Name: Podwiązanie jelita ślepego i sepsa wywołana nakłuciem jako model do badania autofagii u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-09T22:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Poznaj metodę podwiązania jelita ślepego i nakłucia do wywołania sepsy u myszy w celu badania autofagii w tkankach. Technika ta pozwala analizować formowanie autofagosomów w płucach, wątrobie i nerkach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez NIH granty P01 HL108801, R01-HL60234, R01-HL55330, R01-HL079904, dla A. M. K. Choi. S. Ryter otrzymał wsparcie płacowe od Instytutu Badań nad Układem Oddechowym Lovelace.

Uwaga: Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Brigham and Women's Hospital/ Harvard Medical School Area zatwierdził następujące procedury.
1. Podwiązanie i nakłucie jelita ślepego
Użyj myszy o tym samym pochodzeniu (C57Bl/6), samce, 8-10 tygodni. Samice myszy są bardziej odporne niż samce na śmiertelność wywołaną sepsą. Myszy starsze niż 8 tygodni dają mniej zmienne wyniki niż młodsze myszy pod względem przeżycia po CLP. Do analizy przeżycia należy użyć około N = 10 myszy na porównywaną grupę. N = 3-5 myszy jest odpowiednie do testów autofagii.
<ol>
	<li>Używaj sterylnych małych narzędzi chirurgicznych (tj. skalpela, nożyczek i kleszczy anatomicznych), które powinny być odpowiednie do operacji gryzoni</li>.
	<li>Przygotuj mieszaninę znieczulającą: Do 7,95 ml PBS dodać 150 μl ksylazyny (AnaSed iniekcja 100 mg/ml) i 700 μl ketaminy (Ketaset CIII, 100 mg/ml).</li>
	<li>Aby zapewnić aseptyczne warunki podczas zabiegu, należy nosić rękawiczki, maskę na twarz i fartuch chirurgiczny.</li>
	<li>Waż zwierzęta. Znieczulić je, wstrzykując dootrzewnowo (i.p.) mieszaninę wymienioną w kroku 3 w dawce μl (10x masa ciała w g). Na przykład myszy o wadze 22 g należy podać 10x22= 220 μl mieszaniny znieczulającej. Zatem końcowe dawki ksylazyny i ketaminy wynoszą odpowiednio 17 i 80 mg/kg masy ciała. Upewnij się, że znieczulenie jest odpowiednie; Po uszczypnięciu palca u nogi nie powinno dojść do zgięcia kończyny. Uwaga: Użyj maści okulistycznej na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.</li>
	<li>Ułóż zwierzęta na czystej powierzchni roboczej na ich grzbietach. Ogony i tylne łapy są skierowane w stronę badacza. Zdezynfekuj skórę brzucha za pomocą alkoholu (70% roztwór EtOH). nuta: Obszar operacyjny powinien być całkowicie ogolony, aby uniknąć zanieczyszczenia rany w wyniku kontaktu z sierścią. Ponadto, optymalnie, należy użyć podkładki z krążącą ciepłą wodą, aby utrzymać normotermię znieczulonych myszy podczas operacji.</li>
	<li>Za pomocą skalpela wykonaj małe podłużne nacięcie skóry równolegle i około 1 cm w lewo do linii środkowej. Nie wnikać jeszcze do jamy otrzewnej. Użyj małych nożyczek, aby przedłużyć początkowe nacięcie.</li>
	<li>Zidentyfikuj mięśnie brzucha i wypreparuj je, aby uzyskać dostęp do jamy otrzewnej.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy anatomicznych zidentyfikuj jelito ślepe i wynieś je z jamy otrzewnej. Należy uważać, aby nie uszkodzić naczyń krwionośnych krezki (może to prowadzić do śmiertelnego krwotoku).</li>
	<li>Zwiąż 60% jelita ślepego, aby osiągnąć sepsę średniego stopnia. Podwiązanie równe lub więcej niż 75% jelita ślepego na ogół powoduje posocznicę o wysokim stopniu złośliwości, podczas gdy podwiązanie równe lub mniejsze niż 25% jelita ślepego powoduje posocznicę o niskim stopniu złośliwości. Należy uważać, aby nie podwiązać zastawki krętniczo-kątniczej (może to zablokować ciągłość jelitową).</li>
	<li>Za pomocą igły 21 G należy przebić jelito ślepe przez jedno nakłucie na wylot (dwa otwory) w pobliżu podwiązania. Kierunek perforacji powinien być od krezki do antykrezkowej strony jelita ślepego. Uważaj, aby nie przebić naczyń krwionośnych krezki.</li>
	<li>Wyjąć igłę. Delikatnie ściśnij podwiązane jelito ślepe, aby potwierdzić drożność przez dwa otwory; Należy przez nie wytłaczać tylko niewielką ilość kału.</li>
	<li>Przenieś podwiązane i przebite jelito ślepe do jamy otrzewnej. Uwaga: W przypadku myszy pozorowanych pomiń kroki 1.10-1.12.</li>
	<li>Użyj jedwabnych szwów chirurgicznych 6-0 z igłą tnącą, aby zamknąć mięśnie brzucha. Użyj jedwabnych szwów chirurgicznych 6-0 z igłą tnącą, aby zamknąć skórę brzucha.</li>
	<li>Wstrzyknąć 1 ml wstępnie podgrzanej (37 °C) soli fizjologicznej w celu uzupełnienia ciepła i nawodnienia utraconych podczas zabiegu. Umieść myszy pod lampą grzewczą do czasu ich reanimacji. Uwaga: Optymalnie zamiast lampy grzewczej można użyć bezpieczniejszego urządzenia grzewczego (takiego jak podkładka z cyrkulacyjną ciepłą wodą).</li>
	<li>Po operacji wstrzyknąć buprenorfinę (0,05 mg/kg masy ciała s.c.) w celu uzyskania znieczulenia. nuta: Zwierzę nie powinno być pozostawione bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą mostka. Zwierzę, które zostało poddane leczeniu chirurgicznemu, nie powinno być zwracane do towarzystwa innych zwierząt, dopóki nie zostanie w pełni wyleczone.</li>
	<li>Umieść zwierzęta z powrotem w klatkach z nieograniczonym dostępem do jedzenia i wody. Myszy zostaną poddane eutanazji, gdy staną się w stanie agonalnym (na co wskazują objawy kliniczne, takie jak brak ruchu po dotknięciu lub sinica). Sprawdzaj myszy co 4 godziny, aby uniknąć ich śmierci przed eutanazją.</li>
</ol>
2. Pobieranie i utrwalanie tkanek
<ol>
	<li>Przygotuj 4% roztwór paraformaldehydu (PFA): Do 889 ml PBS dodaj 111 ml 37% PFA.</li>
	<li>Ofiaruj myszy za pomocą narkozy indukowanej CO2 lub roztworu ketaminy/ksylazyny w wysokiej dawce.</li>
	<li>Unieruchom myszy na czystej powierzchni roboczej. Spryskaj skórę brzucha i klatki piersiowej 70% roztworem EtOH, aby ją zdezynfekować.</li>
	<li>Za pomocą skalpela i małych nożyczek usuń skórę brzucha i klatki piersiowej, a także skórę pokrywającą obszar tchawicy.</li>
	<li>Odsłoń tchawicę, usuwając otaczające ją tkanki (mięśnie i tkankę łączną).</li>
	<li>Założyć szew (bez igły tnącej) wokół tchawicy. Nie dokręcaj go jeszcze.</li>
	<li>Użyj małego cewnika do żył obwodowych (20 G) do "intubacji" tchawicy. Zachowaj ostrożność podczas wprowadzania cewnika, aby uniknąć rozerwania tchawicy. Należy pamiętać, że największa średnica tchawicy znajduje się tuż poniżej chrząstki pierzastego.</li>
	<li>Zaciśnij szew wokół tchawicy/cewnika. Wyjąć igłę, pozostawiając tylko plastikową kaniulę cewnika do tchawicy. Igła służyła jedynie jako prowadnik do wprowadzania plastikowej kaniuli.</li>
	<li>Po zamocowaniu plastikowej kaniuli w tchawicy, przetnij mięśnie brzucha, otwórz brzuch i odsłoń przeponę.</li>
	<li>Za pomocą igły nakłuć przeponę, aby wytworzyć odmę opłucnową (tj. wprowadzenie powietrza do jamy opłucnej). Płuca powinny być wtedy zapadnięte.</li>
	<li>Za pomocą małych nożyczek usuń przeponę, przetnij wzdłuż mostka (sternotomia), usuń klatkę piersiową i odsłoń serce i płuca.</li>
	<li>Przez plastikową kaniulę wprowadzoną do tchawicy utrwalić płuca roztworem formaldehydu pod ciśnieniem 30 cmH2O.</li>
	<li>Usuń płuca i umieść je w 4% PFA na 24 godziny, a następnie w 70% roztworze EtOH do czasu przetworzenia.</li>
	<li>Zidentyfikuj i usuń serce, wątrobę i nerki. W ten sam sposób umieść je w 4% PFA na 24 godziny, a następnie w 70% roztworze EtOH do czasu przetworzenia.</li>
</ol>
3. Myszy GFP i wyświetlanie slajdów GFP
<ol>
	<li>Wykonaj CLP i pozorowaną operację na myszach GFP-LC3 zgodnie z opisem w kroku 1 oraz procedury pooperacyjne zgodnie z opisem w kroku 2 protokołu.</li>
	<li>Zanurzyć tkanki (tj. płuca, serce, wątrobę i nerki) w parafinie i pociąć je na szeregowe odcinki 5 μm.</li>
	<li>Gdy jest gotowy do barwienia GFP, inkubować w temperaturze 60 °C przez 30-60 minut, aż parafina się rozpuści, a tkanka stanie się przezroczysta.</li>
	<li>Odparafinować standardową serią stopniowanych ksylenów lub substytutów ksylenu, 5 min ksylenu 1, ksylenu 2 i ksylenu 3, następnie inkubować 3 minuty w stopniowanych seriach EtOH: 100%, 95%, 75%, a następnie spłukać w wodzie destylowanej. 
	nuta: Po deparafinowaniu należy unikać wysuszenia tkanek, co zwiększa tło próbki.</li>
	<li>Pobrać antygen za pomocą buforu kwasu cytrynowego (10 mM kwasu cytrynianu sodu, 0,05% Tween 20, pH 6,0), podgrzewając w kuchence mikrofalowej przez 10-20 minut. Należy uważać, aby okresowo wymieniać bufor, aby uniknąć wysuszenia tkanek.</li>
	<li>Pozostaw roztwór do ostygnięcia przez 20 minut na stole, aby zakończyć pobieranie antygenu.</li>
	<li>Umyć 2-3x PBS. Usuń nadmiar bufora i przenieś szkiełka z pozycji zębatej do pozycji poziomej w pudełku na suwaki lub innej wilgotnej komorze, aby zapobiec wysuszeniu.</li>
	<li>Blokuj 45-60 minut w temperaturze pokojowej z 10% normalną surowicą osła (również 5% albuminy surowicy bydlęcej lub najlepiej surowicy zwierzęcej, u której wytworzono przeciwciało drugorzędowe) w PBS.</li>
	<li>Próbki inkubować w pierwszorzędowym przeciwciałie GFP w rozcieńczeniu 1:100 w PBS przez noc w temperaturze 4 °C w wilgotnej komorze. Delikatnie nałóż małe kawałki Parafilmu na tkankę z przeciwciałem, aby zapewnić jednorodny kontakt z tkanką i zapobiec parowaniu. 
	nuta: Pozostałe kroki wykonuje się w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przemyć 5x PBS, aby usunąć nadmiar przeciwciał pierwszorzędowych. Inkubować z przeciwciałem drugorzędowym 1:500-1:1,000 w PBS przez 1-2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przemyć 5x PBS, aby usunąć nadmiar przeciwciał drugorzędowych. W razie potrzeby na tym etapie przeciwplamić szkiełka.</li>
	<li>W przypadku stosowania fluorescencyjnego przeciwciała drugorzędowego inkubuj 0,1% Sudan Black w 70% EtOH przez 15-20 minut, aby zmniejszyć autofluorescencję. Zetrzyj nadmiar Sudan Black z okolic chusteczki i przemyj 5x PBS przez 20 min.</li>
	<li>Zamocuj próbkę za pomocą szkiełka nakrywkowego i przechowuj poziomo, aż roztwór montażowy stwardnieje.</li>
</ol>
4. Alternatywny protokół: Bezpośrednie wykrywanie GFP-LC3
<ol>
	<li>Kanuluj i napompuj płuca za pomocą ~500 ml 50/50 v/v OCT PBS.</li>
	<li>Osadź w OCT, umieszczając niewielką ilość OCT na dnie krioformy.</li>
	<li>Ostrożnie umieść wypreparowany kompleks płuc w formie.</li>
	<li>Powoli zamrażać nad metylobutanem schłodzonym przy użyciu suchego lodu.</li>
	<li>Dodaj więcej OCT, aż tkanka zostanie całkowicie pokryta i zamrożona w stanie stałym. Przechowywać na suchym lodzie w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Za pomocą kriomikrotomu wyciąć odcinki o grubości 5-10 μm, chroniąc je przed światłem. Skrawki i pozostałą tkankę przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Aby przygotować preparaty do obrazowania, wyjmij część z zamrażarki i natychmiast nałóż kroplę PBS, aby zapobiec wysuszeniu.</li>
	<li>Utrwal na 30 minut z 4% PFA. Umyć PBS.</li>
	<li>Stosować DAPI/Hoescht przez 10 min. Umyć 3x PBS.</li>
	<li>Zamocuj próbkę za pomocą szkiełka nakrywkowego i przechowuj poziomo, aż roztwór montażowy stwardnieje.</li>
	<li>Obraz za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego lub konfokalnego. Próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do jednego miesiąca.</li>
</ol>
5. Przygotowanie tkanki do mikroskopii elektronowej
<ol>
	<li>Pokrój tkanki w kostkę o grubości około 1 mm w celu utrwalenia.</li>
	<li>Utrwal tkankę w 2% formaldehydzie, 2,5% aldehydzie glutarowym w 0,1 M buforze kakodylanu sodu, pH 7,4.</li>
	<li>Przemyć 0,1 M buforem kakodylanu sodu przez 1-2 godz. 
	nuta: Utrwalona tkanka może być przechowywana w 0,1 M kakodylanu sodu w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Post fix w 1% tetratlenku osmu w 0,2 M buforze kakodylanu sodu przez 1 godzinę.</li>
	<li>Płukać w 0,2 M buforze kakodylanu sodu przez 10 min 3x.</li>
	<li>Odwodnić w 70% EtOH, 20 min 2x. Odwodnić w 90% EtOH, 10 min 2x. Odwodnić w 100% EtOH, 20 min 2x.</li>
	<li>Inkubować z tlenkiem propylenu (epoksydowo-propanem) przez 10 minut 2x.</li>
	<li>Inkubować z mieszaniną tlenku propylenu i żywicy epoksydowej (50:50) przez 1 godzinę. Mieszanina żywic epoksydowych to: 24 g żywicy Agar 100, 13 g bezwodnika dodecenylobursztynowego, 13 g bezwodnika metylonadynowego i 1 ml N-benzylodimetyloaminy. Dokładnie wymieszaj w jednorazowej zlewce za pomocą drewnianej szpatułki.</li>
	<li>Inkubować z żywicą epoksydową przez noc w niezakorkowanych fiolkach (pozwala to na odparowanie pozostałego tlenku propylenu).</li>
	<li>Zatopić w oznakowanych kapsułkach ze świeżo przygotowaną żywicą. Polimeryzować w temperaturze 60 °C przez 48 godzin.</li>
	<li>Sfotografować skrawki tkanek za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego przy napięciu 80 lub 60 kV na film mikroskopu elektronowego. Wydrukuj obrazy na papierze fotograficznym lub przechowuj jako nośnik cyfrowy.</li>
	<li>Przeanalizuj tworzenie autofagosomów w nienaruszonych komórkach zawierających jądro. Pola o małej mocy (np. 2000-4000X) mogą być używane do identyfikacji komórek jądrzastych. Zazwyczaj do tej kwantyfikacji autofagosomów używa się obrazów 6,800-10,000X. Policz autofagosomy na jednostkę powierzchni z 15-30 pól, aby uzyskać odpowiednią reprezentację statystyczną. Autofagosomy mają strukturę podwójnej błony, gdzie autofogosomy w późnym stadium przypominały wypełnione wakuole.</li>
</ol>

<ol><li>Hotchkiss, R. S., Karl, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathology+and+treatment+of+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">The pathology and treatment of sepsis.</a> N. Engl. J. Med. 348, 138-150 (2003).</li>
<li>Anaya, D. A., Nathens, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risk+factors+for+severe+sepsis+in+secondary+peritonitis%5BTitle%5D)+AND+%22Surg.+Infect%22%5BJournal%5D)">Risk factors for severe sepsis in secondary peritonitis.</a> Surg. Infect. 4, 355-362 (2003).</li>
<li>Bone, R. C., Grodzin, C. J., Balk, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sepsis%3A+A+new+hypothesis+for+pathogenesis+of+the+disease+process%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">Sepsis: A new hypothesis for pathogenesis of the disease process.</a> Chest. 112, 235-243 (1997).</li>
<li>Rivers, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+goal-directed+therapy+in+the+treatment+of+severe+sepsis+and+septic+shock%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med.%22%5BJournal%5D)">Early goal-directed therapy in the treatment of severe sepsis and septic shock.</a> N. Engl. J. Med.. Med, shock.N. .E. ngl.J. . 345, 1368-1377 (2001).</li>
<li>Deitch, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+models+of+intra-abdominal+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Rodent models of intra-abdominal infection.</a> Shock. 24 (Suppl 1), 19-23 (2005).</li>
<li>Raven, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+models+of+sepsis+found+shockingly+lacking%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Rodent models of sepsis found shockingly lacking.</a> Nat. Med. 18, 998 (2012).</li>
<li>Levine, B., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+the+pathogenesis+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Autophagy in the pathogenesis of disease.</a> Cell. 132, 27-42 (2008).</li>
<li>Virgin, H. W., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+genes+in+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Autophagy genes in immunity.</a> Nat. Immunol. 10, 461-470 (2009).</li>
<li>Mizushima, N., Komatsu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy%3A+renovation+of+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Autophagy: renovation of cells and tissues.</a> Cell. 147, 728-741 (2011).</li>
<li>Choi, A. M., Ryter, S. W., Levine, B. Autophagy in human health and disease. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChoi%2C+AM+%22N.+Engl.+J.+Med%22">N. Engl. J. Med</a>. 368, 651-662 (2013).</li>
<li>Haspel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+macroautophagic+flux+in+vivo+using+a+leupeptin-based+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Characterization of macroautophagic flux in vivo using a leupeptin-based assay.</a> Autophagy. 7, 629-642 (2011).</li>
<li>Chen, Z. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Egr-1+regulates+autophagy+in+cigarette+smoke-induced+chronic+obstructive+pulmonary+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLos+One%22%5BJournal%5D)">Egr-1 regulates autophagy in cigarette smoke-induced chronic obstructive pulmonary disease.</a> PLos One. 3, 3313 (2008).</li>
<li>Kim, H. P., Chen, Z. H., Choi, A. M., Ryter, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+autophagy+in+clinical+tissues+of+lung+and+vascular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Meth.+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Analyzing autophagy in clinical tissues of lung and vascular diseases.</a> Meth. Enzymol. 453, 197-216 (2009).</li>
<li>Flierl, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adverse+functions+of+IL-17A+in+experimental+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Adverse functions of IL-17A in experimental sepsis.</a> FASEB J. 22, 2198-2205 (2008).</li>
<li>Rittirsch, D., Huber-Lang, M. S., Flierl, M. A., Ward, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunodesign+of+experimental+sepsis+by+cecal+ligation+and+puncture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Immunodesign of experimental sepsis by cecal ligation and puncture.</a> Nat. Protoc. 4, 31-36 (2009).</li>
<li>Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+mammalian+autophagy+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Methods in mammalian autophagy research.</a> Cell. 140, 313-326 (2010).</li>
<li>Wang, L., Ma, R., Flavell, R. A., Choi, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+mitogen-activated+protein+kinase+kinase+3+%28MKK3%29+for+activation+of+p38%CE%B1+and+p38%CE%B4+MAPK+isoforms+by+TGF-%CE%B21+in+murine+mesangial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Requirement of mitogen-activated protein kinase kinase 3 (MKK3) for activation of p38α and p38δ MAPK isoforms by TGF-β1 in murine mesangial cells.</a> J. Biol. Chem. 277, 47257-47262 (2002).</li>
<li>Ding, Y., Kim, J. K., Kim, S. I., Na, H. J., Jun, S. Y., Lee, S. J., Choi, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%7Bbeta%7D1+protects+against+mesangial+cell+apoptosis+via+induction+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">TGF-{beta}1 protects against mesangial cell apoptosis via induction of autophagy.</a> J Biol Chem. 285, 37909-37919 (2010).</li>
<li>Baker, C. C., Chaudry, I. H., Gaines, H. O., Baue, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+factors+affecting+mortality+rate+after+sepsis+in+a+murine+cecal+ligation+and+puncture+model%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery%22%5BJournal%5D)">Evaluation of factors affecting mortality rate after sepsis in a murine cecal ligation and puncture model.</a> Surgery. 94, 331-335 (1983).</li>
<li>Godshall, C. J., Scott, M. J., Peyton, J. C., Gardner, S. A., Cheadle, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+background+determines+susceptibility+during+murine+septic+peritonitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Surg.+Res%22%5BJournal%5D)">Genetic background determines susceptibility during murine septic peritonitis.</a> J. Surg. Res. 102, 45-49 (2002).</li>
<li>Carchman, E. H., Rao, J., Loughran, P. A., Rosengart, M. R., Zuckerbraun, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heme+oxygenase-1-mediated+autophagy+protects+against+hepatocyte+cell+death+and+hepatic+injury+from+infection%2Fsepsis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Heme oxygenase-1-mediated autophagy protects against hepatocyte cell death and hepatic injury from infection/sepsis in mice.</a> Hepatology. 53, 2053-2062 (2011).</li>
<li>Lo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lc3+over-expression+improves+survival+and+attenuates+lung+injury+through+increasing+autophagosomal+clearance+in+septic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Surg%22%5BJournal%5D)">Lc3 over-expression improves survival and attenuates lung injury through increasing autophagosomal clearance in septic mice.</a> Ann. Surg. 257, 352-363 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konkurencyjnych interesów finansowych, które mogliby zadeklarować

Główną zaletą CLP jest to, że pozwala naukowcom badać sepsę o różnym nasileniu (tj. od niskiego, przez średnie, aż do wysokiego stopnia). Na nasilenie posocznicy indukowanej ma wpływ długość podwiązanego jelita ślepego (co jest najważniejszym wyznacznikiem), wielkość igły użytej do nakłucia oraz liczba wykonanych otworów15. Ponadto szczep myszy i płeć mogą mieć wpływ na nasilenie sepsy; Niektóre szczepy są bardziej podatne niż inne, a samce są na ogół bardziej podatne niż samice19,20. Powyż...

Sepsa, ogólnoustrojowa reakcja zapalna na infekcję, stanowi główną przyczynę zgonów u pacjentów w stanie krytycznym1. Zakażenia wewnątrzbrzuszne, często prowadzące do sepsy wielodrobnoustrojowej, stanowią 20% przypadków sepsy, które charakteryzują się znaczną śmiertelnością sięgającą nawet 60%2. Śmiertelność związana z sepsą wynika przede wszystkim z dysfunkcji wielonarządowej z późniejszą niewydolnością narządową3,4. Pilnie potrzebne są dodatkowe badania nad mechanizmem patogennym tej choroby, aby wspierać rozwój nowych i skuteczniejszych terapii.
Metoda podwiązania i nakłucia jelita ślepego (CLP) jest powszechnie stosowaną procedurą do modelowania sepsy in vivo. Ponieważ jelito ślepe jest pełne bakterii, jego nakłucie powoduje wielobakteryjne zapalenie otrzewnej, translokację bakterii do krwi (bakteriemia), wstrząs septyczny, dysfunkcję wielonarządową i ostatecznie śmierć5. Powszechnie przyjmuje się, że CLP odzwierciedla rzeczywistość kliniczną dokładniej niż poprzednie techniki, takie jak wstrzykiwanie endotoksyny lub nawet oczyszczonych bakterii gryzoniom, dlatego CLP jest uważany za złoty standard (choć nie bez ograniczeń)6 dla indukcji eksperymentalnej, a co za tym idzie, badania patogenezy sepsy. W niniejszej monografii opisano protokoły mające na celu ocenę, czy mechanizmy chorobowe sepsy obejmują autofagię.
Autofagia, ewolucyjnie zachowany proces komórkowy, ułatwia obrót uszkodzonych białek i organelli, takich jak mitochondria, i odgrywa ważną rolę w usuwaniu wewnątrzkomórkowych patogenów, w tym bakterii7,8. Podczas autofagii białka cytozolowe lub organelle są sekwestrowane w pęcherzyki związane z podwójną błoną zwane autofagosomami, które są następnie dostarczane do lizosomów w celu degradacji9. Szereg białek zostało zidentyfikowanych jako ssacze homologi genów związanych z autofagią (Atg), pierwotnie zidentyfikowanych w drożdżach, które regulują proces autofagii. Konwersja łańcucha lekkiego 3B związanego z białkiem-1 związanym z mikrotubulami (LC3B) (homolog Atg8) z LC3B-I (forma wolna) do LC3B-II (forma sprzężona z fosfatydyloetanoloaminą) stanowi główny krok w tworzeniu autofagosomów9. Dysfunkcja autofagiczna jest związana ze starzeniem się i chorobami człowieka, w tym rakiem i zaburzeniami neurodegeneracyjnymi10. Ponadto autofagia wpływa na odporność wrodzoną i nabytą, taką jak prezentacja antygenu, rozwój limfocytów i wydzielanie cytokin przez komórki odpornościowe8. W związku z tym wydaje się rozsądne, że autofagia może również odgrywać rolę w ogólnoustrojowej odpowiedzi zapalnej na zakażenie (tj. w sepsie).
Do tej pory opisano kilka metod oceny roli autofagii w uszkodzeniach tkanek in vivo. Obejmują one zastosowanie białka zielonej fluorescencji (GFP)-LC3 eksprymującego myszy oraz ilościowe oznaczanie autofagosomów w tkance za pomocą mikroskopii elektronowej (te dwie metody opisano w niniejszej monografii). Dodatkowe metody obejmują kwantyfikację ekspresji białek autofagicznych w homogenatach tkankowych oraz analizę strumienia autofagicznego (jak opisano w innym miejscu)11-13. Celem niniejszego przeglądu jest przedstawienie aktualnych protokołów oceny autofagii in vivo w kontekście eksperymentalnej sepsy.

<table><tbody><tr><td>GFP-LC3 Transgeniczne myszy</td><td>Riken (Japonia</td> <td>RBRC00806</td><td>GFP-LC3#53</td></tr><tr><td>Ksylazyna</td><td>Henry-Schein</td><td>568-0606</td><td>Ksylazyna HCl do wstrzykiwań Vet</td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Henry-Schein</td><td>995-2949</td><td>Ketaset Inj 100 mg / ml</td></tr><tr><td>EtOH</td><td>Fisher</td><td>A405-20</td><td>Klasa histologiczna</td></tr><tr><td>EtOH</td><td>Fisher</td><td>A407-1</td><td>do sterylizacji</td></tr><tr><td>jedwabne szwy chirurgiczne 6-0</td><td>Owens & Minor</td><td>2300-0078OG, 017624</td><td></td></tr><tr><td>buprenorfina-HCl</td><td>Henry-Schein</td><td>614-5157</td><td>Buprenex Ampułki</td></tr><tr><td>roztwór paraformaldehydu (37%)</td><td>JT Baker</td><td>S898-09</td><td></td></tr><tr><td>ksyleny</td><td>Fisher</td><td>X3P-1GAL </td><td></td></tr> przeciwciało <tr><td>monoklonalne anty-GFP</td><td>Life Technologies</td><td>G10362</td><td></td></tr><tr><td>Hoescht</td><td>Sigma</td><td>944403</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>OCT</td><td>VWR scientific</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>Sudan Black</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-203760</td><td></td></tr><tr><td>EM grade Aldehyd glutarowy 2,5% w kakodylan sodu</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>15960</td><td></td></tr><tr><td>tlenek propylenu</td><td>Żywica Sigma</td><td>240397</td><td></td></tr><tr><td>Agar 100</td><td>Agar scientific</td><td> R1045</td><td></td></tr><tr><td>bezwodnik dodecenylsztynowy</td><td>Sigma</td><td>46346</td><td></td></tr><tr><td>bezwodnik metylonadowy</td><td>Sigma</td><td>45359</td><td></td></tr><tr><td>N-benzylodimetyloamina</td><td>Sigma</td><td>185582</td><td></td></tr></tbody></table>

podwiązanie jelita ślepego i sepsa wywołana nakłuciem jako model do badania autofagii u myszy

Cecal Ligation and Puncture-induced Sepsis as a Model To Study Autophagy in Mice

Eksperymentalna sepsa może być wywołana u myszy za pomocą metody podwiązania i nakłucia jelita ślepego (CLP), która powoduje posocznicę wielomikrobiologiczną. W tym przypadku zapewniony jest protokół indukowania sepsy o różnym nasileniu u myszy przy użyciu techniki CLP. Autofagia jest podstawową reakcją tkanek na stres i inwazję patogenów. Przedstawiono tu również dwa aktualne protokoły oceny autofagii in vivo w kontekście eksperymentalnej sepsy. (I) Transgeniczne myszy eksprymujące białko fuzyjne białka zielonej fluorescencji (GFP)-LC3 są poddawane CLP. Miejscowe wzmocnienie sygnału GFP (puncta), oceniane za pomocą testów immunohistochemicznych lub konfokalnych, może być stosowane do wykrywania zwiększonego tworzenia autofagosomów, a tym samym zmienionej aktywacji szlaku autofagii. (II) Zwiększone tworzenie autofagicznej wakuoli (autofagosomu) na jednostkę powierzchni tkanki (jako marker stymulacji autofagii) można określić ilościowo za pomocą mikroskopii elektronowej. Badanie autofagicznych odpowiedzi na sepsę jest kluczowym elementem zrozumienia mechanizmów, za pomocą których tkanki reagują na zakażenie. Wyniki badań w tej dziedzinie mogą ostatecznie przyczynić się do zrozumienia patogenezy sepsy, która stanowi poważny problem w medycynie intensywnej terapii.

Bakteremia występuje u myszy już 6 h po sepsie wywołanej przez CLP14. Objawy kliniczne sepsy (w tym dreszcze, tachypnoe i upośledzona aktywność ruchowa) pojawiają się około 12 h po zabiegu. Myszy poddane CLP zaczynają ginąć około 18 h po indukcji zapalenia otrzewnej. Im cięższy przebieg sepsy, tym wyższa śmiertelność15. Szczegółowo, sepsa o wysokim stopniu ciężkości powoduje 100% śmiertelność w ciągu 2-3 dni, podczas gdy sepsa o średnim stopniu ciężkości skutkuje około 60% śmiertelnością w 7 dni po ...

Eksperymentalna sepsa może być wywołana u myszy za pomocą metody podwiązania i nakłucia jelita ślepego (CLP). Aktualne protokoły oceny autofagii in vivo w kontekście sepsy wywołanej CLP przedstawiono tutaj: Protokół pomiaru autofagii przy użyciu myszy (GFP)-LC3 oraz protokół pomiaru tworzenia autofagosomów za pomocą mikroskopii elektronowej.

Podwiązanie jelita ślepego i sepsa wywołana nakłuciem jako model do badania autofagii u myszy

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method, which causes polymicrobial sepsis. Here, a protocol is ...

Ogólnym celem tej procedury jest wywołanie sepsy poprzez podwiązanie i nakłucie kątnicy u myszy w celu zbadania autofagii tkankowej, procesu homeostatycznego ułatwiającego wymianę uszkodzonych białek i organelli. Osiąga się to poprzez uprzednią identyfikację kątnicy i wyprowadzenie jej z jamy otrzewnej znieczulonej myszy. Po wyizolowaniu 60% kątnicy zostaje podwiązane, a następnie perforowane w celu wywołania zapalenia otrzewnej o średnim nasileniu.Podwiązane i nakłute jelito cienkie zostaje umieszczone z powrotem w jamie otrzewnej, a zwierzę zostaje pozostawione do rekonwalescencji. Ostatnim krokiem jest pobranie tkanek płuc, wątroby i nerek od zwierzęcia z sepsą po 24 godzinach. Ostatecznie wykorzystuje się mikroskopię elektronową, aby wykazać tworzenie się autofagosomów w nienaruszonych komórkach tkanek pobranych od zwierzęcia z sepsą.Przedstawimy metodę podwiązania i przerwania jelita krętego (CLP) jako sposób indukowania sepsy oraz badania autofagii. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z wcześniejszymi metodami, takimi jak wstrzykiwanie endotoksyny, jest jej istotność kliniczna. CLP prowadzi do zapalenia otrzewnej, które jest powszechnie znaną przyczyną sepsy polimikrobowe

cecal-ligation-puncture-induced-sepsis-as-model-to-study-autophagy

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Sepsa wywołana ligowaniem i nakłuciem cecum jako model do badania autofagii u myszy

Mysi model podwiązania i perforacji kątnicy jako wartościowe narzędzie do badania sepsy u ludzi.

Procedura ligacji i punkcji kątnicy

Sepsis to zespół ogólnoustrojowej reakcji zapalnej wynikający z infekcji mikrobiologicznej, który można symulować za pomocą techniki chirurgicznej zwanej podwiązaniem i nakłuciem kątnicy (CLP). W niniejszym opracowaniu opisujemy metodę wykorzystania modelu zwierzęcego indukowanego CLP do przesiewowego badania ziół leczniczych w celu poszukiwania czynników terapeutycznych.

Wykorzystanie modelu zwierzęcego sepsy do oceny nowych terapii ziołowych

Aby przeciwdziałać rozprzestrzenianiu się patogenów, komórki gospodarza reorganizują swój cytoszkielet, aby podzielić bakterie na grupy i wywołać autofagię. Za pomocą zakażenia Shigella komórek hodowli tkankowej identyfikowane i charakteryzowane są determinanty gospodarza i patogenu leżące u podstaw tego procesu. Korzystając z modeli zakażenia Shigella danio pręgowanego, bada się rolę odkrytych cząsteczek i mechanizmów in vivo.

Zastosowanie Shigella flexneri do badania interakcji autofagia-cytoszkielet

Tutaj przedstawiono protokół naśladowania wnikania związków pochodzenia bakteryjnego po naruszeniu bariery jelitowej. Niska subletalna dawka lipopolisacharydu została wstrzyknięta ogólnoustrojowo myszom, które były monitorowane przez 24 godziny po wstrzyknięciu. Ekspresję cytokin prozapalnych określono w kilku punktach czasowych w śledzionie, wątrobie i okrężnicy.

Wstrzykiwanie lipopolisacharydu myszom w celu naśladowania wnikania produktów pochodzenia mikrobiologicznego po naruszeniu bariery jelitowej

Tutaj opisany jest prosty i dobrze sprawdzony protokół pomiaru masowej aktywności sekwestracji autofagicznej w komórkach ssaków. Metoda opiera się na ilościowym określeniu proporcji dehydrogenazy mleczanowej (LDH) we frakcjach komórek sedymentacyjnych w porównaniu z całkowitymi poziomami LDH w komórkach.

Test sekwestracji dehydrogenazy mleczanowej — prosta i wiarygodna metoda określania masowej aktywności sekwestracji autofagicznej w komórkach ssaków

Ten protokół opisuje techniki pomiaru wyników infekcji leżących u podstaw wtórnych zakażeń szpitalnych w stanie immunosupresyjnym, najpierw poprzez ustalenie podwiązania/nakłucia jelita ślepego, a następnie prowokację ich infekcją donosową, aby stworzyć klinicznie istotny model sepsy immunosupresyjnej.

Projektowanie podwiązania i nakłucia jelita ślepego oraz podwójnego modelu infekcji donosowej immunosupresji wywołanej sepsą

Ten protokół przedstawia szczegóły operacyjne podwiązania i nakłucia jelita ślepego (CLP) w mysim modelu sepsy. CLP jest jedną z najczęściej stosowanych technik tworzenia zwierzęcego modelu sepsy. W związku z tym do uzyskania wiarygodnych wyników badań wymagany jest ustandaryzowany protokół CLP.

Ocena wiarygodnego biomarkera w mysim modelu sepsy wywołanym podwiązaniem i nakłuciem jelita ślepego

Ten protokół opisuje indukcję monobakteryjnej sepsy Gram-ujemnej w systemie mysim. Model jest przydatny w badaniu zapalnych i śmiertelnych reakcji gospodarza podczas sepsy.

Charakterystyka septycznego zapalenia otrzewnej wywołanego przez Salmonellę Typhimurium u myszy

Ten mysi model łączy w sobie zniewagę septyczną z nieużywaniem mięśni kończyn tylnych, aby podsumować cechę typowego pacjenta z sepsą, która jest przykuta do łóżka. Model ten stanowi znaczące odejście od poprzednich modeli do badania dysfunkcji mięśni w sepsie i jest powtarzalnym podejściem do strategii terapeutycznych w leczeniu tego schorzenia.

Przedkliniczny model miopatii wywołanej sepsą z niestosowaniem u myszy

Tu przedstawiamy protokół do ustanowienia modelu immunosupresji z powodu wstrzyknięcia Klebsiella pneumoniae do nosa u myszy i zweryfikowaliśmy model za pomocą różnych wskaźników.

Ustanowienie modelu immunosupresji wywołanej przez sepsy u myszy poprzez wewnątrznosowe wprowadzanie bakterii

Poznaj metodę podwiązania jelita ślepego i nakłucia do wywołania sepsy u myszy w celu badania autofagii w tkankach. Technika ta pozwala analizować formowanie autofagosomów w płucach, wątrobie i nerkach.

Podwiązanie jelita ślepego i sepsa wywołana nakłuciem jako model do badania autofagii u myszy

Przeglądaj więcej filmów