Name: Analiza funkcjonalna obwodu żerowania larw u Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-19T16:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Poznaj metody analizy obwodu żerowania u larw Drosophila melanogaster. Techniki behawioralne i immunofluorescencyjne pozwalają skorelować zmiany w architekturze neuronalnej z zachowaniem żywieniowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy pragną podziękować Funduszowi Badawczemu Prezydenta z Saint Louis University przyznanemu W.S.N.

1. Utrzymanie klatek dla ludności
<ol>
	<li>Utrzymuj klatki dla populacji w temperaturze 25 °C w 12-godzinnym cyklu jasno-ciemnym. Tak długo, jak grupy kontrolne i eksperymentalne są wystawione na te same warunki oświetleniowe, technika ta może być wykonywana w standardowych warunkach laboratoryjnych.</li>
	<li>Pozwól samicom złożyć jaja przez noc na talerzach z sokiem jabłkowym.</li>
	<li>Zebrać nowo wyklute larwy, utrzymując płytki z nowo złożonymi jajami w temperaturze 25 °C przez 24 godziny. Umieść małą porcję drożdży na środku płytki, aby przyciągnąć wyklute larwy.</li>
	<li>Zbierz 1 larwy w stadium rozwojowym, które migrowały do pasty drożdżowej na środku talerza z sokiem jabłkowym. Użyj metalowej szpatułki, aby przenieść go na talerz ze świeżym sokiem jabłkowym. Można dodać dodatkową pastę drożdżową, aby upewnić się, że do czasu wykonania testów jest odpowiednia ilość pokarmu. Talerze z sokiem winogronowym mogą być również używane zamiast talerzy z sokiem jabłkowym.</li>
	<li>Uzyskać późne 2-wczesne 3-cie larwy w 3. stadium rozwojowym, pozwalając 1st. stadium dojrzewać przez 40-48 godzin. W tym zakresie dawki karmienia są stałe13. Wiek można potwierdzić poprzez badanie haczyków gębowych, ponieważ z każdym linieniem larwalnym zachodzą wyraźne zmiany w tej strukturze.</li>
	<li>Larwy późnego 2-wczesnego3-go stadium rozwojowego są zbierane do testów behawioralnych poprzez delikatne i intensywne mycie talerzy soku jabłkowego wodą i zbieranie larw na filtrze siatkowym. Larwy są następnie przenoszone na płytkę agarową.</li>
	<li>Wszystkie analizy wykonywane są równolegle na zwierzętach kontrolnych i doświadczalnych.</li>
</ol>
2. Paradygmat behawioralny – lokomocja
<ol>
	<li>Umieść pojedynczą larwę w trzecim stadium rozwojowym na 2% podłożu agarowym w naczyniu do hodowli tkankowej o średnicy 100 mm i pozwól larwie zaaklimatyzować się przez 30 sekund. Larwy używają swoich sklerytów głowowo-gardłowych (haczyków gębowych) do przesuwania swoich ciał po powierzchni substratu agarowego. Odbywa się to na osobnej płytce, ponieważ trudniej jest uwidocznić skurcze ciała w roztworze drożdży, ponieważ zwierzę ma prawie ten sam kolor co drożdże.</li>
	<li>Obserwuj i rejestruj każdy ruch od tyłu do przodu nad podłożem przez okres 1 minuty. n = 20 dla każdego genotypu. Nie należy badać więcej niż 10 zwierząt na jednej płytce.</li>
</ol>
3. Paradygmat zachowania – karmienie
<ol>
	<li>Używając pęsety Inox #5, ostrożnie przenieś larwę 3 stopnia rozwojowego z płytki agarowej lokomotywy na środek płytki wypełnionej agarem pokrytej 5 ml 2% aktywowanego roztworu drożdży piekarskich. Upewnij się, że roztwór jest jednorodny, ponieważ drożdże z czasem osiądną. W roztworze drożdży larwy w dużej mierze pozostaną na miejscu i będą żerować, co ułatwi obserwację zachowania. Tempo skurczów haczyków w jamie ustnej jest bezpośrednio skorelowane z ilością spożytego pokarmu14.</li>
	<li>Pozwól larwie zaaklimatyzować się przez 30 sekund.</li>
	<li>Obserwuj i zapisuj liczbę skurczów haczyka w jamie ustnej przez okres 1 minuty. n = 20 dla każdego genotypu.</li>
</ol>
4. Rozbiory jelit larwalnych
<ol>
	<li>Przygotować 4% roztwór utrwalający formaldehyd klasy EM w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i umieścić w 3-dołkowym szkle punktowym.</li>
	<li>Ostrożnie wypreparuj wędrujące wnętrzności larw późnego stadium 3 w 3-dołkowym szklanym naczyniu, używając 1x roztworu PBS, upewniając się za każdym razem, że proventriculus pozostaje nienaruszony. Jednym kleszczem przytrzymaj tylny koniec, a drugim przytrzymaj haczyki do ust. Trzymając tylny koniec nieruchomo, delikatnie pociągnij za haczyki do ust, aby uzyskać dostęp do wnętrzności. Usuń wszelkie powiązane tkanki (gruczoły ślinowe, mózg, ciało tłuszczowe itp.), a następnie przenieś każde jelito do 3-dołkowego naczynia zawierającego formaldehyd. Stosuje się larwy wędrujące w 3. stadium rozwoju, ponieważ na tym etapie rozwoju larwa przestaje żerować w ramach przygotowań do poczwarkowania, a proventriculus jest oczyszczany z drożdży.</li>
	<li>Inkubować wnętrzności w temperaturze 4 °C przez noc w nieprzezroczystym pudełku do hodowli tkankowych.</li>
	<li>Przed usunięciem roztworu utrwalającego formaldehyd ze studzienek należy usunąć żołądek i przyciąć jelito środkowe ~150 μm2 od przedsionka, aby projekcje można było wyraźnie oglądać bez przeszkód.</li>
	<li>Usunąć poprawkę formaldehydu ze studzienek i zastąpić 1x PBT (1x PBS, 0,1% albumina surowicy bydlęcej bez proteazy, 0,1% Triton X-100) roztwór buforowy. Dokładnie umyj wnętrzności 6x przez 10 min w 1x PBT. Umieść próbki tkanek na rotatorze mechanicznym podczas wykonywania płukania.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę w 10-6 M 5-HT w celu wzmocnienia sygnalizacji serotoniny. Dokładnie umyj wnętrzności 6x przez 10 min w 1x PBT. Wcześniejsze badania wykazały, że takie stężenie egzogennego 5-HT nie wpływa na architekturę neuronów ani gęstość żylaków w analizach immunohistochemicznych, a jedynie zwiększa stosunek sygnału do szumu15-16.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 4 °C przez noc w pierwszorzędowym przeciwciałie antyserotoninowym (monoklonalnym wyhodowanym u myszy lub poliklonalnym wyhodowanym u królika). Dokładnie umyj wnętrzności 6x przez 10 min w 1x PBT. Umieść próbki tkanek na rotatorze mechanicznym podczas wykonywania płukania.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 4 °C przez 90 minut w przeciwciałie drugorzędowym (Alexa Fluor 568 kozi anty-mysi lub anty-królicy; rozcieńczenie 1:400). Dokładnie umyj wnętrzności 6x przez 10 min w 1x PBT. Umieść próbki tkanek na rotatorze mechanicznym podczas wykonywania płukania.</li>
	<li>Inkubować w 4 mM węglanie sodu przez 10 minut na rotatorze mechanicznym, następnie zamontować w 4% galusanu n-propylu/20 mM węglanu sodu i oglądać pod wpływem fluorescencji. Węglan sodu służy do przekształcania próbek w bufor i pH stosowany w pożywce mocującej.</li>
	<li>Przechwytuj obrazy próbek tkanek barwionych immunologicznie w 400-krotnym powiększeniu do analizy.</li>
</ol>
5. Analiza obwodów neuronowych
<ol>
	<li>Włókna neurytowe określono ilościowo (liczbę i wielkość żylaków oraz stopień rozgałęzienia) za pomocą Neuroleucida i Neuroexplorer. Można to jednak również zrobić ręcznie lub za pomocą Simple Neurite Tracer (bezpłatnej aplikacji, którą można pobrać online).</li>
	<li>Prześledź poszczególne wypustki włókien od mózgu do przedsionka i określ ilościowo liczbę żylaków, gałęzie i liczbę dużych żylaków na jednostkę długości. Włókna aksonalne wystające z mózgu są zgrupowane w nerwie nawrotowym i nie są dostępne do analizy, dopóki nie dotrą do przedsionka, gdzie oddzielają się i fascykulują.</li>
</ol>

<ol><li>Weiss, E., Maness, P., Lauder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+do+neurotransmitters+act+like+growth+factors%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Perspect+Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Why do neurotransmitters act like growth factors?</a> Perspect Dev Neurobiol. 5, 323-335 Forthcoming.</li>
<li>Herlenius, E., Lagercrantz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotransmitters+and+neuromodulators+during+early+human+development%5BTitle%5D)+AND+%22Early+Hum.+Dev%22%5BJournal%5D)">Neurotransmitters and neuromodulators during early human development.</a> Early Hum. Dev. 65, 21-37 Forthcoming.</li>
<li>Budnik, V., Wu, C., White, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+branching+of+serotonin-containing+neurons+in+Drosophila+mutants+unable+to+synthesize+serotonin+and+dopamine%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Altered branching of serotonin-containing neurons in Drosophila mutants unable to synthesize serotonin and dopamine.</a> J. Neurosci. 9, 2866-2877 (1989).</li>
<li>Sodhi, M., Sanders-Bush, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+and+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Serotonin and brain development.</a> International Review of Neurobiol. 59, 111-174 (2004).</li>
<li>Goldberg, J., Kater, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+function+of+the+neurotransmitter+serotonin+during+development+of+the+Helisoma+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression and function of the neurotransmitter serotonin during development of the Helisoma nervous system.</a> Dev. Biol. 131, 483-495 (1989).</li>
<li>Goldberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+regulation+of+neurite+outgrowth+in+identified+neurons+from+mature+and+embryonic+Helisoma+triyolvis%5BTitle%5D)+AND+%22Perspect+Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Serotonin regulation of neurite outgrowth in identified neurons from mature and embryonic Helisoma triyolvis.</a> Perspect Dev Neurobiol. 5, 373-387 (1998).</li>
<li>Haydon, P., McCobb, P., Kater, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+selectively+inhibits+growth+cone+motility+and+synaptogenesis+of+specific+identified+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Sci%22%5BJournal%5D)">Serotonin selectively inhibits growth cone motility and synaptogenesis of specific identified neurons.</a> Sci. 226, 561-564 (1984).</li>
<li>Neckameyer, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+trophic+role+for+serotonin+in+the+development+of+a+simple+feeding+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A trophic role for serotonin in the development of a simple feeding circuit.</a> Dev. Neurosci. 32, 217-237 Forthcoming.</li>
<li>De Vry, J., Schreiber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+selected+serotonin+5-HT+1+and+5-HT+2+receptor+agonists+on+feeding+behavior%3A+possible+mechanisms+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Biobehav.+Rev%22%5BJournal%5D)">Effects of selected serotonin 5-HT 1 and 5-HT 2 receptor agonists on feeding behavior: possible mechanisms of action.</a> Neurosci. Biobehav. Rev. 24, 341-353 (2000).</li>
<li>Schoofs, A., Niederegger, S., van Ooyen, A., Heinzel, H., Spieß, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+brain+can+eat%3A+Establishing+the+existence+of+a+central+pattern+generator+for+feeding+in+third+instar+larvae+of+Drosophila+virilis+and+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">The brain can eat: Establishing the existence of a central pattern generator for feeding in third instar larvae of Drosophila virilis and Drosophila melanogaster.</a> J. Insect Physiol. 56, 695-705 (2010).</li>
<li>Spieß, R., Schoofs, A., Heinzel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+of+the+stomatogastric+nervous+system+associated+with+the+foregut+in+Drosophila+melanogaster+and+Calliphora+vicin+third+instar+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Morphol%22%5BJournal%5D)">Anatomy of the stomatogastric nervous system associated with the foregut in Drosophila melanogaster and Calliphora vicin third instar larvae.</a> J. Morphol. 269, 272-282 (2008).</li>
<li>Neckameyer, W. S., Bhatt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophic+actions+of+dopamine+on+the+development+of+a+serotonergic+feeding+circuit+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Cent+NeuroSci%22%5BJournal%5D)">Neurotrophic actions of dopamine on the development of a serotonergic feeding circuit in Drosophila melanogaster.</a> Biomed Cent NeuroSci. 13, 26(2012).</li>
<li>Sewall, D., Burnet, B., Connolly, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+larval+feeding+behavior+in+Drosophila+melanogaste%5BTitle%5D)+AND+%22Genet.+Res%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of larval feeding behavior in Drosophila melanogaste.</a> Genet. Res. 24, 163-173 (1975).</li>
<li>Joshi, A., Mueller, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+higher+feeding+rate+in+Drosophila+due+to+density-dependent+natural+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%22%5BJournal%5D)">Evolution of higher feeding rate in Drosophila due to density-dependent natural selection.</a> Evolution. 42, 1090-1093 (1988).</li>
<li>Budnik, V., Wu, C., White, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+branching+of+serotonin-containing+neurons+in+Drosophila+mutants+unable+to+synthesize+serotonin+and+dopamine%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Altered branching of serotonin-containing neurons in Drosophila mutants unable to synthesize serotonin and dopamine.</a> J. Neurosci. 9, 2866-2877 (1989).</li>
<li>Sykes, P., Condron, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+sensitivity+to+serotonin+of+Drosophila+varicosities+in+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Development and sensitivity to serotonin of Drosophila varicosities in the central nervous system.</a> Dev. Biol. 286, 207-216 (2005).</li>
<li>Garrity, P. A., Goodman, M. B., Samuel, A. D., Sengupta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Running+hot+and+cold%3A+behavioral+strategies%2C+neural+circuits%2C+and+the+molecular+machinery+for+thermotaxis+inC.+elegansand+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Running hot and cold: behavioral strategies, neural circuits, and the molecular machinery for thermotaxis inC. elegansand Drosophila.</a> Genes Dev. 24, 2365-2382 (2010).</li>
<li>McKemy, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+sensing+across+species%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archives%22%5BJournal%5D)">Temperature sensing across species.</a> Pflugers Archives. 454, 777-791 (2007).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Nieprawidłowy rozwój serotoninergicznego obwodu stomatożołądkowego, który następuje podczas późnej embriogenezy, wpłynie na jego dojrzałą funkcję. Zmiany w architekturze neurytów unerwiających jelita mogą być skorelowane z funkcjonalnym wyjściem obwodu, którym jest szybkość karmienia (mierzona skurczami haczyków w jamie ustnej w roztworze drożdży) (ryc. 1). Zastosowanie dwuczęściowego systemu UAS-Gal4 u Drosophila umożliwia specyficzne ukierunkowanie regulowanej w górę lub w dół ekspresji danego...

Drosophila to niezwykle potężny system modelowy do badania rozwoju obwodów nerwowych dzięki szybkiemu czasowi generacji, niskim kosztom eksperymentu oraz możliwości manipulowania i kontrolowania czynników genetycznych i środowiskowych. Neurogeneza, znajdowanie ścieżek neuronalnych i synaptogeneza są zachowane między ludźmi a Drosophila; W związku z tym mechanizmy tworzenia, utrzymywania i modyfikowania obwodów neuronowych są również zachowane.
Klasyczne neuroprzekaźniki, takie jak serotonina (5-hydroksytryptamina lub 5-HT) mogą służyć jako czynniki wzrostu przed przyjęciem ich roli jako molekuły sygnałowe w dojrzałym obwodzie nerwowym1-3 Poprzednie badania wykazały, że zaburzone poziomy 5-HT podczas embriogenezy zmieniają łączność dojrzałych neuronów4. Inni wykazali, że ektopowe zastosowanie 5-HT do hodowanych neuronów Helisoma hamuje wzrost neurytów, a także synaptogenezę5-7. U Drosophila rozwojowe poziomy 5-HT są odwrotnie proporcjonalne do liczby i wielkości żylaków, a także stopnia aboryzacji, wzdłuż długości neurytów wystających do jelita przedniego z OUN8.
Wykazano, że Wykazano, że neurotransmisja serotoninergiczna moduluje zachowania żywieniowe u różnych gatunków, w tym Drosophila8-9. Obwód żywieniowy u Drosophila jest stosunkowo prostym obwodem, który można wykorzystać jako model do korelacji funkcjonalnej wydajności (karmienia) ze zmianami w rozwoju projekcji aksonalnych z mózgu do jelita przedniego. Schoofs i wsp. wykazały, że żerowanie larw Drosophila jest regulowane przez centralne generatory wzorców, które wpływają na muskulaturę10. Chociaż specyficzna anatomia mięśniowa nie jest w pełni zrozumiała, wykazano, że nerw czułkowy, nerw szczękowy i nerw dodatkowy przedpiersiowy są odpowiedzialne za cele mięśniowe zaangażowane w zachowanie żywieniowe. Większość danych dotyczących muskulatury i anatomii nerwów w żywieniu bezkręgowców ogranicza się do larw Calliphora.
Szybkość żerowania larw drugiego stadium rozwojowego może być oceniana przez retrakcję sklerytów głowowo-gardłowych (haczyków gębowych) i jest powtarzalna i wysokoprzepustowa. Płytki głowowo-gardłowe są unerwione włóknami z centralnych neuronów 5-HT przez nerw czołowy. Proventriculus, czyli jelito przednie, jest unerwione przez włókna serotoninergiczne (nerw nawrotowy), które fascykulują się w jelicie środkowym i są odpowiedzialne za skurcze jelita przedniego (ryc. 1)11-12. Zmiany w rozgałęzieniach aksonalnych oraz liczbę i wielkość żylaków na całej długości neurytów można określić ilościowo za pomocą technik immunohistochemicznych. Manipulowanie neuronalnym 5-HT podczas rozwoju, bezpośrednio lub pośrednio, może zmienić funkcjonalną moc wyjściową tego obwodu karmienia, co można ocenić i skorelować ze zmianami w morfologii architektury neurytów.

<table><tbody><tr><td>Mikroskop Eclipse E-800</td><td>Instrumenty firmy Nikon Neuroleucida</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>MBF Biosciences</td><td>NL-15</td><td>Służy do analizy architektury włókien jelitowych, nie jest konieczne posiadanie</td></tr><tr><td>oprogramowania do obrazowania</td><td>Northern Eclipse</td><td>Empix Inc</td><td></td></tr><tr><td>G-2E/C TRITC EX 528-553</td><td>Nikon Instruments</td><td>96312</td><td>Filtr do specyficznego przeciwciała</td></tr> <tr><td>wtórnegobrak danych 0,75; szer. d. 0,72 mm; Pryzmat DIC: 40xI, 40x I-C; Sprężynowy</td><td>obiektyw Nikon Instruments</td><td>MRH00400</td><td>używany do obrazowania</td></tr><tr><td>Simple Neurite Tracer</td><td>NIH Image J</td><td></td><td><a href="http://fiji.sc/Simple_Neurite_Tracer">http://fiji.sc/Simple_Neurite_Tracer</a></td></tr></tbody></table>

analiza funkcjonalna obwodu żerowania larw u drosophila

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

Obwód serotoninergiczny u larw Drosophila melanogaster może być wykorzystany do badania substratów neuronalnych o krytycznym znaczeniu podczas rozwoju obwodu. Korzystając z funkcjonalnego wyjścia obwodu, karmienia, można uwidocznić zmiany w architekturze neuronalnej układu stomatożołądkowego. Zachowania żywieniowe można rejestrować, obserwując szybkość cofania się haczyków ustnych, które otrzymują unerwienie z mózgu. Zachowanie lokomotoryczne jest wykorzystywane jako fizjologiczna kontrola żerowania, ponieważ larwy używają haczyków do ust do przechodzenia przez podłoże agarowe. Zmiany w zachowaniach żywieniowych mogą być skorelowane z architekturą aksonalną neurytów unerwiających jelita. Za pomocą immunohistochemii można uwidocznić i określić ilościowo te zmiany. Niewłaściwe obchodzenie się z larwami podczas paradygmatów zachowania może zmienić dane, ponieważ są one bardzo wrażliwe na manipulacje. Prawidłowe obrazowanie architektury neurytów unerwiających jelita ma kluczowe znaczenie dla precyzyjnego określenia liczby i wielkości żylaków, a także zasięgu węzłów rozgałęzionych. Analiza większości obwodów pozwala jedynie na wizualizację architektury neurytów lub efektów behawioralnych; Jednak model ten pozwala na skorelowanie funkcjonalnego wyjścia obwodu z upośledzeniem architektury neuronalnej.

Serotonergiczny obwód żywieniowy w larwie Drosophila może służyć jako niezwykle skuteczny model do obserwacji wpływu poszczególnych czynników na rozwój układu nerwowego. Poprzez kwantyfikację szybkości żywienia możliwe jest powiązanie architektury aksonalnej obwodu żywieniowego z jego wynikiem funkcjonalnym (Rysunek 1). Test lokomocyjny jest wykorzystywany jako kontrola fizjologiczna dla ruchów cofania haczyków gębowych, ponieważ larwy używają haczyków gębowych do przemieszczania się po powierzc...

Obwód żywieniowy u larw Drosophila melanogaster służy prostemu, ale potężnemu modelowi, który pozwala na skorelowanie zmian w tempie karmienia ze zmianami w obwodach nerwowych stomatogastrycznych. Obwód ten składa się z centralnych neuronów serotoninergicznych, które wysyłają projekcje do haczyków ustnych, a także do jelita przedniego.

Analiza funkcjonalna obwodu żerowania larw u Drosophila

The serotonergic  feeding circuit in Drosophila  melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of  critical importance during the ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykorzystanie modelu Drosophila do skorelowania wyników behawioralnych ze zmianami w architekturze neuronalnej. Jest to realizowane poprzez uprzednie przygotowanie klatek populacyjnych dla dorosłych osobników Drosophila w celu zebrania larw. Kolejnym krokiem procedury jest ocena zdolności lokomotorycznych larw w późnym stadium drugiego lub wczesnym stadium trzeciego wzrostu.Trzecim krokiem jest ocena zachowania żywieniowego larw poprzez obserwację wysuwania i chowania ich haczyków gębowych. Ostatnim krokiem jest sekcja i przygotowanie reprezentatywnych próbek komór komórkowych z larw w późnym stadium trzeciego ściernia z wykorzystaniem technik immunohistochemicznych. Ostatecznie, dzięki połączeniu testów behawioralnych i mikroskopii immunofluorescencyjnej, wyniki mogą wykazać, w jaki sposób aberracje w architekturze neuronalnej podczas rozwoju wiążą się ze zmianami behawioralnymi.Implikacje tej techniki prowadzą do lepszego zrozumienia rozwoju architektury neuronalnej, co pozwala na lepsze poznanie przebiegu chorób neurologicznych. Procedurę zademonstruje student studiów podyplomowych w moim laboratorium. Klatki z populacją drosophila należy

functional-analysis-of-the-larval-feeding-circuit-in-drosophila

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Analiza funkcjonalna obwodu żerowania larw Drosophila

Muszka owocówka, Drosophila melanogaster, wysuwa swój trąbek w celu żerowania w odpowiedzi na bodziec cukrowy działający na trąbek lub tarsus. Połączyłem obserwacje reakcji wysuwania trąbka (PER) z techniką obrazowania wapnia, co pozwala nam monitorować aktywność neuronów w mózgu równocześnie z obserwacją behawioralną.

Jednoczesna rejestracja sygnałów wapniowych z zidentyfikowanych neuronów i zachowań żerowania Drosophila melanogaster

Drosophila larwy są w stanie kojarzyć bodźce zapachowe z nagrodą smakową. W niniejszej pracy opisujemy prosty paradygmat behawioralny, który umożliwia analizę apetytywnego uczenia się asocjacyjnego w odpowiedzi na zapachy.

Apetytywne warunkowanie węchowe u larw Drosophila

Ten film przedstawia wizualizację interakcji białko-białko w połączeniu nerwowo-mięśniowym Drosophila (NMJ) przy użyciu testu ligacji zbliżeniowej (PLA). Po wyizolowaniu ścian ciała, oddziałujące białka są badane za pomocą przeciwciał pierwszorzędowych i przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z PLA. Bliskość oddziałujących białek ułatwia ligację sond z oligonukleotydami konektorowymi, tworzącymi koliste DNA, które jest następnie amplifikowane przez amplifikację toczącego się koła. Sondy...

Wykrywanie interakcji białko-białko u larw Drosophila za pomocą testu ligacji zbliżeniowej

Test CApillary FEeder (CAFE) jest prostą, niedrogą i wysoce niezawodną metodą badania mechanizmów leżących u podstaw przyjmowania pokarmu. Stosowany w połączeniu z wysoce wszechstronnym modelem genetycznym Drosophila melanogaster, stanowi potężny środek do uzyskania nowego wglądu w mechanizmy regulacyjne przyjmowania pokarmu.

Test CApillary FEeder mierzy spożycie pokarmu u Drosophila melanogaster

Ilościowe testy spożycia żywności z farbowaną żywnością dostarczają solidnych i wydajnych środków do oceny motywacji do karmienia. Połączenie testu spożycia żywności z termogenetycznymi i optogenetycznymi badaniami przesiewowymi jest skutecznym podejściem do badania obwodów neuronalnych leżących u podstaw apetytu u dorosłych Drosophila melanogaster.

Połączenie ilościowych testów spożycia pokarmu i wymuszonej aktywacji neuronów w celu zbadania apetytu u Drosophila

Celem tego protokołu jest zmierzenie kurczenia się upraw i ilościowe określenie dystrybucji pokarmu w jelitach Drosophila.

Pomiar ruchliwości upraw i pasażowania pokarmu u Drosophila

Opisany tutaj jest protokół, który umożliwia kolorymetryczną kwantyfikację ilości jedzenia spożywanego w określonym przedziale czasu przez larwy Drosophila melanogaster wystawione na działanie diety o różnej jakości makroskładników. Testy te są przeprowadzane w kontekście neuronalnego badania termogenetycznego.

Kwantyfikacja spożycia makroskładników odżywczych w termogenetycznym badaniu przesiewowym neuronów przy użyciu larw Drosophila

Przedstawiamy protokół dla testu żywieniowego dla much z dwoma opcjami. Ten test żywieniowy jest szybki i łatwy do przeprowadzenia i nadaje się nie tylko do badań laboratoryjnych na małą skalę, ale także do wysokowydajnych badań behawioralnych u much.

Szybki test preferencji żywieniowych u Drosophila

Test podawania mikropłytek oferuje ekonomiczną, wysokoprzepustową metodę ilościowego oznaczania spożycia płynów u Drosophila. Urządzenie wydrukowane w 3D łączy 96-dołkową mikropłytkę, w której trzymane są muchy, z 1536-dołkową mikropłytką, z której muchy spożywają roztwór pokarmowy z barwnikiem znacznikowym. Spadek objętości roztworu jest mierzony spektrofotometrycznie.

Wysokoprzepustowy test na mikropłytkach do ilościowego oznaczania spożycia u Drosophila

Tutaj omawiamy proces przygotowania, sekcji, montażu i obrazowania żywych mózgów eksplantatów z larw trzeciego stadium rozwojowego Drosophila melanogaster, aby obserwować dynamikę komórkową i subkomórkową w warunkach fizjologicznych.

Obrazowanie żywymi komórkami mózgów larwalnych Drosophila melanogaster

Protokół przedstawia wysokoprzepustową, opłacalną metodę oceny neurotoksyczności u muszki owocowej poprzez kwantyfikację dysfunkcji lokomotorycznej jako alternatywę dla tradycyjnych modeli ssaków. Ma na celu ocenę neurotoksycznego wpływu związków farmaceutycznych, czynników środowiskowych lub modyfikacji genetycznych przy użyciu czułego, powtarzalnego i etycznie korzystnego modelu.

Analiza behawioralna dysfunkcji narządu ruchu u Drosophila melanogaster jako odczyt neurotoksyczności

Poznaj metody analizy obwodu żerowania u larw Drosophila melanogaster. Techniki behawioralne i immunofluorescencyjne pozwalają skorelować zmiany w architekturze neuronalnej z zachowaniem żywieniowym.

Analiza funkcjonalna obwodu żerowania larw u Drosophila

Przeglądaj więcej filmów