Name: Wykrywanie nieprawidłowości w unaczynieniu naczyniówki w mysim modelu zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem za pomocą zielonej angiografii indocyjaniny w czasie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Poznaj metodę angiografii zielenią indocyjaninową do wykrywania nieprawidłowości naczyniówki w mysim modelu zwyrodnienia plamki żółtej. Technika ta umożliwia precyzyjną analizę zmian naczyniowych w czasie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant NIH 1R01EY022901, Nagrodę Rozwoju Kariery od Research to Prevent Blindness (RPB), C.M.Reeves & M.A. Reeves Foundation, E. Matilda Ziegler Foundation for the Blind, Knights Templar Eye Foundation oraz nieograniczony grant dla Wydziału Okulistyki Uniwersytetu Utah od RPB. Dziękujemy Balamurali Ambati za pomoc techniczną w zakresie systemu obrazowania multimodalnego Spectralis oraz Tao Zhangowi za dyskusje i komentarze na temat manuskryptu.

1. Przygotowanie instrumentów
<ol>
	<li>Zabieg wykonywany jest na sali zabiegowej w pomieszczeniu dla zwierząt.</li>
	<li>Przed rozpoczęciem eksperymentu załóż maski na twarz, czepki do włosów, fartuchy chirurgiczne, sterylne pokrowce na stopy i rękawiczki.</li>
	<li>Podgrzej wodę w zlewce do temperatury ~40 °C na płycie grzejnej.</li>
	<li>Umieść sterylną niebieską podkładkę na poduszce grzewczej, która będzie później używana do utrzymywania temperatury ciała myszy podczas obrazowania. Włącz poduszkę grzewczą.</li>
	<li>Przygotuj system obrazowania:
	<ol>
		<li>Zdejmij osłonę przeciwpyłową i włącz laser.</li>
		<li>Wyjmij soczewkę 55° i zamontuj ją na maszynie.</li>
		<li>Otwórz oprogramowanie do obrazowania z komputera i wprowadź informacje o myszy do obrazowania pod kartą nowego pacjenta (np. genotyp, wiek itp.). W sekcji "typ urządzenia" wybierz tryb podczerwieni (IR).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
Uwaga: Doniesiono, że użycie zewnętrznej podwójnej soczewki asferycznej może poprawić jakość obrazu17-20, chociaż nie mamy problemu z uzyskaniem wysokiej jakości obrazów przez IV-ICGA bez użycia zewnętrznych soczewek (zobacz reprezentatywne wyniki, Rysunki 1-4).
2. Iniekcja żyły ogonowej ICGA
<ol>
	<li>Rozszerz oczy myszy 1% roztworem okulistycznym Tropicamidu i odczekaj 5 minut.</li>
	<li>Zważ mysz, aby określić ilość potrzebnego znieczulenia (ketamina/ksylazyna/acepromazyna 65-100/10-20/1-3 mg/kg).</li>
	<li>Pobrać jałową strzykawkę o pojemności 1 ml wraz z igłą 32 G. Wstrzyknąć myszu dootrzewnowo środki znieczulające (13 mg/ml ketaminy, 2,6 mg/ml ksylazyny, 0,3 mg/ml acepromazyny w sterylnym PBS). Poczekaj, aż mysz zostanie w pełni znieczulona (~5 min).</li>
	<li>Umieść ogon myszy w ciepłej wodzie o temperaturze 40 °C, aby spowodować rozszerzenie naczyń krwionośnych żyły.</li>
	<li>Pobrać strzykawkę o pojemności 1 ml z igłą 32 G. Pobrać żądaną ilość ICG, zwykle 50 μl 1 mg/ml ICG, która jest sterylnie filtrowana za pomocą filtra strzykawkowego 0,2 μM do sterylnej probówki dla myszy 25 g (2 mg/kg). Należy uważać, aby nie wprowadzić powietrza do strzykawki.</li>
	<li>Przetrzyj ogon wacikiem nasączonym alkoholem, aby wysterylizować obszar, który ma zostać wstrzyknięty.</li>
	<li>Przytrzymaj ogon jedną ręką tak, aby boczna żyła ogonowa była skierowana do góry. Ze skosem igły skierowanym do góry, wstrzyknąć igłę ~2 mm do żyły pod minimalnym kątem. Uważaj, aby nie przebić żyły. Lekko odciągnąć strzykawkę i poszukać śladów przepływu krwi do piasty igły, co wskazuje, że igła została pomyślnie wprowadzona do żyły.</li>
	<li>Powoli wstrzyknąć ICG do żyły. Opór podczas wstrzykiwania powinien być minimalny. Wyjmij igłę i przyłóż wacik nasączony alkoholem bezpośrednio do miejsca wstrzyknięcia na ~5-10 sekund, aby zatrzymać krwawienie. Mysz jest wtedy gotowa do obrazowania. Aby uchwycić wczesną fazę (0-4 minuty po wstrzyknięciu), konieczne jest szybkie zobrazowanie myszy.</li>
</ol>
Uwaga: Oczy myszy mogą łatwo stać się suche i mogą rozwinąć się zaćma pod narkozą. Ważne jest, aby oko było nawilżone poprzez stosowanie sterylnego PBS podczas zabiegu. Zetrzyj nadmiar PBS sterylnym wacikiem przed zapisem ICGA. Inne laboratoria używały soczewek kontaktowych, aby uniknąć odwodnienia rogówki17-20.
3. Angiografia ICG
<ol>
	<li>Rozpocznij robienie zdjęć 30-40 sekund po wstrzyknięciu ICG, co pozwala na uchwycenie wczesnej fazy wypełnienia naczyniówki, aż krążenie siatkówki i naczyniówki osiągnie maksymalną jasność (0-4 min). Unaczynienie siatkówki najlepiej uwidocznić przy ognisku ~35-45 dioptrii, a unaczynienie naczyniówki jest uwidocznione przy 10-15 dioptriach. 
	 
	nuta: Podczas pierwszego badania modelu zwierzęcego zaleca się wykonanie zdjęć pod każdym kątem (nosowym, skroniowym, grzbietowym i brzusznym) w celu zidentyfikowania wszystkich możliwych nieprawidłowości w układzie naczyniowym. We wczesnej fazie zarówno średnie, jak i duże tętnice i żyły naczyniówkowe są dobrze uwidocznione. W modelu zwierzęcym zastosowanym w tym protokole zmiany naczyniówkowe (np. poszerzenia polipowate) mogą zacząć pojawiać się po 1 minucie we wczesnej fazie.</li>
	<li>Ustaw ostrość obrazu na układzie naczyniowym. Steruj jasnością i ostrością za pomocą odpowiednio modułu sterującego i pokrętła ostrości. Wartości te można regulować cyfrowo i można je łatwo utrzymać na stałym poziomie. Utrzymuj stałą odległość od oka myszy do obiektywu aparatu, aby zapewnić powtarzalność jakości obrazu przy użyciu poniższej techniki. 
	 
	nuta: Ponieważ urządzenie może obrazować tylko część tylnego oka, staramy się utrzymać stałą ostrość, jasność i odległość między obiektywem aparatu a okiem myszy, obrazując całe tylne oko pod różnymi kątami. Kluczem do tego jest wyrównanie luminescencji w kształcie koła emitowanej przez ICG przez oko z polem widzenia kamery. Osiąga się to poprzez dokonywanie regulacji pozycji kamery od lewej do prawej, góra i dół oraz do wewnątrz i na zewnątrz, aż cały obraz nie będzie miał ciemnych obszarów. Gdy luminescencja i pole widzenia kamery są wyrównane, odległość od oka do obiektywu będzie odtwarzalna dla następnego zestawu obrazów, a także w optymalnej odległości dla wysokiej jakości obrazowania.</li>
	<li>Gdy układ naczyniowy jest ostry, uchwyć klatki obrazu, naciskając okrągły przycisk na module akwizycji. Okrągły przycisk może być również używany do zmniejszania lub wzmacniania sygnału ICG w celu uzyskania najlepszej jakości obrazu.</li>
	<li>Określ optymalny kąt widzenia i głębokość ostrości, aby zobrazować zmiany naczyniówkowe. Ważne jest, aby pozycja oka, głębokość ostrości i inne ustawienia urządzenia były stałe dla całego czasu ICGA. Obrazy są zapisywane poprzez naciśnięcie przycisku akwizycji na panelu ekranu dotykowego modułu akwizycji.</li>
	<li>Obrazy należy wykonywać w środkowej fazie po 6-15 minutach od wstrzyknięcia. 
	 
	nuta: Zarówno naczynia naczyniówkowe, jak i siatkówkowe stają się mniej wyraźne. Naczyniówka objawia się jako rozlana fluorescencja. Zmiany naczyniówkowe wykazujące hiperfluorescencję pojawiają się w przeciwieństwie do blaknięcia otaczającego normalną fluorescencję tła.</li>
	<li>Obrazy należy wykonywać w późnej fazie po 17-25 minutach od wstrzyknięcia. 
	 
	nuta: Hiperfluorescencja zanika. Zarówno naczynia naczyniówkowe, jak i siatkówkowe nie są już widoczne. Głowa nerwu wzrokowego staje się. Hiperfluorescencyjne zmiany naczyniówkowe mają maksymalny kontrast z zanikającym tłem.</li>
	<li>Po zakończeniu akwizycji obrazów nałóż przezroczysty smarujący żel pod oczy myszy na oczy myszy i pozostaw mysz na poduszce grzewczej w celu odzyskania sprawności.</li>
	<li>Wróć myszy do ich klatek i obszaru przetrzymywania. Eksportuj obrazy jako pliki Tiff lub JPEG w celu dalszej analizy.</li>
</ol>
Uwaga: Czas każdej fazy nie jest bezwzględny. Odkryliśmy, że czas każdej fazy może się zmieniać w zależności od ilości wstrzykniętego ICG. Więcej ICG ma tendencję do wydłużania każdej fazy. Najlepszym sposobem zdefiniowania fazy jest skorzystanie z kluczowych cech każdej fazy wymienionych powyżej.

<ol><li>Duane, T. D., Tasman, W., Jaeger, E. A. Chapter 4a, Indocyanine Green Angiography. Duane's clinical ophthalmology on CD-ROM. , Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia. (2002).</li>
<li>Alfaro, D. V. Age-related macular degeneration : a comprehensive textbook. , Lippincott Williams & Wilkins. (2006).</li>
<li>Yannuzzi, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indocyanine+green+angiography%3A+a+perspective+on+use+in+the+clinical+setting%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Indocyanine green angiography: a perspective on use in the clinical setting.</a> Am. J. Ophthalmol. 151, 745-751 (2011).</li>
<li>Destro, M., Puliafito, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indocyanine+green+videoangiography+of+choroidal+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Indocyanine green videoangiography of choroidal neovascularization.</a> Ophthalmology. 96, 846-853 (1989).</li>
<li>Scheider, A., Schroedel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+indocyanine+green+angiography+with+a+scanning+laser+ophthalmoscope%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">High resolution indocyanine green angiography with a scanning laser ophthalmoscope.</a> Am. J. Ophthalmol. 108, 458-459 (1989).</li>
<li>Guyer, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+indocyanine-green+angiography+in+chorioretinal+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Digital indocyanine-green angiography in chorioretinal disorders.</a> Ophthalmology. 99, 287-291 (1992).</li>
<li>Yannuzzi, L. A., Slakter, J. S., Sorenson, J. A., Guyer, D. R., Orlock, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+indocyanine+green+videoangiography+and+choroidal+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Retina%22%5BJournal%5D)">Digital indocyanine green videoangiography and choroidal neovascularization.</a> Retina. 12, 191-223 (1992).</li>
<li>Regillo, C. D., Benson, W. E., Maguire, J. I., Annesley, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indocyanine+green+angiography+and+occult+choroidal+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Indocyanine green angiography and occult choroidal neovascularization.</a> Ophthalmology. 101, 280-288 (1994).</li>
<li>Scheider, A., Kaboth, A., Neuhauser, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+subretinal+neovascular+membranes+with+indocyanine+green+and+an+infrared+scanning+laser+ophthalmoscope%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Detection of subretinal neovascular membranes with indocyanine green and an infrared scanning laser ophthalmoscope.</a> Am. J. Ophthalmol. 113, 45-51 (1992).</li>
<li>Kuck, H., Inhoffen, W., Schneider, U., Kreissig, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+occult+subretinal+neovascularization+in+age-related+macular+degeneration+by+infrared+scanning+laser+videoangiography%5BTitle%5D)+AND+%22Retina%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of occult subretinal neovascularization in age-related macular degeneration by infrared scanning laser videoangiography.</a> Retina. 13, 36-39 (1993).</li>
<li>Imamura, Y., Engelbert, M., Iida, T., Freund, K. B., Yannuzzi, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polypoidal+choroidal+vasculopathy%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Surv.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Polypoidal choroidal vasculopathy: a review.</a> Surv. Ophthalmol. 55, 501-515 (2010).</li>
<li>Ciardella, A. P., Donsoff, I. M., Yannuzzi, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polypoidal+choroidal+vasculopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmol.+Clin.+N.+Am%22%5BJournal%5D)">Polypoidal choroidal vasculopathy.</a> Ophthalmol. Clin. N. Am. 15, 537-554 (2002).</li>
<li>Spaide, R. F., Yannuzzi, L. A., Slakter, J. S., Sorenson, J., Orlach, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indocyanine+green+videoangiography+of+idiopathic+polypoidal+choroidal+vasculopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Retina%22%5BJournal%5D)">Indocyanine green videoangiography of idiopathic polypoidal choroidal vasculopathy.</a> Retina. 15, 100-110 (1995).</li>
<li>Coppens, G., Spielberg, L., Leys, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polypoidal+choroidal+vasculopathy%2C+diagnosis+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Bull.+Soc.+belge+d%27Ophtalmol.%22%5BJournal%5D)">Polypoidal choroidal vasculopathy, diagnosis and management.</a> Bull. Soc. belge d'Ophtalmol.. , 39-44 (2011).</li>
<li>Tsujikawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pigment+epithelial+detachment+in+polypoidal+choroidal+vasculopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Pigment epithelial detachment in polypoidal choroidal vasculopathy.</a> Am. J. Ophthalmol. 143, 102-111 (2007).</li>
<li>Jones, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+expression+of+multifunctional+serine+protease%2C+HTRA1%2C+in+retinal+pigment+epithelium+induces+polypoidal+choroidal+vasculopathy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Increased expression of multifunctional serine protease, HTRA1, in retinal pigment epithelium induces polypoidal choroidal vasculopathy in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 14578-14583 (2011).</li>
<li>Alex, A. F., Heiduschka, P., Eter, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+fundus+imaging+in+mouse+models+of+retinal+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Retinal fundus imaging in mouse models of retinal diseases.</a> Methods Mol. Biol. 935, 41-67 (2013).</li>
<li>Seeliger, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+confocal+imaging+of+the+retina+in+animal+models+using+scanning+laser+ophthalmoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">In vivo confocal imaging of the retina in animal models using scanning laser ophthalmoscopy.</a> Vision Res. 45, 3512-3519 (2005).</li>
<li>Fischer, M. D., Zhour, A., Kernstock, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotyping+of+mouse+models+with+OCT%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Phenotyping of mouse models with OCT.</a> Methods Mol. Biol. 935, 79-85 (2013).</li>
<li>Jian, Y., Zawadzki, R. J., Sarunic, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+optics+optical+coherence+tomography+for+in+vivo+mouse+retinal+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Adaptive optics optical coherence tomography for in vivo mouse retinal imaging.</a> J. Biomed. Opt. 18, 56007 (2013).</li>
<li>Ciardella, A. P., Donsoff, I. M., Huang, S. J., Costa, D. L., Yannuzzi, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polypoidal+choroidal+vasculopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Surv.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Polypoidal choroidal vasculopathy.</a> Surv. Ophthalmol. 49, 25-37 (2004).</li>
<li>Sasahara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polypoidal+choroidal+vasculopathy+with+choroidal+vascular+hyperpermeability%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Polypoidal choroidal vasculopathy with choroidal vascular hyperpermeability.</a> Am. J. Ophthalmol. 142, 601-607 (2006).</li>
<li>Silva, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polypoidal+choroidal+vasculopathy+and+photodynamic+therapy+with+verteporfin%5BTitle%5D)+AND+%22Graefes+Arch.+Clin.+Exp.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Polypoidal choroidal vasculopathy and photodynamic therapy with verteporfin.</a> Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 243, 973-979 (2005).</li>
<li>Yannuzzi, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polypoidal+choroidal+vasculopathy+masquerading+as+central+serous+chorioretinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Polypoidal choroidal vasculopathy masquerading as central serous chorioretinopathy.</a> Ophthalmology. 107, 767-777 (2000).</li>
<li>Janssen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+vessel+formation+in+the+choroid+of+mice+lacking+tissue+inhibitor+of+metalloprotease-3%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Abnormal vessel formation in the choroid of mice lacking tissue inhibitor of metalloprotease-3.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 49, 2812-2822 (2008).</li>
<li>Ding, X., Patel, M., Chan, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+pathology+of+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Retin.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular pathology of age-related macular degeneration.</a> Prog. Retin. Eye Res. 28, 1-18 (2009).</li>
<li>Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+choroidal+and+retinal+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Retin.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Animal models of choroidal and retinal neovascularization.</a> Prog. Retin. Eye Res. 29, 500-519 (2010).</li>
<li>Pennesi, M. E., Neuringer, M., Courtney, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+age+related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Aspects+Med%22%5BJournal%5D)">Animal models of age related macular degeneration.</a> Mol. Aspects Med. 33, 487-509 (2012).</li>
<li>Elizabeth Rakoczy, P., Yu, M. J., Nusinowitz, S., Chang, B., Heckenlively, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Mouse models of age-related macular degeneration.</a> Exp. Eye Res. 82, 741-752 (2006).</li>
</ol>

YF jest wynalazcą dwóch zgłoszonych patentów, które są istotne dla modelu myszy AMD użytego w tej pracy. SK, ZB i ADJ nie mają nic do ujawnienia.

W tym badaniu wykazaliśmy zastosowanie ICGA do obrazowania zmian naczyniówkowych u myszy transgenicznych HTRA1. Charakterystyka wczesnej, środkowej i późnej fazy ICGA w naszym modelu mysim dobrze pasuje do przebiegu czasu w badaniach na ludziach1. Jest to ważne, aby dokonać lepszych porównań między patologią człowieka a fenotypami zwierzęcymi, które są nieocenione w badaniach nad mechanizmami patofizjologicznymi i strategiami leczenia stanów związanych z naczyniówką, takich jak AMD.
<p class="jove_content"...

Angiografia z zielenią indocyjaninową (ICGA) to test diagnostyczny do obrazowania problemów związanych z naczyniami krwionośnymi w oku. Widmo absorpcyjne ICG waha się od 790-805 nm, podczas gdy widmo emisyjne waha się od 770-880 nm ze szczytową emisją przy 835 nm 1. Różni się on od innego popularnego barwnika, fluoresceiny sodu, której widmo mieści się w zakresie widzialnym. Widmo podczerwieni umożliwia ICG przenikanie przez nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE), płyn surowiczo-sogwiniczny i wysięki lipidowe, z których wszystkie mogą łatwo blokować wizualizację za pomocą angiografii fluoresceinowej na bazie sodu i fluoresceiny (FA). ICG jest w 98% związany z białkami w układzie naczyniowym, co skutkuje mniejszym wynaczynieniem, co pozwala na lepsze obrazowanie naczyń naczyniówkowych i zmian naczyniówkowych1,2. ICGA jest prawie jedynym wyborem do wizualizacji naczyniówki naczyniówkowej, która jest tylna w stosunku do RPE. Rycina 1 przedstawia porównanie ICGA i FA w obrazowaniu naczyń krwionośnych w oczach myszy. FA można wykorzystać do dobrego obrazowania unaczynienia siatkówki, ale nie naczynia naczyniówkowego. W przeciwieństwie do tego, ICGA może być używany do obrazowania zarówno naczyń siatkówkowych, jak i naczyniówkowych. ICGA jest wykonywana za pomocą cyfrowych systemów obrazowania o wysokiej rozdzielczości lub skaningowych oftalmoskopów laserowych (SLO) wraz z kamerami wideo czułymi na podczerwień, które wykorzystamy w tym badaniu.
W klinice, ICGA zostało zalecone w diagnozowaniu wielu zaburzeń naczyniówkowo-siatkówkowych obejmujących unaczynienie naczyniówki, w tym polipoidalnej waskulopatii naczyniówkowej (PCV), proliferacji naczyniaków siatkówkowych (RAP), smug naczyniościennych, witelowatej dystrofii plamki, centralnej surowiczej chorioretinopatii, naczyniaka krwionośnego, krwotoku tętniczego siatkówki makrotętników, guzów naczyniówki i niektórych form tylnego zapalenia błony naczyniowej oka1,3. Połączenie ICGA z FA i optyczną tomografią koherentną (OCT) zapewnia klinicznym potężnym narzędziom w diagnostyce i leczeniu wysiękowego zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem (AMD)4-10. ICGA jest szczególnie przydatna w diagnozowaniu stanów obejmujących naczyniówkę. W rzeczywistości ICGA jest uważany za złoty standard w diagnozowaniu PCV, wariantu wysiękowego AMD11-13. PCV charakteryzuje się siecią rozgałęzionych naczyń z końcowymi dylatacjami polipowatymi w naczyniówce11-13. PCV jest często związany z nawracającymi surowiczo-krwawymi odwarstwieniami RPE i siatkówki z przeciekaniem i krwawieniem ze składników polipowatych11,14,15. Niedawno informowaliśmy o wygenerowaniu pierwszego modelu zwierzęcego PCV poprzez transgeniczną ekspresję ludzkiej HTRA1, wielofunkcyjnej proteazy seryny, w nabłonku barwnikowym siatkówki myszy (RPE)16. Wykazaliśmy, że wzrost HTRA1 indukuje charakterystyczne cechy PCV, np. zmiany polipowate.
Tutaj zademonstrowaliśmy użycie ICGA w czasie poprzez wstrzyknięcie żyły ogonowej w badaniach AMD przy użyciu naszego mysiego modelu HTRA1. Nasze dane sugerują, że IV-ICGA jest lepszy od IP (lub podskórnego (SC))-ICGA, które są obecnie stosowane w polu17,18 do charakteryzowania zmian w naczyniówce.
Oświadczenie w sprawie badań na zwierzętach 
Eksperymenty na zwierzętach były prowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) i były przeprowadzane zgodnie z Oświadczeniem ARVO dotyczącym wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych.

<table><tbody><tr><td>Multimodalny system obrazowania Spectralis</td><td>Heidelberg Engineering, Niemcy</td><td>SPECTRALIS HRA+OCT</td><td></td></tr><tr><td>Tropicamide roztwór okulistyczny (1%)</td><td>Bausch & Lomb</td><td>NDC 24208-585-64</td><td>do rozszerzania źrenic</td></tr><tr><td>GenTeal Gel</td><td>Genteal NDC</td><td>58768-791-15</td><td>&nbsp; Przezroczysty żel pod oczy&nbsp;</td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Vedco Inc</td><td>NDC 50989-996-06</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Lloyd Laboratories</td><td>NADA 139-236</td><td></td></tr><tr><td>Acepromazine</td><td>Vedco Inc</td><td>NDC 50989-160-11</td><td></td></tr><tr><td>32-G Igła</td><td>Steriject</td><td>PRE-32013</td><td></td></tr><tr><td>1-ml strzykawka</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Indocyanine Green</td><td>Pfaltz & Bauer</td><td>I01250</td><td></td></tr></tbody></table> powiedział:

wykrywanie nieprawidłowości w unaczynieniu naczyniówki w mysim modelu zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem za pomocą zielonej angiografii indocyjaniny w czasie

Detecting Abnormalities in Choroidal Vasculature in a Mouse Model of Age-related Macular Degeneration by Time-course Indocyanine Green Angiography

Angiografia zielona indocyjaniny (lub ICGA) to technika wykonywana przez okulistów do diagnozowania nieprawidłowości naczyniówki i siatkówki w różnych chorobach oczu, takich jak zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem (AMD). ICGA jest szczególnie przydatny do obrazowania tylnego naczyniówki oka ze względu na jego zdolność przenikania przez warstwę pigmentową za pomocą widma podczerwonego. Przebieg czasowy ICGA można podzielić na fazę wczesną, środkową i późną. Te trzy fazy dostarczają cennych informacji na temat patologii problemów z oczami. Chociaż ICGA w czasie przez wstrzyknięcie dożylne (IV) jest szeroko stosowane w klinice do diagnozowania i leczenia problemów z naczyniówką, ICGA przez wstrzyknięcie dootrzewnowe (IP) jest powszechnie stosowane w badaniach na zwierzętach. Tutaj zademonstrowaliśmy technikę uzyskiwania obrazów przebiegu czasowego ICGA o wysokiej rozdzielczości u myszy poprzez wstrzyknięcie żyły ogonowej i konfokalną skaningową oftalmoskopię laserową. Wykorzystaliśmy tę technikę do zobrazowania zmian naczyniówkowych w mysim modelu zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem. Chociaż znacznie łatwiej jest wprowadzić ICG do układu naczyniowego myszy za pomocą IP, nasze dane wskazują, że trudno jest uzyskać powtarzalne obrazy przebiegu czasu ICGA za pomocą IP-ICGA. W przeciwieństwie do tego, ICGA poprzez wstrzyknięcie żyły ogonowej zapewnia wysokiej jakości obrazy przebiegu czasu ICGA, porównywalne z badaniami na ludziach. Ponadto wykazaliśmy, że ICGA wykonana na myszach albinosach daje wyraźniejsze obrazy naczyń naczyniówkowych niż ta wykonana na myszach pigmentowanych. Sugerujemy, że przebieg czasowy IV-ICGA powinien stać się standardową praktyką w badaniach nad AMD opartych na modelach zwierzęcych.

Przeprowadzono badanie czasowe ICGA u myszy transgenicznych HTRA1 oraz kontrolnych myszy WT z tego samego miotu, obie grupy na tle genetycznym CD1. Wybrano albinotyczne tło CD1, aby ułatwić obrazowanie w angiografii z użyciem zieleni indocyjaninowej (ICGA) (patrz: DYSKUSJA). W wczesnej fazie u myszy HTRA1 zaczęły pojawiać się niektóre rozszerzenia przypominające tętniaki (Rysunek 2, czerwona strzałka wskazuje rozszerzenie na końcówce naczynia, a czerwone koło wskazuje polipowatą zmianę typu skupiskowego)...

Angiografia z zieleni indocyjaninowej (lub ICGA) wykonywana przez wstrzyknięcie żyły ogonowej dostarcza wysokiej jakości obrazów przebiegu czasu ICGA do scharakteryzowania nieprawidłowości w naczyniówce myszy.

Wykrywanie nieprawidłowości w unaczynieniu naczyniówki w mysim modelu zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem za pomocą zielonej angiografii indocyjaniny w czasie

Indocyanine Green&#160;Angiography (or ICGA) is a technique performed by ophthalmologists to diagnose abnormalities of the choroidal and retinal ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykrycie nieprawidłowości w naczyniach błony naczyniówkowej w modelach mysich związanego z wiekiem zwyrodnienia plamki żółtej z wykorzystaniem badania czasu przebiegu endo w zieleni i geografii. Jest to realizowane poprzez wstępne przygotowanie zwierząt i zestawu do iniekcji. Drugim krokiem jest wykonanie iniekcji dożylnych do ogona z użyciem incy w zieleni.Kolejne obrazy oka są pozyskiwane we wczesnej, środkowej i późnej fazie incy w angiografii zielonej, a następnie eksportowane i analizowane. W rezultacie przebieg czasowy incy w angiografii zielonej może być stosowany jako standardowa procedura do charakteryzowania różnych typów zmian w naczyniówce w przebiegu związane z wiekiem zwyrodnienie plamki żółtej. Modele mysie.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z naszymi dotychczasowymi metodami, takimi jak domięśniowe wstrzyknięcie endo signin green, jest możliwość uzyskania wysokiej jakości obrazów w serii czasowej, które są porównywalne z badaniami na ludziach. Aby rozpocząć procedurę, należy ubrać się w odpowiednią odzież do pracy z zwierzętami. Obejmuje to założenie fartuchów chirurgicznych, sterylnych nakładek na obuwie, czepków, masek ochronnych oraz rękawiczek. Następnie należy przygotować podkład grzewczy używany podczas obrazowania, włączając system, ustawiając temperaturę na 37 °C i przykrywając go sterylnym niebieskim podkładem.Następnie włącz płytę grzejną i podgrzej zlewkę z wodą do 40 °C. Przygotuj system obrazowania przed wstrzyknięciem do żyły ogonowej, wstępnie rozgrzewając laser i montując obiektyw 55 stopni w urządzeniu. Następnie otwórz oprogramowanie do obrazowania i wprowadź dane identyfikacyjne myszy w nowej karcie pacjenta w celu wykonania obrazowania.W sekcji typ urządzenia wybierz tryb podczerwieni. Po skonfigurowaniu systemu obrazowania rozszerz źrenice myszy za pomocą 1% roztworu okulistycznego tropic IDE i odczekaj pięć minut. W tym czasie zważ mysz, aby określić wymaganą dawkę znieczulenia.Następnie wstrzyknij dootrzewnowo mieszaninę ketaminy, ksylazyny i acepromazyny zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym. Odczekaj około pięciu minut, aż mysz zostanie w pełni znieczulona. Zamiast pokrywania oczu znieczulonej myszy maścią okulistyczną, aplikuj do oczu sterylny PBS co dwie minuty lub załóż specjalistyczne soczewki kontaktowe, aby zapobiec ich wysychaniu i rozwojowi katarakty.Po znieczuleniu należy umieścić ogon myszy w wodzie o temperaturze 40 °C na 20 do 30 sekund w celu rozszerzenia żyły ogonowej. Następnie, używając strzykawki o pojemności 1 ml z igłą o rozmiarze 32 G, należy pobrać 2 µL na gram masy ciała roztworu indocyjaniny zielonej o stężeniu 1 mg/mL. Należy uważać, aby do strzykawki nie dostały się pęcherzyki powietrza.Następnie przytrzymaj ogon jedną ręką tak, aby boczna żyła ogonowa znajdowała się u góry, i przemyj ogon gazikiem nasączonym alkoholem, aby wysterylizować miejsce wstrzyknięcia. Następnie wprowadź igłę na głębokość około dwóch milimetrów do żyły pod minimalnym kątem, z otworem igły skierowanym ku górze. Delikatnie odciągnij tłok strzykawki i sprawdź, czy w nasadzie igły pojawiła się krew, co potwierdzi prawidłowe wprowadzenie igły do żyły.Następnie powoli wstrzyknij roztwór zieleni indocyjaninowej. Podczas wstrzykiwania opór powinien być minimalny. Wyjmij igłę i dociśnij wacik nasączony alkoholem bezpośrednio do miejsca wkłucia przez 5 do 10 sekund, aby zatamować ewentualne krwawienie.Mysz jest teraz gotowa do obrazowania po wstrzyknięciu do żyły ogonowej. Szybko przenieś mysz do wcześniej przygotowanego systemu obrazowania, aby wykonać zdjęcia w wczesnej fazie wypełniania naczyniówki. Najpierw ustaw obraz, koncentrując się na interesującym obszarze naczyń krwionośnych.Ustaw ostrość w zakresie od 35 do 45 dioptrii dla naczyń siatkówki oraz od 10 do 15 dioptrii dla naczyń naczyniówki. Następnie kontroluj jasność za pomocą modułu sterującego, cyfrowo dostosuj wartości ostrości i jasności, a po ich ustawieniu utrzymuj je na stałym poziomie dla danego typu ujęcia. Zachowaj również stałą odległość od oka myszy do kamery.Aby zapewnić powtarzalną jakość obrazu, należy przeprowadzić wstępną selekcję, obrazując całą tylną część oka pod różnymi kątami. Należy rozpocząć od dopasowania okrągłego obszaru luminescencji emitowanej przez barwnik indocyjanina G do pola widzenia kamery.Aby to osiągnąć, należy przesuwać urządzenie z lewej na prawą, z góry na dół oraz w przód i w tył. Korekcję pozycji kamery należy przeprowadzać do momentu, aż cały obraz będzie ostry i pozbawiony ciemnych obszarów. Należy zapisać optymalne ustawienia urządzenia w celu powtórzenia procedury.Po ustawieniu ostrości na naczynia krwionośne, należy zarejestrować klatki obrazu, naciskając okrągły czarny przycisk w module akwizycji. Przycisk ten może być również wykorzystany do osłabienia lub wzmocnienia sygnału indoc i zielonego w celu uzyskania najlepszej jakości obrazu. Aby zbadać konkretny obszar zmiany na podstawie wcześniejszych wyników przesiewowych, należy skonfigurować system obrazowania, stosując optymalny kąt oraz ustawienia urządzenia określone wcześniej.Przez cały czas trwania badania zachowaj stały kąt widzenia oka, głębokość ogniskowania oraz pozostałe ustawienia urządzenia. Zapisuj obrazy, naciskając przycisk akwizycji na panelu dotykowym modułu przechwytywania. Kontynuuj pobieranie obrazów w fazie wczesnej, aż krążenie siatkówkowe i naczyniówkowe osiągnie maksymalną jasność.Może to zająć do czterech minut. Następnie należy kontynuować pozyskiwanie obrazów w fazie środkowej od 6 do 15 minut po wstrzyknięciu. Jak widać tutaj, naczynia naczyniówkowe stają się w tej fazie mniej wyraźne i objawiają się jako rozproszona fluorescencja.Następnie pojawiają się zmiany naczyniówkowe wykazujące hiperfluorescencję; w tym momencie należy wykonać obrazy w późnej fazie, od 17 do 25 minut po wstrzyknięciu. W tej fazie hiperfluorescencja słabnie, a naczynia przestają być widoczne. Ponadto głowa nerwu wzrokowego staje się czarna, a zmiany naczyniówkowe wykazują maksymalny kontrast względem słabnącego tła.Po zakończeniu akwizycji obrazów należy nałożyć przezroczysty lubrykant IGEL na oczy myszy i pozostawić zwierzęta na podkładce grzewczej w celu rekonwalescencji. Gdy myszy zaczną ponownie się poruszać, należy przenieść je do klatek i pomieszczenia hodowlanego. Na koniec należy wyeksportować wszystkie obrazy jako pliki graficzne lub pliki wideo do dalszej analizy.Przedstawiono tutaj porównanie angiografii z fluoresceiną sodową oraz angiografii z endocytem w kolorze zielonym w obrazowaniu naczyń krwionośnych siatkówki i naczyniówki myszy. Podczas gdy naczynia siatkówki są widoczne zarówno w FA, jak i w ICGA, naczynia naczyniówki można zaobserwować wyłącznie za pomocą ICGA. Poniżej znajdują się obrazy naczyń naczyniówki wykonane po wstrzyknięciu endocytu w kolorze zielonym do żyły ogonowej myszy typu dzikiego.Na żadnym z etapów obrazowania u myszy transgenicznej HT A one nie stwierdzono rozszerzeń ani zmian chorobowych. Jednakże w fazie wczesnej wykryto zarówno rozszerzenia, jak i polipowate zmiany typu skupiskowego; w fazie środkowej pojawiło się kilka kolejnych zmian, które stały się wyraźniejsze w fazie późnej. Aby porównać jakość obrazowania po wstrzyknięciu indocyjaniny zielonej do żyły ogonowej oraz do jam ciała, dodatkowe myszy transgeniczne HRA one poddano obrazowaniu po wstrzyknięciu IP. Unaczynienie choroidei jest w większości niewidoczne pięć minut po wstrzyknięciu u obu myszy i pozostaje niewidoczne przez ponad 12 minut u myszy.Na dolnych panelach, oprócz korzenia wtryskiwania, kolor pigmentu również wpływa na jakość obrazów. Tutaj porównano mysz pigmentowaną i albinos, stosując czasowy przebieg IV incy w kolorze zielonym, w geografii. Mysz albinos miała znacznie ostrzejsze obrazy zarówno dużych, jak i małych naczyń naczyniówkowych w fazach wczesnej i środkowej i stanowiłaby dobre tło hodowlane dla dalszych badań w tym obszarze po jego rozwoju.Technika ta otworzyła badaczom z dziedziny badań nad wzrokiem drogę do eksploracji nieprawidłowości w naczyniówce w modelach mysich.

detecting-abnormalities-choroidal-vasculature-mouse-model-age-related

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Wykrywanie nieprawidłowości w unaczynieniu ścięgna siatkówki u mysiego modelu zwyrodnieniu plamki żółtej związanego z wiekiem przez angiografię indocyaninowo-zieleniową przeprowadzoną w różnych odstępach czasowych

Aktywacja mikrogleju i mikroglejoza są kluczowymi odpowiedziami na przewlekłą neurodegenerację. W tym miejscu przedstawiamy metody długoterminowej wizualizacji in vivo komórek mikrogleju CX3CR1-GFP+ siatkówki za pomocą oftalmoskopii konfokalnej oraz analiz progowych i morfometrycznych w celu identyfikacji i ilościowego określenia ich aktywacji. Monitorujemy zmiany mikrogleju we wczesnych stadiach jaskry związanej z wiekiem.

In vivo (in vivo)Dynamika aktywacji mikrogleju siatkówki podczas neurodegeneracji: konfokalne obrazowanie oftalmoskopowe i morfometria komórkowa w jaskrze myszy

Ten protokół opisuje, jak techniki obrazowania o wysokiej rozdzielczości, takie jak optyczna koherentna tomografia w domenie spektralnej i skaningowa oftalmoskopia laserowa, mogą być wykorzystane u małych gryzoni, przy użyciu systemu platformy obrazowania okulistycznego, aby uzyskać informacje odpowiednio o grubości siatkówki i rozmieszczeniu komórek mikrogleju.

In vivo (in vivo) Obrazowanie myszy reporterowych Cx3cr1gfp/gfp z optyczną koherentną tomografią w domenie spektralnej i skaningową oftalmoskopią laserową

Tutaj prezentujemy przydatność podłużnego obrazowania in vivo w obserwacji zmian morfologicznych wywołanej laserem neowaskularyzacji naczyniówkowej u myszy.

In vivo (in vivo) Multimodalne obrazowanie i analiza mysiego modelu neowaskularyzacji naczyniówki indukowanej laserem

Tutaj opisujemy użycie optycznej koherentnej tomografii spektralnej (SD-OCT) do wizualizacji struktur siatkówki i oka in vivo w modelach zwyrodnienia siatkówki, jaskry, retinopatii cukrzycowej i krótkowzroczności.

Strukturalne oceny in vivo chorób oczu w modelach gryzoni przy użyciu optycznej koherentnej tomografii

Ten protokół przedstawia test kiełkowania naczyniówki, model ex vivo proliferacji mikronaczyniowej. Test ten może być stosowany do oceny szlaków zaangażowanych w proliferację mikronaczyniówek i oceny leczenia farmakologicznego przy użyciu typu dzikiego i genetycznie zmodyfikowanej tkanki myszy.

Test kiełkowania naczyniówki ex vivo w angiogenezie mikronaczyniowej oka

Ten protokół opisuje szczegółową metodę przygotowania i immunofluorescencji barwienia płaskich mocowań siatkówki myszy oraz analizy. Szczegółowo opisano również zastosowanie angiografii dna oka fluoresceiny (FFA) u młodych myszy i przetwarzanie obrazu.

Monitorowanie dynamicznego wzrostu naczyń siatkówki w mysim modelu retinopatii indukowanej tlenem

Tutaj opisujemy technikę obrazowania in vivo wykorzystującą optyczną koherentną tomografię ułatwiającą diagnozę i ilościowy pomiar retinopatii u myszy.

Zastosowanie optycznej koherentnej tomografii do mysiego modelu retinopatii

Tutaj prezentujemy trzy protokoły analizy danych dla obrazów angiografii fluoresceinowej (FA) i optycznej koherentnej tomografii (OCT) w badaniu okluzji żył siatkówki (RVO).

In vivo (in vivo) Odczyty uszkodzeń naczyniowych w siatkówce myszy w celu zwiększenia odtwarzalności

Obecnie, angiografia fluoresceinowa (FA) jest preferowaną metodą identyfikacji wzorców przecieków w zwierzęcych modelach neowaskularyzacji naczyniówkowej (CNV). Jednak FA nie dostarcza informacji na temat morfologii naczyń krwionośnych. Protokół ten przedstawia zastosowanie angiografii zieleni indocyjaninowej (ICGA) do scharakteryzowania różnych typów zmian CNV indukowanych laserem w modelach mysich.

Charakterystyka morfologii naczyniowej neowaskularnego zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem za pomocą angiografii zieleni indocyjaninowej

Aby zrozumieć molekularne mechanizmy uszkodzeń rozwojowych wywołanych przez etanol, opracowaliśmy model ekspozycji na etanol u rybek danio (zebrafish) i badamy zmiany fizyczne, komórkowe oraz genetyczne występujące po takiej ekspozycji1. Następnie dążymy do znalezienia potencjalnych interwencji i ich szybkiego przetestowania w tym modelu zwierzęcym.

Ocena zmian teratogennych w modelu ekspozycji płodowej na alkohol u rybek danio pręgowanych

Poznaj metodę angiografii zielenią indocyjaninową do wykrywania nieprawidłowości naczyniówki w mysim modelu zwyrodnienia plamki żółtej. Technika ta umożliwia precyzyjną analizę zmian naczyniowych w czasie.

Wykrywanie nieprawidłowości w unaczynieniu naczyniówki w mysim modelu zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem za pomocą zielonej angiografii indocyjaniny w czasie (Wideo) | JoVE Journal

Wykrywanie nieprawidłowości w unaczynieniu naczyniówki w mysim modelu zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem za pomocą zielonej angiografii indocyjaniny w czasie

Przeglądaj więcej filmów