Name: Ablacja pojedynczej komórki z ośmiokomórkowych zarodków skorupiaka z rodziny Amphipod Parhyale hawaiensis (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-16T23:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Poznaj technikę ablacji pojedynczej komórki G z ośmiokomórkowych zarodków skorupiaka Parhyale hawaiensis. Metoda umożliwia badanie komórek prekursorowych linii płciowej w embriologii skorupiaków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Rayhanowi Arifowi i Hassaanowi Shahawy'emu za pracę kamery, Tripti Gupcie i Frederike Alwes za pomoc w udoskonaleniu techniki ablacji komórek, a także członkom laboratorium Extavour za opinie na temat danych, filmów i manuskryptu. Praca ta była częściowo wspierana przez Harvard Stem Cell Institute (numer grantu Seed SG-0057-10-00), Ellison Medical Foundation (nagroda New Scholar Award numer AG-NS-07010-10) dla CBE oraz nagrody Harvard College Research Program dla ARN.

Komentarze, które mogą być pomocne w wykonaniu określonych kroków, są zaznaczone kursywą.
1. Dzień 1: Przygotowanie materiałów
<ol>
	<li>Przygotuj następujące materiały (patrz Tabela Materiałów i Wyposażenia):
	<ul>
		<li>Pipety Pasteura 15 cm i 22 cm</li>
		<li>Diamentowy skryba</li>
		<li>przefiltrowana sztuczna woda morska (zasolenie między 0,0018-0,0020) zawierająca 1 mg/ml amfoterycyny B (1:100 z 100 mg/ml roztworu podstawowego), 100 jednostek/ml penicyliny i 100 mg/ml streptomycyny (1:50 roztworu podstawowego zawierającego 5 000 jednostek/ml penicyliny i 5 000 mg/ml streptomycyny)</li>
		<li>filtrowana sztuczna woda morska (zasolenie między 0,0018-0,0020) bez dodatków</li>
		<li>duży plastikowy pojemnik do zakwaterowania par (co najmniej 15 cm x 15 cm x 5 cm)</li>
		<li>małe (3 cm lub 5 cm) szalki Petriego wyłożone Sylgardem</li>
		<li>małe (3 cm lub 5 cm) szalki Petriego</li>
		<li>szkiełko zegarkowe lub szklana płytka wielodołkowa</li>
		<li>kleszcze (używamy kleszczy pochodzących ze starych kleszczy Dumont #5, które zostały przypadkowo uszkodzone w innych procedurach laboratoryjnych, które zmieniliśmy za pomocą kamienia do ostrzenia kleszczy, aby upewnić się, że końce kleszczy są gładkie, że oba zęby są tej samej długości i że nie mają już ostrych końcówek. Niezwykle cienkie kleszcze, takie jak nowe kleszcze Dumont #5, są niepożądane, ponieważ mogą uszkodzić zarodki i/lub samice.)</li>
		<li>pipeta Pasteura z poszerzonym końcem (patrz krok 1.2 poniżej)</li>
		<li>narzędzie do pobierania zarodków składające się z cienkiego, zakrzywionego drutu wolframowego osadzonego w cienkim końcu pipety Pasteura (może być zastąpione alternatywnym narzędziem; patrz ppkt 1.3 poniżej)</li>
		<li>pipeta doustna z małym otworem (patrz krok 1.4 poniżej)</li>
		<li>szklana igła wykonana z ciągniętej szklanej kapilary (patrz krok 1.5 poniżej)</li>
	</ul>
	W protokole tym nie stosuje się materiałów toksycznych dla ludzi. Badacze powinni jednak upewnić się, że noszą rękawice lub inny strój ochronny zgodnie z wytycznymi dotyczącymi zarządzania ryzykiem obowiązującymi w ich instytucji.</li>
	<li>Aby wykonać poszerzoną pipetę Pasteura, najpierw naciąć około 15 cm pipety Pasteura w miejscu, w którym pipeta zaczyna się zwężać, za pomocą rysika diamentowego, owinąć nacięty obszar pipety w Kimwipe lub ręczniku papierowym, aby chronić palce, a następnie ostrożnie odłamać końcówkę na linii nacięcia. Przytrzymaj złamany koniec pipety nad płomieniem palnika Bunsena przez kilka sekund, aby wygładzić krawędzie. Otwór powinien być nieco węższy niż maksymalna szerokość pipety.</li>
	<li>Aby wykonać narzędzie do preparowania drutu wolframowego, włóż drut wolframowy do końca szklanej pipety Pasteura o średnicy 15 cm i przytrzymaj krótko nad płomieniem palnika Bunsena, aby stopić szkło, mocując drut na miejscu. Użyj kleszczy, aby delikatnie wygiąć koniec drutu w haczykowaty kształt. Zobacz rysunek 3, aby zapoznać się z przykładem odpowiedniego kształtu dla tego narzędzia.</li>
	<li>Aby zrobić mały otwór na pipetę doustną, przeciągnij cienką końcówkę pipety Pasteura o długości 22 cm na dwie części nad płomieniem i odłam końcówkę małego końca. Włóż do końcówki uchwytu na pipety do ust.</li>
	<li>Wykonaj szklaną igłę, która będzie używana do nakłuwania badanych blastomerów podczas procedury ablacji, za pomocą ściągacza do igieł. Igła o odpowiednim kształcie jest pokazana na rysunku 4. Igła ta została naciągnięta na ściągacz igłowy Sutter P97 za pomocą programu o parametrach 2x(ciepło = 566, ciągnięcie = 100, prędkość = 20, czas = 250) + 1X (ciepło = 566, pociągnięcie = 100, prędkość = 100, czas = 250). Konkretny program i instrument używany do wykonania igły może się różnić, ale igła musi mieć cienki czubek, a jednocześnie być wystarczająco mocna, aby nie pękła przy nacisku na kosmówkę zarodka.</li>
</ol>
2. Dzień 1: Zbieranie par godowych Parhyale
<ol>
	<li>Użyj poszerzonej pipety Pasteura (krok 1.2 powyżej), aby zebrać par P. hawaiensis z dużego pojemnika na hodowlę i przenieść je do oddzielnego pojemnika zawierającego czystą sztuczną wodę morską. Nie jest konieczne, aby ta woda morska była filtrowana. Najlepiej jest zebrać pary kryjące się późnym popołudniem i pozostawić je na noc w temperaturze pokojowej (20-23 ºC), tak aby następnego ranka większość zarodków była niedawno zapłodniona i zdeponowana, a więc we wczesnych stadiach rozszczepienia nadająca się do ablacji. Zbierz co najmniej 20 par godowych, aby upewnić się, że niektóre samice będą nosiły zarodki we wczesnej fazie rozszczepienia do następnego ranka.</li>
</ol>
3. Dzień 2: Zbieranie zarodków Parhyale
<ul>
	<li>Następnego ranka zainfauuj przefiltrowaną sztuczną wodę morską (FASW) CO2 . Niektóre samice będą pływać swobodnie od samców w nocy; zebrać te oddzielone samice i znieczulić je w FASW / CO2. Pozostałe niesparowane samce można wyjąć z pojemnika na pary godowe i przywrócić do dużej kultury. Pozostałe pary kryjące można zachować do pobrania zarodków później tego samego dnia lub następnego dnia.</li>
	<li>Przenieść pojedynczą znieczuloną kobietę z zarodkami do szkiełka zegarkowego w FASW / CO2. Wszystkie oddzielone samice prawdopodobnie złożą jaja, które będą widoczne gołym okiem jako bladoróżowe lub fioletowe sferoidy przez przezroczyste płytki biodrowe samic (ryc. 1A). Aby ustalić, czy zarodki są we wczesnym stadium rozszczepienia, a zatem nadają się do ablacji blastomerami, badacz będzie musiał usunąć zarodki z torby lęgowej i zbadać je pod mikroskopem.</li>
	<li>Oglądając zabieg pod mikroskopem preparacyjnym, chwyć kleszczem płytki biodrowe wzdłuż jednej strony ciała. Zarodki będą widoczne w brzusznej torbie lęgowej między tymi płytkami biodrowymi (ryc. 1B).</li>
	<li>Włóż cienkie, zakrzywione narzędzie druciane (Rysunek 3; krok 1.3 powyżej) do tylnego końca torby lęgowej i delikatnie podnieś drut w kierunku przedniego końca woreczka lęgowego, aby oddzielić pokrycia woreczka lęgowego (są to zmodyfikowane brzuszne przydatki zwane oostegites30), otwierając woreczek i rozluźniając zarodki. Zarodki, które znajdują się w ciągu pierwszej godziny od złożenia, są zamknięte w bardzo cienkiej, przezroczystej błonie, która łatwo zostanie przerwana przez druciane narzędzie; Błona ta znika po około 2-3 godzinach od złożenia jaj, a zarodki nie są w żaden sposób związane ze sobą ani z samicą od tego momentu przez cały okres embriogenezy. Jeśli badacze uznają, że manewrowanie zakrzywionym drucianym narzędziem do usuwania zarodków z torby lęgowej jest niewygodne lub trudne, można użyć alternatywnego narzędzia, o ile ruchy są delikatne i nie wywiera się ostrego nacisku na zarodki lub torbę lęgową. Inne narzędzia odpowiednie do usuwania zarodków z torby lęgowej to kleszcze lub szklana kapilara z uszczelnionym i wygładzonym końcem.</li>
	<li>Za pomocą niezmienionej pipety Pasteura o długości 15 cm przepłukać wodę przez otwartą torebkę z czerwiem, wypychając zarodki, które powinny osiąść na dnie szkiełka zegarka. Przenieść samicę do czystego FASW (bez CO2 ), aby umożliwić regenerację przed ponownym wprowadzeniem jej do głównej hodowli. Wiele samic można umieścić w tym samym naczyniu regeneracyjnym, ale pozwól samicom w pełni wyzdrowieć przed powrotem do głównej kultury, ponieważ mogą zostać zjedzone przez inne zwierzęta, jeśli nadal są częściowo znieczulone.</li>
	<li>Za pomocą niezmienionej pipety Pasteura o długości 15 cm przenieś zarodki na szalkę Petriego z czystym FASW i obejrzyj pod mikroskopem, aby określić ich stadium embrionalne. Oddzielne zarodki, które znajdują się w trzecim rozszczepieniu (etap 4 5), które nadają się do tej procedury. Powinno być również możliwe zastosowanie tego protokołu do każdego etapu rozszczepienia przed powstaniem krążka zarodkowego (etapy 7-8, 5).</li>
</ul>
4. Dzień 2: Ablacja pojedynczych komórek
<ol>
	<li>Wypełnij szalkę Petriego wyłożoną Sylgardem płytką warstwą FASW. Użyj niezmienionej pipety Pasteura o długości 15 cm, aby przenieść pojedynczy zarodek na płytkę.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy delikatnie przetocz zarodek, aby zidentyfikować komórkę, która ma zostać poddana ablacie (ryc. 2A i 2B). Prekursor linii zarodkowej g może być zidentyfikowany jako najmniejszy mikromer, który znajduje się na najmniejszym makromerze Mav. Ponadto g nie styka się bezpośrednio z komórką en, która jest mikromerem znajdującym się naprzeciwko niej, ponieważ prekursor mezodermy mikromery ml i mr mają wspólną granicę komórkową w środku zarodka. MR to blastomer po prawej stronie G, a ml to mikromer po lewej stronie G. Siostrzanymi makromerami mr, ml i en są prekursory ektodermy odpowiednio Er, El i Ep.</li>
	<li>Z kleszczami w lewej ręce, jeśli badacz jest praworęczny (lub w prawej ręce, jeśli badacz jest leworęczny), ustaw zarodek z komórką będącą przedmiotem zainteresowania w prawo (lub w lewo, jeśli badacz jest leworęczny) i delikatnie chwyć zarodek między kleszczami, aby go ustabilizować.</li>
	<li>Za pomocą wyciągniętej szklanej igły (krok 1.5 powyżej; Ryc. 4), delikatnie nakłuj komórkę będącą przedmiotem zainteresowania. Nie należy wkładać igły zbyt głęboko, aby nie wepchnąć igły w komórki sąsiadujące lub poniżej komórki będącej przedmiotem zainteresowania. Igła musi jedynie przebić kosmówkę i znajdującą się pod nią błonę komórkową i nie musi sięgać głęboko w komórkę, która ma zostać poddana ablacji.</li>
	<li>Zamień igłę używaną do nakłuwania zarodka na szklaną końcówkę pipety do jamy ustnej na cienką wyciągniętą końcówkę pipety Pasteura (krok 1.4 powyżej). Trzymaj końcówkę pipety blisko otworu utworzonego w interesującej nas komórce i bardzo delikatnie odsysaj.</li>
	<li>Bardzo delikatnie ściśnij zarodek kleszczami. Gdy zawartość blastomeru jest wypychana z kosmówki przez otwór utworzony w kroku 4.4, należy ją zassać do pipety ustnej, aby umożliwić niezakłócony widok zarodka. Jeśli jest wystarczająco duża, można zauważyć, że jądro przebitej komórki również się wyłania. Jest to dobra kontrola, aby upewnić się, że cała zawartość komórki została usunięta i nie można jej ponownie zregenerować.</li>
	<li>Uważnie obserwuj zarodek, gdy badany blastomer jest usuwany. Granica przebitej komórki cofnie się w kierunku w kosmówce, dzięki czemu przecięcia komórek znajdujących się pod spodem staną się widoczne. Kontynuuj wywieranie nacisku, aż cały interesujący nas blastomer zostanie usunięty. Użyj kleszczy, aby przetoczyć zarodek z boku na bok i wizualnie potwierdź, że cały interesujący nas blastomer zniknął.</li>
	<li>Za pomocą niezmienionej pipety Pasteura o długości 15 cm przenieś zarodek do czystego FASW+ (FASW + 1 mg/ml amfoterycyny B, 100 jednostek/ml penicyliny i 100 mg/ml streptomycyny).</li>
	<li>Hoduj zarodki po ablacji blastomerów w indywidualnych dołkach na czystej 48-dołkowej płytce w FASW+, zmieniając 50% FASW+ uzupełnionego antybiotykiem dziennie. W naszych rękach zarodki przeżywają i rozwijają się dobrze, nawet po ablacji, w zakresie temperatur od 18 do 28 ºC. Naukowcy powinni hodować swoje zarodki w temperaturze, dla której mają czystą (ale niekoniecznie sterylną) powierzchnię, na której mogą hodować zarodki przy minimalnych zakłóceniach. Aby móc porównać czas zdarzeń rozwojowych w zarodkach poddanych ablacji blastomerem z grupą kontrolną, odsyłamy czytelnika do szczegółowych informacji na temat stopnia zaawansowania rozwoju, które są dostępne dla zarodków hodowanych w temperaturze18 ºC 4, 25 ºC4 i 26 ºC5,6.</li>
</ol>

<ol><li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+3%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Model+Organisms%3A+A+Laboratory+Manual+Volume%22%5BJournal%5D)">Chapter 3.</a> Emerging Model Organisms: A Laboratory Manual Volume. , CSHL Press. 373-404 Forthcoming.</li>
<li>Sander, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+formation+in+insect+embryogenesis%3A+the+evolution+of+concepts+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.Insect+Morphol.+Embryol%22%5BJournal%5D)">Pattern formation in insect embryogenesis: the evolution of concepts and mechanisms.</a> Int. J.Insect Morphol. Embryol. 25, 349-367 (1997).</li>
<li>Regier, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arthropod+relationships+revealed+by+phylogenomic+analysis+of+nuclear+protein-coding+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Arthropod relationships revealed by phylogenomic analysis of nuclear protein-coding sequences.</a> Nature. 463, 1079-1083 (2010).</li>
<li>Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fate+of+isolated+blastomeres+with+respect+to+germ+cell+formation+in+the+amphipod+crustacean+Parhyale+hawaiensis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The fate of isolated blastomeres with respect to germ cell formation in the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Dev. Biol. 277, 387-402 (2005).</li>
<li>Browne, W. E., Price, A. L., Gerberding, M., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+in+the+amphipod+crustacean%2C+Parhyale+hawaiensis%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development in the amphipod crustacean, Parhyale hawaiensis.</a> Genesis. 42, 124-149 (2005).</li>
<li>Gerberding, M., Browne, W. E., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+analysis+of+the+amphipod+crustacean+Parhyale+hawaiensis+reveals+an+early+restriction+of+cell+fates%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cell lineage analysis of the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis reveals an early restriction of cell fates.</a> Development. 129, 5789-5801 (2002).</li>
<li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+and+dissection+of+Parhyale+hawaiensis+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protoc%22%5BJournal%5D)">Fixation and dissection of Parhyale hawaiensis embryos.</a> Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).</li>
<li>Price, A. L., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+divergent+mechanisms+of+mesoderm+development+in+arthropods%3A+the+expression+of+Ph-twist+and+Ph-mef2+in+Parhyale+hawaiensis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+B.+Dev.+Evol%22%5BJournal%5D)">Investigating divergent mechanisms of mesoderm development in arthropods: the expression of Ph-twist and Ph-mef2 in Parhyale hawaiensis.</a> J. Exp. B. Dev. Evol. 310, 24-40 (2008).</li>
<li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization+of+labeled+RNA+probes+to+fixed+Parhyale+hawaiensis+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protoc%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization of labeled RNA probes to fixed Parhyale hawaiensis embryos.</a> Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).</li>
<li>Browne, W. W., Schmid, B. G. M., Wimmer, E. A., Martindale, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+otd+orthologs+in+the+amphipod+crustacean%2C+Parhyale+hawaiensis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Expression of otd orthologs in the amphipod crustacean, Parhyale hawaiensis.</a> Dev. Genes Evol. 216, 581-595 (2006).</li>
<li>Prpic, N. M., Telford, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+homothorax+and+extradenticle+mRNA+in+the+legs+of+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis%3A+evidence+for+a+reversal+of+gene+expression+regulation+in+the+pancrustacean+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Expression of homothorax and extradenticle mRNA in the legs of the crustacean Parhyale hawaiensis: evidence for a reversal of gene expression regulation in the pancrustacean lineage.</a> Dev. Genes Evol. 218, 333-339 (2008).</li>
<li>Kizil, G., Havemann, J., Gerberding, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ+cells+in+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis+depend+on+Vasa+protein+for+their+maintenance+but+not+for+their+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Germ cells in the crustacean Parhyale hawaiensis depend on Vasa protein for their maintenance but not for their formation.</a> Dev. Biol. 327, 320-239 (2009).</li>
<li>Liubicich, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+Parhyale+Ultrabithorax+recapitulates+evolutionary+changes+in+crustacean+appendage+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Knockdown of Parhyale Ultrabithorax recapitulates evolutionary changes in crustacean appendage morphology.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 13892-13896 (2009).</li>
<li>Pavlopoulos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+evolution+of+appendage+specialization+by+Hox+gene+misexpression+in+an+emerging+model+crustacean%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Probing the evolution of appendage specialization by Hox gene misexpression in an emerging model crustacean.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 13897-13902 (2009).</li>
<li>Vargas-Vila, M. A., Hannibal, R. L., Parchem, R. J., Liu, P. Z., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+prominent+requirement+for+single-minded+and+the+ventral+midline+in+patterning+the+dorsoventral+axis+of+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A prominent requirement for single-minded and the ventral midline in patterning the dorsoventral axis of the crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Development. 137, 3469-3476 (2010).</li>
<li>Simanton, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+of+arthropod+midline+netrin+accumulation+revealed+with+a+cross-reactive+antibody+provides+evidence+for+midline+cell+homology%5BTitle%5D)+AND+%22Evol.+Dev%22%5BJournal%5D)">Conservation of arthropod midline netrin accumulation revealed with a cross-reactive antibody provides evidence for midline cell homology.</a> Evol. Dev. 11, 260-268 (2009).</li>
<li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+staining+of+Parhyale+hawaiensis+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protoc%22%5BJournal%5D)">Antibody staining of Parhyale hawaiensis embryos.</a> Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).</li>
<li>Pavlopoulos, A., Averof, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+genetic+transformation+for+comparative+developmental+studies+in+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Establishing genetic transformation for comparative developmental studies in the crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 7888-7893 (2005).</li>
<li>Kontarakis, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+strategy+for+gene+trapping+and+trap+conversion+in+emerging+model+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A versatile strategy for gene trapping and trap conversion in emerging model organisms.</a> Development. 138, 2625-2630 (2011).</li>
<li>Zeng, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+assembly+and+characterization+of+a+maternal+and+developmental+transcriptome+for+the+emerging+model+crustacean+Parhyale+hawaiensis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genom%22%5BJournal%5D)">De novo assembly and characterization of a maternal and developmental transcriptome for the emerging model crustacean Parhyale hawaiensis.</a> BMC Genom. 12, 581 (2011).</li>
<li>Zeng, V., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ASGARD%3A+an+open-access+database+of+annotated+transcriptomes+for+emerging+model+arthropod+species%5BTitle%5D)+AND+%22Database%22%5BJournal%5D)">ASGARD: an open-access database of annotated transcriptomes for emerging model arthropod species.</a> Database. , (2012).</li>
<li>Nestorov, P., Battke, F., Levesque, M. P., Gerberding, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Maternal+Transcriptome+of+the+Crustacean+Parhyale+hawaiensis+Is+Inherited+Asymmetrically+to+Invariant+Cell+Lineages+of+the+Ectoderm+and+Mesoderm%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">The Maternal Transcriptome of the Crustacean Parhyale hawaiensis Is Inherited Asymmetrically to Invariant Cell Lineages of the Ectoderm and Mesoderm.</a> PLoS ONE. 8, (2013).</li>
<li>Alwes, F., Hinchen, B., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+cell+lineage%2C+movement%2C+and+migration+from+germ+layer+specification+to+gastrulation+in+the+amphipod+crustacean+Parhyale+hawaiensis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Patterns of cell lineage, movement, and migration from germ layer specification to gastrulation in the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Dev. Biol. 139, 110-123 (2011).</li>
<li>Ewen-Campen, B., Schwager, E. E., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+machinery+of+germ+line+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">The molecular machinery of germ line specification.</a> Mol. Reprod. Dev. 77, 3-18 (2010).</li>
<li>Price, A. L., Modrell, M. S., Hannibal, R. L., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesoderm+and+ectoderm+lineages+in+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis+display+intra-germ+layer+compensation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mesoderm and ectoderm lineages in the crustacean Parhyale hawaiensis display intra-germ layer compensation.</a> Dev. Biol. 341, 256-266 (2010).</li>
<li>Fraser, S. E., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+metamorphosis+of+experimental+embryology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The molecular metamorphosis of experimental embryology.</a> Cell. 100, 41-55 (2000).</li>
<li>Olsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clash+of+traditions%3A+the+history+of+comparative+and+experimental+embryology+in+Sweden+as+exemplified+by+the+research+of+G%C3%B6sta+J%C3%A4gersten+and+Sven+H%C3%B6rstadius%5BTitle%5D)+AND+%22Theory+Biosci%22%5BJournal%5D)">A clash of traditions: the history of comparative and experimental embryology in Sweden as exemplified by the research of Gösta Jägersten and Sven Hörstadius.</a> Theory Biosci. 126, 117-129 (2007).</li>
<li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injection+of+Parhyale+hawaiensis+blastomeres+with+fluorescently+labeled+tracers%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protoc%22%5BJournal%5D)">Injection of Parhyale hawaiensis blastomeres with fluorescently labeled tracers.</a> Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).</li>
<li>Chaw, R., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+migration+of+cell+populations+in+the+early+gastrulation+of+the+amphipod+crustacean+Parhyale+hawaiensis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Independent migration of cell populations in the early gastrulation of the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Dev. Biol. 371, 94-109 (2012).</li>
<li>Schmitz, E. H. Crustacea Microscopic Anatomy of Invertebrates. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchmitz%2C+EH+%22Microscopic+Anatomy+of+Invertebrates%22">Microscopic Anatomy of Invertebrates</a>. Harrison, F. W. 9, Wiley-Liss, Inc.. 443-528 (1992).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisujemy protokół ręcznej ablacji i całkowitego fizycznego usunięcia pojedynczych blastomerów z wczesnych stadiów rozszczepienia amfipoda P. hawaiensis. Demonstrujemy zastosowanie tego protokołu, usuwając pojedynczą komórkę progenitorową linii zarodkowej g z zarodka w stadium ośmiokomórkowym i pokazujemy, że ablacja zakończyła się sukcesem, potwierdzając brak komórek potomnych g w późniejszej embriogenezie. Protokół ten może być stosowany do usuwania dowolnych mikromerów z zaro...

Skorupiak z Parhyale hawaiensis pojawił się w ciągu ostatniej dekady jako obiecujący organizm modelowy o dużym potencjale do wykorzystania w badaniach nad ewolucyjną biologią rozwoju1. Wśród stawonogów większość systemów modelowych to owady, a najszerzej badanym z nich jest muszka owocowa Drosophila melanogaster. D. melanogaster należy do rzędu owadów Diptera i jako taki wykazuje wiele cech embriologicznych, które są wywodzące się w odniesieniu do tych u owadów rozgałęziających się zasadniczo2. Co więcej, owady są zagnieżdżone w podtypie Pancrustacea3, co oznacza, że owady mają swoich najbliższych krewnych w długotrwałej "naturalnej" grupie zwanej pancrustaceans, i że ta grupa jest parafiletyczna. Sugeruje to, że oprócz zasadniczo rozgałęzionych modeli owadów, potrzebne są badania innych skorupiaków, aby uzyskać szerszy pogląd na ewolucyjną historię cech rozwojowych i mechanizmów molekularnych, które zostały tak dobrze zbadane u D. melanogaster. Jednak bardzo niewiele skorupiaków jest dobrze przygotowanych do eksperymentalnej analizy laboratoryjnej rozwoju. Amfiod P. hawaiensis jest wysoce elastycznym laboratoryjnym systemem modelowym, podatnym na szereg technik eksperymentalnych. Obunogi wykazują wiele unikalnych cech w obrębie swojego nadrzędnego rzędu Peracarida (skoczki plażowe, scudy i krewetki studzienne) i dlatego uważa się, że pochodzą stosunkowo z tej grupy skorupiaków. Niemniej jednak, względna łatwość embriologicznej i funkcjonalnej manipulacji genetycznej oferowana przez Parhyale sprawia, że ten amfipod jest cennym dodatkiem do obecnego inwentarza organizmów modelowych.
Jako zwierzę laboratoryjne, P. hawaiensis oferuje wiele zalet. Zwierzęta są tolerancyjne na szeroki zakres temperatur i zasolenia i dobrze przeżywają w dużych kulturach sztucznej wody morskiej1. Łatwo jest odróżnić samce i samice na podstawie wyraźnych różnic morfologicznych, w szczególności dużych, haczykowatych, przednich wyrostków tułowia, których samce używają do chwytania samic podczas krycia. Do prac embriologicznych i rozwojowych P. hawaiensis ma kilka bardzo atrakcyjnych cech. Embriogeneza trwa około 10 dni, a czas do dojrzałości płciowej wynosi około sześciu tygodni w temperaturze 28 ºC (należy jednak pamiętać, że Parhyale przeżywa dobrze w temperaturach w zakresie około 20-30 ºC, a szczegółowe informacje na temat stopnia zaawansowania rozwoju są dostępne dla zarodków hodowanych w temperaturze18 ºC 4, 25 ºC4 i 26 ºC5,6). Dorosłe osobniki łączą się w pary przez cały rok w laboratorium, więc zarodki są dostępne o każdej porze roku. Samice składają od 2 do 20 (w zależności od wieku samicy) zapłodnionych jaj do brzusznej torby lęgowej znajdującej się między kilkoma pierwszymi parami nóg (ryc. 1A i 1B) i możliwe jest zebranie tych zarodków na bardzo wczesnym etapie rozwoju bez zabijania samicy lub uszkadzania zarodków (ryc. 1C). Zarodki przeżywają w przefiltrowanej sztucznej wodzie morskiej aż do wylęgu, mogą być utrwalone do późniejszej ekspresji genów lub analizy histologicznej7, a szczegółowa tabela etapów pozwala na dokładną identyfikację postępów w rozwoju5. Solidne protokoły zostały wykorzystane do przeprowadzenia analizy ekspresji genów poprzez hybrydyzację in situ 8-15 lub barwienie immunologiczne4,16,17, funkcjonalne knockdown przez interferencję RNA13,15 lub morpholinos12 oraz stabilną transgenezę linii zarodkowej18. Korzystając z systemu transgenezy, metody indukowalnej ekspresji14 i pułapki wzmacniającej19 mogą być również wykorzystane do zbadania funkcji genów u P. hawaiensis. Chociaż publicznie dostępna sekwencja genomu nie jest obecnie dostępna, transkryptom zawierający transkrypty wytworzone podczas oogenezy i embriogenezy został de novo zgromadzony i opisany20 oraz zdeponowany w przeszukiwalnej bazie danych21, co ułatwia odkrywanie genów. Podsumowując, P. hawaiensis jest wysoce elastycznym organizmem modelowym, nadającym się do wielu eksperymentalnych i genetycznych podejść do zrozumienia rozwoju.
W przeciwieństwie do wczesnych syncytialnych rozszczepień D. melanogaster, zarodki P. hawaiensis rozszczepiają się holoblastycznie po zapłodnieniu (Rysunek 2A). Analiza śledzenia linii wykazała, że przy trzecim rozszczepieniu każdy z blastomerów trzeciego rozszczepienia jest specyficznie przeznaczony do powstania jednego z trzech listków zarodkowych lub linii zarodkowej6 (ryc. 2B). Dane te, wraz z danymi z mikromacierzy22, analizami linii komórkowych6,23 i eksperymentami z izolacją blastomerów4 sugerują, że potencjały rozwojowe są segregowane do co najmniej niektórych blastomerów trzeciego rozszczepienia przez asymetryczne dziedziczenie determinantów losu komórki. W związku z tym w eksperymentach z ablacją blastomerów, w których prekursor linii zarodkowej (określany jako "g" w nomenklaturze6 linii komórek Parhyale) został usunięty w stadium ośmiu komórek, zarodki nie miały komórek rozrodczych w późniejszych stadiach rozwojowych4, na co wskazuje brak komórek wyrażających białko Vasa, które jest markerem linii zarodkowej u większości metazoanów24. W przeciwieństwie do tego, eksperymenty z somatyczną ablacją blastomerów wykazały, że zarodki P. hawaiensis posiadają również znaczące zdolności regulacyjne, tak że los blastomerów mezodermy lub prekursorów ektodermy uległych ablacji w stadium ośmiokomórkowym może zostać przejęty przez potomków niektórych z pozostałych blastomerów25. Nie wiadomo, w jaki sposób może zachodzić regulacyjna zamiana losu komórki i w jakim stopniu autonomiczne przyjmowanie losu komórki przez blastomery somatyczne pozostaje nieznane. Eksperymentalne techniki embriologiczne, takie jak ablacja blastomerów, mogą być przydatne w zrozumieniu względnej autonomii i braku autonomii decyzji dotyczących losu komórki26,27 i dlatego są interesujące w badaniach nad embriogenezą P. hawaiensis.
W eksperymentach, które wykazały regulacyjną wymianę linii ektodermalnych i mezodermalnych, ablacja blastomerów była wykonywana przez wstrzyknięcie28 i późniejsze wzbudzenie barwników fototoksycznych25. Chociaż technika ta jest skuteczna w zabijaniu wstrzykniętego blastomeru (blastomerów), nie usuwa całkowicie martwego ciała komórkowego z zarodka. Ponadto zaobserwowano różnice między danymi dotyczącymi linii komórkowych zebranymi aż do etapów gastrulacji embriogenezy poprzez wstrzyknięcie blastomerów z fluorescencyjnymi znacznikami linii28,29, a danymi zebranymi przez śledzenie niezaburzonych blastomerów przez rozwój tych samych stadiów embrionalnych23. Całkowite fizyczne usunięcie określonych blastomerów może być zatem preferowaną metodą ablacji w niektórych zastosowaniach.
Wcześniej opublikowaliśmy wyniki analiz linii komórkowych embrionów, w których pojedyncze komórki były ręcznie ablowane23. Jednak delikatne operacje wymagane do usunięcia pojedynczych blastomerów z zarodków we wczesnym stadium rozszczepienia nie zostały jeszcze w pełni opisane. W niniejszej pracy przedstawiono protokół pobierania zarodków P. hawaiensis oraz ręcznej ablacji pojedynczego blastomeru z zarodka w stadium ośmiokomórkowym. Celem tej metody jest osiągnięcie całkowitego usunięcia ciała komórki z zarodka, co pozwala na obserwację zachowań komórkowych i kompetencji losu komórek pozostałych komórek podczas embriogenezy i rozwoju postembrionalnego. Nasz protokół pokazuje usunięcie prekursora linii zarodkowej g (ryc. 2C), ale może być zastosowany do dowolnej komórki w stadium ośmiokomórkowym lub do blastomerów we wcześniejszych stadiach rozszczepienia. Zasadniczo protokół ten może być stosowany do usuwania pojedynczych komórek z zarodków we wczesnej fazie rozszczepienia innych holoblastycznie rozszczepiających bezkręgowców morskich.

<table><tbody><tr><td>Pipeta Pasteura 15 cm</td><td>Wheaton</td><td>53499-630 VWR</td><td>Do przenoszenia nienaruszonych i ablowanych blastomerem zarodków z naczynia na szalkę.</td></tr><tr><td>Pipeta Pasteura 22 cm</td><td>Wheaton</td><td>53499-632 VWR</td><td>Do wykonywania końcówek do pipet doustnych.</td></tr><tr><td>3 cm szalki Petriego</td><td>Thermo Scientific</td><td>25382-334 VWR</td><td>Użyj niektórych niezmienionych do pobierania i przechowywania zarodków; pokryj niektóre warstwą Sylgardu (patrz poniżej), aby stworzyć powierzchnię roboczą do ablacji blastomerów.</td></tr><tr><td>Płytki 48-dołkowe</td><td>Greiner Bio-One</td><td>82051-004 VWR</td><td>Do hodowli zarodków po ablacji.</td></tr><tr><td>Filtry butelkowe 0,2 i mikro; m</td><td>Nalge Nunc International</td><td>28199-296 VWR</td><td>Za utworzenie FASW (patrz poniżej).</td></tr><tr><td>Palnik Bunsena</td><td>VWR</td><td>89038-530 VWR</td><td>Do tworzenia narzędzia z drutu wolframowego i pipety z cienką końcówką do ust.</td></tr><tr><td>Rysik diamentowy</td><td>Musco Sports Lighting</td><td>52865-005 VWR</td><td>Do tworzenia pipet Pasteura z szerokim otworem do zbierania par.</td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11050-10 Fine Science Tools</td><td>Do trzymania znieczulonych samic podczas usuwania zarodków z torby lęgowej. Nie muszą to być kleszcze Dumonta z cienką końcówką - końcówki mogą być co najmniej tak, jak końcówki kleszczy, dla których numer katalogowy jest tutaj podany.</td></tr><tr><td>Fungizone-Amphotericin B</td><td>Sigma</td><td>A2942 Sigma Aldrich</td><td>Dodać do FASW do końcowego stężenia 1 mg/ml i użyć tego roztworu do hodowli zarodków poddanych blastomerowi.</td></tr><tr><td>Szklane kapilary o długości 4 cali, 1/0,58 OD/ID (mm)</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-4 World Precision Instruments</td><td>Do wykonywania igieł do nakłuwania blastomeru do ablacji.</td></tr><tr><td>Szklane szkiełko zegarkowe o średnicy 300 mm</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>70543-30 Nauki o mikroskopii elektronowej</td><td>Do stosowania przy usuwaniu zarodków z torby lęgowej znieczulonych samic.</td></tr><tr><td>Sztuczna woda morska Instant Ocean (ASW)</td><td>Instant Ocean</td><td>IS160 Aquatic EcoSystems</td><td>Wytwarza ASW, rozpuszczając sól w wodzie dejonizowanej do zasolenia 1,022-1,024.</td></tr><tr><td>Sztuczna woda morska filtrowana przez ocean (FASW)</td><td>Instant Ocean</td><td>IS160 Aquatic EcoSystems</td><td>wykorzystuje 0,2 i mikro; m filtry do sterylizacji ASW. W razie potrzeby uzupełnić w małych ilościach (< 250 ml).</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>21905-026 VWR</td><td>Do bezpiecznego odłamywania cienkiej końcówki pipet Pasteura zmodyfikowanych do zbierania par.</td></tr><tr><td>Adapter do pipet doustnych</td><td>Drummond Labware</td><td>A5177-5EA Sigma Aldrich</td><td>Włóż cienką końcówkę pipety Pasteura do tego końca, która ma być używana do usuwania wytłaczanej zawartości komórek podczas procedury ablacji.</td></tr><tr><td>Rurka do pipety do ust</td><td>Aldrich</td><td>Z280356 Sigma Aldrich</td><td>Przytnij ją tak, aby była wystarczająco długa, aby wygodnie wisiała na szyi podczas zabiegu ablacji.</td></tr><tr><td>Ściągacz igieł</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>P97 Sutter Instrument Company</td><td>Do wykonywania igieł ze szklanych naczyń włosowatych do nakłuwania blastomeru do ablacji.</td></tr><tr><td>Roztwór penicyliny-streptomycyny</td><td>Mediatech</td><td>45000-650 VWR</td><td>Dodać do FASW do końcowego stężenia 100 jednostek/ml penicyliny i 100 mg/ml streptomycyny i użyć tego roztworu do hodowli zarodków poddanych ablacji blastomerowej.</td></tr><tr><td>Gumowa bańka</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>100488-418 VWR</td><td>Do używania pipet Pasteura do przenoszenia zarodków z naczynia na talerz</td></tr>.<tr><td>Sylgard 184</td><td>K. R. Anderson, Inc.</td><td>NC9659604 Fisher Scientific</td><td>Uzupełnij makijaż zgodnie z instrukcją producenta. Wlej warstwę o grubości 2-5 mm na 3-centymetrową szalkę Petriego, aby stworzyć powierzchnię roboczą do ablacji blastomerów.</td></tr><tr><td>Drut wolframowy o średnicy 0,004 cala</td><td>Systemy AM</td><td>719000 Systemy AM</td><td>Użyj tego, aby stworzyć narzędzie do usuwania zarodków z torby lęgowej znieczulonych samic.</td></tr></tbody></table>

ablacja pojedynczej komórki z ośmiokomórkowych zarodków skorupiaka z rodziny amphipod parhyale hawaiensis

Ablation of a Single Cell From Eight-cell Embryos of the Amphipod Crustacean Parhyale hawaiensis

Amfiod Parhyale hawaiensis to mały skorupiak występujący w międzypływowych siedliskach morskich na całym świecie. W ciągu ostatniej dekady Parhyale stał się obiecującym organizmem modelowym do laboratoryjnych badań rozwojowych, dostarczając użytecznego porównania grupy zewnętrznej z dobrze zbadanym organizmem modelowym stawonogów Drosophila melanogaster. W przeciwieństwie do syncytialnych rozszczepieniach Drosophila, wczesne rozszczepienia Parhyale są holoblastyczne. Mapowanie losu za pomocą barwników znacznikowych wstrzykniętych do wczesnych blastomerów wykazało, że wszystkie trzy listki zarodkowe i linia zarodkowa są tworzone w stadium ośmiokomórkowym. Na tym etapie trzy blastomery są przeznaczone do powstania ektodermy, trzy są przeznaczone do powstania mezodermy, a pozostałe dwa blastomery są prekursorami odpowiednio endodermy i linii zarodkowej. Jednak eksperymenty z ablacją blastomerów wykazały, że zarodki Parhyale posiadają również znaczące zdolności regulacyjne, tak że losy blastomerów poddanych ablacji w stadium ośmiokomórkowym mogą zostać przejęte przez potomków niektórych pozostałych blastomerów. Ablacja blastomerów była wcześniej opisywana za pomocą jednej z dwóch metod: iniekcji, a następnie aktywacji barwników fototoksycznych lub ablacji manualnej. Jednak fotoablacja zabija blastomery, ale nie usuwa martwego ciała komórkowego z zarodka. Całkowite fizyczne usunięcie określonych blastomerów może być zatem preferowaną metodą ablacji w niektórych zastosowaniach. W tym miejscu przedstawiamy protokół ręcznego usuwania pojedynczych blastomerów z ośmiokomórkowego stadium zarodków Parhyale, ilustrując narzędzia i procedury manualne niezbędne do całkowitego usunięcia ciała komórki przy jednoczesnym utrzymaniu pozostałych blastomerów przy życiu i nienaruszonym. Protokół ten można zastosować do dowolnej komórki Parhyale w stadium ośmiu komórek lub do blastomerów w innych wczesnych stadiach rozszczepienia. Ponadto, w zasadzie, protokół ten może mieć zastosowanie do zarodków we wczesnym stadium rozszczepienia innych holoblastycznie rozszczepiających bezkręgowców morskich.

Po pomyślnej ablacji pojedynczych mikromerów P. hawaiensis w trzecim podziale, zgodnie z opisem w niniejszym protokole, pozostałe mikromery stopniowo i nieznacznie zmieniają swoje położenie, aby częściowo zająć przestrzeń wcześniej zajmowaną przez ablacyjny blastomer. Na przykład po usunięciu g, sąsiednie blastomery mr oraz ml lekko się przesuwają i zaczynają dzielić boczny brzeg komórkowy, który wcześniej znajdował się w bezpośrednim kontakcie z g</stro...

Obuzd Parhyale hawaiensis jest obiecującym organizmem modelowym do badań embriologii skorupiaków oraz porównawczego rozwoju i ewolucji stawonogówów. Protokół ten opisuje metodę ręcznego usuwania pojedynczych blastomerów z zarodków Parhyale we wczesnym stadium rozszczepienia.

Ablacja pojedynczej komórki z ośmiokomórkowych zarodków skorupiaka z rodziny Amphipod Parhyale hawaiensis

The amphipod Parhyale hawaiensis is a small crustacean found in intertidal marine habitats worldwide. Over the past decade, Parhyale has emerged as a ...

Niniejsza demonstracja przedstawia technikę usuwania prekursorowej komórki linii zarodkowej z wczesnych embrionów wewnątrz pęcherzyka. Skorupiak Parhyale hawaiensis jest nowym organizmem modelowym o szerokim potencjale zastosowania w badaniach ewolucyjnych i rozwojowych. Większością organizmów modelowych wśród stawonogów są owady, a najszerzej z nich przebadaną jest muszka owocowa Drosophila melanogaster. Owady są zaklasyfikowane w obrębie podtypu Pancrustacea, a badanie innych skorupiaków poza grupą owadów pozwala na szersze spojrzenie na historię ewolucyjną cech rozwojowych oraz mechanizmów molekularnych, które zostały szczegółowo opisane u Drosophila.Jednakże bardzo niewielu skorupiaków udało się dobrze ustabilizować pod kątem eksperymentalnych analiz laboratoryjnych rozwoju. Parelli jest wysoce podatnym na badania systemem modelowym i tym samym stanowi wartościowy dodatek do katalogu organizmów modelowych. Jako zwierzę laboratoryjne, parli jest bardzo łatwe w utrzymaniu i w pracy.Gatunek ten dobrze przeżywa w dużych kulturach sztucznej wody morskiej, a odróżnienie osobników płci męskiej od żeńskiej jest łatwe dzięki wyraźnym różnicom morfologicznym. Najbardziej zauważalne są duże, zakrzywione wyrostki przednie, których samce używają do chwytania samic podczas kopulacji w badaniach rozwojowych. Parelli posiada kilka bardzo korzystnych cech; pary kopulują przez cały rok, co umożliwia pozyskiwanie embrionów w dowolnym momencie.Samice składają embriony do torby inkubacyjnej znajdującej się pomiędzy pierwszymi kilkoma parami odnóży, co umożliwia pobranie embrionów na bardzo wczesnym etapie rozwoju bez uśmiercania samicy i bez uszkadzania zarodków. Embriony przeżywają w filtrowanej sztucznej wodzie morskiej aż do momentu wyklucia, a szczegółowa tabela stadiów pozwala na dokładną identyfikację postępów w rozwoju. Przedstawiono tutaj wybrane etapy rozwoju paral aż do wyklucia, zaczynając od stadium ośmiokomórkowego.Każda z komórek w embrionie paral jest specyficznie zróżnicowana do jednej z trzech warstw zarodkowych lub do pierwotnych komórek płciowych. Przedmiotem szczególnym zainteresowania w tym pokazie jest specyfikacja populacji komórek płciowych. Komórka oznaczona symbolem G (germline) jest znanym, jedynym prekursorem linii płciowej w paral; eksperymenty z mapowaniem linii komórkowych wykazują, że potomkowie komórki G stają się wszystkimi komórkami płciowymi i żaden z potomków nie wchodzi w skład żadnej innej warstwy zarodkowej.Dodatkowo przeprowadzono doświadczenia polegające na usunięciu G z embrionu bez uszkadzania pozostałych komórek. W tych eksperymentach embriony, z których usunięto G, nie posiadały komórek zarodkowych w dalszym przebiegu embriogenezy, co potwierdzono brakiem komórek wykazujących ekspresję białka vasa, które jest markerem linii zarodkowej w organizmach modelowych wśród metazoa. Pokażemy teraz, jak zebrać embriony parli oraz jak ręcznie usunąć G z embrionu w stadium ośmiu komórek.Ten film demonstruje usuwanie G, ale można go zastosować do dowolnej komórki na etapie ośmiokomórkowym. Do tej części procedury będziemy potrzebować pipety Pasteura z rozszerzonym końcem, drugiej niezmienionej pipety Pasteura, filtrowanej sztucznej wody morskiej, dużego pojemnika do przechowywania par, małych szalek Petriego, szklanej płytki z dołkami, pęsety oraz narzędzia sekcyjnego składającego się z cienkiego zakrzywionego drutu w końcówce pipety Pasteura. W tym pokazie nie użyto rękawiczek, ale należy pamiętać o zastosowaniu środków ochrony osobistej zgodnie z zasadami zarządzania ryzykiem obowiązującymi w danej instytucji. Aby przygotować rozszerzoną pipetę Pasteura, należy najpierw naciąć pipetę diamentowym rysikiem, a następnie ostrożnie odłamać końcówkę.Przetrzymaj nad płomieniem przez kilka sekund, aby wygładzić krawędzie. Otwór powinien być nieco węższy niż maksymalna szerokość pipety. Aby wykonać drut do mikrodissekcji, włóż drucik wolframowy do końca szklanej pipety i potrzymaj nad płomieniem, aż szkło się stopi.Aby przymocować drut, należy użyć pęsety i delikatnie wygiąć jego koniec, co ułatwi manipulowanie nim za pomocą narzędzia. Zakrzywiony koniec powinien mieć długość nieco ponad pół centymetra. Pary należy zebrać za pomocą poszerzonej pipety Pasteura i przenieść do oddzielnego naczynia z syntetyczną wodą morską.Pozostaw pary w temperaturze pokojowej przez noc. Następnego ranka nasyć przefiltrowaną sztuczną wodę morską dwutlenkiem węgla. Zbierz oddzielone samice i znieczul je w tej wodzie.Przenieś jedną samicę do szklanej płytki wielodołkowej z filtrowaną sztuczną wodą morską z dodatkiem dwutlenku węgla; obserwując pod stereomikroskopem, chwyć pęsetą płytki coxalne wzdłuż jednej strony ciała. Zarodki są widoczne w torbie brzeżnej. Wprowadź drucianą igłę sekcyjną do tylnego końca torby brzeżnej i delikatnie unieś drut w kierunku przednim, aby oddzielić pokrywę torby, otwierając ją i odsłaniając zarodki.Użyj pipety Pasteura, aby przepłukać wodą otwarty worek inkubacyjny, wypychając zarodki. Przenieś samicę do filtrowanej sztucznej wody morskiej bez dwutlenku węgla, aby umożliwić jej regenerację przed ponownym wprowadzeniem do głównej hodowli.Przenieś embriony do szalki Petriego z filtrowaną sztuczną wodą morską i obejrzyj je pod mikroskopem, aby określić stadium ich rozwoju. Ponieważ przed wyjęciem z samicy często trudno jest ustalić stadium embrionów, zazwyczaj konieczne jest pobranie embrionów od wielu samic, aby uzyskać wystarczającą liczbę zarodków w odpowiednim stadium. Często najprostszym sposobem uzyskania embrionów w stadium ośmiokomórkowym jest zebranie embrionów we wcześniejszych stadiach i oczekiwanie, aż dojrzeją do wymaganego etapu.Oprócz embrionów, które już zebraliśmy do procedury ablacji, będziemy potrzebować pęsety do pipety Pasteura, filtrowanej sztucznej wody morskiej, szalki Petriego z warstwą agaru, igły wykonanej z wyciągniętej kapilary szklanej, pipety ustnej z małym otworem, czystych szalek Petriego oraz filtrowanej sztucznej wody morskiej z amfoterycyną oraz penicyliną i streptomycyną do końcówki pipety ustnej. Wyciągnij długą końcówkę pipety Pasteura nad płomieniem i odłam czubek małego końca, a następnie włóż go do końcówki pipety ustnej. Ta końcówka ma idealny rozmiar do przeprowadzenia procedury.Szklana igła, która zostanie użyta do nakłucia G podczas procedury ablacji, musi mieć cienki czubek, ale być jednocześnie na tyle wytrzymała, aby nie złamać się podczas nacisku na korion. Przedstawiony tutaj kształt jest powszechnie stosowany w naszym laboratorium. Do przeprowadzenia ablacji musimy najpierw zidentyfikować komórkę G; na obrazie embrionu po lewej stronie G jest obrysowana czarną linią, a w następnej sekcji dowiemy się, jak odróżnić G od pozostałych mikroluster.Zarodek po prawej stronie pokazuje oczekiwany efekt prawidłowej ablacji. W tym zarodku dokonano ablacji G, co zaznaczono czarnym okręgiem, i za pomocą pęsety pozostawiono jedynie trzy mikromery. Delikatnie obróć zarodek, aby obejrzeć i porównać komórki.G można zidentyfikować jako najmniejszy mikromer znajdujący się na szczycie najmniejszego makromeru. MAV można zidentyfikować jako najmniejszy makromer poprzez obrócenie zarodka. Dodatkowo G nie styka się z komórką EN, która jest mikromerem leżącym naprzeciwko. Ponieważ komórki el i er współdzielą granicę między G a EN w przypadku tego zarodka, możemy stwierdzić, że najmniejszy mikromer znajduje się po lewej stronie i nie styka się on z mikromerem leżącym naprzeciwko.Przetaczając embrion, możemy potwierdzić, że to mikro lustro spoczywa na najmniejszym makro lustrze. Znajdując się teraz w lewym dolnym rogu embrionu, możemy z pewnością nazwać go G i przejść do ablacji. W skrócie.W tej procedurze ustabilizujemy embrion za pomocą pęsety, a następnie przebijemy G za pomocą wyciągniętej igły szklanej. Następnie wywieramy pęsetą lekki nacisk na embrion, powodując wypłynięcie zawartości G z embrionu przez wykonany otwór. Używamy pipety ustnej do usunięcia zawartości G po jej wypłynięciu z embrionu, aby móc ocenić, kiedy G zostało całkowicie usunięte.Przejdźmy teraz do szczegółów: wypełnij płytkę ochronną z jedwabiu cienką warstwą przefiltrowanej sztucznej wody morskiej. Przenieś embrion w stadium ośmiu komórek na płytkę, używając pypety Pasteura oraz pęsety. Lewą ręką zorientuj embrion tak, aby biegun G znajdował się po prawej stronie, a następnie delikatnie go uchwyć w celu stabilizacji za pomocą wyciąganej igły szklanej. Delikatnie nakłuj biegun G; nie wkładaj igły zbyt głęboko, aby zapobiec jej przesunięciu się w stronę mikrocieni znajdujących się poniżej G. Zamień igłę w prawej ręce na mikro pipetę z wyciąganą końcówką pypety Pasteura.Przytrzymaj końcówkę pipety blisko otworu w G i zastosuj bardzo delikatne ssanie. Delikatnie uciśnij embrion pęsetą w momencie, gdy zawartość G jest wypychana z chorionu. Wciągnij go do pipety w kształcie ust, aby uzyskać niezakłócony widok embrionu.Uważnie obserwuj embrion. W miarę usuwania G, krawędź G będzie cofać się w stronę otworu w chorionie, odsłaniając miejsce styku leżących poniżej komórek. Kontynuuj wywieranie nacisku, aż całe G zostanie usunięte, a następnie za pomocą pęsety obróć embrion i potwierdź wizualnie, że całe G zostało usunięte.Za pomocą pipety Pasteura przenieś embrion do filtrowanej sztucznej wody morskiej z dodatkiem amfoterycyny oraz penstrepu. Aby zapobiec infekcji, codziennie wymieniaj połowę wody, w której znajduje się embrion. Oto embrion przed i po ablacji.Jak widać, w miejscu, w którym wcześniej znajdował się G, pozostała pusta przestrzeń. Jeśli zabieg zostanie przeprowadzony delikatnie, a zarodki będą odpowiednio pielęgnowane po procedurze, duży odsetek z nich przeżyje do momentu wyklucia. W naszym laboratorium średni wskaźnik przeżywalności wynosi nieco ponad 50%

ablation-single-cell-from-eight-cell-embryos-amphipod-crustacean

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ablacja pojedynczej komórki z ośmiokomórkowych zarodków skorupiaka skorupniaka Parhyale hawaiensis

Los pojedynczej komórki embrionalnej może być determinowany przez cząsteczki dziedziczne i/lub sygnały pochodzące od sąsiednich komórek. Wykorzystując mapy losów embrionu Xenopus w stadium podziałów, można zidentyfikować pojedyncze blastomery w celu ich izolowanej hodowli, aby ocenić wpływ cząsteczek dziedzicznych w stosunku do oddziaływań międzykomórkowych.

Eksplanty blastomerów do badania determinacji losów komórek podczas rozwoju embrionalnego

Ten film przedstawia metodę izolowania blastomerów C. elegans z wczesnych zarodków. Otrzymane komórki nadają się do hodowli komórkowej lub eksperymentów ex vivo.

C. elegans (C. elegans) Rozwarstwienie blastomerów: metoda usuwania skorupki jaja i dysocjacji komórek embrionalnych

Ten protokół opisuje metodę izolowania pojedynczych komórek z zarodków danio pręgowanego, wzbogacania o interesujące komórki, przechwytywania komórek danio pręgowanego w mikroprzepływowych systemach multipleksów jednokomórkowych i oceny ekspresji genów z pojedynczych komórek.

Izolacja i charakterystyka pojedynczych komórek z zarodków danio pręgowanego

Ten protokół zawiera instrukcję krok po kroku, jak generować parabiotyczne zarodki danio pręgowanego o różnym pochodzeniu genetycznym. W połączeniu z niezrównanymi możliwościami obrazowania zarodka danio pręgowanego, metoda ta zapewnia wyjątkowo potężny środek do badania funkcji autonomicznych i nieautonomicznych komórek dla genów kandydujących na badanie.

Generowanie parabiotycznych zarodków danio pręgowanego poprzez chirurgiczne zespolenie rozwijających się blastuli

Wykorzystanie wstępnie złożonego kompleksu rybonukleoproteinowego Cas9 (RNP) to potężna metoda precyzyjnej, efektywnej edycji genomu. W tym miejscu podkreślamy jego użyteczność w szerokim zakresie komórek i organizmów, w tym pierwotnych komórek ludzkich oraz zarówno klasycznych, jak i powstających organizmów modelowych.

Ulepszona edycja genomu za pomocą rybonukleoproteiny Cas9 w różnych komórkach i organizmach

Celem tego protokołu jest genotyp ukwiału Nematostella vectensis podczas gastrulacji bez poświęcania zarodka.

Genotypowanie ukwiałów morskich we wczesnym okresie rozwoju

Złożoność tkanek systemów wielokomórkowych utrudnia identyfikację związku przyczynowego między sygnałami zewnątrzkomórkowymi a indywidualnymi zachowaniami komórek. W tym miejscu przedstawiamy metodę badania bezpośredniego związku między wskazówkami zależnymi od kontaktu a osiami podziału przy użyciu blastomerów zarodkowych C. elegans i adhezyjnych kulek polistyrenowych.

Rekonstrukcja in vitro przestrzennych wzorców kontaktu komórek z izolowanymi blastomerami zarodkowymi Caenorhabditis elegans i adhezyjnymi kulkami polistyrenowymi

Manipulacje embriologiczne, takie jak eksterminacja i przeszczepianie komórek, są ważnymi narzędziami do badania wczesnego rozwoju. Protokół ten opisuje proste i skuteczne urządzenie do przeszczepiania do wykonywania tych manipulacji w zarodkach danio pręgowanego.

Proste i skuteczne urządzenie do przeszczepiania zarodków danio pręgowanego

Eksplantaty blastodermy danio pręgowanego są generowane przez izolowanie komórek embrionalnych od endogennych centrów sygnalizacyjnych we wczesnym zarodku, tworząc stosunkowo naiwne klastry komórek, które łatwo manipulować i hodować ex vivo. Ten artykuł zawiera instrukcje dotyczące tworzenia takich eksplantatów i demonstruje ich użyteczność, pytając o role sygnalizacji węzłowej podczas gastrulacji.

Wytwarzanie naiwnych eksplantatów blastodermy z zarodków danio pręgowanego

Rozwój embrionalny wymaga koordynacji ruchu komórek na dużą skalę. Ablacja laserowa za pośrednictwem wzbudzenia dwufotonowego umożliwia przestrzennie kontrolowaną 3-wymiarową ablację dużych grup głębokich komórek. Ponadto technika ta może badać reakcję kolektywnie migrujących komórek in vivo na zakłócenia w ich środowisku mechanicznym.

Głębokie i przestrzennie kontrolowane ablacje objętościowe przy użyciu mikroskopu dwufotonowego w danio pręgowanym

Poznaj technikę ablacji pojedynczej komórki G z ośmiokomórkowych zarodków skorupiaka Parhyale hawaiensis. Metoda umożliwia badanie komórek prekursorowych linii płciowej w embriologii skorupiaków.

Ablacja pojedynczej komórki z ośmiokomórkowych zarodków skorupiaka z rodziny Amphipod Parhyale hawaiensis

Przeglądaj więcej filmów