Name: Analiza apoptozy w zarodkach danio pręgowanego za pomocą immunofluorescencji całego wierzchowca w celu wykrycia aktywowanej kaspazy 3 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-20T14:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Poznaj metodę immunofluorescencji całego wierzchowca do wykrywania aktywowanej kaspazy 3 w zarodkach Danio rerio. Ta technika pozwala wizualizować komórki apoptotyczne na różnych etapach rozwoju w biologii rozwoju.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowanie zostało zapewnione przez Huntsman Cancer Foundation (CJ, CT), grant American Cancer Society #RSG-13-025-01-CSM (RS) oraz NIH T32 GM007464-36 (SS).

1. Przygotowanie roztworów
<ol>
	<li>Przygotuj 500 ml 1x PBST (1x PBS, 0,1% Tween-20) i sterylizuj przez filtr. 1x PBST może być przechowywany w temperaturze pokojowej (RT) przez czas nieokreślony, o ile nie ma oznak rozwoju bakterii.</li>
	<li>UWAGA: Przygotuj 50 ml 4% paraformaldehydu (PFA) w kapturze chemicznym, rozpuszczając sproszkowany PFA w 1x PBS w temperaturze 60 °C przez 1 godzinę i przykrywając folią aluminiową w celu ochrony przed światłem. Przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1 miesiąc lub w temperaturze -20 °C przez 2 lata.</li>
	<li>Przygotuj 500 ml świeżego 1x PDT (1x PBST, 0,3% Triton-X, 1% DMSO). 1x PDT może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez okres do jednego miesiąca.</li>
	<li>Przygotować 50 ml buforu blokującego (1x PBST, 10% inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca, 2% albumina surowicy bydlęcej). Utworzyć 10 ml podwielokrotności i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 1 roku. Po rozmrożeniu bufor blokujący może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 48 godzin.</li>
	<li>Przygotować 100 ml 4% metylocelulozy, podgrzewając 30 ml wody do temperatury 80 °C. Dodać 4 g metylocelulozy do gorącej wody i wymieszać za pomocą mieszadła na mieszadle w temperaturze pokojowej. Dokładne mieszanie trwa zwykle od 4 godzin do nocy. Dodać pozostałą część (niepodgrzanej) wody i mieszać w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę. Sklep w RT.</li>
	<li>W przypadku stosowania zarodków w stadium między stadiami pąków ogonowych a 32 hpf, należy przygotować 50 ml pronazy w dawce 10 mg/ml i przechowywać przez okres do 1 tygodnia w temperaturze 4 °C. W przeciwnym razie przechowywać w 10 ml podwielokrotności w temperaturze -20 °C przez okres do 1 roku.</li>
	<li>Umieścić 50 ml 100% metanolu w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Przygotuj 60x wodę jajeczną, rozpuszczając 280 g rozpuszczalnej soli morskiej oceanicznej w 2 litrach wody destylowanej (jak w Westerfield16). Przygotuj 1x wodę jajeczną, rozcieńczając 60x bulion w wodzie dejonizowanej.</li>
</ol>
2. Przygotowanie zarodków
<ol>
	<li>Zbierz zarodki danio pręgowanego na szalce Petriego w 1x wodzie z jajami między stadium 4-komórkowym a 32 hpf.
	<ol>
		<li>W przypadku zarodków między etapem 4-komórkowym a pączkiem ogonowym przejdź do kroku 2.2.</li>
		<li>W przypadku zarodków między stadium pąka ogonowego a 32 hpf należy usunąć kosmówkę, dodając 100 μl 10 mg/ml pronazy do zarodków w 10 ml 1x wody jajecznej.</li>
		<li>Uwaga: Aktywność pronazy może być zmienna między partiami. W związku z tym końcowe stężenie pronazy powinno być zoptymalizowane pod kątem dechorionacji po uzyskaniu nowych partii.
		<ol>
			<li>Pozostawić do inkubacji w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
			<li>Wlej wodę z jajka / roztwór pronazy do odpadów i powoli dodaj z powrotem świeżą 1x wodę jajeczną.</li>
			<li>Opłucz 2x, wylewając istniejącą wodę z jaj (i swobodnie pływającą choriony) i delikatnie dodaj nową wodę jajeczną.</li>
			<li>Uwaga: W tym momencie należy usunąć większość chorionów. Za pomocą pipety transferowej delikatnie zasysaj zarodki w górę i w dół, aż do usunięcia pozostałych kosmówek.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieś do 40 zarodków do probówki o pojemności 1,5 ml. Spłukać 2 razy 1 ml 1x PBST.  </li>
	<li>Usunąć PBST, pozostawiając płyn tuż nad zarodkami (w probówce powinno pozostać około 100 μl objętości). Dodać 1 ml 4% PFA. Ułożyć probówki na boku (tak, aby zarodki były rozłożone wzdłuż probówki) w pojemniku o odpowiedniej wielkości ułatwiającym transport (np. na szalce Petriego lub w pudełku z pipetami) i umieścić na delikatnym bujaku w temperaturze 4 °C przez noc lub do tygodnia.  
	<ol>
		<li>W przypadku zarodków między stadiami 4-komórkowymi a pąkiem ogonowym należy ręcznie zdechorionować utrwalone zarodki za pomocą kleszczy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Procedura immunofluorescencji
<ol>
	<li>Umieść probówki w stojaku na probówki tak, aby wszystkie zarodki opadły na dno probówki. Usunąć PFA (do odpowiedniego pojemnika na odpady) pozostawiając płyn tuż nad poziomem zarodków. Po utrwaleniu (etap 2.3) zarodki nigdy nie powinny być wystawiane na działanie powietrza, aby zapobiec barwieniu przeciwciałami tła.</li>
	<li>Dodaj kroplami 1 ml lodowatego 100% metanolu (do przepuszczalności). Zarodki są teraz kruche po utrwaleniu i należy zachować szczególną ostrożność, aby zapobiec ich przewracaniu się w probówce podczas wszystkich kolejnych wyjmowania/dodawania płynów. Połóż probówki na bokach i umieść w temperaturze -20 °C na 2 godziny. Alternatywnie zarodki można pozostawić w temperaturze -20 °C na okres do 24 godzin.</li>
	<li>Umieść probówki w stojaku, aby zebrać zarodki na dnie probówki. Usuń metanol, pozostawiając płyn tuż nad poziomem zarodków.</li>
	<li>Ostrożnie dodać 1 ml 1x PDT. Usuń PDT i dodaj 1 ml świeżego 1x PDT. Połóż rurki na bokach i delikatnie kołysz się w temperaturze RT przez 30 minut. Usuń PDT i powtórz 30-minutowe mycie świeżym PDT.</li>
	<li>Usuń PDT, aż płyn znajdzie się tuż powyżej poziomu zarodków, i dodaj 500 μl buforu blokującego.
	<ol>
		<li>Połóż zarodki na boku w pojemniku transportowym i upewnij się, że zarodki nie przemieszczają się dalej niż 2/3 długości probówki. W przeciwnym razie zarodki zostaną uwięzione w wieczku probówki i na zewnątrz płynu.  </li>
		<li>Ostrożnie umieść pojemnik transportowy z rurkami na bardzo delikatnym bujaku w RT na 1 godzinę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustaw probówki pionowo w stojaku na probówki i otwórz wszystkie probówki, aby sprawdzić, czy zarodki nie utknęły na pokrywie. W przypadku probówek z zarodkami na pokrywce zamknij górną część i delikatnie kołysz rurką ręcznie, aby wprowadzić wszystkie zarodki z powrotem do płynu.</li>
	<li>Dodać 1 μl przeciwciała przeciwko kaspazie 3 (rozcieńczenie 1:500).
	<ol>
		<li>Jeśli przeprowadzasz eksperyment ze wspólnym znakowaniem, po prostu dodaj odpowiednie rozcieńczenie drugiego przeciwciała niepochodzącego od królika oprócz przeciwciała antyaktywowanego kaspazy 3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ostrożnie ułóż zarodki na boku i delikatnie kołysz w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Alternatywnie zarodki można inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
	<li>Postaw probówki w stojaku na tuby. Usunąć roztwór bloku/przeciwciała. Dodać 1 ml 1x PDT. Pamiętaj, aby ręcznie odwrócić probówkę, aby zebrać wszelkie zarodki przyklejone do wieczka probówki. Następnie otwórz wszystkie probówki, aby upewnić się, że wszystkie zarodki zostały usunięte z pokrywy.</li>
	<li>Powtórz krok 3.4.</li>
	<li>Powtórz kroki 3.5-3.10, ale zastąp przeciwciało antyaktywowane kaspazą 3 odpowiednim rozcieńczeniem przeciwciała sprzężonego z fluoroforem przeciwko królikowi, które pochłania światło niebieskie i emituje światło zielone. Można jednak użyć tutaj dowolnego przeciwciała sprzężonego z fluoroforem o preferowanych przez użytkownika widmach absorpcji/emisji. Po dodaniu przeciwciała drugorzędowego ważne jest, aby trzymać zarodki w ciemności przez pozostałą część testu. Przykryj pojemnik transportowy folią aluminiową podczas etapów inkubacji, ale nie martw się o ekspozycję na światło podczas wymiany.
	<ol>
		<li>Jeśli wykonujesz eksperyment ze wspólnym znakowaniem, po prostu dodaj odpowiednie rozcieńczenie komplementarnego przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z fluoroforem na tym etapie.</li>
		<li>Uwaga: Jeśli użytkownik chce koznakować aktywną kaspazę 3 z komórkami wykazującymi ekspresję Gfp, wówczas po króliczym przeciwciałie antyaktywnym kaspazie 3 powinno nastąpić drugorzędowe przeciwciało anty-królicze niefluorescencyjne przeciwko królicowi, a po przeciwciałie anty-GFP powinno nastąpić fluorescencyjne przeciwciało drugorzędowe niekrólicze o zielonym fluorze. Wyeliminuje to zamieszanie, jeśli część fluorescencji Gfp pozostanie widoczna po utrwaleniu zarodków.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza komórek apoptotycznych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej
<ol>
	<li>Analizuj zarodki w 1x PDT na małej szalce Petriego lub szklanej płytce punktowej pod mikroskopem fluorescencyjnym przy użyciu odpowiedniego filtra światła. Jeśli kontrole pozytywne mają jasną fluorescencję z minimalnym tłem, przejdź do kroku 4.2. (Jeśli nie, zapoznaj się z sekcją dotyczącą rozwiązywania problemów w Dyskusji i powtórz protokół z nowymi zarodkami.) Zarodki mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C w 1x PDT przez okres do 48 godzin.</li>
	<li>Wlej 4% metylocelulozy do szalki Petriego o średnicy 3,5 cm, tylko tyle, aby przykryć dno naczynia. Alternatywnie można zastosować szklaną płytkę punktową lub szkiełko wgłębieniowe z dużą kroplą metylocelulozy w wgłębieniu. Ostrożnie zassać zarodki z dna probówki do czystej pipety transferowej i przenieść na płytkę Petriego w celu wizualizacji.</li>
	<li>Zorientuj interesujący zarodek do dokumentacji za pomocą sondy kątowej. Prawdopodobnie wystąpi pewna zmienność między zarodkami z tej samej próbki, dlatego ważne jest, aby wykonać zdjęcia, które reprezentują intensywność fluorescencji i wzór obserwowany w większości zarodków z tej próbki. Dokumentację należy wykonać w ciągu 48 godzin od zakończenia testu, aby zapobiec akumulacji niespecyficznej fluorescencji tła. Pozostałe 4% metylocelulozy nie będzie zakłócać kolejnych reakcji PCR wymaganych do genotypowania zarodków.</li>
	<li>Uwaga: Aby pomóc w unieruchomieniu zarodka pod pewnym kątem, pomocne jest delikatne dociśnięcie zarodka do dna naczynia, tak aby żółtko lub inna część zarodka (w zależności od pożądanego widoku) spoczywała na dnie naczynia. Następnie użyj sondy, aby przesunąć zarodek lub bezpośrednio otaczającą metylocelulozę (jednocześnie wizualizując pod mikroskopem), aby uzyskać pożądany kąt do dokumentacji.</li>
</ol>

<ol><li>Tait, S. W., Green, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+and+cell+death%3A+outer+membrane+permeabilization+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondria and cell death: outer membrane permeabilization and beyond.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 621-632 (2010).</li>
<li>Taylor, R. C., Cullen, S. P., Martin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%3A+controlled+demolition+at+the+cellular+level%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Apoptosis: controlled demolition at the cellular level.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 231-241 (2008).</li>
<li>Eimon, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delineation+of+the+cell-extrinsic+apoptosis+pathway+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Delineation of the cell-extrinsic apoptosis pathway in the zebrafish.</a> Cell Death Differ. 13, 1619-1630 (2006).</li>
<li>Jette, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BIM+and+other+BCL-2+family+proteins+exhibit+cross-species+conservation+of+function+between+zebrafish+and+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">BIM and other BCL-2 family proteins exhibit cross-species conservation of function between zebrafish and mammals.</a> Cell Death Differ. 15, 1063-1072 (2008).</li>
<li>Kratz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+the+Bcl-2+gene+family+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of the Bcl-2 gene family in the zebrafish.</a> Cell Death Differ. 13, 1631-1640 (2006).</li>
<li>Sidi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chk1+suppresses+a+caspase-2+apoptotic+response+to+DNA+damage+that+bypasses+p53%2C+Bcl-2%2C+and+caspase-3.+%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chk1 suppresses a caspase-2 apoptotic response to DNA damage that bypasses p53, Bcl-2, and caspase-3. </a> Cell. 133, 864-877 (2008).</li>
<li>Zhao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interruption+of+cenph+causes+mitotic+failure+and+embryonic+death%2C+and+its+haploinsufficiency+suppresses+cancer+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Interruption of cenph causes mitotic failure and embryonic death, and its haploinsufficiency suppresses cancer in zebrafish.</a> J. Biol. Chem. 285, 27924-27934 (2010).</li>
<li>Yager, T. D., Ikegami, R., Rivera-Bennetts, A. K., Zhao, C., Brooker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+imaging+at+the+cellular+and+subcellular+levels+in+flattened+whole+mounts+of+early+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">High-resolution imaging at the cellular and subcellular levels in flattened whole mounts of early zebrafish embryos.</a> Biochem. Cell Biol. 75, 535-550 (1997).</li>
<li>Furutani-Seiki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+degeneration+mutants+in+the+zebrafish%2C+Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Neural degeneration mutants in the zebrafish, Danio rerio.</a> Development. 123, 229-239 (1996).</li>
<li>Sorrells, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ccdc94+Protects+Cells+from+Ionizing+Radiation+by+Inhibiting+the+Expression+of+p53%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Ccdc94 Protects Cells from Ionizing Radiation by Inhibiting the Expression of p53.</a> PLoS Genet. 8, (2012).</li>
<li>Gavrieli, Y., Sherman, Y., Ben-Sasson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+programmed+cell+death+in+situ+via+specific+labeling+of+nuclear+DNA+fragmentation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation.</a> J. Cell Biol. 119, 493-501 (1992).</li>
<li>Cole, L. K., Ross, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+in+the+developing+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Apoptosis in the developing zebrafish embryo.</a> Dev. Biol. 240, 123-142 (2001).</li>
<li>Abrams, J. M., White, K., Fessler, L. I., Steller, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+cell+death+during+Drosophila+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Programmed cell death during Drosophila embryogenesis.</a> Development. 117, 29-43 (1993).</li>
<li>Beers Jr, R. F., Hendley, D. D., Steiner, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+and+activation+of+polynucleotide+phosphorylase+through+the+formation+of+complexes+between+acridine+orange+and+polynucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inhibition and activation of polynucleotide phosphorylase through the formation of complexes between acridine orange and polynucleotides.</a> Nature. 182, 242-244 (1958).</li>
<li>Delic, J., Coppey, J., Magdelenat, H., Coppey-Moisan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impossibility+of+acridine+orange+intercalation+in+nuclear+DNA+of+the+living+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Impossibility of acridine orange intercalation in nuclear DNA of the living cell.</a> Exp. Cell Res. 194, 147-153 (1991).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%22">The Zebrafish Book</a>. , University of Oregon Press. Eugene, OR. (1993).</li>
<li>Shin, J., Park, H. C., Topczewska, J. M., Mawdsley, D. J., Appel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+cell+fate+analysis+in+zebrafish+using+olig2+BAC+transgenics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Neural cell fate analysis in zebrafish using olig2 BAC transgenics.</a> Methods Cell Sci. 25, 7-14 (2003).</li>
<li>Park, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+upstream+elements+in+the+HuC+promoter+leads+to+the+establishment+of+transgenic+zebrafish+with+fluorescent+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of upstream elements in the HuC promoter leads to the establishment of transgenic zebrafish with fluorescent neurons.</a> Dev. Biol. 227, 279-293 (2000).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Test Casp3 przedstawiony w tym protokole ma być prosty, a jeśli zostanie przeprowadzony zgodnie z instrukcjami w niniejszym dokumencie, powinien dać solidny stosunek sygnału do szumu. Krytyczne etapy tego protokołu obejmują użycie świeżego buforu 1x PDT do wszystkich płukań, wystarczającą długość etapów płukania w buforze PDT po inkubacji zarodków w pierwotnym przeciwciałie, delikatne obchodzenie się z zarodkami oraz skrupulatne rozliczanie wszystkich zarodków w probówkach lub pipetach transferowych podczas wszystkich etapów protokołu.
Z naszego doświadczenia wynika, że najczęstszymi przyczynami braku sygnału o kontrolach pozytywnych są: 1) 1x PBST jest zastępowany przez 1x PDT podczas etapów mycia, 2) 1x bufor PDT jest starszy niż jeden miesiąc, 3) zastosowano niewłaściwe przeciwciało drugorzędowe, 4) zarodki są starsze niż 32 hpf i/lub 5) w jednej probówce przeanalizowano więcej niż 40 zarodków. Gdy w próbkach pojawiają się niespójne wyniki lub zmienność, dzieje się tak zwykle dlatego, że 1) nie zadbano o to, aby wszystkie zarodki pozostały w płynie przez cały czas trwania zabiegu i/lub 2) zarodki nie były inkubowane pod wystarczającym kołysaniem. Wysoki poziom szumu tła jest często wizualizowany jako ogólna fluorescencyjna mgiełka powstająca w tkance zwierzęcej zarodka (patrz Ryc. 4, "fluorescencja tła"). Słaby stosunek sygnału do szumu może wystąpić, gdy 1) zarodki nie były myte przez wystarczająco długi czas po podaniu przeciwciała pierwotnego i/lub 2) zarodki pozostawiono w PFA lub metanolu dłużej niż zalecany czas. Jeżeli zarodki nie pozostaną nienaruszone do końca testu: 1) roztwory nie zostały dodane kroplami po utrwaleniu z PFA i/lub 2) prędkość obrotowa podczas etapów inkubacji była zbyt wysoka.
Wizualizacja całościowa nieodłącznie związana z testem Casp3 jest pomocna w przestrzennej lokalizacji komórek apoptotycznych. Jednak swoistość tkankowa jest przybliżona i prawdopodobnie będzie zależeć od technik wspólnego znakowania (patrz rycina 5) i/lub sekcji zarodków w celu określenia dokładnej tożsamości komórek poddawanych apoptozie. W opisanym tutaj protokole wspólne znakowanie jest ograniczone przez wymóg specyficznego przeciwciała pochodzącego od królika użytego w naszym teście. Nie zidentyfikowaliśmy komercyjnie dostępnego przeciwciała antyaktywowanego kaspazy 3 pochodzącego z królika, które specyficznie znakuje komórki apoptotyczne przez immunofluorescencję całej góry w zarodkach danio pręgowanego. W związku z tym przeciwciała specyficzne dla typu komórkowego, które są hodowane u królików, nie będą kompatybilne z testem Casp3 do eksperymentów ze wspólnym znakowaniem. Jedną z alternatyw jest wykonanie testu TUNEL, który wymaga przeciwciała pochodzącego od myszy do znakowania komórek apoptotycznych6. Odkryliśmy jednak, że test TUNEL z pełnym wierzchowaniem przeprowadzony na zarodkach danio pręgowanego jest bardzo wrażliwy na szereg zmiennych w reakcji, w tym stężenie enzymu TdT, czas inkubacji zarodka w enzymie TdT oraz liczbę zarodków obecnych w probówce (nasze niepublikowane obserwacje). W związku z tym trudno jest znaleźć równowagę enzymów, która daje spójną interpretację wyników. Dlatego preferowaną alternatywą jest analiza komórek apoptotycznych w transgenicznych zarodkach danio pręgowanego, które wyrażają fluorofor (z dostępnymi na rynku silnymi przeciwciałami), taki jak GFP, w określonym typie komórki. Następnie eksperymenty ze wspólnym znakowaniem można przeprowadzić przy użyciu pierwszorzędowego mysiego przeciwciała anty-Gfp, a następnie fluoryzującego na zielono przeciwciała anty-mysiego przeciwciała wtórnego. Zobacz rysunek 5 , aby zapoznać się z przykładem.
Podczas gdy protokół Casp3 zapewnia solidne, niezawodne barwienie komórek apoptotycznych w zarodkach od stadium 4-komórkowego do 32 hpf, ma ograniczone zastosowanie powyżej 32 hpf ze względu na niezdolność przeciwciał do przenikania przez skórę starszych zarodków. Dodatkowe techniki przenikania zarodków, w tym leczenie kolagenazą, trypsyną, acetonem lub etanolem, mogą być potencjalnie zoptymalizowane w celu dostosowania tego testu do analizy starszych zarodków. Barwienie AO można jednak przeprowadzić na żywych danio pręgowanych w wieku do co najmniej 5 dni9. W ten sposób test AO omija ograniczenie stadium embrionalnego i stanowi szybki test do analizy komórek apoptotycznych (1-2 godziny). Natomiast test Casp3 wymaga utrwalenia zarodków przez noc i trwa 2-4 dni. Wady testu AO obejmują to, że skuteczna dokumentacja fotograficzna zarodków może być trudna w przypadku wielu próbek, ponieważ zarodki są żywe, a komórki apoptotyczne są szybko tworzone i oczyszczane. Może to być szczególnie problematyczne, jeśli zarodki muszą zostać zamontowane w celu uzyskania określonej orientacji do dokumentacji. Ponadto odkryliśmy, że barwienie AO zmniejsza się po utrwaleniu za pomocą PFA, więc nie jest zgodne z eksperymentami koznakowania obejmującymi immunofluorescencję.
Analizę ilościową aktywowanej kaspazy 3 można przeprowadzić za pomocą oprogramowania, które mierzy intensywność fluorescencji udokumentowanych obrazów. Określiliśmy ilościowo apoptozę indukowaną przez IR w tkance nerwowej, metodę, którą szczegółowo opisaliśmy w innym miejscu10. W zależności od eksperymentu, analiza ilościowa aktywowanej kaspazy 3 może wymagać dalszej manipulacji zarodkami, takiej jak montaż płaski, w celu uzyskania właściwej orientacji dla optymalnej analizy tkanki. Ponadto liniowość analizy będzie zależała od grubości analizowanej tkanki. Na przykład przeanalizowaliśmy apoptozę indukowaną przez IR w tkance nerwowej, mierząc immunofluorescencję aktywnej kaspazy 3 w płytkiej tkance nerwowej rdzenia kręgowego, a nie w gęstej od neuronów tkance mózgu4,10.
Z naszego doświadczenia wynika, że test Casp3 jest najbardziej solidnym i wiarygodnym testem dostępnym do analizy apoptozy w zarodkach danio pręgowanego między stadium 4-komórkowym a 32 hpf, gdy analiza wymaga dużo czasu na dokumentację. Gdy dostępne są odpowiednie przeciwciała lub linie transgeniczne do identyfikacji określonych komórek, test ten jest również wysoce podatny na koznakowanie w celu identyfikacji określonych typów komórek ulegających apoptozie.

Tutaj opisujemy, jak przeprowadzić immunofluorescencję całej góry we wczesnych zarodkach danio pręgowanego w celu wykrycia komórek z aktywowaną kaspazą 3 (zwaną dalej testem Casp3). Ogólnym celem tej metody jest określenie względnej obfitości i lokalizacji komórek apoptotycznych u danio pręgowanego od etapu 4-komórkowego do 32 godzin po zapłodnieniu (hpf).
Zarówno wewnętrzne (za pośrednictwem mitochondriów), jak i zewnętrzne (za pośrednictwem receptora śmierci) szlaki apoptotyczne pośredniczą w śmierci komórki poprzez aktywację kaskadykaspazy 1-2. Kaspazy inicjujące zwykle istnieją jako monomery w komórce, a po zrekrutowaniu do platform specyficznych dla szlaku w odpowiedzi na sygnał proapoptotyczny stają się aktywowanymi dimerami. Aktywowane kaspazy inicjujące (kaspaza 9; szlak wewnętrzny i kaspaza 8; szlak zewnętrzny) następnie celują w predimeryzowane, nieaktywne kaspazy efektorowe (kaspaza 3, 6, 7) w celu rozszczepienia w celu utworzenia aktywnych heterotetramerów. Aktywne kaspazy efektorowe następnie rozszczepiają cele komórkowe specyficznymi resztami tetrapeptydowymi, aby zainicjować specyficzne zniszczenie proteolityczne, którego kulminacją są ultrastrukturalne cechy apoptozy, takie jak kondensacja chromatyny i pęcherzenie błony, oraz sygnały powierzchniowe komórki, które pośredniczą w pakowaniu komórki w celu pochłonięcia przez fagocyty w sposób immunologiczny. Uważa się, że w komórkach ssaków aktywne kaspazy efektorowe wykonują większość zdarzeń rozszczepienia komórek, które pośredniczą w apoptozie zarówno poprzez wewnętrzne, jak i zewnętrzne szlaki1-2. Opisany tutaj protokół wykorzystuje przeciwciało, które specyficznie wiąże rozszczepioną, heterotetrameryczną formę kaspazy 3, ale nie nieaktywny dimer kaspazy 3.
Jedną z zalet testu Casp3 jest możliwość wizualizacji przestrzennego rozmieszczenia komórek apoptotycznych w kontekście całego zarodka. W związku z tym interesujące tkanki mogą być badane pod kątem obecności komórek apoptotycznych, a jeśli istnieją przeciwciała lub fluorescencyjne szczepy transgeniczne, które znakują określone typy komórek, możliwe jest określenie dokładnej tożsamości komórek poddawanych apoptozie poprzez eksperymenty ze wspólnym znakowaniem. Kilka grup z powodzeniem wykorzystało aktywowaną kaspazę 3 jako marker apoptozy w zarodkach danio pręgowanego (np. 3-7). Dodatkowe techniki całego montażu do identyfikacji komórek apoptotycznych w zarodkach danio pręgowanego obejmują test TUNEL8 i barwienie pomarańczą akrydynową (AO)9. Zastosowaliśmy wszystkie trzy metody do identyfikacji komórek apoptotycznych w zarodkach danio pręgowanego4,6,10.
TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling) barwienie wykorzystuje enzym Terminal deoxynucleotydylotransferazy (TdT), który jest używany do dodawania nukleotydów do 3' hydroksylowych końców DNA podczas rekombinacji VDJ w limfocytach11. TdT dodaje biotynę dUTP do wolnych grup hydroksylowych 3' w DNA, które występują obficie przede wszystkim w komórkach apoptotycznych. Tkanki są następnie wystawiane na działanie peroksydazy awidyny, a komórki apoptotyczne są barwione po dodaniu substratu 3-amino-9-etylokarbazolu. Test TUNEL wykorzystano do przeprowadzenia obszernej analizy komórek apoptotycznych podczas rozwoju embrionalnego w tkankach danio pręgowanego typu dzikiego12. Podobnie jak w przypadku testu Casp3, test TUNEL przeprowadza się tylko na utrwalonych zarodkach. Odkryliśmy, że test Casp3 jest bardziej spójny i tańszy niż test TUNEL.
Barwienie AO zostało po raz pierwszy opisane jako mechanizm specyficznej identyfikacji komórek apoptotycznych u Drosophila13. AO barwi zarówno cytoplazmę, jak i jądro komórek apoptotycznych, ale nie nekrotycznych. AO jest dobrze znany z wiązania kwasów nukleinowych14 i uważa się, że to odpowiada za barwienie jądrowe. Jednak AO nie barwi chromatyny żywych komórek; Wydaje się raczej, że specyficzne zmiany zachodzące podczas apoptozy pozwalają na interkalację i barwienie skondensowanych jąder apoptotycznych15. Barwienie AO ma tę zaletę, że umożliwia szybką analizę apoptotyczną żywych zarodków. Jednak dokumentacja próbek musi być wykonywana szybko ze względu na dynamiczny charakter tworzenia i klirensu komórek apoptotycznych. Z drugiej strony, jednoczesna fiksacja wszystkich próbek zapewnia obraz apoptozy w danym momencie we wszystkich próbkach i nie podlega tej zmiennej czasowej. W związku z tym, że analiza komórek apoptotycznych za pomocą barwienia AO nie jest zgodna z utrwalonymi zarodkami, test Casp3 jest preferowany w eksperymentach, w których wymagana jest dokumentacja fotograficzna i/lub ocena ilościowa na wielu próbkach.

<table><tbody><tr><td>Probówki 1,5 ml&nbsp;</td><td>Denville Scientific</td><td>c2170</td><td>Bezpieczny Wystarczą podobne plastikowe rurki o długości 1,5 m.</td></tr><tr><td>10x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5493</td><td>Bezpieczny</td></tr><tr><td>Przeciwciało a-aktywowane-ludzkie-kaspazy-3</td><td>Fisher Scientific</td><td>BDB559565</td><td>Może być szkodliwe w przypadku wdychania lub połknięcia.</td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne a-GFP (mysz)</td><td>Life Technologies</td><td>33-2600</td><td>Może być szkodliwe w przypadku wdychania lub połknięcia.</td></tr><tr><td>a-HuC/HuD ludzkie białko neuronalne, mysie IgG2b, monoklonalne 16A11 - UNCONJ</td><td>Life Technologies</td><td>A21271</td><td>Może być szkodliwe w przypadku wdychania lub połknięcia.</td></tr><tr><td>Albumina, izolacja szokiem cieplnym BSA bydła&nbsp;</td><td>Amresco</td><td>CAS 9048-46-8</td><td>Bezpieczny Można również kupić za pośrednictwem Bioexpress: 0332-1006</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Donkey anti-mouse IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11029</td><td>Stosować w rozcieńczeniu 1:200. Może być szkodliwy w przypadku wdychania lub połknięcia.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Donkey anty-Rabbit IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A21206</td><td>Stosować w rozcieńczeniu 1:200. Może być szkodliwy w przypadku wdychania lub połknięcia.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Donkey anty-Rabbit IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A10042</td><td>Stosować w rozcieńczeniu 1:200. Może być szkodliwy w przypadku wdychania lub połknięcia.</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8418</td><td>Łatwopalny.</td></tr><tr><td>Kleszcze Dumont #5 Inox (końcówki standardowe/proste)</td><td>Narzędzia do nauki</td> precyzyjnej <td>11251-20</td><td>Ostre!</td></tr><tr><td>FBS HyClone Płodowa surowica bydlęca&nbsp;</td><td>Thermo-Fisher</td><td>SH3091003</td><td>bezpieczny.</td></tr><tr><td>Fisher Scientific Ocelot Rotator</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-450-21</td><td>Odpowiedni jest każdy rotator z ręczną regulacją prędkości.</td></tr><tr><td>Natychmiastowa sól oceaniczna do akwarium&nbsp;</td><td>Petco</td><td>1373684</td><td>bezpieczne.</td></tr><tr><td>Metanol (bez acetonu)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1775</td><td>Łatwopalny: działa toksycznie przez drogi oddechowe, spożycie i kontakt</td></tr>.<tr><td>Metyloceluloza</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M0387-1006</td><td>Bezpieczny</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td>Łatwopalny: działa toksycznie przez drogi oddechowe, spożycie i kontakt.</td></tr><tr><td>Sonda (kątowa 80 krótka/15,5 cm/0,15 mm średnicy końcówki)</td><td>Fine Science Tools</td><td>10140-02</td><td>Ostra!</td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Roche</td><td>11459643001</td><td>bezpieczny.</td></tr><tr><td>Płyta punktowa Pyrex</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-748B</td><td>Bezpieczny</td></tr><tr><td>Pipety transferowe, Samco ogólnego przeznaczenia</td><td>Thermo-Scientific</td><td>204</td><td>Bezpieczne.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td>Działa drażniąco: działa szkodliwie po spożyciu lub kontakcie.</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7949</td><td>Bezpieczny Inne marki to VWR #97063-872.</td></tr></tbody></table>

analiza apoptozy w zarodkach danio pręgowanego za pomocą immunofluorescencji całego wierzchowca w celu wykrycia aktywowanej kaspazy 3

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Immunofluorescencja w całości do wykrywania aktywowanej kaspazy 3 (test Casp3) jest przydatna do identyfikacji komórek ulegających wewnętrznej lub zewnętrznej apoptozie w zarodkach danio pręgowanego. Analiza całościowa dostarcza informacji przestrzennych w odniesieniu do specyficzności tkankowej komórek poddanych apoptozie, chociaż ostatecznie wymagane jest cięcie i/lub koznakowanie, aby wskazać dokładne typy komórek ulegających apoptozie. Test Casp3 z całą mocowaniem jest zoptymalizowany pod kątem analizy utrwalonych zarodków między etapem 4-komórkowym a 32 godzinami po zapłodnieniu i jest przydatny w wielu zastosowaniach, w tym do analizy mutantów i morfantów danio pręgowanego, nadekspresji zmutowanych i dzikich mRNA oraz narażenia na chemikalia. W porównaniu z barwieniem pomarańczą akrydynową, które może zidentyfikować komórki apoptotyczne w żywych zarodkach w ciągu kilku godzin, testy Casp3 i TUNEL trwają znacznie dłużej (2-4 dni). Jednak ze względu na dynamiczną naturę tworzenia i klirensu komórek apoptotycznych, analiza utrwalonych zarodków zapewnia dokładne porównanie komórek apoptotycznych w wielu próbkach w określonych punktach czasowych. Stwierdziliśmy również, że test Casp3 jest lepszy od analizy komórek apoptotycznych za pomocą testu TUNEL z całą mocą pod względem kosztów i wiarygodności. Ogólnie rzecz biorąc, test Casp3 stanowi solidny, wysoce powtarzalny test, w którym można analizować komórki apoptotyczne we wczesnych zarodkach danio pręgowanego.

Test Casp3 dostarcza wyraźnych dowodów na obecność komórek apoptotycznych od stadium 4 komórek do 32 hpf. Rysunek 2A wykazuje, że wstrzyknięcie do embrionów wysokich stężeń mRNA kodującego silne proapoptotyczne białka z grupy bh3-only, takie jak Bim lub Noxa, prowadzi do szybkiego powstania aktywnej kaspazy 3 do stadium 4 komórek. W konsekwencji śmierć embrionów następuje w ciągu 1 h4Należy zauważyć, że intensywność fluorescencji jest umiarkowana, jednak wyniki są jednoznaczne. W późniejszych etapach intensywność fluorescencji jest silniejsza. Na przykład, Rycina 2B wykazuje jasne, aktywne komórki dodatnie pod kątem kaspazy 3 w embrionach w stadium sfery, którym wstrzyknięto umiarkowanie toksyczne poziomy4 mRNA kodującego proapoptotyczne białka z domeną BH3 (bh3-only) gen pumamRNA kodujący białko antyapoptotyczne bcl-2 gen został wstrzyknięty równocześnie, aby udowodnić, że wstrzyknięcie puma mRNA indukuje apoptozę poprzez wewnątrzpochodny szlak zależny od mitochondriów.
Apoptoza indukowana przez promieniowanie jonizujące (IR) u danio pręgowanego wymaga p53-zależnej transkrypcji genów typu bh3-only, takich jak puma5-6. Opóźnienie apoptozy indukowanej przez IR przedstawione na Ryc. 3 jest zgodne z wymogiem transkrypcji pośredniczonej przez p53.
Protokół Casp3 powinien zapewnić wysoki stosunek sygnału do szumu. Rysunek 4 porównuje optymalny wynik testu Casp3 z dwoma typowymi wynikami suboptymalnymi, które pojawiają się, gdy kluczowe etapy zostaną pominięte lub wykonane nieprawidłowo (patrz sekcja Dyskusja): słaby stosunek sygnału do szumu wynikający z fluorescencji tła w tkance zwierzęcej oraz fluorescencji żółtka, która zakłóca sygnał docelowy.
Eksperymenty z podwójnym znakowaniem z wykorzystaniem transgenicznych linii wykazujących ekspresję GFP przybliżają obraz tkanek przechodzących apoptozę (Rysunek 5).
<img alt="Schemat immunostainingu zarodków: permeabilizacja metanolem, traktowanie przeciwciałami, proces obrazowania." fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/51060/51060fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51060/51060fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Uproszczony schemat protokołu Casp3.
<img alt="Rozwój embrionalny danio pręgowanego, stadia 4-komórkowe i sfery, mikroskopia w świetle przechodzącym z analizą ekspresji genów." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51060/51060fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51060/51060fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. (A) Analiza apoptozy w embrionach w stadium 4-komórkowym. Embriony w stadium jednego komórki zostały wstrzyknięte z 50 pg mRNA kodującego egfp (kontrola) lub proapoptotycznymi genami bh3-only: bim oraz noxa. W stadium 4-komórkowym (około jednej godziny po wstrzyknięciu, hpi), embriony poddano analizie immunofluorescencyjnej w celu wykrycia aktywowanej kaspazy 3. mRNA bim i noxa indukują szybką apoptozę w embrionach danio pręgowanego bezpośrednio po wstrzyknięciu, co w przypadku pozostawienia embrionów do dalszego rozwoju prowadzi do śmierci do 2 hpi4. Do porównania przedstawiono obraz w świetle przechodzącym embrionu typu dzikiego w stadium 4-komórkowym. (B) Analiza apoptozy w embrionach danio pręgowanego w stadium sfery. Embriony w stadium jednego komórki zostały wstrzyknięte z mRNA kodującym odpowiednio 50 pg egfp (kontrola), 5 pg puma oraz 45 pg egfp (puma), lub 5 pg puma oraz 45 pg bcl-2 (bcl-2). W stadium sfery (około 4 hpi), embriony przeanalizowano za pomocą testu Casp3. Przedstawiono widoki boczne oraz od strony bieguna zwierzęcego w celu wizualizacji komórek apoptotycznych. Zahamowanie apoptozy indukowanej przez puma przez bcl-2 wskazuje, że wstrzyknięcie mRNA puma indukuje apoptozę specyficznie poprzez wewnątrzkomórkową ścieżkę zależną od mitochondriów. Do porównania przedstawiono obraz w świetle przechodzącym embrionu typu dzikiego w stadium sfery.
<img alt="Sekwencyjny rozwój embrionalny, obrazowanie fluorescencyjne; stadia wzrostu zarodka 0-3 hpfIR, 17-20 hpf." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51060/51060fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51060/51060fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Przebieg czasowy apoptozy indukowanej promieniowaniem jonizującym (IR) między 17 a 20 hpf. Zarodki zebrafish zostały napromieniowane dawką 8 Gy IR w 17 hpf i przeanalizowane w czasie 0, 1,5, 2 i 3 h po napromieniowaniu (hpIR) za pomocą testu Casp3. Strzałki w 20 hpf wskazują akumulację komórek apoptotycznych w rdzeniu kręgowym w 3 hpIR. Dla porównania przedstawiono obraz w świetle przechodzącym zarodka w 17 hpf.
<img alt="Analiza fluorescencji zarodków; porównawcze obrazy mikroskopowe próbek kontrolnych i traktowanych." fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51060/51060fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51060/51060fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Optymalne i suboptymalne wyniki immunofluorescencji Casp3 na zarodkach w 27 hpf. Zarodki danio pręgowanego zostały napromieniowane (lub nie) w 24 hpf dawką 15 Gy i poddane analizie testem Casp3. Grupa „optimal” wykazuje idealne wyniki, w których komórki apoptotyczne wykazują silną fluorescencję, a komórki nieapoptotyczne i żółtko wykazują minimalną fluorescencję tła. Strzałki w grupie „background fluorescence in control” wskazują nadmierną fluorescencję tła w tkankach zwierzęcych zarodków kontrolnych. Gwiazdki w grupie „yolk fluorescence” wskazują nadmierną nieswoistą fluorescencję w żółtku.
<img alt="Analiza mikroskopii fluorescencyjnej; ekspresja α-Gfp, α-Casp3; wykrywanie apoptozy komórek; schemat nałożony." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51060/51060fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51060/51060fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5. Eksperymenty z podwójnym znakowaniem określają specyficzność tkankową apoptozy indukowanej przez IR. Linia transgeniczna Tg(olig2:egfp)vu12 znakuje neurony ruchowe i oligodendrocyty17, a linia Tg(elavl3:egfp) znakuje wszystkie różnicujące się neurony18. Każda linia transgeniczna została naświetlona dawką 15 Gy w 24 hpf i przeanalizowana 3 h później przy użyciu mysich przeciwciał pierwszorzędowych anty-GFP oraz króliczych przeciwciał pierwszorzędowych anty-aktywna-Kaspaza 3, a następnie odpowiednio zielonych i czerwonych fluorescencyjnych przeciwciał wtórnych. Przedstawiono powiększenie rdzenia kręgowego (zlokalizowanego grzbietowo względem końca wyrostka żółtka embrionów w 27-hpf, 3-hpIR). Komórki apoptotyczne wydają się być częściowo zlokalizowane w populacjach Tg(elavl3:egfp) oraz Tg(olig2:egfp)vu12 (patrz groty strzałek na obrazie nałożonym), co sugeruje, że neurony i oligodendrocyty są wrażliwe na apoptozę indukowaną przez IR.

Pewne zaburzenia genetyczne lub narażenie na toksyny mogą zakłócić normalne procesy rozwojowe, prowadząc do śmierci określonych typów komórek. Analiza aktywowanej kaspazy 3 metodą immunofluorescencji całej góry w zarodkach danio pręgowanego ujawnia specyficzną dla etapu i tkanki lokalizację komórek specyficznie ulegających apoptozie.

Analiza apoptozy w zarodkach danio pręgowanego za pomocą immunofluorescencji całego wierzchowca w celu wykrycia aktywowanej kaspazy 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest analiza całych embrionów zebrafish w okresie od stadium czterech komórek do 32 godzin po zapłodnieniu w celu stwierdzenia obecności i lokalizacji komórek apoptotycznych. Jest to realizowane poprzez wstępne barwienie embrionów w wybranym punkcie czasowym. Następnie embriony są utrwalane i poddawane permeabilizacji.Następnie embriony inkubuje się z przeciwciałem króliczym przeciwko aktywowanej kaspazie 3, a następnie z przeciwciałem wtórnym anty-króliczym znakowanym fluorescencyjnie w celu fluorescencyjnego oznakowania komórek apoptotycznych. Na koniec embriony analizuje się za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. W rezultacie, dzięki immunofluorescencji, można uzyskać wyniki wykazujące różnice w liczbie i rozmieszczeniu komórek apoptotycznych pomiędzy embrionami kontrolnymi a traktowanymi lub mutantami.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak analiza komórek apoptotycznych przy użyciu barwienia pomarańczą akrydynową lub test TUNEL, jest to, że analiza kaspazy 3 jest wysoce powtarzalną i stosunkowo niedrogą metodą w eksperymentach, w których wymagana jest dokumentacja fotograficzna i/lub kwantyfikacja komórek apoptotycznych w wielu próbkach. Procedurę zademonstrują Shelly SOLs, doktorantka z mojego laboratorium oraz Christian Tono, technik z mojego laboratorium. W dygestorium chemicznym przygotować 50 ml 4% paraformaldehydu (PFA), dodając proszek PFA do 1x PBS; chronić przed światłem i mieszać w temperaturze 60 °C przez jedną godzinę do całkowitego rozpuszczenia. Przechowywać w temperaturze 4 °C przez miesiąc lub w temperaturze -20 °C przez dwa lata.Przygotuj 100 ml 4% metylocelulozy, podgrzewając 30 ml wody do 80 °C. Następnie dodaj 4 g metylocelulozy i mieszaj do rozpuszczenia w temperaturze pokojowej. Proces ten trwa od czterech godzin do całej nocy.Dopełnić objętość do 100 milliliters i mieszać w temperaturze four degrees Celsius przez one hour. Przechowywać w temperaturze pokojowej, zebrać zarodki bezpośrednio po zapłodnieniu i pozwolić im rozwijać się do pożądanego punktu czasowego między stadiem czterech komórek a 32 hours post fertilization (HPF) lub zebrać four embryos między stadiem pąka ogonowego a 32 HPF. Usunąć chorion poprzez inkubację zarodków w 100 microliters roztworu 10 milligrams per milliliter.Inkubować z Pronazą w 10 ml jednokrotnego roztworu wodnego białka jaja przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Powoli odlać roztwór Pronazy.Dodaj jedną porcję wody z jajek i powtórz płukanie jeszcze dwa razy. Następnie przenieś do 40 embrionów do probówki o pojemności 1,5 ml i użyj 1 ml roztworu X-P-B-S-T do dwukrotnego wypłukania, usuwając całość PBT z wyjątkiem około 100 µl. Dodaj 1 ml 4% PFA.Połóż probówki poziomo w pojemniku o odpowiedniej wielkości w celu ułatwienia transportu i umieść je na łagodnym wytrząsarce w temperaturze 4 °C przez noc lub do tygodnia po utrwaleniu embrionów. Odlej większość roztworu PFA i ostrożnie, kroplami, dodaj 1 mL lodowatego 100% methanolu. Połóż probówki poziomo i umieść je w temperaturze -20 °C na dwie godziny.Alternatywnie zarodki można pozostawić w temperaturze -20 °C do 24 godzin. Po inkubacji należy odczekać, aż zarodki osiądą na dnie probówki, a następnie usunąć większość metanolu i ostrożnie dodać 1 mL 1x PBS z 0,3% Triton X i 1% DMSO. Natychmiast usunąć PDT i zastąpić je świeżym PDT.Następnie położyć probówki na boku i inkubować w ruchu kołyszącym przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po ostrożnym usunięciu większości PDT dodać 500 µL buforu blokującego i, upewniając się, że embrion pozostaje zanurzony w roztworze, delikatnie inkubować w ruchu kołyszącym przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie dodać 1 µL przeciwciała króliczego przeciwko aktywowanej kaspazie-3 oraz dodatkowe przeciwciała niekrólicze.W razie potrzeby delikatnie kołysz zarodkami przez dwie godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C. Po usunięciu roztworu przeciwciał, dodaj 1 mL PDT, aby szybko wypłukać zarodki. Następnie wymień roztwór na świeży PDT i delikatnie kołysz przez 30 minut w temperaturze pokojowej.Przed powtórzeniem płukania należy usunąć roztwór do płukania PDT i powtórzyć etap blokowania. Następnie należy dodać odpowiednie przeciwciała wtórne sprzężone z Fluor four. Próbki należy osłonić przed światłem i delikatnie kołysać przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, obserwując pod mikroskopem fluorescencyjnym z odpowiednim filtrem.Przeanalizuj zarodki w jednej płytce XPDT. Jeśli kontrole dodatnie wykazują silną fluorescencję przy minimalnym tle, przenieś je za pomocą zakrzywionej sondy do szalki Petriego o średnicy 3,5 centymetra z cienką warstwą 4% metylocelulozy lub na szkiełko z zagłębieniem z dużą kroplą metylocelulozy. Ustaw wybrany zarodek do obrazowania, wykonując zdjęcia reprezentujące intensywność i wzory fluorescencji zaobserwowane u większości zarodków z danej próbki.Rysunek ten pokazuje, że wstrzyknięcie do embrionów wysokich stężeń mRNA kodującego wyłącznie silne białka proto BH3, takie jak BIM lub NOXA, prowadzi do szybkiej aktywacji kaspazy 3. W stadium czterech komórek dochodzi następnie do śmierci embrionalnej w ciągu jednej godziny.Na późniejszych etapach rozwoju intensywność fluorescencji jest bardziej wyraźna. Przykładowo, przedstawiono tutaj jasne komórki wykazujące aktywność kaspazy 3 w embrionach w stadium sfery, do których wstrzyknięto umiarkowanie toksyczne poziomy mRNA kodującego wyłącznie proapoptotyczne BH3. mRNA genu Puma, kodujące antyapoptotyczny gen BCL2, zostało wstrzyknięte równocześnie, aby udowodnić, że wstrzyknięcie mRNA Puma indukuje apoptozę poprzez wewnątrzkomórkową ścieżkę zależną od mitochondriów.Apoptoza indukowana promieniowaniem jonizującym (IR) u danio pręgowanego wymaga zależnej od P 53 transkrypcji genów proapoptotycznych z rodziny BH3, takich jak puma. Przedstawione tutaj opóźnienie w apoptozie indukowanej przez IR jest zgodne z wymogiem transkrypcji pośredniczonej przez P 53. Protokół oznaczania kaspazy 3 powinien zapewnić wysoki stosunek sygnału do szumu.Rysunek ten porównuje optymalny wynik testu kaspazy 3 z dwoma typowymi wynikami suboptymalnymi, które pojawiają się, gdy kluczowe etapy zostaną pominięte, co opisano w sekcji dyskusji protokołu tekstowego. Pierwszym z nich jest słaby stosunek sygnału do szumu wynikający z fluorescencji tła w tkance zwierzęcej, a drugim fluorescencja żółtka, która zakłóca interesujący nas sygnał. Na koniec, jak pokazano tutaj, eksperymenty z podwójnym znakowaniem z wykorzystaniem linii transgenicznych wykazujących ekspresję GFP przybliżają tkanki przechodzące apoptozę: linia transgeniczna OLE two EGFP VU, 12 znakuje neurony ruchowe i oligodendrocyty, a linia transgeniczna elev L three EEG FP znakuje wszystkie różnicujące się neurony.Wyniki sugerują, że zarówno neurony, jak i oligodendrocy są wrażliwe na apoptozę indukowaną przez IR po zastosowaniu tej procedury. W celu precyzyjnego określenia tożsamości komórek ulegających apoptozie można zastosować inne metody, takie jak barwienie współobecne z tkankowo specyficznymi przeciwciałami pierwszorzędowymi oraz odsysanie zarodka.

analysis-apoptosis-zebrafish-embryos-whole-mount-immunofluorescence

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Analiza apoptozy w zarodkach danio pręgowanego przez całkowitą immunofluorescencyjną detekcję aktywowanej kaspazy 3

Obumierające komórki są usuwane z tkanek nabłonkowych poprzez skoordynowany skurcz komórek sąsiednich, bez naruszania funkcji barierowej. Przejrzystość optyczna rozwijających się rybek danio przymrużonych stanowi doskonały system do wizualizacji procesu ekstruzji w żywych nabłonkach. W niniejszej pracy opisujemy metody indukcji i obrazowania ekstruzji w naskórku larw rybek danio przymrużonych z rozdzielczością komórkową.

Obrazowanie na żywo ekstruzji komórek z naskórka rozwijającego się danio pręgowanego

Opisano metodę fotoaktywacji pojedynczych komórek zawierających „uwięzione” (caged) białko fluorescencyjne z wykorzystaniem absorpcji dwufotonowej z femtosekundowego oscylatora laserowego Ti:Szafir. W celu mapowania losu fotoaktywowanej komórki zastosowano immunohistochemię. Technikę tę można zastosować do każdego typu komórek.

Mapowanie losów pojedynczych komórek u danio przeznaczonego (zebrafish)

Źródło: Zhang, X., et al. Model zarodka danio pręgowanego do wizualizacji in vivo i analizy przyżyciowej zakażenia Staphylococcus aureus związanego z biomateriałem. J. Vis. Exp. (2019 rok)Film przedstawia obrazowanie fluorescencyjne zarodków danio pręgowanego, którym wstrzyknięto Staphylococcus aureus, umożliwiając ilościowe określenie progresji infekcji i rozmieszczenia bakterii w celu oceny wpływu mikrosfer biomateriału na interakcje gospodarz-patogen in vivo.

 Obrazowanie fluorescencyjne infekcji bakteryjnej związanej z biomateriałem w zarodkach danio pręgowanego

Opisano techniki immunobarwienia fosfo-epitopów w całych zarodkach danio pręgowanego, a następnie przeprowadzania dwukolorowej fluorescencyjnej lokalizacji konfokalnej w strukturach komórkowych tak małych jak pierwotne rzęski. Techniki utrwalania i obrazowania mogą określać lokalizację i kinetykę pojawiania się lub aktywacji określonych białek.

Immunobarwiące fosfo-epitopy w narządach rzęskowych całych zarodków danio pręgowanego

Mitoza jest niezbędna dla każdego żywego organizmu, a defekty często prowadzą do raka i zaburzeń rozwojowych. Korzystając z tego protokołu obrazowania i danio pręgowanego jako systemu modelowego, naukowcy mogą wizualizować mitozę w żywym organizmie kręgowców i mnogość defektów, które powstają, gdy procesy mitotyczne są wadliwe.

Obserwacja podziału i dynamiki mitotycznej w żywym zarodku danio pręgowanego

Rozwój rzęsek jest niezbędny do prawidłowego organogenezy. Protokół ten opisuje zoptymalizowaną metodę oznaczania i wizualizacji komórek rzęskowych danio pręgowanego.

Wizualizacja wielorzęskowych komórek u danio pręgowanego za pomocą połączonego protokołu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ i immunofluorescencji całej góry

Ten protokół demonstruje sekwencyjną immunofluorescencję i immunohistochemię na kriosekcjach z wczesnych stadiów zarodków danio pręgowanego, umożliwiając precyzyjne analizy kolokalizacji w określonych populacjach komórek.

Sekwencyjna immunofluorescencja i immunohistochemia na kriowyciętych zarodkach danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania białek za pośrednictwem przeciwciał fluorescencyjnych w całych preparatach zarodków i larw danio pręgowanego.

Immunohistochemia całego wierzchowca w zarodkach i larwach danio pręgowanego

Ten protokół wykorzystuje test immunofluorescencyjny do wykrywania uszkodzeń DNA wywołanych PM2.5 w wypreparowanych sercach zarodków danio pręgowanego.

Wykorzystanie immunofluorescencji do wykrywania uszkodzeń DNA wywołanych przez PM2,5 w sercach zarodków danio pręgowanego

Ten protokół opisuje, jak uzyskać obrazy poprzez połączenie hybrydyzacji in situ i immunohistochemii odcinków embrionalnych danio pręgowanego. Przed kriosekcją przeprowadzono hybrydyzację in situ, a następnie barwienie przeciwciałami. Przydatne jest wykrycie wzorców ekspresji dwóch genów u danio pręgowanego, jeśli występuje niedobór przeciwciał.

In Situ Hybrydyzacja połączona z immunohistochemią w kriosekcji zarodków danio pręgowanego

Optogenetyczne manipulowanie szlakami sygnałowymi może być potężną strategią do zbadania, w jaki sposób sygnalizacja jest dekodowana w rozwoju, regeneracji, homeostazie i chorobie. Protokół ten zawiera praktyczne wskazówki dotyczące stosowania aktywatorów sygnalizacyjnych białka węzłowego i morfogennego kości (BMP) opartych na dziedzinie wykrywania światła i tlenu we wczesnym zarodku danio pręgowanego.

Aktywacja sygnalizacji optogenetycznej w zarodkach danio pręgowanego

Poznaj metodę immunofluorescencji całego wierzchowca do wykrywania aktywowanej kaspazy 3 w zarodkach Danio rerio. Ta technika pozwala wizualizować komórki apoptotyczne na różnych etapach rozwoju w biologii rozwoju.

Analiza apoptozy w zarodkach danio pręgowanego za pomocą immunofluorescencji całego wierzchowca w celu wykrycia aktywowanej kaspazy 3 (Wideo) | JoVE Journal

Analiza apoptozy w zarodkach danio pręgowanego za pomocą immunofluorescencji całego wierzchowca w celu wykrycia aktywowanej kaspazy 3

Przeglądaj więcej filmów