Name: Badanie migracji komórek w kanałach mikroprefabrykowanych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Poznaj metodę badania migracji komórek w mikroprefabrykowanych kanałach PDMS. Technika umożliwia ilościową analizę dynamiki ruchu komórek dendrytycznych w kontrolowanym środowisku z ograniczeniem przestrzennym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy bardzo cenią platformę PICT IBiSA w Instytucie Curie (CNRS UMR144). Praca została sfinansowana z grantów: Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych dla A-M. L-D (Strapacemi 243103), Association Nationale pour la Recherche (ANR-09-PIRI-0027-PCVI), fundacji InnaBiosanté (Micemico) do M.P. i A-M. L-D i grant ERC Strapacemi dla młodego badacza dla A-M. L-D.

Ważna uwaga: Ten protokół zakłada, że forma zawierająca kształt dla pożądanych mikrokanałów została już wykonana. Dalsze informacje na temat przygotowania formy zostały już opublikowane10. Protokół ten zakłada również, że posiew DC szpiku kostnego jest znany.
1. Produkcja chipów
<ol>
	<li>Wymieszaj olej PDMS i utwardzacz w stosunku wagowym 10:1 w plastikowym kubku. Dokładnie wymieszaj oba związki.</li>
	<li>Odlej mieszankę na mikrokanaliki z łożyskiem formy. Całkowita wysokość musi wynosić od 0,5 do 1 cm.</li>
	<li>Usuń pęcherzyki powietrza z dzwonu słoika próżniowego w ciągu 1 godziny.</li>
	<li>Utwardź PDMS w formie, umieszczając go w piekarniku na 2 godziny w temperaturze 65 °C.</li>
	<li>Gdy PDMS osiągnie temperaturę pokojową, wytnij duży kawałek wokół konstrukcji za pomocą ostrza chirurgicznego i oderwij go od formy (ryc. 1A).</li>
	<li>Wywierć otwory, w które zostaną wstrzyknięte komórki (zwykle 2 mm) i zmień rozmiar PDMS za pomocą ostrza chirurgicznego, aby dopasować rozmiar do naczyń ze szklanym dnem, w których będzie oceniana migracja (ryc. 1B). Przed kontynuowaniem usuń resztki kurzu z naczynia za pomocą papieru do czyszczenia soczewek. Sprzyja to wiązaniu PDMS ze szkłem opisanym w kroku 1.10.</li>
	<li>Wyczyść chip PDMS o zmienionym rozmiarze zawierający kanały, przyklejając i odklejając taśmę klejącą po bokach konstrukcji.</li>
	<li>Sonikuj kawałki PDMS przez 30 sekund w 70% etanolu, aby usunąć pyły i małe cząsteczki PDMS. Następnie szybko je wysusz, wydmuchując czyste powietrze.</li>
	<li>Aktywuj PDMS (struktury do góry) i szalki hodowlane za pomocą obróbki plazmą powietrzną (lub tlenową) w ciągu 30 sekund przy 300 mTorr.</li>
	<li>Umieść obie aktywowane powierzchnie w kontakcie, aby trwale przykleić PDMS do podłoża. W razie potrzeby użyj metalowych kleszczyków, aby lekko docisnąć górną część PDMS, aby wymusić kontakt między polimerem a szklanką naczynia (Rysunek 1C).</li>
	<li>Inkubować chipsy w piekarniku w temperaturze 65 °C przez 1 godzinę, aby wzmocnić wiązanie.</li>
</ol>
2. Powlekanie mikrokanalików
<ol>
	<li>Aktywuj całą strukturę za pomocą plazmy powietrznej o temperaturze 300 mTorr przez 1 min. Ułatwi to wejście cieczy do kanałów w następnym kroku.</li>
	<li>Szybko napełnij otwory wejściowe chipa fibronektyną w stężeniu 10 μg/ml w wodzie. Inne podłoża, takie jak PEG, mogą być używane do modyfikowania przylegania komórek do ścian kanału. Zwróć uwagę, aby płyn rozchodził się po całej konstrukcji. Można to łatwo sprawdzić wzrokowo przy zwykłym świetle lub za pomocą zwykłego mikroskopu jasnego pola. 
	UWAGA: W bardzo małych konstrukcjach, w których dyfuzja jest trudniejsza, wejście cieczy do kanałów można wymusić poprzez umieszczenie struktury w dzwonie słoika próżniowego na co najmniej 15 minut. Aby sprawdzić skuteczność powłoki, można użyć podłoży fluorescencyjnych (rysunek 2).</li>
	<li>Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, aby umożliwić adsorpcję fibronektyny lub innego podłoża powlekającego do ścianek kanałów.</li>
	<li>Umyj struktury 3x PBS, aby usunąć niezwiązane podłoże.</li>
	<li>Po umyciu należy przejść do protokołu 3 lub przechowywać chip w temperaturze 4 °C do późniejszego użycia (maksymalnie 24 godziny).</li>
</ol>
3. Wczytywanie komórek
<ol>
	<li>Usunąć PBS z płytki i napełnić mikrosystem pożywką komórkową. Pozostawić do inkubacji przez 1 godzinę, aby nasycić kanały pożywką. 
	UWAGA: W przypadku eksperymentów z udziałem leków, takich jak inhibitory molekularne, zaleca się wstępną inkubację kanałów z pożywką zawierającą lek o odpowiednim stężeniu. Ponadto niektóre leki mają tendencję do rozpuszczania się w strukturze PDMS, co zmniejsza efektywne stężenie. Zaproponowano pewne rozwiązania, które mają przeciwdziałać temu problemowi11-12.</li>
	<li>Usuń pływające DC i odzyskaj częściowo przylegające komórki, przepłukując je pożywką hodowlaną. Policz komórki za pomocą hemocytometru. 
	UWAGA: W przypadku obrazowania jądra można wcześniej wybarwić Hoechst 33342 poprzez inkubację 2 x 106 komórek w ciągu 30 minut z barwnikiem o stężeniu 200 ng / ml w kompletnym pożywce. Umyj dwukrotnie przez odwirowanie, aby usunąć nadmiar barwnika przed kontynuowaniem protokołu.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut (czas i prędkość mogą się różnić w zależności od typu komórki) i wyrzucić pożywkę. Rozcieńczyć osad do uzyskania stężenia 20 x 106 komórek/ml.</li>
	<li>Usunąć nadmiar pożywki z płytki i opróżnić otwory wejściowe w strukturze PDMS za pomocą mikropipety. Wypełnij wpisy 5 μl roztworu komórek, aby uzyskać ilość 1 x 105 komórek w każdym otworze wejściowym. 
	UWAGA: Wymagana jest wysoka gęstość komórek, aby sprzyjać kontaktowi komórek z kanałami. Niskie zagęszczenie komórek może skutkować małą liczbą komórek wewnątrz kanałów i niepowodzeniem eksperymentu.</li>
	<li>Inkubować mikroczip przez 30 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze. Dodać 2 ml kompletnej pożywki do naczynia doświadczalnego. 
	UWAGA: Cała struktura PDMS musi być pokryta, aby uniknąć wysuszenia komórek podczas eksperymentu. Jeśli 2 ml to za mało, dodaj więcej pożywki, aby całkowicie pokryć strukturę PDMS.</li>
</ol>
4. Obrazowanie
<ol>
	<li>Oczyść zewnętrzną dolną powierzchnię naczyń chusteczką do czyszczenia soczewek przed umieszczeniem płytek pod mikroskopem.</li>
	<li>Aby przeanalizować migrację w dużej liczbie komórek, należy użyć 10-krotnego powiększenia i oświetlenia o szerokim polu widzenia w wideomikroskopie wyposażonym w CO2 i temperaturę (ryc. 3). Aby ułatwić śledzenie komórek, można zastosować barwienie Hoechst i światło UV (patrz krok 3.2). Migrację można również analizować za pomocą mikroskopii konfokalnej w celu uzyskania wyższej rozdzielczości struktur komórkowych podczas migracji.</li>
	<li>W przypadku mikroskopii poklatkowej z prędkością 10X wybierz częstotliwość czasu zgodnie z oczekiwaną prędkością komórki (zwykle 2 minuty dla komórek dendrytycznych migrujących z prędkością 5 μm/min). 
	nuta: Opisany tutaj protokół nie obejmuje analizy parametrów migracji komórek. W dyskusji wymieniono kilka punktów, które mają doradzić czytelnikom, jak postępować w celu wydobycia informacji z filmów poklatkowych.</li>
</ol>

<ol><li>Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration%3A+a+physically+integrated+molecular+process%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell migration: a physically integrated molecular process.</a> Cell. 84 (3), 359-369 (1996).</li>
<li>Lämmermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+leukocyte+migration+by+integrin-independent+flowing+and+squeezing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing.</a> Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).</li>
<li>Schor, S. L., Allen, T. D., Harrison, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration+through+three-dimensional+gels+of+native+collagen+fibres%3A+collagenolytic+activity+is+not+required+for+the+migration+of+two+permanent+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Cell migration through three-dimensional gels of native collagen fibres: collagenolytic activity is not required for the migration of two permanent cell lines.</a> J. Cell. Sci. 41, 159-175 (1980).</li>
<li>Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decisions+about+dendritic+cells%3A+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Decisions about dendritic cells: past, present, and future.</a> Annu. Rev. Immunol. 30, 1-22 (2012).</li>
<li>Faure-André, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+dendritic+cell+migration+by+CD74%2C+the+MHC+class+II-associated+invariant+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of dendritic cell migration by CD74, the MHC class II-associated invariant chain.</a> Science. 322 (5908), 1705-1710 (2008).</li>
<li>Renkawitz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+force+transmission+in+amoeboid+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Adaptive force transmission in amoeboid cell migration.</a> Nat. Cell Biol. 11 (12), 1438-1443 (2008).</li>
<li>Jacobelli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confinement-optimized+three-dimensional+T+cell+amoeboid+motility+is+modulated+via+myosin+IIA-regulated+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Confinement-optimized three-dimensional T cell amoeboid motility is modulated via myosin IIA-regulated adhesions.</a> Nat. Immunol. 11 (10), 953-961 (2010).</li>
<li>Irimia, D., Charras, G., Agrawal, N., Mitchinson, T., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polar+stimulation+and+constrained+cell+migration+in+microfluidic+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Polar stimulation and constrained cell migration in microfluidic channels.</a> Lab Chip. 7 (12), 1783-1790 (2007).</li>
<li>Moreau, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+in+situ+cytometry+uncovers+T+cell+receptor+signaling+during+immunological+synapses+and+kinapses+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Dynamic in situ cytometry uncovers T cell receptor signaling during immunological synapses and kinapses in vivo.</a> Immunity. 37 (2), 351-363 (2012).</li>
<li>Heuzé, M. L., Collin, O., Terriac, E., Lennon-Duménil, A. M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration+in+confinement%3A+a+micro-channel-based+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell migration in confinement: a micro-channel-based assay.</a> Methods Mol. Biol. 769, 415-434 (2011).</li>
<li>Ren, K., Zhao, Y., Su, J., Ryan, D., Wu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convenient+method+for+modifying+poly%28dimethylsiloxane%29+to+be+airtight+and+resistive+against+absorption+of+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Convenient method for modifying poly(dimethylsiloxane) to be airtight and resistive against absorption of small molecules.</a> Anal. Chem. 82 (14), 5965-5971 (2010).</li>
<li>Ren, K., Dai, W., Zhou, J., Su, J., Wu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-Teflon+microfluidic+chips%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Whole-Teflon microfluidic chips.</a> PNAS. 108 (20), 8162-8166 (2011).</li>
<li>Maiuri, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+first+World+Cell+Race%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The first World Cell Race.</a> Curr Biol. 22 (17), 673-675 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu opisujemy urządzenie złożone z mikrokanałów jako metodę badania właściwości migracyjnych dużej liczby komórek w pojedynczych eksperymentach. Ten eksperymentalny system naśladuje ograniczone ograniczenia środowiskowe występujące w tkankach przez endogenne komórki migrujące. Jednak wymuszając migrację w jednym wymiarze, ułatwia automatyczne śledzenie komórek i ekstrakcję mierzalnych danych (ryc. 5). Pokazujemy również, że nasze urządzenie jest kompatybilne z mikroskopią fluorescencyjną i dlat...

Migracja to złożona funkcja komórkowa, która jest ważna dla wielu procesów fizjologicznych w organizmach wielokomórkowych, w tym rozwoju, odpowiedzi immunologicznych i regeneracji tkanek. Ponadto niektóre sytuacje patologiczne, takie jak inwazja guza i przerzuty, zależą od ruchliwości komórek1. Z tych powodów migracja komórek stała się głównym obszarem badań zarówno w kontekście badań podstawowych, jak i translacyjnych. In vivo większość tkanek charakteryzuje się bogatą macierzą zewnątrzkomórkową i dużą gęstością komórek. Migracja komórek w warunkach fizjologicznych zachodzi zatem w złożonym, zamkniętym środowisku. Klasycznie, najprawdopodobniej ze względów historycznych i ograniczeń technicznych, migrację komórek badano w płaskich systemach 2D, które nie odtwarzają wielu właściwości środowiskowych występujących w tkankach, takich jak uwięzienie. Co więcej, ostatnio wykazano, że czynniki takie jak adhezja komórek, które są niezbędne dla ruchliwości w 2D, niekoniecznie są wymagane do migracji in vivo lub wewnątrz żeli, co sugeruje, że mechanizmy rządzące lokomocją, które rządzą lokomocją, w 2D i w innych środowiskach, są odrębne2. Opracowano kilka systemów naśladujących złożone właściwości tkanek, z których najbardziej znane to żele kolagenowe, które mają na celu rekapitulację właściwości kompozycji macierzy zewnątrzkomórkowej3. W tym miejscu proponujemy mikrokanały jako prostą metodę uzupełniającą, która umożliwia badanie migracji komórek w jednym wymiarze w ograniczonym środowisku.
W tym systemie komórki migrują wzdłuż mikrokanałów, do których wchodzą spontanicznie. Komórki wędrowne nabierają następnie kształtu kanałów, przyjmując geometrię rurkową, która najprawdopodobniej wzmacnia ich polarność. Liniowy ruch komórek w kanałach umożliwia automatyczne śledzenie komórek i ekstrakcję parametrów ilościowych z eksperymentów. Z technicznego punktu widzenia system ten jest łatwy i elastyczny. Powłoką ścianek kanałów można manipulować, dostosowywać rozmiar i kształt kanałów, a w pojedynczych eksperymentach można analizować dużą liczbę komórek. System ten można również rozbudować w celu przeprowadzenia analizy przesiewowej cząsteczek biorących udział w ruchliwości komórek w średnim zakresie. Opisany tutaj protokół został ustandaryzowany przy użyciu komórek dendrytycznych (DC) jako modelu komórkowego. Komórki te mają kluczowe znaczenie dla układu odpornościowego, ponieważ uczestniczą w inicjacji i utrzymaniu specyficznych odpowiedzi immunologicznych4. W badaniach in vitro wykazano, że DC spontanicznie migrują w ograniczonych środowiskach i dlatego są dobrym modelem do badania ruchliwości komórek w mikrokanałach5,6. Co ważne, system ten można rozszerzyć o analizę migracji dowolnego innego typu komórek ruchliwych, takich jak limfocyty T, neutrofile lub komórki nowotworowe7-9.

<table><tbody><tr><td>Polidimetylosiloksan (PDMS)GE</td> <td>Silikony</td><td>RTV615</td><td>Pakiet 90% bazy silikonowej i 10% utwardzacza</td></tr><tr><td>Frez do próbek</td><td>rdzeniowych Ted Pella Int.</td><td>Harris Uni-Core</td><td>Średnica 2,5 mm</td></tr><tr><td>Naczynie ze szklanym dnem</td><td>WPI</td><td>Fluorodish FD 35-100</td><td></td></tr><tr><td>Myjka ultradźwiękowa</td><td>Branson Ultrasonics</td><td>Branson 200</td><td></td></tr><tr><td>Myjka plazmowa</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC 32 G</td><td>Do małych próbek (35 szalek). Dostępna jest również większa wersja</td></tr><tr><td>Fibronektyna z osocza bydlęcego</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F0895</td><td></td></tr><tr><td>PEG szczepiony polilizyną (Pll-g-PEG)</td><td>Susos</td><td>PLL(20)-g[3.5]-PEG(5)</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>TOCRIS</td><td>1254</td><td></td></tr></tbody></table>

badanie migracji komórek w kanałach mikroprefabrykowanych

Study of Cell Migration in Microfabricated Channels

Opisana tutaj metoda pozwala na badanie migracji komórek w zamknięciu w jednym wymiarze. Opiera się na wykorzystaniu mikrofabrykowanych kanałów, które narzucają komórkom spolaryzowany fenotyp za pomocą fizycznych ograniczeń. Po wejściu do kanałów komórki mają tylko dwie możliwości: poruszać się do przodu lub do tyłu. Ta uproszczona migracja, w której kierunkowość jest ograniczona, ułatwia automatyczne śledzenie komórek i ekstrakcję parametrów ilościowych w celu opisania ruchu komórek. Parametry te obejmują prędkość komórki, zmiany kierunku i przerwy podczas ruchu. Mikrokanaliki są również kompatybilne z użyciem markerów fluorescencyjnych i dlatego nadają się do badania lokalizacji organelli i struktur wewnątrzkomórkowych podczas migracji komórek w wysokiej rozdzielczości. Wreszcie, powierzchnia kanałów może być funkcjonalizowana za pomocą różnych substratów, co pozwala na kontrolę właściwości adhezyjnych kanałów lub badanie haptotaksji. Podsumowując, opisany tutaj system przeznaczony jest do analizy migracji dużej liczby komórek w warunkach, w których zarówno geometria, jak i biochemiczny charakter środowiska są kontrolowane, ułatwiając normalizację i odtwarzalność niezależnych eksperymentów.

W każdym eksperymencie powierzchnia PDMS jest powlekana cząsteczką dostosowaną do celu badania. Rysunek 2 przedstawia kanały powlekane fluorescencyjną cząsteczką, PLL-g-PEG, przed i po płukaniu (krok 2.4). Taki eksperyment pozwala na kontrolę jednorodności powłoki w kanałach.
Po załadowaniu komórek można przeprowadzić mikroskopię wideo w celu śledzenia migracji komórek. Rysunek 3A przedstawia przykład migracji komórek DC w mikrokanałach przy gęstości odpowiedn...

Opisano ilościową metodę badania spontanicznej migracji komórek w jednowymiarowym, zamkniętym mikrośrodowisku. Metoda ta wykorzystuje mikrofabrykowane kanały i może być stosowana do badania migracji dużej liczby komórek w różnych warunkach w pojedynczych eksperymentach.

Badanie migracji komórek w kanałach mikroprefabrykowanych

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest przygotowanie mikrofabrykowanych kanałów do badania spontanicznej ograniczonej migracji komórek. Osiąga się to poprzez przygotowanie w pierwszym etapie płytki z polidimetylosiloksanu (PDMS) zawierającej kanały. W drugim kroku kanały są powlekane fibronektyną lub innym podłożem powlekającym, co umożliwia funkcjonalizację urządzenia.Po kilku przemyciach komórki dendrytyczne są wprowadzane do mikrosystemu w celu zbadania migracji komórek. Na podstawie mikroskopii i analizy obrazów uzyskuje się wyniki wykazujące różnice w prędkości dla różnych typów komórek lub zastosowanych zabiegów. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak klasyczna migracja dwukierunkowa, jest to, że konfrontujemy geometrię z ograniczeniem przestrzeni komórek.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności ze względu na precyzję wymaganą na każdym etapie. Aby rozpocząć, wymieszaj PDMS i czynnik sieciujący w plastikowym kubku w stosunku masowym 10:1. Po dokładnym wymieszaniu obu składników, wlej mieszaninę na formę zawierającą mikrokanały. Całkowita wysokość warstwy musi wynosić od 0,5 do 1 cm.Usuń pęcherzyki powietrza w komorze próżniowej przez jedną godzinę, a następnie utwardź PDMS w formie, umieszczając ją w piekarniku przez dwie godziny w temperaturze 65 °C. Po ochłodzeniu PDMS do temperatury pokojowej, wytnij skalpelem większy fragment wokół struktury i odlep go od formy. Następnie wywierć otwory w miejscach, w których będą wstrzykiwane komórki, a potem przytnij PDMS skalpelem tak, aby pasował do szalek z szklanym dnem, w których będzie oceniana migracja. Oczyść.Po zmianie rozmiaru chipa PDMS zawierającego kanały poprzez naklejanie i odklejanie taśmy klejącej z boków struktury, poddaj fragmenty PDMS sonicacji przez 30 sekund w 70% etanolu w celu usunięcia kurzu i drobnych cząsteczek PDMS przed dalszą procedurą. Usuń pozostały kurz z naczynia za pomocą papieru do czyszczenia soczewek.Aktywuj PDMS oraz naczynia hodowlane za pomocą obróbki plazmą powietrzną przez 30 sekund przy 300 Milit, a następnie, jeśli jest to konieczne, zetknij obie aktywowane powierzchnie, aby trwale przytwierdzić PDMS do podłoża. Użyj metalowej pęsety, aby lekko docisnąć górną część PDMS i wymusić kontakt między polimerem a szkłem naczynia. Inkubuj chip w piekarniku w temperaturze 65 °C przez jedną godzinę.Aby wzmocnić wiązanie, aktywuj całą strukturę za pomocą plazmy powietrznej przy ciśnieniu 300 millitorr przez jedną minutę. Sprzyja to wprowadzaniu cieczy do kanałów w kolejnym kroku. Następnie szybko wypełnij otwory wlotowe chipa fibonektyną w stężeniu 10 µg/mL w wodzie.W celu modyfikacji przylegania komórek do ścianek kanału można zastosować inne podłoża, takie jak glikol polietylenowy. Należy upewnić się, że ciecz rozprzestrzenia się w całej strukturze. Można to łatwo sprawdzić wzrokowo w świetle zwykłym lub za pomocą standardowego mikroskopu w jasnym polu.Następnie inkubować strukturę przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, aby umożliwić absorpcję fibronektyny lub innego substratu powlekającego do ścianek kanałów. Na koniec wypłukać struktury w celu usunięcia niezwiązanego substratu, usuwając cały płyn z kanałów i naczynia, a następnie namoczyć w świeżym roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo lub PBS przez pięć minut. Usunąć PBS z płytki i wypełnić mikrosystem pożywką komórkową.Inkubować płytkę przez jedną godzinę, aby nasycić kanały medium w celu zebrania komórek do obrazowania. Usunąć pływające komórki dendrytyczne i odzyskać komórki półprzylegające poprzez przepłukanie płytki medium hodowlanym. Przed zliczeniem komórek.Używając komory countingowej (hemocytometru), odwiruj komórki przy 300 ×g przez pięć minut i odlej pożywkę. Rozcieńcz osad, aby uzyskać stężenie 20 milionów komórek na mililitr. Usuń nadmiar pożywki z płytki i opróżnij otwory wlotowe w strukturze PDMS.Używając mikropipety, napełnij otwory wejściowe pięcioma mikrolitrami roztworu komórek, aby uzyskać stężenie 1 × 10⁵ komórek w każdym otworze. Po inkubowaniu mikrochipu przez 30 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze, dodaj dwa mililitry pełnej pożywki do naczynia eksperymentalnego w celu przeprowadzenia obrazowania.Najpierw, przed umieszczeniem szalek pod mikroskopem, należy oczyścić zewnętrzną powierzchnię ich dna za pomocą chusteczek do czyszczenia soczewek. Aby przeanalizować migrację w dużej liczbie komórek, należy zastosować powiększenie 10x oraz oświetlenie szerokopolowe w mikroskopie wideo wyposażonym w kontrolę temperatury i stężenia CO2, co ułatwi śledzenie komórek. Zgodnie z opisem w protokole tekstowym, do mikroskopii poklatkowej przy powiększeniu 10x można zastosować barwienie Hirscha i światło UV.Wybierz częstotliwość czasową zgodnie z oczekiwaną prędkością komórek. Zazwyczaj wynosi ona dwie minuty dla komórek dendrytycznych migrujących z prędkością pięciu mikronów na minutę. W każdym eksperymencie powierzchnia PDMS jest powlekana cząsteczką dobraną do celu badania.Na tej rycinie kanały są pokryte cząsteczką fluorescencyjną. Polilizyna szczepiona glikolem polietylenowym przed i po płukaniu. Taki eksperyment pozwala na kontrolę jednorodności powłoki w kanałach po załadowaniu komórek; można przeprowadzić mikroskopię wideo w celu śledzenia migracji komórek.Oto przykład komórek dendrytycznych migrujących w mikrokanałach przy gęstości umożliwiającej śledzenie tych komórek. W tym celu można zastosować zarówno kontrast fazowy, jak i barwienie Hersch. Technika ta jest również kompatybilna z konfokalną mikroskopią fluorescencyjną o wyższej rozdzielczości i może być wykorzystywana do śledzenia organelli lub struktur komórkowych, co pokazano w dynamice polimeryzacji aktyny w migrujących komórkach dendrytycznych wykazujących ekspresję life act GFP.Przedstawiono tutaj przykład kwantyfikacji motylowości komórek analizowanej w migrujących komórkach dendrytycznych. Siła generowana przez komórki dendrytyczne typu dzikiego lub traktowane dihydrochlorkiem Y 27 632 wykazuje, że lek ten jest dobrze scharakteryzowanym inhibitorem kurczliwości i migracji komórek i został użyty do weryfikacji zdolności systemu do wykrywania zmian prędkości. Log danych może być dalej analizowany w celu wyodrębnienia pozycji i rozmiaru komórek w funkcji czasu, co umożliwia badanie różnych parametrów opisujących migrację komórek.Prędkość migracji śledzono poprzez obrazowanie pozycji jądra komórkowego przy użyciu autorskiego oprogramowania. Komórki dendrytyczne osiągają średnią prędkość bliską 6 µm/min. Podanie leku znacząco zmniejsza ich prędkość.Niniejszy przykład pokazuje możliwości tej techniki, która pozwala na kwantyfikację dużej liczby komórek w pojedynczych eksperymentach, a także użyteczność systemu w wykrywaniu różnic wywołanych działaniem leków. Po opanowaniu i odpowiednim wdrożeniu, zaprezentowana tutaj technika może zostać wykonana w ciągu trzech godzin. Metoda ta utorowała drogę badaczom zajmującym się migracją do studiowania lokomocji komórek w kontrolowanych, ograniczonych środowiskach.

study-of-cell-migration-in-microfabricated-channels

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Badanie migracji komórek w mikrofabrykowanych kanałach

Opisano przedzielone urządzenie mikrofluidyczne do badania migracji komórek macierzystych nowotworu. Ta nowatorska platforma tworzy żywotne mikrośrodowisko komórkowe i umożliwia mikroskopową wizualizację lokomocji żywych komórek. Wysoce ruchliwe komórki nowotworowe są izolowane w celu zbadania molekularnych mechanizmów agresywnej infiltracji, co w przyszłości może prowadzić do opracowania bardziej skutecznych terapii.

Ocena migracji komórek macierzystych nowotworu z wykorzystaniem kompartymentowych urządzeń mikroprzepływowych i obrazowania żywych komórek

Test ścieżki motylości fagokinetycznej jest metodą stosowaną do oceny ruchu komórek. W szczególności test ten mierzy w sposób ilościowy chemokinezę (losową motylość komórek) w czasie. Metoda ta wykorzystuje zdolność komórek do tworzenia mierzalnego śladu ich ruchu na szkiełkach nakrywkowych powlekanych koloidalnym złotem.

Ilościowa ocena migracji komórek z wykorzystaniem testu ruchliwości w śladach fagokinetycznych

Opisano metodę montażu adhezyjnych i rozpuszczalnych gradientów w komorze mikroskopowej do badań migracji żywych komórek. Zaprojektowane środowisko łączy powierzchnie przeciwporostowe i ścieżki adhezyjne z gradientami roztworu, a tym samym pozwala określić względne znaczenie wskazówek naprowadzających.

Tworzenie adhezyjnych i rozpuszczalnych gradientów do obrazowania migracji komórek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Migracja komórek jest ważną częścią rozwoju i życia człowieka. Aby zrozumieć mechanizmy, które mogą zmieniać migrację komórek, przedstawiamy planarny system dyfuzji gradientowej do badania chemotaksji w matrycy kolagenu 3D, co pozwala przezwyciężyć nowoczesne ograniczenia komory dyfuzyjnej istniejących testów.

Planarny system dyfuzji gradientowej do badania chemotaksji w matrycy kolagenowej 3D

Wiele urządzeń mikroprzepływowych zostało opracowanych do użytku w badaniach nad elektrotaksją. Jednak żaden z tych chipów nie pozwala na efektywne badanie jednoczesnego wpływu substancji chemicznych i pola elektrycznego (EF) na komórki. Opracowaliśmy urządzenie na bazie polimetakrylanu metylu, które zapewnia lepiej kontrolowany współistniejący ślad węglowy i stymulację chemiczną do wykorzystania w badaniach nad elektrotaksją.

Badania elektrotaktyczne komórek raka płuc przy użyciu wielokanałowego układu mikroprzepływowego o podwójnym polu elektrycznym

Ten protokół szczegółowo opisuje konfigurowalną metodę pomiaru migracji komórek w odpowiedzi na chemoatraktanty, które mogą być również użyte do określenia szybkości dyfuzji leku z matrycy polimerowej.

Konfigurowalna komora do pomiaru migracji komórek

Kontrola gradientów chemicznych i tlenu jest niezbędna dla hodowli komórkowych. W artykule opisano urządzenie mikroprzepływowe z polidimetylosiloksanu i poliwęglanu (PDMS-PC) zdolne do niezawodnego generowania kombinacji gradientów chemicznych i tlenowych do badań migracji komórek, które można praktycznie wykorzystać w laboratoriach biologicznych bez wyrafinowanego oprzyrządowania.

Urządzenia mikroprzepływowe z polidimetylosiloksanu i poliwęglanu do badań migracji komórek w prostopadłych gradientach chemicznych i tlenu

Zbiorowa migracja komórek w procesie rozwoju, gojenia ran i przerzutów nowotworowych jest często kierowana przez gradienty czynników wzrostu lub cząsteczek sygnałowych. Opisano tutaj eksperymentalny system łączący mikroskopię trakcyjną z układem mikroprzepływowym oraz demonstrację sposobu ilościowego określania mechaniki migracji zbiorowej w warunkach gradientu biochemicznego.

Mikroskopia trakcyjna zintegrowana z mikrofluidyką do chemotaktycznej migracji zbiorowej

W tym protokole, do badania interakcji między komórkami leukocytów w chorobie zapalnej stosuje się biomimetyczne badanie mikropłynów, które może odtworzyć fizjologicznie istotne środowisko mikrokrążenia i odtworzyć całą kaskadę adhezji/migracji leukocytów.

System mikrofizjologiczny do badania interakcji między leukocytami a komórkami śródbłonka podczas stanu zapalnego

Protokół do ilościowej oceny migracji komórek 3D w obrębie i do interfejsu granulowanych hydrożeli jest przedstawiony tutaj.

Kwantyfikacja trójwymiarowej migracji komórek w obrębie i do granulowanych biomateriałów hydrożelowych

Poznaj metodę badania migracji komórek w mikroprefabrykowanych kanałach PDMS. Technika umożliwia ilościową analizę dynamiki ruchu komórek dendrytycznych w kontrolowanym środowisku z ograniczeniem przestrzennym.

Badanie migracji komórek w kanałach mikroprefabrykowanych

Przeglądaj więcej filmów