacterial+parasite%2C+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Actin filaments and the growth, movement, and spread of the intracellular bacterial parasite, Listeria monocytogenes.</a> Journal of Cell Biology. 109, 1597-1608 (1989).</li>
<li>Mengaud, J., Chenevert, J., Geoffroy, C., Gaillard, J. L., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+structural+gene+encoding+the+SH-activated+hemolysin+of+Listeria+monocytogenes%3A+listeriolysin+O+is+homologous+to+streptolysin+O+and+pneumolysin%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Identification of the structural gene encoding the SH-activated hemolysin of Listeria monocytogenes: listeriolysin O is homologous to streptolysin O and pneumolysin.</a> Infection and Immunity. 55, 3225-3227 (1987).</li>
<li>Gaillard, J. L., Berche, P., Frehel, C., Gouin, E., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entry+of+L.+monocytogenes+into+cells+is+mediated+by+internalin%2C+a+repeat+protein+reminiscent+of+surface+antigens+from+gram-positive+cocci%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Entry of L. monocytogenes into cells is mediated by internalin, a repeat protein reminiscent of surface antigens from gram-positive cocci.</a> Cell. 65, 1127-1141 (1991).</li>
<li>Mengaud, J., Dramsi, S., Gouin, E., Vazquez-Boland, J. A., Milon, G., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pleiotropic+control+of+Listeria+monocytogenes+virulence+factors+by+a+gene+that+is+autoregulated%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Pleiotropic control of Listeria monocytogenes virulence factors by a gene that is autoregulated.</a> Molecular Microbiology. 5, 2273-2283 (1991).</li>
<li>Kocks, C., Gouin, E., Tabouret, M., Berche, P., Ohayon, H., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L.+monocytogenes-induced+actin+assembly+requires+the+actA+gene+product%2C+a+surface+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">L. monocytogenes-induced actin assembly requires the actA gene product, a surface protein.</a> Cell. 68, 521-52 (1992).</li>
<li>Glaser, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+genomics+of+Listeria+species%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Comparative genomics of Listeria species.</a> Science. 294, 849-852 (2001).</li>
<li>Toledo-Arana, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Listeria+transcriptional+landscape%3A+from+saprophytism+to+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Listeria transcriptional landscape: from saprophytism to virulence.</a> Nature. 459, 950-956 (2009).</li>
<li>Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+the+landscape+of+host-pathogen+interactions+with+the+bacterium+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Illuminating the landscape of host-pathogen interactions with the bacterium Listeria monocytogenes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108, 19484-19491 (1073).</li>
<li>Mengaud, J., Ohayon, H., Gounon, P., Mege, R. -M., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-cadherin+is+the+receptor+for+internalin%2C+a+surface+protein+required+for+entry+of+L.+monocytogenes+into+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">E-cadherin is the receptor for internalin, a surface protein required for entry of L. monocytogenes into epithelial cells.</a> Cell. 84, 923-932 (1996).</li>
<li>Shen, Y., Naujokas, M., Park, M., Ireton, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((InIB-dependent+internalization+of+Listeria+is+mediated+by+the+Met+receptor+tyrosine+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">InIB-dependent internalization of Listeria is mediated by the Met receptor tyrosine kinase.</a> Cell. 103, 501-510 (2000).</li>
<li>Lecuit, M., Hurme, R., Pizarro-Cerda, J., Ohayon, H., Geiger, B., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+alpha-and+beta-catenins+in+bacterial+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">A role for alpha-and beta-catenins in bacterial uptake.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 97, 10008-10013 (2000).</li>
<li>Ireton, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+phosphoinositide+3-kinase+in+bacterial+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A role for phosphoinositide 3-kinase in bacterial invasion.</a> Science. 274, 780-782 (1996).</li>
<li>Ireton, K., Payrastre, B., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Listeria+monocytogenes+protein+InlB+is+an+agonist+of+mammalian+phosphoinositide+3-kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The Listeria monocytogenes protein InlB is an agonist of mammalian phosphoinositide 3-kinase.</a> Journal of Biological Chemistry. 274, 17025-17032 (1999).</li>
<li>Pizarro-Cerdá, J., Jonquières, R., Gouin, E., Vandekerckhove, J., Garin, J., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+protein+patterns+associated+with+Listeria+monocytogenes+InlA-+or+InlB+phagosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Distinct protein patterns associated with Listeria monocytogenes InlA- or InlB phagosomes.</a> Cellular Microbiology. 4, 101-115 (2002).</li>
<li>Pizarro-Cerdá, J., Payrastre, B., Wang, Y. -J., Veiga, E., Yin, H. L., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+II+phosphatidylinositol+4-kinases+promote+Listeria+monocytogenes+entry+into+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Type II phosphatidylinositol 4-kinases promote Listeria monocytogenes entry into target cells.</a> Cellular Microbiology. 9, 2381-2390 (2007).</li>
<li>Hamon, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+modifications+induced+by+a+family+of+bacterial+toxins%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Histone modifications induced by a family of bacterial toxins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 104, 17555-17559 (2007).</li>
<li>Ribet, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Listeria+monocytogenes+impairs+SUMOylation+for+efficient+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Listeria monocytogenes impairs SUMOylation for efficient infection.</a> Nature. 464, 1192-1195 (2010).</li>
<li>Rämet, M., Manfruelli, P., Pearson, A., Mathey-Prevot, B., Ezekowitz, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+analysis+of+phagocytosis+and+identification+of+a+Drosophila+receptor+for+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional genomic analysis of phagocytosis and identification of a Drosophila receptor for E. coli.</a> Nature. 416, 644-648 (2002).</li>
<li>Agaisse, H., Burrack, L. S., Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N., Higgins, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+screen+for+host+factors+required+for+intracellular+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection.</a> Science. 309, 1248-1251 (2005).</li>
<li>Cheng, L. W., Viala, J. P., Stuurman, N., Wiedemann, U., Vale, R. D., Portnoy, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+RNA+interference+in+Drosophila+S2+cells+to+identify+host+pathways+controlling+compartmentalization+of+an+intracellular+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Use of RNA interference in Drosophila S2 cells to identify host pathways controlling compartmentalization of an intracellular pathogen.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102, 13646-13651 (2005).</li>
<li>Ripio, M. T., Domínguez-Bernal, G., Lara, M., Suárez, M., Vazquez-Boland, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Gly145Ser+substitution+in+the+transcriptional+activator+PrfA+causes+constitutive+overexpression+of+virulence+factors+in+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">A Gly145Ser substitution in the transcriptional activator PrfA causes constitutive overexpression of virulence factors in Listeria monocytogenes.</a> Journal of Bacteriology. 179, 1533-1540 (1997).</li>
<li>Rajabian, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bacterial+virulence+factor+InlC+perturbs+apical+cell+junctions+and+promotes+cell-to-cell+spread+of+Listeria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The bacterial virulence factor InlC perturbs apical cell junctions and promotes cell-to-cell spread of Listeria.</a> Nature Cell Biology. 11, 1212-1218 (2009).</li>
<li>Gouin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Listeria+monocytogenes+InlC+protein+interferes+with+innate+immune+responses+by+targeting+the+I%CE%BAB+kinase+subinit+IKK%CE%B1%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">The Listeria monocytogenes InlC protein interferes with innate immune responses by targeting the IκB kinase subinit IKKα.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107, 17333-17338 (2010).</li>
<li>Pizarro-Cerdá, J., Lecuit, M., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+and+analysing+invasion+of+mammalian+cells+by+bacterial+pathogens%3A+the+Listeria+monocytogenes+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Measuring and analysing invasion of mammalian cells by bacterial pathogens: the Listeria monocytogenes system.</a> Methods in Molecular Microbiology. 31, 161-177 (2002).</li>
<li>Snijder, B., Sacher, R., Rämö, P., Damm, E. M., Liberali, P., Pelkmans, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+context+determines+cell-to-cell+variability+in+endocytosis+and+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Population context determines cell-to-cell variability in endocytosis and virus infection.</a> Nature. 461, 520-523 (2009).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Kilka parametrów ma kluczowe znaczenie dla powodzenia naszego protokołu wykrywania InlC, w tym wykorzystanie zdrowych linii komórkowych wykazujących wystarczająco dużą cytoplazmę, aby umożliwić jednoznaczne wykrycie sygnału InlC. W teście, który prezentujemy w tym artykule, proponujemy zastosowanie komórek HeLa CCL2, które szczególnie dobrze nadają się do naszego testu ze względu na rozszerzenie ich przestrzeni cytozolowej; inne klony HeLa, takie jak komórki HeLa Kyoto, wykazują mniejszą cytoplazmę, ale mogą być używane ...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/51043">Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes</a>. Three authors were omitted from the article at the time of publication. The acknowledgments section was also updated. The author list has been updated from:
Andreas K&#252;hbacher1,2,3, Edith Gouin1,2,3, Pascale Cossart1,2,3, Javier Pizarro-Cerd&#225;1,2,3 
1Unit&#233; des Interactions Bact&#233;ries Cellules, Pasteur Institute, 2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020
to
Andreas K&#252;hbacher1,2,3, Edith Gouin1,2,3, Jason Mercer4, Mario Emmenlauer5, Christoph Dehio5, Pascale Cossart1,2,3, Javier Pizarro-Cerd&#225;1,2,3 
1Unit&#233; des Interactions Bact&#233;ries Cellules, Pasteur Institute,2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020, 4Institute of Biochemistry, ETH Z&#252;rich 5Focal Area Infection Biology, Biozentrum, University of Basel
The acknowledgments where update from:
Research in P. Cossart laboratory is supported by the Pasteur Institute, the Institut National de la Sant&eacute; et de la Recherche M&eacute;dicale, the Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233348), the Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE-SignRupVac), the Louis-Jeantet Foundation and the Fondation Le Roch Les Mousquetaires. A.K. is a recipient of a scholarship from the Pasteur-Paris University International Doctoral Program/Institut Carnot Maladies Infectieuses. We thank Jason Mercer for optimizing the cellular transfection protocol.
to
Research in P. Cossart laboratory is supported by the Pasteur Institute, the Institut National de la Sant&eacute; et de la Recherche M&eacute;dicale, the Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233348), the Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE-SignRupVac), the Louis-Jeantet Foundation and the Fondation Le Roch Les Mousquetaires. A.K. is a recipient of a scholarship from the Pasteur-Paris University International Doctoral Program/Institut Carnot Maladies Infectieuses. We acknowledge support by grant 51RT 0_126008 for the Research and Technology Development (RTD) project InfectX in the frame of SystemsX.ch, the Swiss Initiative for Systems Biology (to C.D.).

A correction to author list has been made for the article Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes. Three authors were omitted from the article at the time of publication.

Erratum: Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Bakteria Gram-dodatnia Listeria monocytogenes to patogen przenoszony przez żywność, który atakuje komórki gospodarza, zakłóca jego wakuolę internalizacji i replikuje się w cytoplazmie komórek gospodarza1. Łatwość manipulacji L. monocytogenes w kontekście laboratoryjnym (szybki wzrost, niska toksyczność dla osób zdrowych) związana z utrzymywaniem się cech wirulencji bakterii obserwowanych w modelach komórkowych i zwierzęcych (aktywność hemolityczna, leukocytoza) pozwoliła na jego początkowe zastosowanie w latach 60. XX wieku jako głównego modelu do badania pasożytnictwa wewnątrzkomórkowego i do ustanowienia teoretycznych podstaw odporności komórkowej na infekcje2. Pod koniec lat osiemdziesiątych i na początku lat dziewięćdziesiątych XX wieku analiza bakteryjnego cyklu wewnątrzkomórkowego3, a także charakterystyka molekularna najważniejszych czynników wirulencji bakterii4-7 sprzyjały zastosowaniu L. monocytogenes jako kluczowego narzędzia molekularnego do manipulacji i badania funkcji komórek gospodarza. Obecność gatunków awirulentów (L. innocua) i zjadliwych (L. monocytogenes) w rodzaju Listeria utorowała drogę do porównawczych badań genomicznych8 , które wraz z niedawnym ustaleniem kompletnego transkryptomu L. monocytogenes 9 poszerzyły naszą wiedzę na temat ewolucji L. monocytogenes jako ludzkiego patogenu i systemu modelowego do badań nad infekcjami10.
L. monocytogenes indukuje swoją internalizację w komórkach gospodarza po interakcji białek powierzchniowych bakterii InlA i InlB z ich receptorami komórek gospodarza, E-kadheryną i Met, odpowiednio11-12. Wstępne badania oparte na kandydatach doprowadziły do zidentyfikowania związku α/β kateniny-aktyny jako istotnego składnika szlaku inwazji InlA13 oraz kinazy fosfoinozytolu 3 (PI 3-K) jako krytycznego efektora kaskady inwazji zależnej od InlB14-15. Testy proteomiczne i funkcjonalne pozwoliły następnie na zidentyfikowanie nowych elementów cytoszkieletu16 i drugich przekaźników lipidowych17 wymaganych do inwazji komórek gospodarza. Badania transkrypcyjne18 i proteomika ilościowa oparta na spektrometrii mas19 rzuciły ostatnio nowe światło na aktywację kaskad sygnałowych gospodarza i tłumienie odpowiedzi immunologicznej podczas infekcji L. monocytogenes. Podejścia biologii systemowej oparte na inaktywacji dużych zestawów genów (kinomów, kompletnych genomów) przez wyciszanie małych interferujących RNA (siRNA) otworzyły ostatnio nowe możliwości analizy globalnych kaskad sygnalizacyjnych gospodarza w kontekście określonych funkcji komórkowych, w tym fagocytozy i internalizacji patogenów20. Badania przesiewowe siRNA całego genomu były wcześniej wykonywane w celu zbadania kaskad komórkowych wymaganych do zakażenia L. monocytogenes w fagocytarnych komórkach Drosophila S221-22, ale tego typu analiza nie została przeprowadzona w komórkach niefagocytarnych, które stanowią krytyczne cele infekcji in vivo.
Zoptymalizowaliśmy protokół do mikroskopowego wykrywania późnych etapów infekcji przez L. monocytogenes, który nadaje się do wysokoprzepustowych badań siRNA wnikania bakterii do komórek nabłonkowych. Nasz test wykorzystuje wysoce inwazyjny szczep L. monocytogenes, który wykazuje mutację punktową w PrfA, głównym regulatorze transkrypcji czynników wirulencji L. monocytogenes 6: ta mutacja (nazwana PrfA*) sprawia, że PrfA jest konstytutywnie aktywny23 i prowadzi do zwiększonej ekspresji białek inwazyjnych InlA i InlB, sprzyjając w ten sposób wnikaniu bakterii do słabo zakażonych komórek niefagocytarnych. Nasz odczyt infekcji opiera się na wykryciu cytozolowej akumulacji wydzielanego białka bakteryjnego InlC: cząsteczka ta jest efektorem plejotropowym, który jest wyrażany preferencyjnie przez wewnątrzcytoplazmatyczny L. monocytogenes9 i który uczestniczy nie tylko w rozprzestrzenianiu się bakterii z komórki na komórkę24, ale także moduluje odpowiedzi immunologiczne gospodarza25. Fluorescencyjne znakowanie wydzielania InlC przez bakterie wewnątrzkomórkowe nie tylko pozwala na wyraźne odróżnienie komórek zakażonych od niezakażonych, ale także stanowi odczyt punktu końcowego, który można wykorzystać do późniejszej analizy infekcji na różnych etapach: wejście, ucieczka wakuolarna, proliferacja bakterii cytozolowych i rozprzestrzenianie się z komórki na komórkę. Ten protokół oparty na mikroskopii może być sprzężony z badaniami przesiewowymi siRNA, aby badać szlaki komórkowe zaangażowane w infekcję komórek gospodarza przez L. monocytogenes.

<table><tbody><tr><td>Napar Bacto Brain Heart BD</td><td></td><td>237500</td><td>Do płynnego preparatu BHI</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td>Suplement do płynnego BHI do płytek agarowych BHI </td></tr><tr><td>Inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca</td><td>Biowest</td><td>51830-500</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>61965-026</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMax</td><td>Invitrogen</td><td>13778-100</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycyna</td><td>Sigma</td><td>G1397-10ML</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd (16%)</td><td>EMS</td><td>15710</td><td>Przygotuj świeże przed każdym eksperymentem</td></tr><tr><td>Anty-Królik Alexa Fluor 546</td><td>Invitrogen</td><td>A-11035</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D-1306</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin Dy647</td><td>Dyomics</td><td>647-33</td><td></td></tr><tr><td>siRNA Scramble</td><td>Dharmacon</td><td>D-001810-10</td><td></td></tr><tr><td>siRNA Met</td><td>Dharmacon</td><td>L-003156-00-0005</td><td></td></tr><tr><td>384-dołkowa płytka do hodowli komórkowych</td><td>Mikroskop Corning</td><td>3985</td><td></td></tr><tr><td>AxioObserver Z1</td> Kamera sCMOS <td>Zeiss</td><td>431007 9901</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy metamorfów</td> Andor Neo <td></td><td></td> Urządzenia molekularne 4000 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie analityczne CellProfiler</td><td>Broad Institute</td><td>Oprogramowanie publiczne dostępne pod adresem <a href="http://www.cellprofiler.org/" target="_blank">http://www.cellprofiler.org/</a></td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie wydzielania inlc w celu zbadania zakażenia komórkowego patogenem bakteryjnym listeria monocytogenes

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Bakteryjne wewnątrzkomórkowe patogeny mogą być postrzegane jako molekularne narzędzia do analizowania kaskad sygnalizacji komórkowej ze względu na ich zdolność do znakomitego manipulowania i podważania funkcji komórek, które są wymagane do infekcji tkanek docelowych gospodarza. Wśród tych patogenów bakteryjnych Listeria monocytogenes jest mikroorganizmem Gram-dodatnim, który został wykorzystany jako paradygmat pasożytnictwa wewnątrzkomórkowego w charakterystyce komórkowej odpowiedzi immunologicznej i który odegrał kluczową rolę w odkryciu szlaków molekularnych kontrolujących dynamikę transportu cytoszkieletu i błony. W tym artykule opisujemy solidny test mikroskopowy do wykrywania późnych stadiów infekcji komórkowej L. monocytogenes oparty na fluorescencyjnym znakowaniu InlC, wydzielanego białka bakteryjnego, które gromadzi się w cytoplazmie zakażonych komórek; test ten można połączyć ze zautomatyzowanymi, wysokoprzepustowymi, małymi interferującymi badaniami przesiewowymi RNA w celu scharakteryzowania komórkowych szlaków sygnałowych zaangażowanych w regulację infekcji w górę lub w dół.

Fluorescencyjne znakowanie cytoplazmatycznego InlC zapewnia wiarygodny odczyt infekcji komórek przez L. monocytogenes, co zilustrowano na Rysunku 1: centralna komórka na mikrofotografii jest silnie zainfekowana szczepem P14.PrfA*23, co można zaobserwować na obrazie w kontraście fazowym (groty strzałek, Rysunek 1A), a co potwierdza sygnał DAPI, gdzie można wyraźnie rozróżnić poszczególne bakterie (Rysunek 1B). Barwienie InlC (nałożone na barwienie DAPI...

Listeria monocytogenes to Gram-dodatni patogen bakteryjny, często używany jako główny model do badania pasożytnictwa wewnątrzkomórkowego. Obrazowanie późnych etapów infekcji L. monocytogenes w kontekście małych interferujących badań przesiewowych RNA pozwala na globalne badanie szlaków komórkowych wymaganych do infekcji bakteryjnej docelowych komórek gospodarza.

Obrazowanie wydzielania InlC w celu zbadania zakażenia komórkowego patogenem bakteryjnym Listeria monocytogenes

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest ilościowe określenie inwazji komórkowej patogenu listeria monocytogenes w kontekście testów siRNA, aby odkryć nowe funkcje komórkowe niezbędne do infekcji bakteryjnej. Osiąga się to poprzez wstępne przeprowadzenie odwrotnej transfekcji siRNA do komórek w celu dezaktywacji specyficznych funkcji komórek gospodarza. W drugim kroku komórki są inokulowane listeria monocytogenes, która będzie infekować komórki w stopniu zróżnicowanym w zależności od funkcji komórkowych, na które wpłynęła terapia siRNA.Następnie zainfekowane komórki poddaje się immunofluorescencji w celu oznakowania jąder komórkowych. Uzyskuje się wyniki dotyczące cytoszkieletu aktynowego oraz białka bakteryjnego INLC, które pozwalają zidentyfikować zainfekowane komórki i odróżnić je od komórek niezinfekowanych na podstawie analizy mikroskopowej rozkładu białka INLC w poszczególnych komórkach. Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod, takich jak testy inwazji z użyciem gentamycyny, jest możliwość jej zastosowania w sposób FU.Zatem metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie mikrobiologii komórkowej poprzez identyfikację nowych szlaków

imaging-inlc-secretion-to-investigate-cellular-infection-bacterial

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Obrazowanie Sekrecji InlC w Badaniu Zakażenia Komórkowego przez Bakteryjnego Patogenu Listeria monocytogenes

Opisano metody obrazowania bioluminescencyjnego infekcji bakteryjnych u żywych zwierząt. Patogeny są modyfikowane w celu ekspresji lucyferazy, co umożliwia optyczne obrazowanie całego ciała w celu wykrycia infekcji u żywych zwierząt. Modele zwierzęce mogą zostać zainfekowane patogenami wykazującymi ekspresję lucyferazy, a wynikający z tego przebieg choroby może być wizualizowany w czasie rzeczywistym za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego.

Wykorzystanie lucyferazy do obrazowania infekcji bakteryjnych u myszy

Listeria monocytogenes jest organizmem modelowym do badania odpowiedzi immunologicznych i genetycznej podatności myszy na bakterie wewnątrzkomórkowe. Metoda ta umożliwia pomiar ładunku bakteryjnego oraz przygotowanie jednokomórkowych zawiesin wątroby i śledziony myszy do analizy FACS w celu określenia zmian w komórkach odpornościowych wywołanych zakażeniem Listeria.

Pomiar ładunku bakteryjnego i odpowiedzi immunologicznych u myszy zainfekowanych Listeria monocytogenes

Źródło: Chetrit, D. i in. Zastosowanie obrazowania żywych komórek oraz tomografii krioelektronowej w celu wyróżnienia cech przestrzenno-skroniowych systemu sekrecji kropkowej/icm Legionella pneumophila . J. Vis. Exp. (2020).Ten film pokazuje przygotowanie i obrazowanie bakterii patogennych znakowanych fluorescencjonie. Agarozowe podkładki są najpierw przygotowywane i umieszczane w ramie klejącej. Na podkład aplikowana jest zawiesina genetycznie modyfikowanych bakterii ekspresujących...

Przygotowanie próbek i obrazowanie bakterii znakowanych fluorescencją

W tym filmie określamy ilościowo wewnątrzkomórkową i zewnątrzkomórkową Listeria monocytogenes, wewnątrzkomórkową bakterię chorobotwórcze, po ich zakażeniu hodowanymi makrofagami in vitro za pomocą cytometrii przepływowej.

Analiza cytometrii przepływowej wewnątrzkomórkowych i pojawiających się zewnątrzkomórkowych Listeria monocytogenes in vitro

Ten film demonstruje technikę wykrywania lokalnej i globalnej reakcji jonów wapnia na zakażenie Shigella ludzkimi komórkami nabłonkowymi. Shigella atakuje komórki gospodarza i uwalnia efektory inwazji, wpływając na wewnątrzkomórkowy poziom wapnia. Amplitudę i częstość lokalnego i globalnego cytozolowego wapnia bada się za pomocą wskaźnika fluorescencyjnego.

Technika obrazowania do badania odpowiedzi wapnia w komórkach zakażonych bakteriami

Ten artykuł opisuje nowatorską metodę doustnego zakażenia myszy za pomocą żywności skażonej Listeria monocytogenes. Protokół można łatwo dostosować do stosowania z innymi patogenami bakteryjnymi przenoszonymi przez żywność.

Przenoszenie Listeria monocytogenes drogą pokarmową drogą pokarmową u myszy

Obrazowanie multimodalne jest cennym podejściem do badania kolonizacji bakteryjnej w małych modelach zwierzęcych. Protokół ten przedstawia zakażenie myszy bioluminescencyjnym Citrobacter rodentium i podłużne monitorowanie kolonizacji bakteryjnej za pomocą kompozytowej tomografii obrazowania 3D w świetle rozproszonym z obrazowaniem μCT w celu stworzenia filmu 4D infekcji C. rodentium.

Multimodalne obrazowanie 4D zakażeń Citrobacter rodentium u myszy

Listeria monocytogenes powoduje infekcje płodu u kobiet w ciąży i zapalenie opon mózgowych w populacjach podatnych.  Subpopulacje bakterii mogą kolonizować tkankę serca, powodując zapalenie mięśnia sercowego u pacjentów i zwierząt laboratoryjnych.  W tym miejscu przedstawiamy protokół, który opisuje, jak ocenić inwazję komórek serca L. monocytogenes in vitro i kolonizację serca u zakażonych zwierząt.

Ocena inwazji bakteryjnej komórek serca w hodowli i kolonizacji serca u zakażonych myszy przy użyciu Listeria monocytogenes

Ten protokół opisuje, jak zaszczepić myszy C57BL/6J szczepem EGD Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) i zmierzyć odpowiedzi interferonu γ (IFN-γ) przez komórki NK (natural killer), limfocyty T (NKT) i adaptacyjne limfocyty T po zakażeniu. Protokół ten opisuje również, w jaki sposób przeprowadzać badania przeżycia u myszy po zakażeniu zmodyfikowaną dawką LD50 patogenu.

Eksperymentalne zakażenie Listeria monocytogenes jako model do badania odpowiedzi na interferon-γ gospodarza

Opisujemy zarówno testy infekcji in vitro, jak i in vivo, które mogą być użyte do analizy aktywności czynników kodujących gospodarza.

Wykorzystanie patogenu bakteryjnego do badania odpowiedzi gospodarza na poziomie komórkowym i organizmowym

Tutaj opisujemy prostą metodę obrazowania konfokalnego, aby zobrazować lokalizację in situ komórek wydzielających cytokinę Interferon gamma w mysich wtórnych narządach limfatycznych. Protokół ten można rozszerzyć o wizualizację innych cytokin w różnych tkankach.

Obrazowanie wytwarzania interferonu gamma in situ w śledzionie myszy po zakażeniu Listeria monocytogenes

Poznaj mikroskopową metodę wykrywania zakażenia Listeria monocytogenes poprzez fluorescencyjne znakowanie białka InlC. Technika umożliwia wysokoprzepustowe badania interakcji patogen-gospodarz.

Obrazowanie wydzielania InlC w celu zbadania zakażenia komórkowego patogenem bakteryjnym Listeria monocytogenes

Przeglądaj więcej filmów