Name: Aplizja Przygotowanie zwojów nerwowych do analiz elektrofizjologicznych i molekularnych pojedynczych neuronów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Poznaj metodę analizy elektrofizjologicznej i molekularnej pojedynczych neuronów u Aplysia californica. Technika obejmuje identyfikację neuronów, rejestrację aktywności oraz izolację RNA do analizy ekspresji genów metodą qPCR.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Serdecznie dziękujemy Fundacji Whitehall za wsparcie finansowe oraz fundusze na rozpoczęcie działalności przez Instytut Badawczy Scripps za przeprowadzenie tej pracy.

1. Przygotowanie zwojów brzusznych, pomiary elektrofizjologiczne i izolacja pojedynczych zidentyfikowanych neuronów ze zwoju brzusznego Aplysia californica
<ol>
	<li>Utrzymuj Aplysia w akwarium laboratoryjnym z krążącą sztuczną wodą morską (ASW) o temperaturze 16 °C w warunkach 12:12 światło: ciemność.</li>
	<li>Izolacja zwoju brzusznego.
	<ol>
		<li>Znieczulenie zwierząt poprzez wstrzyknięcie 380 mM roztworu MgCl2 przez 5-10 minut (co odpowiada 30-35% masy ciała zwierzęcia).</li>
		<li>Zidentyfikuj zwój brzuszny na podstawie jego położenia w ośrodkowym układzie nerwowym24,28.</li>
		<li>Usunąć zwoje jaj chirurgicznie i natychmiast przechowywać w sztucznej wodzie morskiej składającej się z 450 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM CaCl2, 55 mM MgCl2, 2,5 mM NaHCO3 i 10 mM HEPES (pH 7,4).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Leczenie proteazą.
	<ol>
		<li>Inkubować ganglion brzuszny przez 30 minut w temperaturze 34 °C±0,5 na szalce Petriego z 0,1% proteazą (dypazą) rozcieńczoną w ASW opisanym powyżej. 
		UWAGA: Ilość użytej proteazy musi być znormalizowana z wiekiem i wagą zwierząt. Ogólnie rzecz biorąc, starsze i większe zwierzęta wymagałyby więcej proteazy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usunięcie pochewki zwojowej.
	<ol>
		<li>Po poddaniu działaniu enzymów przypiąć zwoje nerwowe do silikonowej podstawy komory komórkowej Sylgard (Ø= 1 cm; obj. = 0,3 ml) i przeprowadzić perfuzję za pomocą ASW (natężenie przepływu: 150 μl/min) w temperaturze pokojowej (18 °C±2 ). 
		UWAGA: Aby zwiększyć widoczność zidentyfikowanych neuronów, umieść ganglion na górze cylindra ze szkła poliwęglanowego (ryc. 1) (średnica Ø = 2 mm zmodyfikowana komora komórkowa), który można łatwo oświetlić od dołu za pomocą dwuokularowego mikroskopu stereoskopowego o powiększeniu 20X i 40X.</li>
		<li>Ostrożnie usuń osłonkę z ganglionu za pomocą kleszczy i mikronożyczek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Jednoczesny zapis elektrofizjologiczny z dwóch neuronów.
	<ol>
		<li>Zidentyfikuj neuron będący przedmiotem zainteresowania.</li>
		<li>Przebić neuron pojedynczą wewnątrzkomórkową ostrą mikroelektrodą o rezystancji 10-15 MΩ wypełnioną 3 M roztworem KCl.</li>
		<li>Rejestruj aktywność neuronalną (przepust pasma 10 kHz) za pomocą wewnątrzkomórkowego systemu zapisu.</li>
		<li>Przetwarzanie danych rejestracyjnych za pomocą oprogramowania do elektrofizjologii, takiego jak Axograph. 
		UWAGA: Można łatwo przeprowadzić zapis z wielu neuronów. Neurony L7, L11 lub R15 i R2 można łatwo zidentyfikować na podstawie ich położenia. Dwa wzmacniacze i dwa mikromanipulatory są potrzebne do jednoczesnego nagrywania z dwóch neuronów L7 i R15 (ilustracja 2).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Stosowanie leków.
	<ol>
		<li>Nałóż wybrany lek do komory komórkowej poprzez delikatne pipetowanie lub wstrzyknij bezpośrednio do neuronów.</li>
		<li>Wykonaj pomiary elektrofizjologiczne. 
		UWAGA: W zależności od celu eksperymentu, można mierzyć różne parametry elektrofizjologiczne neuronów, takie jak zmiany potencjału błonowego (MP) lub potencjału czynnościowego (AP) przed, w trakcie i po zastosowaniu leku.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja pojedynczych neuronów.
	<ol>
		<li>Na zakończenie eksperymentów elektrofizjologicznych zatrzymaj perfuzję ASW i umyj ganglion 100% etanolem. Ekspozycja na etanol skamienieje neurony i przy użyciu cienkich kleszczy ułatwi usunięcie pojedynczych neuronów bez uszkadzania innych neuronów ze zwoju.</li>
		<li>Usuń pojedyncze neurony pod mikroskopem stereoskopowym i przenieś do małej probówki Eppendorfa zawierającej lodowaty odczynnik do ekstrakcji RNA o pojemności 500 μl. Wyizolowane pojedyncze neurony mogą być przechowywane w odczynniku do ekstrakcji RNA w temperaturze -80 °C do przyszłej analizy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Izolacja RNA z pojedynczych neuronów i analiza ekspresji genów za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (qPCR)
<ol>
	<li>Środki ostrożności w celu zminimalizowania degradacji RNA: 
	Rybonukleazy (RNazy) rozkładają RNA i są bardzo stabilnymi i aktywnymi enzymami. Wykonaj następujące kroki podczas obchodzenia się z RNA.
	<ol>
		<li>Oczyść obszar roboczy i instrumenty środkami dezaktywującymi RNazy.</li>
		<li>Podczas pracy z RNA należy nosić rękawiczki i często zmieniać rękawice.</li>
		<li>Do obsługi RNA należy używać wyłącznie tworzyw sztucznych wolnych od RNaz.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolowanie całkowitego RNA z pojedynczych neuronów:
	<ol>
		<li>Standardowy protokół Trizol do izolacji RNA może być używany do izolowania RNA z pojedynczych neuronów. Na krótko dodać 20% v/v chloroformu do Trizolu, dobrze wymieszać przez krótkie wirowanie.</li>
		<li>Umieścić probówki na rotatorze na 10 minut w temperaturze 4 °C. Wirować mieszaninę Trizol-Chloroform w temperaturze 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Zebrać fazę wodną i przenieść do świeżej probówki.</li>
		<li>Dodać roztwór octanu sodu (pH 5,5) do końcowego stężenia 0,3 M, 100 ng/ml współrecipitantu GlycoBlue i 2,5 objętości 100% etanolu w celu wytrącenia RNA.</li>
		<li>Dobrze wymieszać próbki i inkubować w temperaturze -80 °C przez noc.</li>
		<li>Obracać próbki w temperaturze 12 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C, a na dnie probówki będzie widoczna mała niebieska osadka.</li>
		<li>Usunąć supernatant i przepłukać osad 850 μl 75% lodowatego etanolu o stężeniu 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Ostrożnie usunąć supernatant i suszyć na powietrzu osad RNA przez maksymalnie 7-10 minut. 
		UWAGA: Upewnij się, że RNA nie jest pozostawione na długo do wyschnięcia, ponieważ nadmierne wysuszenie osadu RNA bardzo utrudnia solubilizację.</li>
		<li>Po wysuszeniu ponownie zawieś osad RNA w 10 μl wody wolnej od RNAzy i oznacz stężenie RNA. 
		UWAGA: Oznaczyć stężenie RNA za pomocą spektrofotometru. Gdy nie używasz od razu, przechowuj RNA w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Synteza aRNA z pojedynczych neuronów:
	<ol>
		<li>Amplifikuj RNA (jedna lub dwie rundy w zależności od celu eksperymentalnego) za pomocą dostępnego na rynku liniowego systemu amplifikacji RNA. 
		UWAGA: Całkowite RNA z pojedynczych neuronów wahało się od ~10-60 ng. Oczekiwana wydajność pierwszej rundy amplifikacji wynosi ~100-300 ng, a drugiej rundy amplifikacji to ~0,8-1,5 μg RNA.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odwrotna transkrypcja RNA:
	<ol>
		<li>Aby wygenerować cDNA z aRNA, użyj 1,0 μg aRNA w 20 μl reakcji odwrotnej transkrypcji. W tym celu na rynku dostępnych jest kilka zestawów.
		 UWAGA: cDNA zsyntetyzowano zgodnie z protokołem producenta przy użyciu następujących ustawień na termocyklerze. 
		5 min przy 25 °C 
		30 min przy 42 °C 
		5 min przy 85 °C 
		Przechowywać w temperaturze 4 °C</li>
		<li>Po etapie odwrotnej transkrypcji przechowuj cDNA w temperaturze -20 °C w celu długotrwałego przechowywania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Projektowanie i standaryzacja podkładu: 
	Dostępnych jest kilka doskonałych programów do bezpłatnego projektowania podkładów do wzmocnień w czasie rzeczywistym.
	<ol>
		<li>Wybierz 18-24 merowe oligonukleotydy, które wytwarzają amplikony 70-110 pz i zsyntetyzuj startery przy użyciu źródeł komercyjnych. 
		UWAGA: Dla każdego genu będącego przedmiotem zainteresowania należy zaprojektować od dwóch do trzech par starterów. Każdy zestaw starterów musi być standaryzowany metodą qPCR. Pary starterów do przodu i do tyłu, które zostały użyte dla genu CREB1 (Figura 4), są poniżej:
		 Zestaw podkładów 1 
		Naprzód: 5'-TGATTCTGACGCAAAGAAAGA-3' 
		Rewers: 5'-ACCGTGAGCAGTCAGTTGTAGA-3' 
		Zestaw podkładów 2 
		Naprzód: 5'-AGGGAATGTCGATGAAAGAAGA-3' 
		Rewers: 5'-GACACACAGGAAGTATGCCAAA-3'</li>
		<li>Aby wybrać najlepszy starter do dalszych analiz, należy monitorować wartość Ct i kształt krzywej amplifikacji w qPCR. 
		UWAGA: Startery, które dają wartości Ct (próg cyklu) między 10-35 w 40-krotnym amplifikacji i gładkie krzywe podczas fazy wykładniczej PCR, po której następuje gładkie plateau, są optymalne do analiz ekspresji genów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ilościowy PCR w czasie rzeczywistym (qPCR): 
	Uwaga: Użyj odpowiednich probówek lub płytek, które są kompatybilne z maszyną qPCR.
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć cDNA do 5x wodą wolną od nukleaz.</li>
		<li>Do 2 μl rozcieńczonego cDNA dodać 8 μl głównej mieszaniny qPCR zawierającej 2 μlH2O, 5 μl 2x SYBR Green master mix i 1,0 μl 10 μM (każdy) startera do przodu i do tyłu.</li>
		<li>Zamknąć probówki i uszczelnić płytkę po odpipetowaniu cDNA i mieszaniny wzorcowej. Wymieszaj zawartość, delikatnie stukając i obracając z prędkością 1 500 obr./min przez 30 sekund.</li>
		<li>Przejdź do konfiguracji maszyny qPCR.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Neuron R15 bierze udział w regulacji układu sercowo-naczyniowego, pokarmowego, oddechowego i rozrodczego30. Cechą charakterystyczną R15 jest regularna rytmiczna aktywność rozstrzeliwania AP. Jak pokazano w sekcji wyników, sparowany zapis R15 i L7 pokazuje, że preparat zwojów zachował aktywność neuronów R15. Neurony R15 i L7 odpowiednio reagowały na Ach. To przygotowanie zwojów można utrzymać do 8-10 godzin, a aktywność elektrofizjologiczną można stale monitorować. W ten sposób można by badać elektrofizjologicz...

Ludzki mózg jest niezwykle złożony, z prawie 100 miliardami neuronów i bilionami połączeń synaptycznych. Istnieje prawie taka sama liczba komórek nieneuronalnych, które oddziałują z neuronami i regulują ich funkcję w mózgu. Neurony są zorganizowane w obwody, które regulują określone zachowania. Pomimo postępów w naszym zrozumieniu funkcji mózgu i obwodów neuronalnych, niewiele wiadomo na temat tożsamości elementów obwodów, które kontrolują określone zachowanie. Wiedza na temat tożsamości różnych składników obwodu znacznie ułatwi nam zrozumienie zarówno komórkowych, jak i molekularnych podstaw zachowania oraz pomoże w opracowaniu nowych strategii terapeutycznych dla zaburzeń neuropsychiatrycznych.
Ślimak morski Aplysia californica był koniem pociągowym do określania obwodów neuronalnych leżących u podstaw określonych zachowań1-14. Układ nerwowy Aplysia zawiera około 20 000 neuronów, które są zorganizowane w 9 różnych zwojów. Neurony Aplysia są duże i można je łatwo zidentyfikować na podstawie ich wielkości, właściwości elektrycznych i położenia w zwojach. Aplysia ma bogaty repertuar zachowań, które można badać. Jednym z dobrze zbadanych zachowań jest odruch wycofania skrzeli (GWR). Centralne elementy tego odruchu znajdują się w zwojach brzusznych. Zmapowano składowe obwodów GWR i określono udział różnych komponentów. Co ważne, obwody GWR podlegają uczeniu asocjacyjnemu i nieasocjacyjnemu5,6,15-19. Dziesięciolecia badań nad tym odruchem zidentyfikowały również kilka szlaków sygnałowych, które odgrywają kluczową rolę w uczeniu się i zapamiętywaniu20-24.
Kilka różnych preparatów Aplysia zostało użytych do badania komórkowych i molekularnych podstaw przechowywania pamięci. Należą do nich nienaruszonyzwierzęcy 2,3, półnienaruszony preparat1,7,13,14,16 i odtworzenie głównych składników obwodów nerwowych25-29. Poniżej opisano zmniejszone przygotowanie do badania zwojów Aplysia do analiz elektrofizjologicznych i molekularnych zidentyfikowanych obwodów neuronalnych. Badaniom poddano następujące cztery zidentyfikowane neurony. Badano R15, neuron pękający, L7 i L11, dwa różne neurony ruchowe oraz R2, neuron cholinergiczny. R2 jest największym neuronem opisanym w układzie nerwowym bezkręgowców. Krótko mówiąc, metodologia ta obejmuje leczenie zwojów proteazą, pomiary elektrofizjologiczne przed i po leczeniu farmakologicznym oraz izolację pojedynczych neuronów w celu ilościowej analizy ekspresji genów. Metodologia ta pozwala nam łączyć analizy molekularne z jednoczesnym zapisem z wielu neuronów. Metodologia ta została z powodzeniem wykorzystana do zbadania odpowiedzi neuronów R15 i L7 na acetylocholinę (Ach) za pomocą sparowanych zapisów wewnątrzkomórkowych. Po pomiarach elektrofizjologicznych R15 i L7 oraz inne zidentyfikowane neurony, takie jak L11 i R2, wyizolowano w celu ilościowej analizy ekspresji CREB1 (qPCR) za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR).

<table><tbody><tr><td>Aplysia</td><td>National Aplysia Resource Facility, University of Miami</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>SIGMA</td><td>S 3014-1KG</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>SIGMA</td><td>P 9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&bull; 2H2O</td><td>SIGMA</td><td>C5080- 500G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&bull; 6H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 214-501</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO4</td><td>SIGMA</td><td>S 6297-250G</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>SIGMA</td><td>H 3375-500G</td><td></td></tr><tr><td>Proteaza</td><td>GIBCO</td><td>17105-042</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Ambion</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>MP Biomedicals</td><td>2194002</td><td></td></tr><tr><td>100% etanol</td><td>ACROS</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td></td><td>Ambion AM9515</td><td></td></tr><tr><td>3 M NaOAc, pH 5,5</td><td>Ambion</td><td>AM9740</td><td></td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz</td><td>Ambion</td><td>AM9737</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do amplifikacji aRNA MessageAmp II</td><td>Ambion</td><td>AM1751</td><td></td></tr><tr><td>qScript cDNA SuperMix</td><td>Quanta Biosciences</td><td>95048-100</td><td></td></tr><tr><td>Power SYBR Green PCR Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4367659</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Szpilki minutienne ze stali nierdzewnej&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10 lub</td><td></td></tr><tr><td>26002-20</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Veriti Thermal Cycler</td><td>Applied Biosystems</td><td>Veriti Thermal Cycler</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka 5430R</td><td>Eppendorf</td><td>5430R Wirówka</td><td></td></tr><tr><td>7900HT Szybki PCR w czasie rzeczywistym</td><td>Applied Biosystems</td><td>7900HT Szybki wzmacniacz PCR</td><td></td>w czasie rzeczywistym</tr><tr><td></td><td>BRAMP-01R</td><td>NPI Elektronika</td><td></td></tr><tr><td>Digidata Converter</td><td>Instrutech ITC-18</td><td>HEKA ELEKTRONIK</td><td></td></tr><tr><td>Mikro manipulator</td><td>Patch Star</td><td>Scientifica</td><td></td></tr></tbody></table>

aplizja przygotowanie zwojów nerwowych do analiz elektrofizjologicznych i molekularnych pojedynczych neuronów

Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons

Głównym wyzwaniem w neurobiologii jest zrozumienie molekularnych podstaw obwodów neuronowych, które rządzą określonym zachowaniem. Po zidentyfikowaniu konkretnych mechanizmów molekularnych można opracować nowe strategie terapeutyczne w celu leczenia nieprawidłowości w określonych zachowaniach spowodowanych chorobami zwyrodnieniowymi lub starzeniem się układu nerwowego. Ślimak morski Aplysia californica dobrze nadaje się do badań komórkowych i molekularnych podstaw zachowania, ponieważ obwody neuronalne leżące u podstaw określonego zachowania można łatwo określić, a poszczególnymi elementami obwodów można łatwo manipulować. Te zalety Aplysia doprowadziły do kilku fundamentalnych odkryć w dziedzinie neurobiologii uczenia się i pamięci. W tym artykule opisano przygotowanie układu nerwowego Aplysia do analiz elektrofizjologicznych i molekularnych poszczególnych neuronów. Krótko mówiąc, ganglion wypreparowany z układu nerwowego jest wystawiany na działanie proteazy w celu usunięcia osłonki zwojowej tak, że neurony są odsłonięte, ale zachowują aktywność neuronalną, jak u nienaruszonego zwierzęcia. Preparat ten służy do przeprowadzania pomiarów elektrofizjologicznych pojedynczych lub mnogich neuronów. Co ważne, po zarejestrowaniu przy użyciu prostej metodologii, neurony można było wyizolować bezpośrednio ze zwojów w celu analizy ekspresji genów. Protokoły te wykorzystano do przeprowadzenia jednoczesnych zapisów elektrofizjologicznych z neuronów L7 i R15, zbadania ich odpowiedzi na acetylocholinę i ilościowego określenia ekspresji genu CREB1 w izolowanych pojedynczych neuronach L7, L11, R15 i R2 Aplysia.

Masa zwierząt wykorzystanych w niniejszym badaniu mieściła się w przedziale 100-200 g. Zgodnie z opisanymi protokołami przeprowadzono pomiary elektrofizjologiczne oraz analizę molekularną neuronów zzwojów brzusznych wyizolowanych od zwierząt o masie od 2-5 g do 200-300 g.
Standaryzacja obróbki proteazą jest istotna dla pomyślnych pomiarów elektrofizjologicznych neuronów w zwojach. Początkowo zastosowano różne stężenia i czasy inkubacji z proteazą (Dispase), rejestrując seryjne potencjały czynn...

Ślimak morski Aplysia californica był powszechnie używany jako model neurobiologiczny do badań nad komórkowymi i molekularnymi podstawami zachowania. Opisano metodologię badania układu nerwowego Aplysia do analiz elektrofizjologicznych i molekularnych pojedynczych neuronów zidentyfikowanych obwodów neuronalnych.

Aplizja Przygotowanie zwojów nerwowych do analiz elektrofizjologicznych i molekularnych pojedynczych neuronów

A major challenge in neurobiology is to understand the molecular underpinnings of neural circuitry that govern a specific behavior. Once the specific ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest badanie ekspresji genów oraz zmian elektrofizjologicznych w pojedynczych, zidentyfikowanych neuronach. Jest to realizowane poprzez wstępną, staranną identyfikację interesujących neuronów w zwoju plegia, po potraktowaniu zwoju proteazą i usunięciu jego osłonek w celu odsłonięcia neuronów. Drugim krokiem jest rejestracja właściwości elektrofizjologicznych zidentyfikowanych neuronów.Następnie, po pomiarach elektrofizjologicznych, należy wyizolować pojedyncze neurony, a następnie wyizolować z nich RNA w celu amplifikacji liniowej. Końcowym etapem jest analiza ekspresji genów za pomocą ilościowej PCR. Ostatecznie należy przeanalizować dane elektrofizjologiczne oraz dane dotyczące ekspresji genów z grup badawczych i kontrolnych, aby zidentyfikować specyficzne zmiany.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak analiza organów, tkanek czy zwojów, jest fakt, że umożliwia ona analizę na poziomie pojedynczego neuronu. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu neuronauki poznawczej, na przykład dotyczące tego, jak ekspresja genów zmienia się w pojedynczych neuronach podczas starzenia się lu

aplysia-ganglia-preparation-for-electrophysiological-molecular

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Aplysia Przygotowanie gangliów do elektrofizjologicznych i molekularnych analiz pojedynczych neuronów

Neurony *Aplysia californica* w hodowli tworzą duże stożki wzrostu, które doskonale nadają się do obrazowania wysokiej rozdzielczości w badaniu motywności i prowadzenia stożków wzrostu. W niniejszej pracy przedstawiamy protokół sekcji i wysiewu neuronów komórek torby *Aplysia* oraz przygotowania komory do obrazowania żywych komórek.

Kultury komórek neuronalnych z Aplysia do obrazowania stożków wzrostu w wysokiej rozdzielczości

Pierwotne kultury neuronów czuciowo-ruchowych Aplysia stanowią modelowe przygotowanie do badania powstawania synaps i plastyczności synaps in vitro.  Film ten przedstawia identyfikację i mikrodysekcję neuronów czuciowych i ruchowych z Aplysia ganglia, a także metody tworzenia i utrzymywania neuronów czuciowo-ruchowych w hodowli.

Przygotowanie kultur czuciowo-ruchowych komórek neuronalnych Aplysia

Opisano technikę implantacji czterech elektrod in vivo w celu monitorowania neuromięśniowej kontroli zachowania żerowania u Aplysia californica.

Wytwarzanie i implantacja elektrod u Aplysia californica do wielokanałowych rejestracji aktywności neuronalnej i mięśniowej u nienaruszonych zwierząt w swobodnym zachowaniu

Przedstawiamy sposób sterylizacji, przygotowania, napełniania medium, wysiewania komórek oraz wykorzystywania do rejestracji elektrofizjologicznej płaskich chipów do patch-clampu, wyprodukowanych w Narodowej Radzie Badań Kanady (National Research Council of Canada).

Hodowla i elektrofizjologia komórek na chipach do patch-clampingu NRCC

Prezentujemy sposób jednoczesnego monitorowania zmian stężenia wewnątrzkomórkowego wolnego wapnia oraz skuteczności synaptycznej w preparacie zwojowym Aplysia. Obrazujemy wapń wewnątrzkomórkowy z wykorzystaniem barwnika fluorescencyjnego Calcium Orange, a transmisję synaptyczną indukujemy i monitorujemy za pomocą elektrod ostrych (wewnątrzkomórkowych).

Monitorowanie zmian wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia i skuteczności synaptycznej u mięczaka Aplysia

Opisujemy technikę pozwalającą na rejestrację i stymulację pozakomórkową nerwów, mięśni oraz pojedynczych, zidentyfikowanych neuronów in vitro przy jednoczesnym wywoływaniu i obserwowaniu różnych rodzajów zachowań żerowania w aparacie gębowym Aplysia.

Przygotowanie in vitro do wywoływania i rejestrowania programów motorycznych żerowania z ruchami fizjologicznymi u Aplysia californica

U zwierząt z dużymi zidentyfikowanymi neuronami (np.), analiza puli motorycznej odbywa się za pomocą technik wewnątrzkomórkowych1,2,3,4. Niedawno opracowaliśmy technikę zewnątrzkomórkowej stymulacji i zapisu pojedynczych neuronów w Aplysia californica5. Opisujemy teraz protokół wykorzystania tej techniki do unikalnej identyfikacji i scharakteryzowania neuronów ruchowych w puli motorycznej.

Zewnątrzkomórkowa identyfikacja neuronów ruchowych w puli motorycznej mięśni u Aplysia californica

Opisujemy sekcję układu nerwowego zająca morskiego Aplysia po znieczuleniu, izolację neuronów do krótkotrwałej hodowli tkanek oraz zapisy prądów jonowych pojedynczej komórki za pomocą techniki patch clamp.

Izolacja neuronów czuciowych Aplysia californica w celu nagrań prądów glutaminergicznego za pomocą zacisków krosowych

Ten protokół przedstawia metodę obrazowania aktywności populacji neuronów z rozdzielczością pojedynczej komórki u nietransgenicznych gatunków bezkręgowców przy użyciu barwników absorbancyjnych wrażliwych na napięcie i matrycy fotodiodowej. Takie podejście umożliwia szybki przepływ pracy, w którym obrazowanie i analiza mogą być realizowane w ciągu jednego dnia.

Obrazowanie optyczne oparte na fotodiodach do rejestrowania dynamiki sieci z rozdzielczością pojedynczego neuronu u bezkręgowców nietransgenicznych

Potranskrypcyjne modyfikacje RNA reprezentują niedostatecznie zbadaną warstwę regulacji translacji, która ostatnio została powiązana z plastycznością ośrodkowego układu nerwowego. W tym miejscu opisano przygotowanie próbki i podejście oparte na chromatografii cieczowej i tandemowej spektrometrii mas w celu jednoczesnej charakterystyki licznych modyfikacji RNA w pojedynczych neuronach.

Charakterystyka modyfikacji RNA w pojedynczych neuronach za pomocą spektrometrii mas

Poznaj metodę analizy elektrofizjologicznej i molekularnej pojedynczych neuronów u Aplysia californica. Technika obejmuje identyfikację neuronów, rejestrację aktywności oraz izolację RNA do analizy ekspresji genów metodą qPCR.

Aplizja Przygotowanie zwojów nerwowych do analiz elektrofizjologicznych i molekularnych pojedynczych neuronów

Przeglądaj więcej filmów