Wizualizacja synapsy immunologicznej za pomocą dwukolorowej nanoskopii STED (Time-Gated Stimulated Emission Depletion)

Ogólnym celem tej procedury jest wizualizacja struktur takich jak aktyna F w synapsie litycznej komórki NK za pomocą mikroskopii TED. Osiąga się to poprzez najpierw rekapitulację synapsy na szkle za pomocą przeciwciała aktywującego. Drugim krokiem procedury jest utrwalenie trwałej ondulacji i wybarwienie komórek pod kątem interesujących struktur.

Następnie preparaty są obrazowane za pomocą laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej, a następnie stosuje się stałe zubożenie w celu zwiększenia rozdzielczości obrazu. Ostatnim krokiem jest przetworzenie obrazów przy użyciu algorytmu dekonwolucji. Ostatecznie wyniki mogą pokazać rozdzielczość struktur komórkowych poniżej 100 nanometrów dzięki podwójnemu utrwalaniu kolorów i endoskopii.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii komórki, takie jak związek między cytoszkieletem a egzocytozą. W naszym przypadku interesuje nas wydzielanie przez komórki NK wyspecjalizowanych lizosomów nazywanych granulkami litycznymi. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowicjuszami w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ istnieje wiele zmiennych, które można dostosować w zastosowaniu lasera zubożającego TED.

Niewłaściwe zastosowanie wiązki zubożającej spowoduje pogorszenie zamiast poprawy rozdzielczości W przygotowaniu podgrzej 30 mililitrów pożywki RPMI z 10% FCS i osobno. Jeden mililitr BD CY wpływa na trwałą ondulację cyop zarówno do 37 stopni Celsjusza. Następnie rozpocznij proces powlekania szkiełek nakrywkowych przeciwciałami.

Weź szkiełka nakrywkowe numer 1,5 i użyj pisaka PAP. Na szkiełkach nakrywkowych ułóż kwadraty wielkości dziesięciocentówki. Przygotuj jeden kwadrat dla każdego badanego warunku.

Załaduj każde koło 200 mikrolitrami przeciwciała w ilości pięciu mikrogramów na mililitr w PBS. Do aktywacji komórek NK 92 należy użyć przeciwciał anty CD 18 i anty NK P 30. Inkubuj załadowane szkiełka nakrywkowe w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pół godziny, a następnie zmyj je zanurzając w temperaturze pokojowej PBS Natychmiast przystąp do dodawania komórek dla każdego badanego stanu, 500 000 komórek musi być gotowych do użycia.

Umyj komórki w 10 mililitrach wstępnie podgrzanego podłoża, a następnie zawieś je ponownie w tym samym podgrzanym podłożu. Przy 2,5 miliona komórek na mililitr z komórkami w pełni w zawiesinie, zdekantować 200 mikrolitrów do każdego kwadratu przeciwciała na pokrywie Zrazy inkubują szkiełka nakrywkowe z komórkami w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO2 w tym przypadku. 20 minut to wystarczający czas, aby spolaryzować granulki w komórkach NK po myciu inkubacyjnym, pokrywa delikatnie wsuwa się do PBS w temperaturze pokojowej.

Zacznij od dodania mikrolitra TRITTON X 100 do mililitra ciepłego roztworu cyto ondulacji BD CY effects. Potem wir. Nałóż 200 mikrolitrów tego roztworu na każdy kwadrat warunku na szkiełkach nakrywkowych.

Następnie umieść komórki w ciemności w temperaturze pokojowej i odczekaj 10 minut. Po zakończeniu inkubacji delikatnie umyj szkiełka nakrywkowe w buforze barwiącym. Następnie osusz krawędzie otoczonych obszarów bawełnianym wacikiem.

Następnie dodaj 200 mikrolitrów pierwszorzędowego przeciwciała w buforze barwiącym do otaczających regionów i pozwól szkiełkom osłonkowym inkubować w ciemności przez pół godziny. Niektóre dobre przeciwciała drugorzędowe do obrazowania stead to Alexa floor 4, 88 Pacific orange i Horizon V 500. Każdy z nich działa dobrze w rozcieńczeniu od jednego do 200.

Po umyciu inkubacyjnym okładka wsunęła się w barwienie, buforowała i wytarła je do sucha. Tak jak poprzednio, nałóż 200 mikrolitrów przeciwciała wtórnego na każdy kwadrat warunku. Następnie pozwól im siedzieć w ciemności przez kolejne 30 minut.

W tym momencie możliwe jest dodanie dodatkowych przeciwciał po dodatkowych płukaniach. Na przykład Phin można stosować w ilości od 1 do 200 w celu wykrycia f aktyny. W przypadku nośnika montażowego wybierz ekran Prolong over Vector Shield, który nie jest kompatybilny z STEAD.

Jeśli stosuje się barwienie phin, unikaj używania dwóch dwóch tioetanolu, chociaż jest to w porządku, teraz nałóż od 10 do 20 mikrolitrów podłoża montażowego na szkiełko. Przy odwróconym szkiełku nakrywkowym delikatnie opuść je do medium, unikając pęcherzyków powietrza. Następnie inkubuj szkiełko przez 24 godziny.

Z okładką poślizgnij się następnego dnia, uszczelnij szkiełko nakrywkowe lakierem do paznokci i kontynuuj obrazowanie. Uruchom lasery i oprogramowanie. Laser do wyczerpywania się światła stałego powinien rozgrzać się do 100% mocy i być wyrównany.

Za pomocą okularu ustaw ostrość na próbce, a następnie przejdź do oprogramowania. Przeskanuj pierwszy kanał, ten o najdłuższej długości fali. Piętro czwarte, zoptymalizuj moc lasera, położenie wiązki wzbudzenia i zasięg detektora.

Unikaj ustawiania powyżej 100. Następnie przechwyć obraz konfokalny i sprawdź, czy nie ma pikseli. Nasycenie, linia i uśrednianie klatek poprawią rozdzielczość pikseli.

Celem jest osiągnięcie wartości poniżej 30 nanometrów na piksel. Pewne nasycenie jest dopuszczalne dla stabilności. Następnie zastosuj stabilną wiązkę zubożającą przy 50% mocy i uchwyć obraz.

Jeśli rozdzielczość się poprawi, można zastosować większą moc. Co więcej, dostosowanie mocy lasera wzbudzenia lub średniej liniowej lub wzmocnienia może również poprawić rozdzielczość. Aby zmniejszyć tło, zastosuj bramkowanie czasu o 0,3 nanosekundy i dostosuj w górę.

Nową rozdzielczość należy oszacować przy użyciu pełnego obliczenia maksymalnej połowy szerokości. Gdy będziesz zadowolony, powtórz te kroki z drugim kanałem, gdy wszystkie kanały zostaną dostosowane. Sprawdź nakładanie się widma, obrazując kontrole pojedynczej plamy ze wszystkimi sekwencjami skanowania.

Łagodne nakładanie się można skorygować za pomocą rozmieszania spektralnego przez oprogramowanie, ale najlepiej jest tego unikać lub ograniczyć do minimum. Teraz pobierz obrazy do obrazowania ilościowego. Uzyskaj co najmniej 20 obrazów na warunek zgodnie z warunkami eksperymentalnymi.

Aby przekazać zapisane obrazy, otwórz pliki w odpowiednim oprogramowaniu. Sprawdź parametry każdego kanału, w szczególności widma wzbudzenia i wpuszczenia, emisję utrwalenia i kierunek obrazowania. Następnie zastosuj obliczenia dekonwolucji oprogramowania.

Zazwyczaj wystarczą ustawienia domyślne, ale stosunek sygnału do szumu będzie się różnił w zależności od siły podłogi, więc parametr należy ustawić ręcznie dla eksperymentu. Istnieje kilka typowych pułapek, które mogą prowadzić do nieoptymalnej rozdzielczości z steady. Jeden z nich jest w trakcie pobierania próbek.

Prowadzi to do ziarnistości i utraty informacji o pikselach, takich jak w tych włóknach f aktyny. Zwiększenie uśredniania linii lub klatek często rozwiązuje ten problem. Innym problemem jest wybielanie lub nadpróbkowanie spowodowane długimi pikselami.

Czas przebywania, zwykle spowodowany nadmiernym uśrednianiem linii, nadmiernym skanowaniem przed uzyskaniem obrazu, może być również winowajcą i można go skorygować za pomocą mniejszego skanowania przed uzyskaniem obrazów lub przy użyciu większej prędkości skanowania. Zmniejszenie mocy lasera może również pomóc w działaniu wszystkiego. Obraz znacznie się poprawi

Dekonwolucja jeszcze bardziej poprawi obraz. Zarówno ilościowo, jak i jakościowo. Podczas próby wykonania tej procedury należy rutynowo uzyskiwać rozdzielczość poniżej 100 nanometrów.

Ważne jest, aby pamiętać o wykonaniu stabilnego wyrównania wiązki przed każdym eksperymentem i mniej więcej raz na godzinę po tej procedurze. Inne metody, takie jak analiza ilościowa, można przeprowadzić, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące kolokalizacji, lokalizacji subkomórkowej i interakcji molekularnych.