Optymalizacja hodowli komórek glejaka o wysokim stopniu złośliwości z próbek chirurgicznych do zastosowania w klinicznie istotnych modelach zwierzęcych i immunochemii 3D

Ogólnym celem tej procedury jest opracowanie rutynowej sfery nerwicowej, hodowla gwiaździaków o wysokim stopniu złośliwości oraz ekspansja komórek nowotworowych na dużą skalę do badań przedklinicznych. Osiąga się to poprzez najpierw ostrą dysocjację świeżych próbek guza i oddzielenie pojedynczych komórek od czerwonych krwinek i szczątków. W drugim etapie komórki nowotworowe są hodowane w sferze nerwicowej, pożywce uzupełnionej czynnikami wzrostu do momentu zaobserwowania neurosfer.

Neurosfery mogą być hodowane do eksperymentów in vivo i charakterystyki molekularnej lub formalne i utrwalone i osadzone w parafinie w celu charakterystyki immunologicznej. Ostatecznie można ocenić długoterminowe samoodnawianie się ortotopowego guza i profilowanie molekularne kultur sfery nerwowej. Główną zaletą w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak długoterminowe hodowle surowicy 10% FBS, jest to, że technika ta zachowuje cechy molekularne i genetyczne pierwotnego guza.

Metoda ta umożliwia stworzenie żywego banku nowotworów w celu wygenerowania specyficznych dla pacjenta kultur komórkowych glejaka wielopostaciowego i modeli zwierzęcych do badań klinicznych. Implikacje tego modelu dla testów terapeutycznych dla pacjentów z glejakiem złośliwym są oczywiste. Model najlepiej odzwierciedla guz pierwotny i umożliwia przeprowadzanie testów terapeutycznych w środowisku przedklinicznym.

Chociaż ta metoda może zapewnić wgląd w glejaki o wysokim stopniu złośliwości, może być również stosowana do innych nowotworów ludzkich i zwierzęcych. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały problemy, ponieważ wymaga ona odpowiednich sterylnych technik i pielęgnacji oraz wielu kroków, aby sprzyjać długoterminowej żywotności komórek. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł metody histologii 3D ze względu na lepszą subkomórkową lokalizację znakowanych białek i skrawków w stosunku do bardziej powszechnych metod znakowania i obrazowania całych neurosfer lub dysocjacji komórek.

Wizualna demonstracja tej metody histologicznej ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy utrwalania, czyszczenia, przetwarzania i osadzania są trudne do nauczenia. Należy zadbać o to, aby wszystkie neurosfery były odpowiednio wystawione na działanie odczynników i równomiernie przetwarzane, co daje najlepszą dostępną osadkę dla morfologii i chemii immunologicznej. Zaczynając od 200 do 500 miligramów próbki guza, użyj ostrza skalpela, aby zmielić tkankę.

Przenieś kawałki do 15-mililitrowej probówki zawierającej 10 mililitrów pożywki, a następnie kilkakrotnie odwróć zawiesinę, aby wymieszać roztwór tkankowy. Pozwól kawałkom guza osadzać się grawitacyjnie, a następnie usuń podłoże. Kontynuuj zmywanie zanieczyszczeń z kawałków guza, aż podłoże przestanie być twarde.

Następnie usuń pożywkę. Dodaj dwa mililitry enzymatycznego roztworu dysocjacji tkanek na 0,5 grama mieszanej próbki guza i delikatnie wymieszaj roztwór przez inwersję. Roztwór tkankowy inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze do hodowli tkankowych na zmianę.

Po 30 minutach trzykrotnie napełnij zawiesinę za pomocą dwumililitrowej pipety. Gdy guz zostanie strawiony do zawiesiny przeważnie jednokomórkowej, należy zatrzymać enzymy dwiema objętościami roztworu zatrzymującego i wymieszać zawiesinę komórkową za pomocą pięciomililitrowej pipety serologicznej. Teraz odfiltruj niestrawiony materiał przez sitko o średnicy 40 mikrometrów i osadzaj komórki przez pięć minut w temperaturze 800 razy G i temperaturze pokojowej.

Następnie po trzech płukaniach w 10 mililitrach pożywki, resus, zawiesić końcowe osady komórkowe w pięciu mililitrach pożywki. Powoli ułóż tę zawiesinę komórkową na pięciu mililitrach limfy lekkiej M, a następnie oddziel populacje komórek na 20 minut w temperaturze 1300 razy G i temperaturze pokojowej. Teraz zbierz warstwę interfejsu zawierającą komórki jądrzaste do 15-mililitrowej probówki zawierającej 10 mililitrów pożywki.

Następnie ponownie zawieś komórki w pożywce sfery nerwowej uzupełnionej czynnikami wzrostu i umieść je w ilości mniejszej niż 10 do piątej komórki na mililitr. W nieregularnej kolbie do hodowli tkankowej T 25 w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. W nawilżanym inkubatorze do hodowli tkankowych.

Przenieś unoszące się neurosfery, które tworzą się w ciągu jednego do trzech tygodni, do świeżej kolby, aby oddzielić je od przyczepionych komórek i zanieczyszczeń. Aby przeanalizować neurosfery za pomocą chemii immunohisto, najpierw zapiecz neurosfery, a następnie uważaj, aby nie zakłócić pastylki. Usunąć supernatant i dodać 10 mililitrów DPBS do probówki.

Następnie wyjmij DPBS, ponownie zawiesić osad w 10% neutralnej buforowanej forminie i inkubuj komórki przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Po ponownym granulowaniu sterydów, ponownie zawiesić je w serii inkubacji etanolu. Po drugiej inkubacji 95% etanolu ponownie zawiesić PHE z absolutnym etanolem, aż komórki będą jasne, białe i skondensowane.

Następnie zrób mały stożek z papieru do soczewek. Umieść go w małym lejku w zlewce i zwilż bibułę do soczewek alkoholem bezustannym. Lekko poluzuj granulkę świeżym 100% etanolem, a następnie odlej nadmiar alkoholu.

Przelej kulki przez papierowy stożek soczewki, upewniając się, że idą do końcówki i przepłucz rurkę dodatkowym absolutnym etanolem. Wlej pozostały steryd przez papierowy stożek soczewki, a następnie wyjmij stożek z lejka. Następnie złóż papier do soczewek w kwadrat, upewniając się, że sterydy są tak bezpiecznie zamknięte, jak to możliwe, i przenieś pakiet neurosfer do kasety.

Teraz umieść kasetę w automatycznym procesorze tkanek i uruchom procesor. Następnie wyjmij kasetę i umieść ją na rozgrzanej części systemu zatapiania parafiny. Po upewnieniu się, że powierzchnia jest wolna od fragmentów, kurzu lub innych zanieczyszczeń, odsysaj całą parafinę z kleszczy w studniach grzewczych.

Następnie podgrzej czystą parę kleszczy bez parafiny i dodaj niewielką ilość parafiny do podgrzanej formy bazowej. Teraz wyjmij pakiet z kasety i umieść go na rozgrzanej części systemu zatapiania. Ostrożnie otwórz papier, aż rożen będzie widoczny.

Użyj wstępnie rozgrzanych kleszczyków, aby zebrać jak najwięcej materiału, a następnie przenieś sferoidy do ciekłej parafiny w formie podstawowej. Ostrożnie rozbić wszelkie grudki i przenieść steryd z dala od rogów do jednolitej warstwy centralnej. Przenieś formę bazową do obszaru chłodzenia, aby zabezpieczyć steryd na miejscu.

Na koniec dodaj kasetę i powoli napełniaj ją parafiną. Gdy kaseta całkowicie schłodzi blok parafiny sfery nerwowej można podzielić na sekcje w celu immunohistochemii, jak opisano w tabeli. Skuteczność tego protokołu w ustanawianiu długoterminowych kultur sfery neuros z 88 nowo zdiagnozowanych i 37 nawrotów guzów wyniosła 41,6%Podobna zarówno dla nowo zdiagnozowanych guzów, jak i nowotworów nawracających.

W przypadku niektórych próbek glejaka neurosfery uformowały się w ciągu pierwszych kilku dni, podczas gdy w przypadku innych wymagany był dłuższy czas hodowli. Skuteczność tworzenia sfery nerwów nie zależała wyłącznie od poziomu martwicy tkanki, czego przykładem są wyniki nowo zdiagnozowanego guza o dużej gęstości komórek oraz nawrotu i martwiczego guza, oba przetworzone, jak właśnie wykazano, i dające neurosfery testujące potencjał rakotwórczy każdej sfery nerwicowej. Hodowla u myszy z obniżoną odpornością jest kluczową walidacją tego podejścia w celu wzbogacenia nowotworowych komórek macierzystych.

W tym eksperymencie dwie różne kultury nerwiaka glejaka zostały wszczepione do mózgów myszy z obniżoną odpornością. Guzy ksenoprzeszczepu wykazywały cechy morfologiczne glejaków, takie jak inwazja do mózgu, miąższ i martwica. W tym eksperymencie komórki, które nie tworzyły neurosfer, hodowano w pożywce ze sfery neurologicznej uzupełnionej 2% FBS, tworzeniem guza przez te alternatywne komórki pożywki.

W porównaniu z glejakiem, oceniono ksenoprzeszczep w posiewach neurosfer u nagich myszy. Brak różnic w przeżywalności. Zaobserwowano dynamikę wzrostu lub morfologię guza między dwiema metodami hodowli przedroślinnej.

Podczas gdy markery nerwowych komórek macierzystych, w tym SOX 2, są regulowane w dół w większości pierwotnych komórek glejaka hodowanych w 10% komórkach glejaka FBS hodowanych w pożywce neurosferycznej, uzupełnione 2% FBS zachowują ekspresję SOX dwa po przetworzeniu, jak właśnie wykazano. W tym eksperymencie neurosfery zostały oznaczone przeciwciałem H i E antiox two w celu wykazania lokalizacji jądrowej i przeciwciałem przeciwko naskórkowi czynnikowi wzrostu w celu zilustrowania lokalizacji błony komórkowej. Jak pokazują uzyskane obrazy, zademonstrowana metoda optymalizuje analizę ekspresji białek i modyfikacji potranslacyjnych przy zachowaniu architektury 3D neurosfer Po opanowaniu tę technikę dysocjacji tkanek można wykonać w ciągu około dwóch godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo Podczas próby zabiegu należy pamiętać, że odstęp czasu między operacją a asocjacją, a także niejednorodny skład molekularny glejaków o wysokim stopniu złośliwości może wpływać na wynik Po tej procedurze.

Inne metody, takie jak implantacja wewnątrzczaszkowa, mogą być wykonywane w celu odtworzenia oryginalnego guza w modelach zwierzęcych. Technika ta rewolucjonizuje neuroonkologię, umożliwiając przeprowadzanie badań przedklinicznych w środowisku klinicznie istotnym. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak rozwijać i utrzymywać długoterminowe neurosfery, a także jak wytwarzać formalne i stałe neurosfery zatopione w parafinie do analizy molekularnej.

Nie zapominaj, że praca z tkankami ludzkimi może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze stosować środki ostrożności, takie jak środki ochrony osobistej, kompatybilne i potencjalnie niebezpieczne środki.