Name: Wizualizacja synapsy immunologicznej za pomocą dwukolorowej nanoskopii STED (Time-Gated Stimulated Emission Depletion) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-24T20:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Poznaj dwukolorową nanoskopię STED do wizualizacji synapsy immunologicznej komórek NK z rozdzielczością poniżej 100 nm. Ta metoda umożliwia badanie interakcji cytoszkieletu z egzocytozą lityczną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Geoffowi Danielsowi za pomoc techniczną. Praca ta została sfinansowana przez R01 AI067946 J.S.O.

1. Pokryj szkiełka nakrywkowe przeciwciałem
<ol>
	<li>Rozgrzej (w temperaturze 37 °C) 30 ml pożywki RPMI 10% FCS i 1 ml BD Cytofix/Cytoperm.</li>
	<li>Przygotować roztwór 5 μg/ml oczyszczonego przeciwciała w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (PBS). Do aktywacji linii komórkowej NK92 zaleca się stosowanie anty-CD18 i anty-NKp30.
	<ol>
		<li>Zaznacz jedno kółko o wielkości około dziesięciocentówki dla każdego warunku na szkiełku nakrywkowym #1.5 za pomocą pisaka PAP. W przypadku eksperymentu z dwoma kolorami powinny istnieć cztery warunki: niebarwiony, podwójnie barwiony i dwa warunki pojedynczo barwione. Dozować 200 μl roztworu przeciwciał w każdym regionie i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.</li>
		<li>Szkiełka nakrywkowe należy umyć, delikatnie zanurzając je w 50 ml PBS w stożkowej probówce o pojemności 50 ml w temperaturze pokojowej. Mycie powinno nastąpić bezpośrednio przed dodaniem komórek i należy zachować ostrożność, aby uniknąć wysuszenia przeciwciał na szkiełku nakrywkowym.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Aktywuj komórki NK na szkiełkach nakrywkowych; Naprawa i przepuszczalność
<ol>
	<li>Wyizoluj 5 x 105 komórek NK92 na warunek. Odwirować i zdekantować supernatant. Przemyć raz 10 ml podgrzanego podłoża z kroku 1.1. Odwirować i zdekantować supernatant.
	<ol>
		<li>Zawiesić komórki w podgrzanym podłożu z kroku 1.1 w stężeniu 2,5 x 106/ml.</li>
		<li>Delikatnie zdekantować 200 μl do środka obszaru utworzonego w sekcji 1.2.1. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 20 minut w temperaturze 5% CO2 . (Uwaga: czas ten może być wydłużony lub skrócony w zależności od interesującej nas funkcji biologicznej. Do polaryzacji granulek komórek NK wystarczy 20 min).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po inkubacji komórek delikatnie umyć szkiełka nakrywkowe, zanurzając każde z nich w 50 ml PBS o temperaturze pokojowej w stożkowej probówce o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Dodać 1 μl Triton X-100 do 1 ml podgrzanego roztworu Fix/Perm z kroku 1.1 i dokładnie wymieszać. Utrwal i przepuszczalność, dodając 200 μl buforu Fix/Perm (krok 2.3) do komórek. Inkubować przez 10 minut w ciemności w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
3. Plamy
<ol>
	<li>Przygotować bufor barwiący: sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), 1% BSA, 0,1% saponina.
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór przeciwciała pierwszorzędowego w 200 μl buforu barwiącego (patrz krok 3.1). (Uwaga: przeciwciała należy miareczkować przed użyciem). Należy unikać stosowania przeciwciała pierwszorzędowego, które jest wytwarzane u tego samego gatunku, który jest używany do powlekania szkiełka nakrywkowego (krok 1.2). Należy również unikać połączeń strepatiwidyna-biotyna w obrazowaniu chorób przenoszonych drogą płciową.</li>
		<li>Zgodnie z sekcją 2.3.1 delikatnie umyć szkiełka nakrywkowe w 50 ml buforu barwiącego. Przetrzyj krawędzie obszaru pióra PAP bawełnianym wacikiem, aby usunąć nadmiar buforu. Zastosować roztwór przeciwciał utworzony w sekcji 3.1.1. Inkubować 30 minut w ciemności w temperaturze pokojowej. (Zalecane: inkubować szkiełka nakrywkowe w pudełku na szkiełka z wilgotnym ręcznikiem papierowym, aby utrzymać wilgotność).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować roztwór przeciwciała drugorzędowego w 200 μl buforu barwiącego. Zalecane fluorofory to Alexa Fluor 488, Pacific Orange i V500. Ogólnie rzecz biorąc, rozcieńczenie 1:200 jest odpowiednie do obrazowania STED.
	<ol>
		<li>Delikatnie umyj szkiełka nakrywkowe w 50 ml buforze barwiącym. Przetrzyj krawędzie obszaru pióra PAP bawełnianym wacikiem, aby usunąć nadmiar buforu. Zastosuj drugorzędowy roztwór przeciwciał. Inkubować 30 minut w ciemności w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powtórz mycie i barwienie, aby uzyskać dodatkowe interesujące białka. W przypadku wykrycia F-aktyny z falloidyną, można ją dołączyć do przeciwciała drugorzędowego, zwykle w rozcieńczeniu 1:200.</li>
</ol>
4. Zamontuj szkiełka nakrywkowe na slajdach
<ol>
	<li>Przygotuj podłoże montażowe. Uwaga: Preferowane są Prolong lub Prolong Gold. Należy unikać stosowania VECTASHIELD, ponieważ nie jest on kompatybilny z chorobami przenoszonymi drogą płciową. W przypadku stosowania falloidyny należy unikać stosowania 2,2-tiodioetanolu. Mowiol jest akceptowalny.</li>
	<li>Umieść około 10-20 μl podłoża montażowego na szkiełku. Odwróć szkiełko nakrywkowe (stroną z komórką do dołu) i delikatnie zamontuj szkiełko nakrywkowe, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. Inkubować szkiełka podstawowe przez 24 godziny (szkiełko nakrywkowe do góry) przed obrazowaniem.</li>
	<li>Uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego lakierem do paznokci.</li>
</ol>
5. Konfiguracja eksperymentalna
<ol>
	<li>Uruchom wymagane lasery i oprogramowanie. Zainicjuj laser wyczerpujący STED przy 100% mocy. Align STED laser, który w przypadku systemów komercyjnych jest często zabiegiem zautomatyzowanym.</li>
	<li>Skupić próbkę, zaczynając od pojedynczej barwionej kontroli, na mikroskopie za pomocą okularów.</li>
</ol>
6. Optymalizacja ustawień
<ol>
	<li>Zeskanuj pierwszy kanał i zoptymalizuj moc lasera, położenie wiązki wzbudzenia i zasięg detektora. Jeśli to możliwe, unikaj zysku w wysokości 100 >. Przechwyć obraz w trybie konfokalnym, aby zoptymalizować ustawienia. Uśrednianie linii i/lub klatek zwiększy rozdzielczość. Sprawdź nasycenie pikseli. Uwaga: Pewne nasycenie jest dopuszczalne w konfokalnym, ponieważ zastosowanie STED zmniejszy intensywność emisji. W przypadku STED optymalny rozmiar piksela będzie wynosił poniżej 30 nm, jednak lepszą rozdzielczość uzyska się przy mniejszych rozmiarach pikseli. Rozmiar obszaru zainteresowania, który jest obrazowany, będzie dyktował dolną granicę rozmiaru piksela. Mniejsze rozmiary pikseli mogą zwiększyć fotowybielanie.
	<ol>
		<li>Zastosuj wiązkę zubożającą STED i uchwyć obraz, zaczynając od 50% mocy lasera zubożającego. Jeśli zauważalna jest poprawa rozdzielczości, można zastosować większą moc lasera zubożającego. Na tym etapie może być konieczne dostosowanie mocy lasera wzbudzenia, średniej linii i/lub wzmocnienia.</li>
		<li>Zastosuj bramkowanie czasowe, aby zmniejszyć tło (minimum 0,3 nsec). Dostosuj ustawienia, aż będzie widoczna poprawa rozdzielczości w stosunku do konfokalnej. Rozdzielczość można przybliżyć, szacując połowę maksimum na całej szerokości (FWHM). Reprezentuje to odległość o połowie maksymalnej intensywności piku Gaussa utworzonego przez narysowanie profilu liniowego w poprzek struktury będącej przedmiotem zainteresowania i jest szeroko stosowaną metodą szacowania rozdzielczości.</li>
		<li>Gdy pierwszy kanał będzie zadowalający, zainicjuj drugą sekwencję skanowania sekwencyjnego. Ogólnie rzecz biorąc, najlepiej jest najpierw zeskanować fluorofor o dłuższej długości fali. Powtórz krok 6.1 na drugim kanale.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Potwierdź brak nakładania się spektralnego, obrazując pojedyncze barwione kontrole z obiema sekwencjami skanowania. Łagodne nakładanie się widma można skorygować za pomocą funkcji usuwania spektralnego w oprogramowaniu, jednak należy tego unikać, jeśli to możliwe.</li>
</ol>
7. Akwizycja obrazu
<ol>
	<li>Pobieranie obrazów. W przypadku obrazowania ilościowego zaleca się uzyskanie co najmniej 20 obrazów/warunek. Dokładna liczba powinna być jednak określona zgodnie z pytaniem eksperymentalnym w połączeniu z podejściem statystycznym, takim jak obliczanie wielkości próby. Zapisz eksperyment.</li>
</ol>
8. Dekonwolucja
<ol>
	<li>Otwórz plik za pomocą oprogramowania do dekonwolucji lub procesora wsadowego. Sprawdź parametry dla każdego kanału za pomocą oprogramowania. Potwierdź widma wzbudzenia i emisji każdego kanału, emisję zubożenia STED i kierunek obrazowania (w górę lub w dół, jeśli obraz jest trójwymiarowy).</li>
	<li>Dekonwolucjonizuj za pomocą kreatora dekonwolucji. Ustawienia domyślne są na ogół odpowiednie, jednak stosunek sygnału do szumu (SNTR) będzie się różnił w zależności od fluoroforu i będzie musiał być określony dla każdego kanału i każdego eksperymentu indywidualnie.</li>
</ol>

<ol><li>Stinchcombe, J. C., Bossi, G., Booth, S., Griffiths, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunological+synapse+of+CTL+contains+a+secretory+domain+and+membrane+bridges%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The immunological synapse of CTL contains a secretory domain and membrane bridges.</a> Immunity. 15 (5), 751-761 (2001).</li>
<li>Grakoui, A., Bromley, S. K., Sumen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunological+synapse%3A+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285 (5425), 221-227 (1999).</li>
<li>Monks, C. R., Freiberg, B. A., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+segregation+of+supramolecular+activation+clusters+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells.</a> Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).</li>
<li>Orange, J. S., Harris, K. E., Andzelm, M. M., Valter, M. M., Geha, R. S., Strominger, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mature+activating+natural+killer+cell+immunologic+synapse+is+formed+in+distinct+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The mature activating natural killer cell immunologic synapse is formed in distinct stages.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (24), 14151-14156 (2003).</li>
<li>Treanor, B., Lanigan, P. M., Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microclusters+of+inhibitory+killer+immunoglobulin-like+receptor+signaling+at+natural+killer+cell+immunological+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microclusters of inhibitory killer immunoglobulin-like receptor signaling at natural killer cell immunological synapses.</a> J. Cell Biol. 174 (1), 153-161 (2006).</li>
<li>Abeyweera, T. P., Merino, E., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+signaling+blocks+activating+receptor+clustering+and+induces+cytoskeletal+retraction+in+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Inhibitory signaling blocks activating receptor clustering and induces cytoskeletal retraction in natural killer cells.</a> J. Cell Biol. 192 (4), 675-690 (2011).</li>
<li>Beemiller, P., Jacobelli, J., Krummel, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+the+movement+of+signaling+microclusters+with+cellular+motility+in+immunological+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Integration of the movement of signaling microclusters with cellular motility in immunological synapses.</a> Nat. Immunol. 13 (8), 787-795 (2012).</li>
<li>Campi, G., Varma, R., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+and+agonist+MHC-peptide+complex-dependent+T+cell+receptor+microclusters+as+scaffolds+for+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Actin and agonist MHC-peptide complex-dependent T cell receptor microclusters as scaffolds for signaling.</a> J. Exp. Med. 202 (8), 1031-1036 (2005).</li>
<li>Mossman, K. D., Campi, G., Groves, J. T., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+TCR+signaling+from+geometrically+repatterned+immunological+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Altered TCR signaling from geometrically repatterned immunological synapses.</a> Science. 310 (5751), 1191-1193 (2005).</li>
<li>Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor-proximal+signals+are+sustained+in+peripheral+microclusters+and+terminated+in+the+central+supramolecular+activation+cluster%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">T cell receptor-proximal signals are sustained in peripheral microclusters and terminated in the central supramolecular activation cluster.</a> Immunity. 25 (1), 117-127 (2006).</li>
<li>Yokosuka, T., Sakata-Sogawa, K., Kobayashi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newly+generated+T+cell+receptor+microclusters+initiate+and+sustain+T+cell+activation+by+recruitment+of+Zap70+and+SLP-76%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76.</a> Nat. Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).</li>
<li>Toomre, D., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+wave+of+cellular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">A new wave of cellular imaging.</a> Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 26, 285-314 (2010).</li>
<li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> J. Cell Biol. 190 (2), 165-175 (2010).</li>
<li>Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Super-resolution fluorescence microscopy.</a> Annu. Rev. Biochem. 78, 993-1016 (2009).</li>
<li>Mace, E. M., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+views+of+the+human+NK+cell+immunological+synapse%3A+recent+advances+enabled+by+super-+and+high-resolution+imaging+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Immunol%22%5BJournal%5D)">New views of the human NK cell immunological synapse: recent advances enabled by super- and high-resolution imaging techniques.</a> Front. Immunol. 3, 421 (2012).</li>
<li>Hell, S. W., Wichmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+the+diffraction+resolution+limit+by+stimulated+emission%3A+stimulated-emission-depletion+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy.</a> Opt. Lett. 19 (11), 780-782 (1994).</li>
<li>Klar, T. A., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subdiffraction+resolution+in+far-field+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy.</a> Opt. Lett. 24 (14), 954-956 (1999).</li>
<li>Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy+with+diffraction+resolution+barrier+broken+by+stimulated+emission%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (15), 8206-8210 (2000).</li>
<li>Rankin, B. R., Moneron, G., Wurm, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscopy+in+a+living+multicellular+organism+expressing+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Nanoscopy in a living multicellular organism expressing GFP.</a> Biophys. J. 100 (12), 63-65 (2011).</li>
<li>Willig, K. I., Kellner, R. R., Medda, R., Hein, B., Jakobs, S., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+resolution+in+GFP-based+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Nanoscale resolution in GFP-based microscopy.</a> Nat. Methods. 3 (9), 721-723 (2006).</li>
<li>Rak, G. D., Mace, E. M., Banerjee, P. P., Svitkina, T., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+cell+lytic+granule+secretion+occurs+through+a+pervasive+actin+network+at+the+immune+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Natural killer cell lytic granule secretion occurs through a pervasive actin network at the immune synapse.</a> PLoS Biol. 9 (9), (2011).</li>
<li>Mace, E. M., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+channel+STED+nanoscopy+of+lytic+granules+on+actin+filaments+in+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Commun.+Integr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Dual channel STED nanoscopy of lytic granules on actin filaments in natural killer cells.</a> Commun. Integr. Biol. 5 (2), 184-186 (2012).</li>
<li>Singh, H., Lu, R., Rodriguez, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+quantification+of+cardiac+mitochondrial+protein+clusters+with+STED+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Visualization and quantification of cardiac mitochondrial protein clusters with STED microscopy.</a> Mitochondrion. 12 (2), 230-236 (2012).</li>
<li>Tonnesen, J., Nagerl UV, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superresolution+imaging+for+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Superresolution imaging for neuroscience.</a> Exp. Neurol. 242, 33-40 (2013).</li>
<li>Kempf, C., Staudt, T., Bingen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+multicolor+STED+nanoscopy+of+presynaptic+proteins+in+the+calyx+of+held%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Tissue multicolor STED nanoscopy of presynaptic proteins in the calyx of held.</a> PLoS One. 8 (4), (2013).</li>
<li>Jans, D. C., Wurm, C. A., Riedel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STED+super-resolution+microscopy+reveals+an+array+of+MINOS+clusters+along+human+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">STED super-resolution microscopy reveals an array of MINOS clusters along human mitochondria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (22), 8936-8941 (2013).</li>
<li>Gustafsson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J. Microsc. 198 (2), 82-87 (2000).</li>
<li>Gustafsson, M. G., Shao, L., Carlton, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+resolution+doubling+in+wide-field+fluorescence+microscopy+by+structured+illumination%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination).</a> Biophys. J. 94 (12), 4957-4970 (2008).</li>
<li>Schermelleh, L., Carlton, P. M., Haase, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subdiffraction+multicolor+imaging+of+the+nuclear+periphery+with+3D+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy.</a> Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).</li>
<li>Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 13 (5793), 1642-1645 (2006).</li>
<li>Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy.</a> Nat. Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li>
<li>Cdc42-interacting protein-4 functionally links actin and microtubule networks at the cytolytic NK cell immunological. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22J.+Exp.+Med%22">J. Exp. Med</a>. Banerjee, P. P., Pandey, R., Zheng, R., Suhoski,, Monaco-Shawver, L., Orange, J. S. 204 (10), 2305-2320 (2007).</li>
<li>Vicidomini, G., Moneron, G., Han, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sharper+low-power+STED+nanoscopy+by+time+gating%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Sharper low-power STED nanoscopy by time gating.</a> Nat. Methods. 8 (7), 571-573 (2011).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych. Częściowy koszt publikacji tego artykułu został pokryty przez Leica Microsystems, Inc.

Poprawa rozdzielczości w stosunku do konfokalnej będzie w pewnym stopniu zależna od czynników, których nie można kontrolować. Czynniki te obejmują drobne aberracje w grubości szkiełka nakrywkowego i niespójności w mediach montażowych. Ważne jest, aby temperatura i wilgotność w pomieszczeniu do obrazowania były jak najbardziej spójne, a wiązka STED powinna być ponownie ustawiana co około 60 minut. Jak wspomniano w procedurach, należy unikać stosowania medium montażowego VECTASHIELD, ponieważ nie jest ono kompatybilne z STED. Oprócz tego należy zawsze używać szkiełek nakrywkowych #1,5, a jeśli są dostępne, używać tych, które zostały sprawdzone do określonej grubości.
Jedną z modyfikacji opisanego tutaj podejścia jest obrazowanie dodatkowych kanałów w konfokalu, przy użyciu fluoroforów, które emitują na większej długości fali niż wiązka STEM. W ten sposób można obrazować do czterech kanałów (dwa w konfokalu, dwa w STED). Jeśli jednak przyjmiemy to podejście, kanały z fluoroforami emitującymi powyżej lasera zubożającego STED będą musiały zostać najpierw zobrazowane, ponieważ zastosowanie wiązki STED spowoduje wyczerpanie fotonów w tych kanałach. Jedną z zalet tej techniki jest zastosowanie bramkowania czasowego, które również poprawi rozdzielczość w konfokalnym poprzez wyeliminowanie emisji z fotonów o krótkim czasie życia34. W szczególności zastosowanie bramkowania czasowego, czyli taktowania detektorów emisji odpowiadającego wzbudzeniu impulsowemu STED, zmniejszy fluorescencję tła od odbicia od szkła nakrywkowego podczas obrazowania z bliska. Nawet w eksperymencie, który nie nadaje się do STED, jeśli używasz impulsowego źródła wzbudzenia, bramkowanie czasowe może być użytecznym narzędziem do poprawy rozdzielczości w konfokalu.
Istnieją różne modyfikacje, które można wykorzystać do poprawy rozdzielczości w STED. Jednym z nich jest zmniejszenie rozmiaru otworu w stosunku do standardowej jednostki 1 Airy, chociaż zmniejszy to również ilość światła docierającego do próbki. Można to skompensować poprzez zwiększenie mocy lub wzmocnienia lasera. Innym jest zwiększenie średniej liniowej, co zwiększy ilość informacji zbieranych dla każdego fotonu, poprawiając rozdzielczość. Również w tym przypadku może się to jednak odbyć kosztem fotowybielania próbki, dlatego konieczne będzie znalezienie równowagi między rozdzielczością a wybielaniem. Podobnie, stosowanie białek fluorescencyjnych, takich jak GFP, będzie wymagało starannej optymalizacji, aby uniknąć wybielania. W razie potrzeby można to osiągnąć poprzez zmniejszenie mocy lasera STED. Dłuższe punkty czasowe pozwolą również na większą regenerację fotonów i zmniejszenie bielenia. Korekta fotowybielania powinna być uwzględniona podczas analizy żywej choroby przenoszonej drogą płciową.
Oczywiście możliwe jest również obrazowanie w 3 wymiarach w STED, które również da poprawę w stosunku do konwencjonalnego obrazowania konfokalnego. Jest to szczególnie ważne, jeśli odbywa się to w połączeniu z dekonwolucją, chociaż należy zachować ostrożność, aby skorygować dryft, który występuje podczas obrazowania wielu płaszczyzn w osi z. W przypadku korzystania z oprogramowania Huygens do dekonwolucji, korekcję tę uzyskuje się za pomocą funkcji "stabilizacji obrazu". Dzięki takiemu podejściu poprawi się rozdzielczość w osi z. Jest to ogromna poprawa w porównaniu z konwencjonalnym obrazowaniem konfokalnym, które ma słabą rozdzielczość osiową, a nawet w porównaniu z samym STED, który również ma stosunkowo słabą rozdzielczość osi z. Podczas pozyskiwania wielu stosów w STED należy zachować ostrożność, aby uniknąć wybielania próbki, a w razie potrzeby można w tym celu zmniejszyć uśrednianie linii lub intensywność mocy lasera. Ponownie należy zauważyć, że w przypadku obrazowania innych fluoroforów, które nie są odpowiednie dla STED, zastosowanie wiązki zubożającej w pierwszym sekwencyjnym skanie zapobiegłoby emisji z tych kanałów. W związku z tym podejście mieszane STED/konfokalne (przy użyciu skanowania konfokalnego w kanałach, które emitują o długości fali większej niż 592 nm) niestety nie będzie odpowiednie dla 3D.
Podsumowując, wybraliśmy STED jako podejście ze względu na jego względną łatwość aplikacji i poprawę rozdzielczości w porównaniu ze standardowym obrazowaniem konfokalnym. W obrazowaniu synapsy immunologicznej okazał się skuteczną i cenną techniką, która pozwala nam dostrzec szczegóły w architekturze F-aktyny, które nie są możliwe w rozdzielczości powyżej 200 nm. Chociaż wiele z tych szczegółów wydaje się subtelnych, mogą one mieć głęboki wpływ na funkcjonowanie komórek NK. W ten sposób stosujemy najnowszą technologię obrazowania nanoskopowego do uzyskiwania informacji, które mają kluczowe znaczenie dla utrzymania zdrowia ludzkiego.

Synapsa immunologiczna to złożone środowisko białek sygnałowych i elementów cytoszkieletu. Synapsa cytolityczna została pierwotnie opisana jako mająca strukturę podobną do "strzału w dziesiątkę" z pierścieniem aktyny i cząsteczkami adhezyjnymi otaczającymi centralną domenę wydzielniczą1-4. Jednak teraz wiemy, że składa się z mikroskopijnych domen aktywnej sygnalizacji, które wymagają ciągłej dynamicznej reorganizacji cytoszkieletu dla funkcji5-11. Wiele informacji, które obecnie posiadamy na temat synaps, pochodzi z mikroskopii, a immunolodzy jako pierwsi przyjęli najnowocześniejszą technologię obrazowania.
Jedną z takich nowatorskich technologii jest mikroskopia superrozdzielcza. Konwencjonalna mikroskopia świetlna jest ograniczona przestrzennie przez barierę dyfrakcyjną światła, która wyznacza dolną granicę rozdzielczości dla całej mikroskopii fluorescencyjnej, w tym konfokalnej, na około 200 nm. W ostatnich latach opracowano kilka technik, które pozwalają na rozdzielczość poniżej bariery dyfrakcyjnej. Należą do nich mikroskopia zubożenia emisji stymulacji (STED), mikroskopia oświetlenia strukturalnego (SIM), mikroskopia stochastycznie rozdzielcza (STORM) i mikroskopia światła fotoaktywowanego (PALM). Techniki te zostały szczegółowo omówione w innym miejscu12-15, ale są opisane poniżej. Ograniczona rozdzielczość subdyfrakcji jest generowana w unikalny sposób w każdym systemie. Wybór techniki super-rozdzielczości powinien być zatem podyktowany eksperymentem i systemem eksperymentalnym, który nas interesuje.
STED super rozdzielczość osiąga się za pomocą wiązki zubożenia torroidalnego o wysokiej intensywności, która selektywnie "wycisza" fluorescencję wokół każdego interesującego nas fluoroforu po wzbudzeniu, co skutkuje mikroskopią fluorescencji ograniczoną do subdyfrakcji16-18. Jedną z zalet STED jest to, że akwizycja obrazu jest szybka i wymaga stosunkowo niewielkiej obróbki końcowej. Podczas gdy wybór barwnika jest podyktowany położeniem widmowym wiązki zubożającej, która w dostępnym na rynku systemie znajduje się na długości fali 592 nm, dostępnych na rynku jest kilka dostępnych na rynku barwników, które umożliwiają kombinację dwóch fluoroforów. Ponadto można obrazować powszechnie stosowane reportery fluorescencyjne, takie jak GFP, co umożliwia eksperymenty z żywymi komórkami19,20.
Wcześniej używaliśmy STED do identyfikacji i ilościowego określania regionów hipogęstości F-aktyny, które są wykorzystywane przez komórki NK do degranulacji21,22. Sugerujemy, że STED jest dobrym wyborem do obrazowania synapsy immunologicznej ze względu na stosunkowo elastyczną dostępność fluoroforów i lepszą poprawę rozdzielczości w osi x-y. Ponadto, w dostępnym na rynku systemie STED wykorzystywanym w tych eksperymentach, zastosowanie szybkiego (12 000 Hz) skanera rezonansowego pozwala na szybkie pozyskiwanie obrazów przy minimalnym uszkodzeniu próbek. Ograniczona elastyczność w doborze barwników jest uważana za wadę STED12, jednak dwukolorowy STED jest stosunkowo prosty z kilkoma dostępnymi na rynku fluoroforami. Integracja STED z laserowym skaningowym mikroskopem konfokalnym pozwala również na dodatkowe obrazowanie konfokalne w połączeniu z STED, więc podczas gdy STED jest ograniczony do dwóch kanałów, dodatkowe struktury mogą być obrazowane w konfokalnym z rozdzielczością około 200 nm (E. Mace, obserwacje niepublikowane). Chociaż opisujemy zastosowanie STED do obrazowania komórek odpornościowych, technologia ta jest stosowana do różnych typów komórek, w tym komórek nerwowych, oraz do wizualizacji różnych struktur komórkowych23-26.
SIM używa innego podejścia do generowania obrazów ograniczonych subdyfrakcją. Poprzez wizualizację znanych wzorców okresowego wzbudzenia, można następnie uzyskać informacje o nieznanej strukturze badanej po transformacji matematycznej27. Daje to wzrost rozdzielczości do ~100 nm w bok28,29. Zaletą karty SIM jest to, że jest kompatybilna ze wszystkimi standardowymi barwnikami i sondami konfokalnymi, jednak wadą jest to, że pozyskiwanie obrazów jest znacznie wolniejsze, a te wymagają długiego przetwarzania końcowego12. Ogranicza to również jego zastosowanie do obrazowania żywych komórek.
Na koniec, obrazy o super rozdzielczości mogą być generowane przez stochastyczne przełączanie foto-fluoroforów. Podejście to jest wykorzystywane w mikroskopii lokalizacyjnej aktywowanej światłem (PALM) i stochastycznej mikroskopii rekonstrukcji optycznej (STORM). Skanując wiele klatek kamery i lokalizując losowo aktywowane cząsteczki, które są "włączane" i "wyłączane" w czasie, obrazy o rozdzielczości 20-30 nm są generowane ze skumulowanych klatek30-32 . Wadą tej rozdzielczości jest czas potrzebny na pozyskanie obrazów.
Tutaj pokazujemy szczegółowo protokół przygotowania i obrazowania próbek dwukolorowych w STED. W tym systemie wzbudzenie odbywa się za pomocą impulsowego, przestrajalnego lasera ze światłem białym. Ze względu na charakter impulsowej wiązki wzbudzenia, możliwe jest bramkowanie czasowe detekcji, co dodatkowo zwiększa rozdzielczość. Ponadto system jest wyposażony w hybrydowe detektory gadolinu (HyD), które są bardziej czułe niż konwencjonalne lampy fotopowielaczy, co pozwala na mniejsze zapotrzebowanie na moc lasera. Wiązka zubożająca dla STED jest stosowana w sposób ciągły i jest dostrojona do 592 nm, co będzie dyktować wybór barwników dostępnych dla dwóch kolorów STED. Powszechnie stosowane kombinacje barwników obejmują zazwyczaj jedną pobudliwą o długości 488 nm (taką jak Alexa Fluor 488, Oregon Green, DyLights green lub Chromeo 488) i jedną pobudliwą o długości 458 nm (taką jak Pacific Orange lub Horizon V500). Tak więc, podczas gdy wykrywanie dwóch barwników będzie w podobnym zakresie (i oba są dostępne za pomocą lasera zubożającego), wzbudzenie będzie następować przy różnych długościach fal. Dzięki przestrajalnemu laserowi światła białego i przestrajalnym detektorom maksymalizacja sygnału przy jednoczesnej eliminacji nakładania się widma jest dość łatwa. W związku z tym odnieśliśmy duży sukces dzięki kombinacjom dostępnych na rynku barwników, takich jak Pacific Orange i Alexa Fluor 488 (stosowany tutaj). Nasz protokół jest dostosowany i opisuje ocenę ludzkich komórek NK, ponieważ reprezentuje to historyczne skupienie naszego laboratorium. W tym przykładzie wykorzystujemy w szczególności linię komórkową NK92, ponieważ jest to jedna z tych, które regularnie stosowaliśmy w naszych pracach eksperymentalnych21,33.

<table><tbody><tr><td>#1.5 Szkiełka nakrywkowe</td><td>VWR</td><td>48393-172</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm</td><td>BD Biosciences</td><td>554722</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Aplikator z bawełnianą końcówką</td><td>Fisher Scientific</td><td>S450941</td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe Falcon (50 ml)</td><td>VWR</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu (FCS) (500 ml)</td><td>Atlantic Biologicals</td><td>S11050</td><td></td></tr><tr><td>Kozia anty-królik Pacific Orange</td><td>Life Technologies</td><td>P31584</td><td></td></tr><tr><td>Wycieraczki laboratoryjne</td><td>VWR</td><td>82003-820</td><td></td></tr><tr><td>Lakier do paznokci</td><td>VWR</td><td>100491-940</td><td></td></tr><tr><td>Komórki NK-92</td><td>ATCC</td><td>CRL-2407</td><td></td></tr><tr><td>Falloidyna Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Life Technologies</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>Przedłużony odczynnik zapobiegający blaknięciu</td><td>Life Technologies</td><td>P7481</td><td></td></tr><tr><td>Oczyszczony anty-CD18</td><td>Biolegend</td><td>301202</td><td></td></tr><tr><td>Oczyszczony anty-NKp30</td><td>Biolegend</td><td>325202</td><td></td></tr><tr><td>Oczyszczony anty-perforyna</td><td>Biolegend</td><td>308102</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 podłoże ( 500 ml)</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Saponina z kory Quillaja</td><td>Sigma</td><td>S4521</td><td></td></tr><tr><td>Długopis Super PAP</td><td>Life Technologies</td><td>008899</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>22142</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do dekonwolucji Huygensa</td><td>SVI</td><td>Skontaktuj się z firmą</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP8 TCS STED</td> mikroskop <td>Leica Firma Microsystems</td><td>skontaktuj się z firmą</td><td></td></tr></tbody></table>

wizualizacja synapsy immunologicznej za pomocą dwukolorowej nanoskopii sted (time-gated stimulated emission depletion)

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion (STED) Nanoscopy

Komórki NK tworzą ściśle regulowane, precyzyjnie dostrojone synapsy immunologiczne (IS) w celu lizy komórek zakażonych wirusowo lub rakotwórczych. Dynamiczna reorganizacja aktyny ma kluczowe znaczenie dla funkcjonowania komórek NK i tworzenia IS. Obrazowanie F-aktyny w synapsie tradycyjnie wykorzystuje mikroskopię konfokalną, jednak granica dyfrakcji światła ogranicza rozdzielczość mikroskopii fluorescencyjnej, w tym konfokalnej, do około 200 nm. Ostatnie postępy w technologii obrazowania umożliwiły rozwój obrazowania superrozdzielczego z ograniczoną subdyfrakcją. Aby zobrazować architekturę F-aktyny w IS, podsumowujemy cytotoksyczną synapsę komórek NK poprzez przyleganie komórek NK do aktywującego receptora na szkle. Następnie obrazujemy interesujące nas białka za pomocą dwukolorowej mikroskopii zubożenia emisji stymulowanej (STED). Daje to rozdzielczość <80 nm w synapsie. W niniejszym artykule opisujemy etapy przygotowania próbki i akwizycji obrazów za pomocą dwukolorowej nanoskopii STED w celu wizualizacji F-aktyny w NK IS. Ilustrujemy również optymalizację pozyskiwania próbek za pomocą oprogramowania Leica SP8 i bramkowanego czasowo STED. Na koniec wykorzystujemy oprogramowanie Huygens do dekonwolucji obrazów w post-processingu.

Oczywistym głównym celem obrazowania super-rozdzielczego jest poprawa jakości względem konwencjonalnej mikroskopii konfokalnej. Istnieje jednak kilka powszechnych pułapek, które mogą prowadzić do uzyskania suboptymalnej rozdzielczości. Wymaga to indywidualnej optymalizacji każdego eksperymentu. W naszym reprezentatywnym doświadczeniu obrazujemy sieć F-aktyny w komórce NK aktywowanej przez przeciwciało związane ze szkłem. Powszechne przyczyny (oraz sposoby ich korygowania) braku poprawy rozdzielczości w metodzie STED w porównaniu z metodą konfokalną są następujące:
<ol>
	<li>Niedopróbkowanie (Ryc. 1a). Może ono prowadzić do ziarnistości i utraty informacji o pikselach, co objawia się słabą rozdzielczością włókien F-aktyny. Często można to skorygować poprzez zwiększenie uśredniania linii lub klatek.</li>
	<li>Wybielanie i/lub nadpróbkowanie (Ryc. 1b). Może być to spowodowane zbyt długim czasem przebywania piksela w wyniku nadmiernego uśredniania linii. Alternatywnie, może być to rezultat zbyt intensywnego skanowania obrazu przed akwizycją, w tym nadmiernego użycia lasera deplekcji. Zazwyczaj skutkuje to obrazami zamglonymi lub rozmytymi. Można to skorygować, skanując pole zainteresowania w minimalnym stopniu przed akwizycją lub, jeśli to możliwe, zwiększając prędkość skanowania laserem. Jeśli problem będzie się utrzymywał, można zmniejszyć moc lasera deplekcji.</li>
</ol>
Poprzez osiągnięcie właściwej równowagi między czasem przebywania piksela, mocą lasera wzbudzającego a mocą lasera wygaszającego, można wygenerować obraz o poprawionej rozdzielczości i wystarczającej ilości informacji (Rycina 1c). Rozdzielczość można dodatkowo poprawić poprzez zastosowanie dekonwolucji (Rycina 1d). Przy zoptymalizowanym procesie akwizycji, dekonwolucja poprawi rozdzielczość zarówno jakościowo, jak i ilościowo, a rozdzielczość poniżej 100 nm powinna być rutynowo osiągalna.
<img alt="Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej pokazujące poprawę struktury komórkowej dzięki dekonwolucji." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51100/51100fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51100/51100fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Optymalizacja akwizycji i typowe błędy obrazowania STED. Komórki NK92 aktywowano na szkle pokrytym przeciwciałami anty-CD18 i -NKp30 przez 20 min, następnie utrwalono, permeabilizowano i barwiono na F-aktynę za pomocą Phalloidin Alexa Fluor 488. a) Przykład utraty informacji obrazowej z powodu niedopróbkowania. b) Przykład utraty rozdzielczości z powodu blaknięcia/nadpróbkowania c) warunki zoptymalizowane d) zoptymalizowane warunki prowadzą do większej poprawy rozdzielczości po dekonwolucji. Pasek skali = 5 μm.

Tutaj ilustrujemy protokół obrazowania za pomocą dwukolorowej nanoskopii STED, cytotoksycznej synapsy immunologicznej komórek NK rekapitulowanej na szkle. Za pomocą tej metody uzyskujemy rozdzielczość sub-100 nm białek synapsy i cytoszkieletu.

Wizualizacja synapsy immunologicznej za pomocą dwukolorowej nanoskopii STED (Time-Gated Stimulated Emission Depletion)

Natural killer cells form tightly regulated, finely tuned immunological synapses (IS) in order to lyse virally infected or tumorigenic cells. Dynamic ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wizualizacja struktur, takich jak F aktyna, w synapsie litycznej komórek NK przy użyciu mikroskopii TED. Osiąga się to poprzez odtworzenie synapsy na szkle z wykorzystaniem przeciwciała aktywującego. Drugim krokiem procedury jest fiksacja, permeabilizacja i barwienie komórek w celu uwidocznienia struktur budzących zainteresowanie.Następnie preparaty są obrazowane za pomocą konfokalnej mikroskopii skaningowej, po czym stosuje się metodę STED w celu zwiększenia rozdzielczości obrazu. Ostatnim krokiem jest przetworzenie obrazów przy użyciu algorytmu dekonwolucji. W rezultacie, dzięki dwukolorowemu STED i endoskopii, możliwe jest uzyskanie rozdzielczości poniżej 100 nanometrów dla struktur komórkowych.Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii komórki, takie jak kwestia związku między cytoszkieletem a egzocytozą. W naszym przypadku interesuje nas sekrecja wyspecjalizowanych lizosomów, zwanych ziarnistościami litycznymi, przez komórki natural killer. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ w procesie stosowania lasera do deplecji TED można dostosować wiele zmiennych.Niewłaściwe zastosowanie wiązki deplecyjnej spowoduje pogorszenie zamiast poprawy rozdzielczości. W ramach przygotowania podgrzać 30 mililitrów pożywki RPMI z 10% FCS oraz oddzielnie jeden mililitr BD CY effects cyop perm do 37 stopni Celsjusza. Następnie rozpocząć proces powlekania szkiełek przykrywkowych przeciwciałami.Pobrać szkiełka nakrywkowe nr 1,5 i za pomocą pisaka PAP narysować na nich kwadraty o wielkości monety. Przygotować jeden kwadrat dla każdego badanego warunku.Napełnij każde kółko 200 µL przeciwciał o stężeniu 5 µg/mL w PBS. W celu aktywacji komórek NK 92 użyj przeciwciał anty-CD 18 i anty-NK P 30. Inkubuj pokrywki z naniesionymi przeciwciałami w temperaturze 37 °C przez pół godziny, a następnie przemyj je, zanurzając w PBS o temperaturze pokojowej; niezwłocznie przystąp do dodawania komórek – dla każdego badanego warunku przygotowane musi być 500 000 komórek.Przemyj komórki w 10 mililitrach podgrzanego wcześniej medium, a następnie resuspenduj je w tym samym ogrzanym medium. Przy stężeniu 2,5 miliona komórek na mililitr i pełnej suspensji komórek, przelej 200 mikrolitrów do każdego kwadratu z przeciwciałami na szkiełkach nakrywkowych. Inkubuj szkiełka nakrywkowe z komórkami w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy 5% CO2; w tym przypadku 20 minut jest wystarczającym czasem na polaryzację ziarnistości w komórkach NK. Po inkubacji delikatnie przemyj szkiełka nakrywkowe w PBS w temperaturze pokojowej.Zacznij od dodania 1 µL TRITTON X 100 do 1 mL ciepłego roztworu BD CY effects cyto perm. Następnie wymieszaj na vortexie. Nałóż 200 µL tego roztworu na każde pole z odpowiednim warunkiem na szkiełkach nakrywkowych.Następnie umieść komórki w ciemności w temperaturze pokojowej i odczekaj 10 minut. Po zakończeniu inkubacji delikatnie przemyj szkiełka podstawowe buforem barwiącym. Następnie osusz krawędzie otoczonych obszarów za pomocą patyczka higienicznego.Następnie dodaj 200 µL przeciwciała pierwszorzędowego w buforze do barwienia do obszarów otoczonych i inkubuj szkiełka nakrywkowe w ciemności przez pół godziny. Dobrymi przeciwciałami drugorzędowymi do obrazowania stabilnego są Alexa Fluor 488, Pacific Orange oraz Horizon V500. Każde z nich działa prawidłowo przy rozcieńczeniu 1:200.Po przemyciu po inkubacji, przenieś szkiełka przykrywowe do buforu barwiącego i osusz je delikatnie. Podobnie jak poprzednio, nanieś 200 µL przeciwciała wtórnego na każde pole z odpowiednim warunkiem. Następnie pozostaw je w ciemności na kolejne 30 minut.Na tym etapie, po dodatkowych etapach płukania, można dodać kolejne przeciwciała. Na przykład, można zastosować Phalloidin w rozcieńczeniu od 1:100 do 1:200 w celu wykrycia f-aktyny. Jako medium do montowania preparatów należy wybrać Prolong zamiast Vector Shield, który nie jest kompatybilny z metodą stead.W przypadku stosowania barwienia phin należy unikać używania 2-tioetanolu, choć pozostałe odczynniki są dopuszczalne; następnie nanieś 10–20 µL medium do montowania na szkiełko. Odwrócone szkiełko przykrywcze ostrożnie opuść do medium, unikając powstania pęcherzyków powietrza. Następnie inkubuj szkiełko przez 24 godziny.Następnego dnia nałóż szkiełko nakrywkowe, uszczelnij je lakierem do paznokci i przystąp do obrazowania. Uruchom lasery oraz oprogramowanie. Laser do deplecji stanu stacjonarnego powinien zostać rozgrzany przy mocy 100% i wyrównany.Używając okularu, ustaw ostrość na próbce, a następnie przejdź do oprogramowania. Przeskanuj pierwszy kanał, czyli ten o najdłuższej długości fali. W czwartym kroku zoptymalizuj moc lasera, pozycję wiązki wzbudzenia oraz zakres detektora.Należy unikać ustawiania wartości powyżej 100. Następnie należy zarejestrować obraz konfokalny i sprawdzić nasycenie pikseli. Uśrednianie linii oraz klatek pozwoli na poprawę rozdzielczości pikseli.Celem jest uzyskanie rozdzielczości poniżej 30 nanometrów na piksel. Pewna saturacja jest dopuszczalna dla stead. Następnie należy zastosować wiązkę deplekcji stead z mocą 50% i zarejestrować obraz.Jeśli rozdzielczość ulegnie poprawie, można zastosować większą moc. Ponadto, regulacja mocy lasera wzbudzającego, średniej linii lub wzmocnienia może również poprawić rozdzielczość. Aby zredukować tło, należy zastosować bramkowanie czasowe trwające 0,3 nanosekund i stopniowo zwiększać tę wartość.Nową rozdzielczość należy oszacować, wykonując pełne obliczenie szerokości połówki maksymalnej (FWHM). Po uzyskaniu satysfakcjonującego wyniku powtórz te kroki dla drugiego kanału, aż wszystkie kanały zostaną dostrojone. Sprawdź występowanie nakładania się widm poprzez obrazowanie kontroli z pojedynczym barwieniem przy użyciu wszystkich sekwencji skanowania.Lekkie nakładanie się widm można skorygować za pomocą dekonwolucji spektralnej w oprogramowaniu, jednak najlepiej go unikać lub ograniczyć do minimum. Następnie należy pozyskać obrazy do obrazowania ilościowego. Należy wykonać co najmniej 20 zdjęć dla każdego wariantu, zgodnie z warunkami eksperymentalnymi.Aby przeprowadzić dekonwolucję zapisanych obrazów, otwórz pliki w odpowiednim oprogramowaniu. Sprawdź parametry każdego kanału, a w szczególności widma wzbudzenia i emisji, emisję przy stałym wygaszaniu oraz kierunek obrazowania. Następnie zastosuj obliczenia dekonwolucyjne dostępne w oprogramowaniu.Ustawienia domyślne zazwyczaj są wystarczające, jednak stosunek sygnału do szumu będzie różnił się w zależności od siły nacisku, dlatego parametr ten należy ustawić ręcznie dla danego eksperymentu. Istnieje kilka powszechnych błędów, które mogą prowadzić do suboptymalnej rozdzielczości w systemie stead. Jednym z nich jest zbyt rzadkie próbkowanie.Prowadzi to do ziarnistości i utraty informacji o pikselach, co widać na przykład w przypadku tych filamentów aktyny F. Zwiększenie uśredniania linii lub klatek często rozwiązuje ten problem. Kolejną kwestią jest blaknięcie lub nadmierne próbkowanie spowodowane zbyt długim czasem ekspozycji piksela.Przyczyną może być również zbyt długi czas przebywania (dwell time), zwykle wynikający z nadmiernego uśredniania linii podczas skanowania przed akwizycją obrazu, co można skorygować poprzez zastosowanie mniejszego obszaru skanowania przed obrazowaniem lub zwiększenie prędkości skanowania. Zmniejszenie mocy lasera również może pomóc w prawidłowym działaniu układu. W efekcie jakość obrazu ulegnie znacznej poprawie.Dekonwolucja pozwoli na dalszą poprawę obrazu, zarówno ilościowo, jak i jakościowo. Podczas przeprowadzania tej procedury rutynowo powinno się uzyskać rozdzielczość poniżej 100 nanometrów.Należy pamiętać o przeprowadzaniu stabilizacji i wyrównania wiązki przed każdym eksperymentem, a następnie w przybliżeniu raz na godzinę zgodnie z poniższą procedurą. W celu uzyskania dodatkowych odpowiedzi dotyczących kolokalizacji, lokalizacji subkomórkowej i oddziaływań molekularnych można zastosować inne metody, takie jak analiza ilościowa.

visualization-immunological-synapse-dual-color-time-gated-stimulated

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Wizualizacja synapsy immunologicznej za pomocą dwukolorowej, czasowo ograniczanej emisyjnej deplecyjnej mikroskopii STED

Neisseria meningitidis (Nm), gram-ujemny patogen dróg oddechowych specyficzny dla ludzi, może wiązać się z ludzką α-aktyniną. Przedstawiamy tutaj protokół wizualizacji kolokalizacji bakterii z wewnątrzkomórkową α-aktyniną po wniknięciu bakterii do ludzkich komórek śródbłonka mikro naczyniowego mózgu (HBMECs).

Wizualizacja i kwantyfikacja oddziaływań wewnątrzkomórkowych Neisseria meningitidis oraz ludzkiej α-aktyniny za pomocą obrazowania konfokalnego

Niniejszy protokół szczegółowo opisuje sposób ilościowego oznaczania liczby synaps zarówno w dysocjowanych kulturach neuronowych, jak i w przekrojach mózgu z wykorzystaniem immunocytochemii. Przy użyciu przeciwciał specyficznych dla poszczególnych przedziałów komórkowych znakujemy terminale presynaptyczne oraz miejsca specjalizacji postsynaptycznej. Synapsy definiujemy jako punkty kolokalizacji sygnałów generowanych przez te markery.

Ilościowe oznaczanie synaps: test oparty na immunocytochemii do ilościowego oznaczania liczby synaps

Ten film demonstruje technikę wizualizacji powstawania synapsy immunologicznej w komórkach NK na podpartej dwuwarstwie lipidowej (SLB). SLB jest najpierw znakowany ligandem receptora aktywującego komórki NK znakowanym fluoroforem, a następnie inkubacją z komórkami NK. Następnie komórki są barwione pod kątem spolimeryzowanych granulek litycznych aktyny i perforyno-dodatniej. Takie podejście umożliwia wizualizację powstawania synaps za pomocą mikroskopii wymuszonego zubożenia emisji (STED).

Obrazowanie w superrozdzielczości tworzenia synaps immunologicznych komórek NK na podpartej dwuwarstwie lipidowej

Ten film demonstruje obrazowanie na żywych komórkach topologii synaps immunologicznych, badając interakcje między limfocytami T a komórkami nabłonkowymi przenoszącymi antygeny fluorescencyjne. Mikroskopia fluorescencyjna ujawnia przemieszczenie czerwonej cytoplazmy i żółte pierścienie błonowe w komórkach śródbłonka, co wskazuje na tworzenie się synaps immunologicznych.

Ocena topologii synaps immunologicznych za pomocą obrazowania żywych komórek

Czterowymiarowe (4D) obrazowanie jest wykorzystywane do badania zachowania i interakcji między dwoma typami endosomów w zakończonych nerwach żywych kręgowców.  Ruch tych małych struktur jest scharakteryzowany w trzech wymiarach, co pozwala na potwierdzenie zdarzeń takich jak fuzja endosomów i egzocytoza.

Wizualizacja dynamiki endosomów w żywych zakończeniach nerwowych za pomocą czterowymiarowego obrazowania fluorescencyjnego

Opisujemy tutaj połączenie techniki tworzenia synaps immunologicznych z wykorzystaniem dwuwarstwowego lipidu na wspartym szkłem z techniką obrazowania w superrozdzielczości mikroskopii STED (Stimulated emission depletion). Celem tego protokołu jest dostarczenie użytkownikom instrukcji niezbędnych do pomyślnego przeprowadzenia tych dwóch technik.

Obrazowanie w superrozdzielczości synapsy immunologicznej komórek NK na płaskiej dwuwarstwie lipidowej na podłożu szklanym

Odporność adaptacyjna jest kontrolowana przez dynamiczne 'synapsy immunologiczne' utworzone między limfocytami T a komórkami prezentującymi antygen. Protokół ten opisuje metody badania komórek śródbłonka zarówno jako niedostatecznie zbadane fizjologiczne APC, jak i jako nowy typ "płaskiego komórkowego modelu APC".

Model płaskiej komórki śródbłonka do obrazowania dynamiki synaps immunologicznych

Przedstawiamy protokół użycia mikroskopii STED do jednoczesnego obrazowania struktur aktynowych, mikrotubul i białek wiążących mikrotubule plus end w komórkach B, które rozprzestrzeniły się na szkiełkach nakrywkowych pokrytych przeciwciałami przeciwko receptorowi komórek B, modelowi początkowej fazy tworzenia synaps immunologicznych.

Wizualizacja cytoszkieletów aktyny i mikrotubul w synapsie immunologicznej komórek B przy użyciu mikroskopii wyczerpywania się emisji stymulowanej (STED)

Ogólnym celem tej metodologii jest zapewnienie optymalnych warunków eksperymentalnych od przygotowania próbki do akwizycji i rekonstrukcji obrazu, aby umożliwić wykonanie dwukolorowych obrazów 2D dSTORM mikrotubul i pośrednich włókien w stałych komórkach...

Obrazowanie pośrednich włókien i mikrotubul za pomocą 2-wymiarowej bezpośredniej stochastycznej mikroskopii rekonstrukcji optycznej

Ten protokół obrazuje zarówno powstawanie synaps immunologicznych, jak i późniejszy spolaryzowany ruch wydzielniczy w kierunku synapsy immunologicznej. Koniugaty komórkowe utworzono między komórką Raji impulsową superantygenem (działającą jako komórka prezentująca antygen) a klonem Jurkat (działającym jako limfocyt T wspomagający efektor).

Obrazowanie ludzkiej synapsy immunologicznej

Ten protokół opisuje metodę analizy morfometrycznej połączeń nerwowo-mięśniowych za pomocą połączonej mikroskopii konfokalnej i STED, która jest używana do ilościowego określania zmian patologicznych w mysich modelach SMA i CMS związanych z ColQ.

Charakterystyka połączeń nerwowo-mięśniowych u myszy za pomocą połączonej mikroskopii konfokalnej i superrozdzielczej

Poznaj dwukolorową nanoskopię STED do wizualizacji synapsy immunologicznej komórek NK z rozdzielczością poniżej 100 nm. Ta metoda umożliwia badanie interakcji cytoszkieletu z egzocytozą lityczną.

Wizualizacja synapsy immunologicznej za pomocą dwukolorowej nanoskopii STED (Time-Gated Stimulated Emission Depletion)

Przeglądaj więcej filmów