Analiza funkcjonalna obwodu żerowania larw u Drosophila

Obwód żywieniowy u larw Drosophila melanogaster służy prostemu, ale potężnemu modelowi, który pozwala na skorelowanie zmian w tempie karmienia ze zmianami w obwodach nerwowych stomatogastrycznych. Obwód ten składa się z centralnych neuronów serotoninergicznych, które wysyłają projekcje do haczyków ustnych, a także do jelita przedniego.

Ogólnym celem tej procedury jest wykorzystanie systemu modelu Drosophila do skorelowania wyników behawioralnych ze zmianami w architekturze neuronalnej. Osiąga się to poprzez najpierw ustawienie klatek populacyjnych dorosłych drosophila w celu zbierania larw. Kolejnym etapem zabiegu jest ocena zdolności lokomotorycznych larw w późnym drugim i wczesnym trzecim stadium rozwojowym.

Trzecim krokiem jest ocena zachowań żywieniowych larw poprzez obserwację wysuwania i chowania ich haczyków pyskowych. Ostatnim krokiem jest wypreparowanie i przygotowanie sprawdzonych próbek komorowych od larw późnego stadium rozwojowego przy użyciu technik immunohistochemicznych. Ostatecznie wyniki mogą pokazać, w jaki sposób aberracje w architekturze neuronalnej podczas rozwoju odnoszą się do zmian behawioralnych poprzez połączone zastosowanie testów behawioralnych i mikroskopii immunofluorescencyjnej.

Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku lepszego zrozumienia rozwoju architektury neuronalnej, co pozwala lepiej zrozumieć postęp chorób neurologicznych. Demonstracją procedury będzie prag bot, doktorant w moim laboratorium. Utrzymuj klatki populacji Drosophila w temperaturze 25 stopni Celsjusza w 12-godzinnym cyklu jasnego i ciemnego.

Tak długo, jak grupy kontrolne i eksperymentalne są wystawione na te same warunki oświetleniowe, technika ta może być wykonywana w standardowych warunkach laboratoryjnych. Korzystając z ustalonych populacji, zbieraj larwy, pozwalając samicom na składanie jaj przez noc na soku jabłkowym. Płytki agarowe Zmień talerz rano i umieść małą porcję drożdży na środku zebranej płytki.

Drożdże przyciągną wyklute larwy, pozwolą jajom rozwijać się przez 24 godziny w temperaturze 25 stopni Celsjusza, a następnego dnia zbiorą z pasty pierwsze larwy w stadium rozwojowym. Za pomocą metalowej szpatułki przenieś larwy na świeży talerz z sokiem jabłkowym lub sokiem winogronowym. Można dodać dodatkową pastę drożdżową, aby odżywić larwy do czasu przeprowadzenia testów w celu zebrania larw drugiego i wczesnego trzeciego stadium rozwojowego, co pozwala pierwszemu stadium dojrzewać przez 40 do 48 godzin.

W tym czasie tempo karmienia jest stałe do zebrania. Larwy w późnym trzecim stadium rozwojowym wychowują larwy w butelkach. Hodowla larw w późnym trzecim stadium rozwojowym na talerzach z sokiem może być szkodliwa ze względu na gromadzenie się agro w układzie somatycznym żołądka.

Wiek larw można potwierdzić na podstawie morfologii haka gębowego, ponieważ w tej strukturze zachodzą wyraźne zmiany. Z każdą pleśnią larwalną zbierz późne drugie i wczesne larwy trzeciego stadium rozwojowego, delikatnie i obszernie myjąc talerz z sokiem wodą i wlewając larwy do filtra siatkowego, a następnie przystąp do analizy behawioralnej. Umieść pojedynczą larwę w późnym drugim do początku trzeciego stadium rozwojowego na podłożu o stężeniu 2% aceru w 100-milimetrowym naczyniu do hodowli tkankowej i pozwól larwom zaaklimatyzować się przez 30 sekund przez dokładnie jedną minutę.

Korzystając z licznika, każdy ruch od tyłu do przodu nad podłożem ocenia każdy skurcz, który występuje na trzech czwartych ciała zwierzęcia. Kiedy larwy kołyszą się na boki, ale w rzeczywistości nie zmieniają pozycji, ruchy te nie są oceniane. Czasami całkowity skurcz od przodu do tyłu generuje ruch do tyłu, taki jak lokomocja do przodu.

Punktowana jest również lokomocja do tyłu. Płytkę testową należy wymienić po całkowitym przebadaniu co najwyżej 10 zwierząt. Wykonaj co najmniej 20 nagrań na warunki eksperymentalne.

Oceń każdą larwę użytą w teście lokomotorycznym w teście żywieniowym za pomocą inoxu. Numer pięć, pęseta. Ostrożnie przenieś larwę z lokomotywowej płytki rolniczej na środek płytki wypełnionej agri pokrytej pięcioma mililitrami jednorodnego roztworu drożdży.

W roztworze drożdży larwy w dużej mierze pozostaną na miejscu, a karmienie paszą koreluje bezpośrednio z szybkością skurczów haka w jamie ustnej, które są postrzegane jako wydłużenie i cofnięcie praw kości krzyżowej gardła głowa Pozwól larwom zaaklimatyzować się przez 30 sekund, a następnie przez jedną minutę rejestruj liczbę skurczów haka w jamie ustnej za pomocą licznika. Zacznij od załadowania świeżo przygotowanego formaldehydu klasy 4% EM do PBS do trzydołkowej szklanki punktowej. Następnie przenieś wędrującą larwę trzeciego stadium rozwojowego do naczynia rozwarstwiającego z PBS.

Jednym kleszczem przytrzymaj tylny koniec, a drugim przytrzymaj haczyki do ust, trzymając tylny koniec nieruchomo. Delikatnie pociągnij za haczyki do ust, aby uzyskać dostęp do wnętrzności. Usuń wszelkie powiązane tkanki, takie jak gruczoły ślinowe, mózg, ciało tłuszczowe i tak dalej.

Następnie przenieś każde jelito do naczynia z trzema dołkami zawierającego poprawkę formaldehydu. Inkubuj wnętrzności w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc w nieprzezroczystym pudełku do hodowli tkankowych. Następnego dnia przed usunięciem roztworu utrwalającego należy usunąć soczewkę żołądkową i przyciąć jelito środkowe w pobliżu sprawdzonych komór, aby można było wyraźnie zobaczyć projekcje bez przeszkód.

Teraz zastąp utrwalacz jednym XPBT i pozwól tkankom inkubować przez 10 minut, delikatnie kołysząc. Wykonaj to pranie PBT sześć razy. Następnie dodaj serotoninę, która wzmocni sygnalizację serotoniny bez wpływu na architekturę neuronalną.

Następnie inkubuj wnętrzności przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza bez kołysania. Po godzinie dokładnie umyj jelita PBT sześć razy, tak jak to zrobiono, aby usunąć przeciwciało pierwotne. Następnie inkubuj jelita przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza z pierwotnym przeciwciałem anty serotoninowym.

Następnego dnia powtórz sześć płukań PPT, a następnie inkubację przeciwciał wtórnych w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 90 minut. Użyj od jednego do 400 pięter Alexa 5 68 kozy anty-US lub jednego do 400 anty królików IgG. Usuń przeciwciało drugorzędowe w reżimie płukania PBT, a następnie inkubuj jelita w czteromilimolowym węglanie sodu, delikatnie kołysząc przez 10 minut.

Jelita można następnie zamontować w 4% N galusanu propylu z 20 milimolowym węglanem sodu jako buforem i oglądać pod fluorescencją w powiększeniu 400 razy w celu analizy. Unikaj robienia zdjęć na tylnym końcu sprawdzonych komór, ponieważ włókna te są ciasno związane. Więcej włókien tylnych w jelicie środkowym jest bardziej rozgałęzionych, ponieważ fascynują się, gdy dostaną się do tkanki.

Włókna neurytowe można określić ilościowo za pomocą komercyjnego oprogramowania, takiego jak neuro lucita i neuro Explorer, opracowując je ręcznie lub za pomocą ogólnodostępnego oprogramowania. Proste obrazy znacznika nerytu, które nie są wyraźne, utrudnią odróżnienie włókna od żylaków i nie powinny być używane, jeśli architektura światłowodu jest wyraźnie odróżnialna od tła. A jeśli można zidentyfikować indywidualne żylaki na całej długości neritu, preparat nadaje się do analizy.

Ponadto, jeśli poszczególne żylaki można zidentyfikować na podstawie reszty włókna, jest to kolejny wskaźnik jakości obrazu do analizy. Włókna aksonalne wystające z mózgu są zwinięte w nerw nawrotowy i nie nadają się do analizy, dopóki nie dotrą do sprawdzonej komory, gdzie oddzielają się i unerwiają. Parowy układ żołądkowy Przeanalizuj wszystkie włókna z wyjątkiem tych, które znajdują się poza zakresem ostrości.

W niektórych przypadkach włókna zakrzywiają się między wieloma płaszczyznami ostrości, śledzą poszczególne projekcje włókien od mózgu do sprawdzonych komór i liczą żylaki i gałęzie, a następnie obliczają częstotliwość dużych żylaków na jednostkę długości. Badanie serotoninergicznego obwodu żywieniowego jest skuteczne w analizie wpływu poszczególnych czynników na rozwój układu nerwowego. Określając ilościowo szybkość karmienia, możliwe jest powiązanie architektury aksonalnej obwodu zasilającego z jego funkcjonalnym wyjściem.

Test lokomotoryczny nie wykazuje różnicy w reakcjach lokomotorycznych między genotypami kontrolnymi i zmutowanymi. Jeśli mutacje wpływają tylko na obwód karmienia, zmutowane ciało elipsoidalne otwiera się. EBO 3 ma defekt strukturalny w elipsoidalnym ciele kompleksu centralnego.

Szczep rodzicielski typu dzikiego. CSWU ujawniło, że EO 3 powoduje depresję karmienia, podczas gdy lokomocja nie jest zaburzona. Wady rozwojowe mutantów EO three wpłynęły na architekturę moczanu w jelitach.

Larwy te wykazywały więcej rozgałęzień, a także więcej żylaków, zarówno małych, jak i dużych, na całej długości moczanu. Zwróć uwagę na węzły gałęzi na strzałkach, żylaki na grotach strzał i duże żylaki na gwiazdce. Te zmiany w rozgałęzieniach neuronalnych zostały określone ilościowo do analizy statystycznej.

Podejmując się tej procedury, należy pamiętać, aby nie uszkodzić larw ani wypreparowanych próbek tkanek.