Metoda badania wpływu chemicznie wywołanej niewydolności jajników na wydolność wysiłkową i adaptację serca u myszy

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przyspieszenie naturalnego procesu atrezji pęcherzyków w jajnikach, co prowadzi do niewydolności jajników, wyczerpania zapasów estrogenu oraz ustania cykli u samicy, co w sposób zbliżony naśladuje menopauzę. Cel ten osiąga się poprzez podawanie przez 15 do 20 kolejnych dni związku chemicznego cyklofosfanu winylu (vinyl cyclone dioxide) lub VCD, o którym wykazano, że specyficznie oddziałuje on na małe pęcherzyki jajnikowe pierwotne i pierwotne (primordial), niszcząc je poprzez przyspieszenie ich naturalnego procesu atrezji. Drugim krokiem jest określenie cyklu estralnego i cykliczności jajników za pomocą cytologii pochwy, rozpoczynając ją około sześć tygodni po rozpoczęciu iniekcji VCD.

Aby potwierdzić utratę cykliczności i niewydolność jajników, w badaniu cytologii pochwy należy zaobserwować od 15 do 20 dni utrzymującego się stanu dsestrusu lub braku cyklu. Ostatnim krokiem jest wdrożenie interwencji, na którą może wpłynąć menopauza lub okres okołomenopauzalny, takiej jak dobrowolna aktywność na kołowrotku w klatce oraz adaptacja kardiologiczna. Ostatecznie dobrowolna aktywność na kołowrotku i adaptacja kardiologiczna są wykorzystywane do wykazania, czy menopauza zmniejsza aktywność na kołowrotku.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak ektomia, jest fakt, że ektomia jest procedurą chirurgiczną prowadzącą do nagłego wyczerpania zapasów estrogenu, co różni się od naturalnej, stopniowej utraty estrogenu występującej podczas przejścia z okresu przedmenopauzalnego do pomenopauzalnego. Zastosowanie tej techniki ma znaczenie dla terapii chorób metabolicznych i sercowo-naczyniowych u kobiet w okresie pomenopauzalnym, ponieważ kobiety te są szczególnie bardziej podatne na zespół metaboliczny i związane z nim choroby współistniejące, w tym choroby sercowo-naczyniowe, w porównaniu z kobietami w okresie przedmenopauzalnym. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy cytologii pochwy są trudne do opanowania, gdyż należy zachować szczególną staranność podczas wykonywania prawidłowej techniki rozmazu oraz identyfikacji cyklu EST.

Po czwarte, dwutlenek winylocyklinu (VCD) przechowuje się w temperaturze -20 °C. Aby przygotować VCD do protokołu iniekcji, należy dodać 0,587 ml VCD do czystej fiolki dozującej, uzupełnić końcową objętość do 10 ml olejem sezamowym, zamknąć szczelnie za pomocą Parafilmu i wymieszać, delikatnie odwracając fiolkę. Przechowywać w temperaturze 4 °C przez maksymalnie siedem dni.

Aby rozpocząć protokół wstrzykiwania VCD, należy przez 20 kolejnych dni ważyć dwie myszy w wieku dwóch miesięcy oraz codziennie podawać dojambrzusznie VCD w temperaturze pokojowej w dawce 160 milligrams per kilogram, używając igły o rozmiarze 27 G podczas okresu iniekcji. Należy starać się naprzemiennie zmieniać miejsca wstrzyknięć, aby w podobny sposób zmniejszyć ryzyko wystąpienia miejscowej infekcji. Myszom kontrolnym, po zakończeniu okresu iniekcji, należy wstrzyknąć roztwór nośnika w postaci oleju sezamowego w objętości 2.5 milliliters per kilogram.

Codziennie monitoruj cykl estralny, pobierając wymazy z pochwy. Jednym z czynników kluczowych dla sukcesu tego badania jest uzyskanie wysokiej jakości wymazów z pochwy do analizy cytologicznej. Unieruchom myszy, stosując metodę chwytu za kark.

Wprowadź pipetę z 0,2 milliliters sterylnej soli fizjologicznej do ujścia pochwy na głębokość 0,5 centimeters. Pomieszaj wstrzykniętą sól fizjologiczną trzykrotnie za pomocą pipety, a następnie nanieś jedną kroplę na czyste szkiełko przedmiotowe. Bezzwłocznie oceń każdą próbkę mikroskopowo, używając standardowego mikroskopu świetlnego przy powiększeniu 100 x, aby potwierdzić niewydolność jajników.

Następnie myszy z indukowaną przez VCD menopauzą są wykorzystywane do eksperymentów związanych z wysiłkiem fizycznym. Aparatura z kołowrotkiem klatkowym składa się z koła o średnicy 11,5 cm z powierzchnią biegową o szerokości 5 cm, wyposażonego w cyfrowy licznik magnetyczny aktywowany przez obrót koła. Przed każdym biegiem należy skalibrować kołowrotek klatkowy zgodnie z wytycznymi producenta.

Zmierz średnicę wewnętrzną kołowrotka. Oblicz obwód i wprowadź tę wartość do licznika cyfrowego jako rozmiar koła; aby zamontować kołowrotek w klatce, wsuń go przez górną kratkę klatki dla zwierząt.

Przymocuj stojak koła do drutów klatki za pomocą żabinek biurowych. Żabinki powinny znajdować się w górnej części drutów, z dala od zwierzęcia. Przeciągnij moduł komputerowy i nadmiar kabla przez druty klatki.

Umieść komputer i nadmiar kabla poza zasięgiem zwierzęcia. Można to osiągnąć, kładąc średniej wielkości plastikową łódkę ważką na okablowaniu klatki, aby przytrzymała komputer i nadmiar kabla. Następnie przymocuj część komputerową cyfrowego licznika magnetycznego do podstawy kołowrotka.

Za pomocą taśmy naprawczej przymocuj wolny magnes cyfrowego licznika magnetycznego do centralnego pręta po tej samej stronie, po której znajduje się kabel łączący magnes z komputerem. Ponownie należy użyć wystarczającej ilości taśmy, aby zabezpieczyć magnes przed uszkodzeniem przez przegryzienie. Magnes powinien być ustawiony w taki sposób, aby każdy obrót koła był rejestrowany przez komputer bez żadnych zakłóceń ani oporu utrudniającego pełny obrót koła.

Przymocuj koło biegowe do podstawy. Ustaw stojak, wkładając słupki do otworów montażowych w centralnych prętach koła. Upewnij się, że koło może obracać się swobodnie.

Układ należy codziennie monitorować pod kątem uszkodzeń spowodowanych gryzieniem i w razie potrzeby naprawiać. Do eksperymentu wykorzystano siedmiomiesięczne samice myszy inbredowych szczepów C 57, black six oraz B six C3 F1, które z danego miotu zostały losowo przydzielone do grupy z reżimem ćwiczeń lub do osiadłej grupy kontrolnej. Zwierzęta eksperymentalne utrzymywano indywidualnie w klatkach o wymiarach 47 x 26 x 14,5 cm z nieograniczonym dostępem do kołowrotka przez 28 dni; zwierzęta kontrolne utrzymywano wspólnie w klatce bez kołowrotka.

Zapewnij wszystkim zwierzętom dostęp do wody i standardowej twardej karmy dla gryzoni. Dodaj lido; codziennie ręcznie zapisuj wartości przebytego dystansu oraz całkowitego czasu biegu wskazywane przez licznik magnetyczny. Wartości dystansu i czasu rejestruj każdego dnia w tym samym przedziale jednej godziny, aby uzyskać dokładne i spójne wyniki przez cały 28-dniowy okres ćwiczeń. Po każdym dniu rejestracji wyzeruj licznik magnetyczny, aby zapewnić dokładne odczyty w dniu następnym.

Po zakończeniu określonego okresu ćwiczeń, przed pobraniem tkanek, rejestruje się masę ciała uśpionych zwierząt. Aby wydobyć serce, należy wykonać cięcie pośrodkowe na stronie brzusznej, otworzyć przeponę i szybko zlokalizować serce. Wyciąć serce u nasady i umieścić w zimnym roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem, aby wystarczająco wypłukać pozostałą krew z komór. Odciąć z serca nadmiar tkanek, zważyć całe serce, a w razie potrzeby zamrozić szokowo w ciekłym azocie.

Pobrać dodatkowe wycinki tkanek, przemyć je zmodyfikowanym, lodowatym roztworem soli fizjologicznej z buforem fosforanowym, a następnie zamrozić błyskawicznie w izopentanie schłodzonym w ciekłym azocie. W niniejszym badaniu niewydolność jajników wywołano za pomocą leczenia VCD i potwierdzono poprzez badanie mikroskopowe mazie pochwowych. Stadium cyklu estralnego określa się na podstawie proporcji komórek nabłonkowych, ilości komórek nabłonkowych oraz leukocytów; w fazie PROE przeważają jądrowe komórki nabłonkowe.

Strzałki wskazują tutaj komórki zjądrowane; podczas estrusy komórki są głównie bezjądrowanymi, skwantyfikowanymi komórkami nabłonka łuskowego. Metestrus charakteryzuje się mieszanką typów komórek z przewagą leukocytów. Diestrus jest zdominowany przez leukocyty.

Cykl rujowy u myszy zazwyczaj trwa cztery dni przed wstrzyknięciem VCD. Zwierzęta uznawano za acykliczne po 15 dniach trwałego diestrusu. Rysunek ten przedstawia średnią długość w dniach cyklu rujowego w grupach otrzymujących nośnik oraz wstrzyknięty VCD.

Jeden cykl mierzono od pierwszego dnia w fazie ES do pierwszego dnia następnej rui. Cytologię pochwy w fazie ES rozpoczynano w przybliżeniu sześć tygodni po rozpoczęciu iniekcji. Zaobserwowano, że cykle ESTRO u zwierząt otrzymujących VCD stały się nieregularne w porównaniu z zwierzętami otrzymującymi nośnik, a po 12 cyklach estro cytologia wszystkich zwierząt po iniekcjach VCD nie wskazywała już na cykliczność po zakończeniu protokołu iniekcji VCD; barwienie H i e przekrojów poprzecznych tkanki jajnika ujawniło znaczną atrofię w tkance jajnika leczonej VCD w porównaniu z grupą kontrolną.

Przy powiększeniu 20 x oraz 200 x w tkance traktowanej VCD zaobserwowano całkowity ubytek pęcherzyków pierwotnych i prymordialnych. W przeciwieństwie do tkanki traktowanej nośnikiem, wpływ niewydolności jajników indukowanej przez VCD na wydajność wysiłkową przetestowano u siedmiomiesięcznych myszy dwóch szczepów, traktowanych VCD oraz nośnikiem; przez czterytygodniowy okres ćwiczeń codziennie rejestrowano wartości czasu i dystansu pokonanego przez każde zwierzę na kołowrotku klatkowym. Rysunek ten przedstawia tygodniowe średnie z codziennych wartości dystansu, czasu i prędkości biegu.

W przypadku myszy C 57, black six traktowanych nośnikiem lub VCD, nie zaobserwowano istotnych różnic w wydajności wysiłkowej, mierzonej średnim dziennym dystansem biegu oraz czasem spędzonym na kołowrotku, pomiędzy grupą traktowaną VCD a grupą kontrolną (nośnik), zarówno w szczepie C 57, black six, jak i w szczepie B six C3 F1. Wskazuje to, że wpływ niewydolności jajników indukowanej VCD na dobrowolną aktywność na kołowrotku w klatce wykracza poza co najmniej dwa szczepy myszy po zakończeniu protokołu dobrowolnych ćwiczeń na kołowrotku. Odnotowano morfometrię ciała, a serca szybko wycięto i zważono, zgodnie z wcześniejszymi obserwacjami.

Zaobserwowano przerost serca w odpowiedzi na ćwiczenia na kołowrotku w klatce, mierząc go poprzez absolutną masę serca oraz masę serca znormalizowaną do długości kości piszczelowej. Chociaż absolutna masa serca oraz stosunek masy serca do długości kości piszczelowej były znacząco większe u myszy traktowanych nośnikiem i VCD w porównaniu z grupami siedzącymi, nie stwierdzono mierzalnych różnic w przerostie serca między grupą kontrolną a grupą z indukowaną przez VCD niewydolnością jajników. Na koniec, myszy po dobrowolnych ćwiczeniach na kołowrotku w klatce, traktowane VCD oraz nośnikiem, poddano wymuszonemu biegowi na bieżni w celu określenia wydolności wysiłkowej zarówno o wysokiej, jak i niskiej intensywności.

W protokole o wysokiej intensywności średnią prędkość bieżni zwiększano stopniowo co 10 minut, aż u myszy wystąpiły oznaki wyczerpania. Średnio maksymalna prędkość myszy traktowanych nośnikiem wynosiła 26,7 ± 0,95 metrów na minutę, a maksymalna prędkość myszy traktowanych VCD przed wyczerpaniem wynosiła 28 ± 1,4 metrów na minutę. Do oceny wydolności organizmu zastosowano bieg o niższej intensywności z prędkością 20 metrów na minutę.

Średnio maksymalny czas myszy traktowanych nośnikiem przed wyczerpaniem wynosił 28,3 ± 1,3 minuty, a maksymalny czas myszy traktowanych VCD wynosił 29,7 ± 1,4 minuty. Nie stwierdzono istotnych różnic w wydolności wysiłkowej o wysokiej lub niskiej intensywności pomiędzy grupą traktowaną nośnikiem a grupą traktowaną VCD, co wskazuje, że wywołana przez VCD niewydolność jajników nie miała wpływu na wydolność wysiłkową myszy. Po opracowaniu technika ten utorował drogę badaczom z zakresu nauk komórkowych, molekularnych i fizjologicznych do zbadania roli menopauzy u gryzoni.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak prawidłowo wykonywać iniekcje VCD, przeprowadzać cytologię pochwy oraz wdrażać interwencję fizjologiczną.