Name: Przyżyciowe pomiary wideomikroskopii przepływu krwi w siatkówce u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-26T14:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Poznaj metodę pomiaru przepływu krwi w siatkówce myszy przy użyciu wideomikroskopii przyżyciowej z fluorescencyjnymi mikrosferami. Technika ta umożliwia precyzyjne określenie średnic naczyń i prędkości krwi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Finansowane przez NIH EY017599 (NRH).

Procedury związane z wykorzystaniem zwierząt zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania LSUHSC-S i przeprowadzone zgodnie z kryteriami określonymi przez National Institutes of Health.
1. Przygotowanie roztworów perfuzyjnych
<ol>
	<li>Sonikować 1% (wagowo) roztwór podstawowy mikrosfer o średnicy 1,9 μm.</li>
	<li>Pobrać ~25-30 x 106 zielonych mikrosfer fluorescencyjnych (czyli ~10 μl roztworu podstawowego) do strzykawki o pojemności 300 μl. Rozcieńczyć mikrosfery, pobierając dodatkowe 240 μl soli fizjologicznej do strzykawki.</li>
	<li>Przygotować 50 μl roztworu 2 x 10 6 fluorescencyjnego dekstranu rozpuszczonego w sterylnym roztworze soli fizjologicznej, z wstrzykiwaną dawką w zakresie 3-10 mg/kg. Trzymaj dekstran przykryty folią aluminiową do czasu jego naparu.</li>
</ol>
2. Znieczulenie zwierzęce i kaniulacja naczyniowa
<ol>
	<li>Znieczulić zwierzę do chirurgicznego wprowadzenia kaniul naczyniowych oraz do stacjonarnego pozycjonowania pod obiektywem mikroskopu. Dostępnych jest wiele rodzajów protokołów anestezjologicznych, o różnych zaletach i wadach oraz potencjalnym wpływie na parametry ogólnoustrojowe. Wśród wielu różnych opcji znajduje się połączenie ketaminy (100-150 mg/kg), ksylazyny (10 mg/kg) i acepromazyny (2 mg/kg) lub połączenie ketaminy (50 mg/kg) i pentobarbitalu (50 mg/kg). Opisane procedury są ostre i kończą się eutanazją wywołaną przedawkowaniem pentobarbitalu (150 mg/kg), po której następuje torakotomia; Włączenie leku przeciwbólowego nie jest konieczne w przypadku procedury terminalnej.</li>
	<li>Utrzymuj poduszkę grzewczą pod zwierzęciem przez pozostałą część eksperymentu.</li>
	<li>Utrzymuj oczy wilgotne solą fizjologiczną buforowaną fosforanami podczas kolejnych chirurgicznych wprowadzania kaniul naczyniowych.</li>
	<li>Przygotuj kaniulę naczyniową do kolejnych infuzji znaczników fluorescencyjnych. Rurkę polietylenową o długości 20 cm (na przykład średnica wewnętrzna 0,28 mm; średnica zewnętrzna 0,61 mm) umieszcza się na końcówce igły strzykawki, przy czym ostry koniec igły jest wcześniej odłamywany przez zginanie w przód iw tył za pomocą hemostatu.</li>
	<li>Napełnić strzykawkę i rurkę heparynizowanym (25 j./ml) solą fizjologiczną.</li>
	<li>Ogol jedną stronę dolnej części brzucha i wykonaj nacięcie, aby odsłonić żyłę udową.</li>
	<li>Aby kaniulować żyłę udową, zwiąż naczynie szwem 5,0, wykonaj częściowe nacięcie naczynia (około połowy średnicy naczynia) i włóż rurkę do naczynia, zabezpieczając rurkę szwem zawiązanym wokół odcinka kaniulowanego.</li>
</ol>
3. Przygotowanie do mikroskopii przyżyciowej
<ol>
	<li>Rozszerz źrenicę oka kroplą 1% tropikamidowego roztworu okulistycznego, a następnie kroplą 2,5% roztworu okulistycznego hypromelozy.</li>
	<li>Przykryj oko szkiełkiem nakrywkowym o średnicy 5 mm.</li>
	<li>Umieść zwierzę na tablicy z pleksi, która zostanie umieszczona pod obiektywem mikroskopu pionowego. Strategicznie umieść gazę chirurgiczną pod głową, aby umożliwić bezpośrednią oś przez obiektyw do centralnej siatkówki i tarczy optycznej.</li>
	<li>Ustaw ostrość przez mikroskop na tarczy optycznej, znajdując dysk za pomocą obiektywu 4X o małej mocy i używając filtra fluoresceinowego.</li>
</ol>
4. Napar z mikrosfer fluorescencyjnych do pomiaru prędkości
<ol>
	<li>Używając obiektywu 4X, ustaw ostrość na siatkówce z dyskiem optycznym w środku pola widzenia.</li>
	<li>Nasycić fluorescencyjny roztwór mikrosfery z szybkością 250 μl/min/kg.</li>
	<li>Nagraj na wideo widoczną siatkówkę wokół tarczy optycznej, używając czasu naświetlania kamery ~8 ms.</li>
	<li>Przerwij infuzję mikrosfery, gdy nagrany zostanie wystarczający czas trwania filmu (1-2 min); część roztworu mikrosfery prawdopodobnie pozostanie niewykorzystana.</li>
</ol>
5. Infuzja fluorescencyjnego markera plazmowego do pomiaru średnic
<ol>
	<li>Używając obiektywu 4X, ustaw ostrość na siatkówce z dyskiem optycznym w środku pola widzenia.</li>
	<li>Przygotowany roztwór fluorescencyjnego dekstranu należy wprowadzić do żyły udowej w bolusie w ciągu ~5 sekund, podczas nagrywania wideo. Ten film pomoże określić tożsamość tętniczek i żyłek, przy czym tętniczki są najpierw perfundowane. Wykonaj ten krok z czasem ekspozycji aparatu ustawionym na ~8 ms, chociaż dokładny czas ekspozycji nie jest krytyczny.</li>
	<li>Przełącz się na obiektyw 10X i czas naświetlania 20-40 ms, aby poprawić rozdzielczość, aby sfilmować każdą z 4-7 tętniczek i 4-7 żyłek w powierzchownej siatkówce. Ustaw ostrość (i nagraj wideo) na około jednej ćwiartce widocznej siatkówki na raz, ze środkiem dysku optycznego w jednym rogu pola widzenia. Należy dołożyć starań, aby zminimalizować czas, w którym światło mikroskopu oświetla tkankę, aby zmniejszyć możliwość fototoksyczności wywołanej światłem/barwnikiem17.</li>
</ol>
6. Analiza wideo
<ol>
	<li>Za pomocą skali mikrometrycznej skalibruj system wizyjny pod kątem konwersji μm/piksel.</li>
	<li>Za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu odtwórz nagrane wideo.</li>
	<li>Na filmie przedstawiającym wlew bolusa z dekstranu fluorescencyjnego zidentyfikuj tętniczki i żyłki.</li>
	<li>Dla każdej z 4-7 tętniczek i 4-7 żyłek zarejestrowanych za pomocą obiektywu 10X, zmierz średnice wypełnione fluorescencyjnym dekstranem, średnio 5 pomiarów średnicy na naczynie wzdłuż widocznej długości.</li>
	<li>Dla każdej z tych samych tętniczek i żyłek zmierz długość smugi mikrosfer fluorescencyjnych, używając 10 kolejnych smug mikrosfery w każdym naczyniu, aby uniknąć błędu selekcji. Podziel długości smug przez czas ekspozycji, aby obliczyć prędkość mikrosfery, na przykład 160 μm/8 ms = 20 μm/ms = 2 cm/s. Uśrednij 10 prędkości na statek.</li>
	<li>Obliczyć objętościowe natężenie przepływu dla każdego naczynia za pomocą następującego równania: przepływ = średnia prędkość × π × średnica2/4.</li>
	<li>Zsumuj natężenia przepływu tętniczego i oddzielnie natężenia przepływu komorowego, aby uzyskać całkowity przepływ krwi w siatkówce.</li>
</ol>

<ol><li>Wang, L., Fortune, B., Cull, G., McElwain, K. M., Cioffi, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microspheres+method+for+ocular+blood+flow+measurement+in+rats%3A+size+and+dose+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Microspheres method for ocular blood flow measurement in rats: size and dose optimization.</a> Exp. Eye Res. 84, 108-117 (2007).</li>
<li>Wang, L., Grant, C., Fortune, B., Cioffi, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+and+choroidal+vasoreactivity+to+altered+PaCO2+in+rat+measured+with+a+modified+microsphere+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Retinal and choroidal vasoreactivity to altered PaCO2 in rat measured with a modified microsphere technique.</a> Exp. Eye Res. 86, 908-913 (2008).</li>
<li>Pouliot, M., Hetu, S., Lahjouji, K., Couture, R., Vaucher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+retinal+blood+flow+by+kinin+B%281%29+receptor+in+Streptozotocin-diabetic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Modulation of retinal blood flow by kinin B(1) receptor in Streptozotocin-diabetic rats.</a> Exp. Eye Res. 92, 482-489 (2011).</li>
<li>Pouliot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+regional+measurement+of+retinal+blood+flow+in+rats+using+N-isopropyl-p-%5B14C%5D-iodoamphetamine+%28%5B14C%5D-IMP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative and regional measurement of retinal blood flow in rats using N-isopropyl-p-[14C]-iodoamphetamine ([14C]-IMP).</a> Exp. Eye Res. 89, 960-966 (2009).</li>
<li>Zhi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volumetric+and+quantitative+imaging+of+retinal+blood+flow+in+rats+with+optical+microangiography%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Opti.+Express%22%5BJournal%5D)">Volumetric and quantitative imaging of retinal blood flow in rats with optical microangiography.</a> Biomed. Opti. Express. 2, 579-591 (2011).</li>
<li>Zhi, Z., Cepurna, W. O., Johnson, E. C., Morrison, J. C., Wang, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+intraocular+pressure+on+changes+of+blood+flow+in+the+retina%2C+choroid%2C+and+optic+nerve+head+in+rats+investigated+by+optical+microangiography%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Opti.+Express%22%5BJournal%5D)">Impact of intraocular pressure on changes of blood flow in the retina, choroid, and optic nerve head in rats investigated by optical microangiography.</a> Biomed. Opti. Express. 3, 2220-2233 (2012).</li>
<li>Li, G., De La Garza, B., Shih, Y. Y., Muir, E. R., Duong, T. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layer-specific+blood-flow+MRI+of+retinitis+pigmentosa+in+RCS+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Layer-specific blood-flow MRI of retinitis pigmentosa in RCS rats.</a> Exp. Eye Res. 101, 90-96 (2012).</li>
<li>Muir, E. R., Renteria, R. C., Duong, T. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+ocular+blood+flow+as+an+early+indicator+of+diabetic+retinopathy+in+a+mouse+model+of+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Reduced ocular blood flow as an early indicator of diabetic retinopathy in a mouse model of diabetes.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 53, 6488-6494 (2012).</li>
<li>Wright, W. S., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ozagrel+attenuates+early+streptozotocin-induced+constriction+of+arterioles+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Ozagrel attenuates early streptozotocin-induced constriction of arterioles in the mouse retina.</a> Exp. Eye Res. 86, 528-536 (2008).</li>
<li>Lee, S., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Losartan+and+ozagrel+reverse+retinal+arteriolar+constriction+in+non-obese+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Losartan and ozagrel reverse retinal arteriolar constriction in non-obese diabetic mice.</a> Microcirculation. 15, 379-387 (2008).</li>
<li>Wright, W. S., Messina, J. E., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+diabetes-induced+retinal+vasoconstriction+by+a+thromboxane+receptor+antagonist%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Attenuation of diabetes-induced retinal vasoconstriction by a thromboxane receptor antagonist.</a> Exp. Eye Res. 88, 106-112 (2009).</li>
<li>Wang, Z., Yadav, A. S., Leskova, W., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+streptozotocin-induced+microvascular+changes+in+the+mouse+retina+with+the+endothelin+receptor+A+antagonist+atrasentan%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Attenuation of streptozotocin-induced microvascular changes in the mouse retina with the endothelin receptor A antagonist atrasentan.</a> Exp. Eye Res. 91, 670-675 (2010).</li>
<li>Yadav, A. S., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+tempol+on+diabetes-induced+decreases+in+retinal+blood+flow+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of tempol on diabetes-induced decreases in retinal blood flow in the mouse.</a> Curr. Eye Res. 36, 456-461 (2011).</li>
<li>Wang, Z., Yadav, A. S., Leskova, W., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+20-HETE+attenuates+diabetes-induced+decreases+in+retinal+hemodynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Inhibition of 20-HETE attenuates diabetes-induced decreases in retinal hemodynamics.</a> Exp. Eye Res. 93, 108-113 (2011).</li>
<li>Wright, W. S., Yadav, A. S., McElhatten, R. M., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+blood+flow+abnormalities+following+six+months+of+hyperglycemia+in+the+Ins2%28Akita%29+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Retinal blood flow abnormalities following six months of hyperglycemia in the Ins2(Akita) mouse.</a> Exp. Eye Res. 98, 9-15 (2012).</li>
<li>Lee, S., Morgan, G. A., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ozagrel+reverses+streptozotocin-induced+constriction+of+arterioles+in+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Ozagrel reverses streptozotocin-induced constriction of arterioles in rat retina.</a> Microvasc. Res. 76, 217-223 (2008).</li>
<li>Rumbaut, R. E., Sial, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+phototoxicity+of+fluorescent+dye-labeled+albumin+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Differential phototoxicity of fluorescent dye-labeled albumin conjugates.</a> Microcirculation. 6, 205-213 (1999).</li>
<li>Tadayoni, R., Paques, M., Gaudric, A., Vicaut, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythrocyte+and+leukocyte+dynamics+in+the+retinal+capillaries+of+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Erythrocyte and leukocyte dynamics in the retinal capillaries of diabetic mice.</a> Exp. Eye Res. 77, 497-504 (2003).</li>
<li>Walsh, M. K., Quigley, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+time-lapse+fluorescence+imaging+of+individual+retinal+ganglion+cells+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo time-lapse fluorescence imaging of individual retinal ganglion cells in mice.</a> J. Neurosci. Methods. 169, 214-221 (2008).</li>
<li>Shahidi, M., Wanek, J., Blair, N. P., Mori, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+mapping+of+chorioretinal+vascular+oxygen+tension+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional mapping of chorioretinal vascular oxygen tension in the rat.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 820-825 (2009).</li>
<li>Hughes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+schematic+eye+for+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Vis.+Res%22%5BJournal%5D)">A schematic eye for the rat.</a> Vis. Res. 19, 569-588 (1979).</li>
<li>Remtulla, S., Hallett, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+schematic+eye+for+the+mouse%2C+and+comparisons+with+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Vis.+Res%22%5BJournal%5D)">A schematic eye for the mouse, and comparisons with the rat.</a> Vis. Res. 25, 21-31 (1985).</li>
<li>Schmucker, C., Schaeffel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+biometry+in+the+mouse+eye+with+low+coherence+interferometry%5BTitle%5D)+AND+%22Vis.+Res%22%5BJournal%5D)">In vivo biometry in the mouse eye with low coherence interferometry.</a> Vis. Res. 44, 2445-2456 (2004).</li>
<li>Mulivor, A. W., Lipowsky, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation-+and+ischemia-induced+shedding+of+venular+glycocalyx%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Inflammation- and ischemia-induced shedding of venular glycocalyx.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 286, 1672-1680 (2004).</li>
<li>Harris, N. R., Whatley, J. R., Carter, P. R., Specian, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Venular+constriction+of+submucosal+arterioles+induced+by+dextran+sodium+sulfate%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm.+Bowel+Dis%22%5BJournal%5D)">Venular constriction of submucosal arterioles induced by dextran sodium sulfate.</a> Inflamm. Bowel Dis. 11, 806-813 (2005).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ta technika przyżyciowej mikroskopii wideo może być stosowana nie tylko u myszy, ale także u szczurów. Protokół ten opiera się tylko na kilku założeniach, ale jest ograniczony do stosowania w znieczuleniu i z rozszerzeniem źrenicy, jak to opisaliśmy. Pozostałe założenia i ograniczenia są następujące:
1. Założenie minimalnego błędu powiększenia optycznego wynikającego z refrakcyjnej natury oka. Jak opisali inni18-20, metoda wypełniania przestrzeni między rogówką a szk...

Siatkówka jest jedną z najbardziej aktywnych metabolicznie tkanek w ciele i w związku z tym wymaga obfitego dopływu krwi. Dwa oddzielne krążenia spełniają to wymaganie: krążenie naczyniówkowe dla zewnętrznej części siatkówki i krążenie siatkówki dla wewnętrznej części siatkówki. Badania perfuzji siatkówki są niezbędne do zrozumienia patologicznych mechanizmów i konsekwencji retinopatii cukrzycowej, retinopatii indukowanej tlenem, niedrożności tętnic lub żył siatkówki oraz udaru. Do ilościowego określenia przepływu krwi w siatkówce zastosowano kilka metod, przy czym każda technika ma swoje zalety, wady, ograniczenia i założenia. Wśród tych technik znajduje się infuzja mikrosfer o średnicy 7-8 μm, które osadzają się w tętniczkach przedwłośniczkowych1,2, autoradiografia ilościowa3,4, mikroangiopatia optyczna - optyczna tomografia koherentna5,6, rezonans magnetyczny7,8 i wideomikroskopia przyżyciowa9-16. Zaletami tego ostatniego są bezpośrednia wizualizacja na żywo naczyń siatkówkowych i przepływu, zależność od zaledwie kilku drobnych założeń oraz przystępność cenowa dla laboratoriów posiadających mikroskop fluorescencyjny z dołączoną kamerą wideo. W poprzednich badaniach przyżyciowej mikroskopii wideo9-16 fluorescencyjny dekstran był używany jako marker osocza, a znakowane fluorescencyjnie czerwone krwinki (od zwierzęcia dawcy) były używane jako markery prędkości. W obecnym protokole do pomiaru prędkości używa się fluorescencyjnie znakowanych mikrosfer o średnicy 1,9 μm zamiast czerwonych krwinek, przy czym ta zmiana neguje potrzebę dawcy komórek krwi.

<table><tbody><tr><td>Mikrosfery fluorescencyjne</td><td>Bangs Laboratories</td><td>FS04F/10584 (zielone)</td><td></td></tr> <tr><td>Sondy molekularne</td> <td>fluorescencyjnego dekstranu o wysokiej masie cząsteczkowej</td><td>D-7137 (zielone); D-7139 (czerwony)</td><td></td></tr><tr><td>System mikroskopowy</td><td>Nikon</td><td>Eclipse E600FN + nasadki</td><td></td></tr><tr><td>Obiektyw 4X</td><td>Nikon</td><td>Plan Fluor 4X</td><td>przysłona numeryczna 0,13; odległość robocza 17,2 mm</td></tr><tr><td>obiektyw 10X</td><td>Nikon</td><td>Plan 10X</td><td>przysłona numeryczna 0,25; odległość robocza 10,5 mm</td></tr><tr><td>Tropicamid roztwór okulistyczny</td><td>Bausch Lomb</td><td>1% tropicamid</td><td></td></tr><tr><td>Hypromeloza roztwór okulistyczny</td><td>HUB Pharmaceuticals</td><td>2,5% Goniovisc</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do przetwarzania obrazu</td><td>Uniwersytet Kalifornijski San Francisco Vale Lab</td><td>Micro-Manager</td><td></td></tr><tr><td>Cyfrowa kamera wideo do mikroskopii</td><td>Fotometria</td><td>CoolSnap ES</td><td>Rozdzielczość 1392 x 1040 pikseli; Rozmiar piksela 6,45 x 6,45 &mu; mln</td></tr></tbody></table>

przyżyciowe pomiary wideomikroskopii przepływu krwi w siatkówce u myszy

Intravital Video Microscopy Measurements of Retinal Blood Flow in Mice

Zmiany w przepływie krwi w siatkówce mogą przyczyniać się do chorób oczu i dysfunkcji wzroku lub być ich konsekwencją. Dlatego kwantyfikacja zmienionej perfuzji może pomóc w badaniach nad mechanizmami patologii siatkówki. Przyżyciowy mikroskop wideo znaczników fluorescencyjnych może być stosowany do pomiaru średnic naczyń krwionośnych i prędkości krwiobiegu siatkówki, w szczególności tętniczek rozgałęziających się od centralnej tętnicy siatkówkowej i żyłek prowadzących do centralnej żyły siatkówki. Natężenia przepływu krwi można obliczyć na podstawie średnic i prędkości, z sumą przepływu tętniczego i oddzielnie przepływu komorowego, podając wartości całkowitego przepływu krwi w siatkówce. Ten artykuł i związany z nim film opisują metody stosowania tej techniki u myszy, które obejmują 1) przygotowanie oka do mikroskopii przyżyciowej znieczulonego zwierzęcia, 2) dożylny wlew mikrosfer fluorescencyjnych w celu pomiaru prędkości krwi, 3) dożylny wlew fluorescencyjnego dekstranu o wysokiej masie cząsteczkowej, w celu wspomagania mikroskopowej wizualizacji mikrokrążenia siatkówki, 4) użycie cyfrowej kamery mikroskopowej do uzyskania filmów perfuzyjnej siatkówki oraz 5) użycie oprogramowania do przetwarzania obrazu do analizy wideo. Te same techniki można zastosować do pomiaru szybkości przepływu krwi w siatkówce u szczurów.

Rycina 1 przedstawia pojedyncze klatki z filmu z eksperymentu, przy czym panele A–D oraz F–I pokazują smugi fluorescencyjnych mikrokul, uchwycone przy użyciu obiektywu 4X i czasie naświetlania 8 ms (oraz binningu 2 × 2 piksele w celu zmniejszenia rozmiaru pliku wideo). Rycina 1E przedstawia orientację naczyń siatkówki na pozostałych panelach ryciny. Nie każda klatka filmu będzie zawierać ostro skupioną smugę fluorescencyjną; jednak niektóre klatki mogą zawierać wiele smug możliwych do wy...

Mikroskopia przyżyciowe może być używana u zwierząt do wizualizacji i pomiaru średnic naczyń krwionośnych siatkówki, prędkości przepływu krwi i całkowitego przepływu krwi w siatkówce.

Przyżyciowe pomiary wideomikroskopii przepływu krwi w siatkówce u myszy

Alterations in retinal blood flow can contribute to, or be a consequence of, ocular disease and visual dysfunction. Therefore, quantitation of altered ...

Ogólnym celem tej procedury jest pomiar przepływu krwi w siatkówce u myszy. Osiąga się to poprzez uprzednie wprowadzenie fluorescencyjnych mikrosfer przez kaniulowaną żyłę udową znieczulonej myszy. Drugim krokiem jest nagranie wideo mikrosfer przepływających przez naczynia siatkówki myszy.Następnie wlej fluorescencyjny dekstran przez żyłę udową i uchwyć wideo, gdy przepływa przez naczynia siatkówki. Ostatnim krokiem jest zmierzenie prędkości mikrosfer i średnic naczyń na podstawie nagranych filmów w celu obliczenia przepływu krwi w siatkówce. Podstawową zaletą tej techniki jest możliwość dokładnego pomiaru przepływu krwi w siatkówce za pomocą standardowego mikroskopu fluorescencyjnego.Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie siatkówki, takie jak stopień, w jakim zmiany w przepływie krwi przyczyniają się do retinopatii cukrzycowej. Chociaż będziemy demonstrować tę technikę w siatkówce myszy. Ogólna metoda może być stosowana w innych tkankach, a także u szczurów.Sonikować 1% roztwór podstawowy mikrosfer o średnicy 1,9 mikrona, pobrać 10 mikrolitrów roztworu podstawowego do strzykawki o pojemności 300 mikrolitrów, a następnie rozcieńczyć mikrosfery, pobierają

intravital-video-microscopy-measurements-of-retinal-blood-flow-in-mice

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Pomiary mikroskopii wideo intravitalnej przepływu krwi w siatkówce u myszy

Mikroskopia wewnątrzżyciowa do śledzenia czasowych i przestrzennych zdarzeń hemodynamicznych i zapalnych w mikrokrążeniu opony miękkiej.

Mikroskopia intravitalna mikrokrążenia mózgu myszy z wykorzystaniem zamkniętego okna czaszkowego

Mikroskopia przyżyciowa myszy M. cremaster microcirculation oferuje unikalny i dobrze ustandaryzowany model in vivo do analizy migracji komórek macierzystych szpiku kostnego obwodowego.

Mikroskopia przyżyteczna mikrokrążenia w mięśniu Cremaster myszy do analizy migracji obwodowych komórek macierzystych

Ten artykuł opisuje szczegółową metodę dynamicznego pomiaru i kwantyfikacji prędkości przepływu krwi w poszczególnych naczyniach krwionośnych układu krwionośnego wątroby myszy przy użyciu obrazowania pod mikroskopem przyżyciowym w połączeniu ze specyficzną metodologią pozyskiwania i analizy obrazów.

Obrazowanie pod mikroskopem przyżyciowym wątroby po zakażeniu Leishmania: ocena hemodynamiki wątroby

Obrazowanie żywych komórek krwi oznaczonych krwinek w krążeniu ocznym może dostarczyć informacji o stanie zapalnym i niedokrwieniu w retinopatii cukrzycowej oraz zwyrodnieniu plamki żółtej związanym z wiekiem. Opisano protokół oznaczania komórek krwi i obrazowania znakowanych komórek w krążeniu siatkówkowym.

Fluorescencyjne znakowanie barwnikami erytrocytów i leukocytów w celu badania dynamiki przepływu w krążeniu siatkówkowym myszy

Wiele zagrażających wzrokowi chorób oczu jest związanych z dysfunkcyjnymi mikronaczyniami siatkówki. Dlatego pomiar odpowiedzi tętniczek siatkówki jest ważny dla zbadania podstawowych mechanizmów patofizjologicznych. W artykule opisano szczegółowy protokół izolacji i przygotowania tętniczek siatkówki myszy do oceny wpływu substancji wazoaktywnych na średnicę naczyń krwionośnych.

Etapy przygotowania do pomiaru reaktywności tętniczek siatkówki myszy ex vivo

Podejście oparte na otwartym oknie naczyniowym przy użyciu znaczników fluorescencyjnych zapewnia wystarczającą rozdzielczość do pomiaru przepływu krwi w ślimaku (CoBF). Metoda ułatwia badanie zmian strukturalnych i funkcjonalnych w CoBF u myszy w warunkach normalnych i patologicznych.

Pomiar przepływu krwi w ślimaku myszy z wykorzystaniem otwartego okna naczyniowego i przyżyciowej mikroskopii fluorescencyjnej

Obrazowanie in vivo jest potężnym narzędziem do badania biologii w zdrowiu i chorobie. Protokół ten opisuje obrazowanie przezźrenicowe siatkówki myszy za pomocą standardowego mikroskopu dwufotonowego. Zademonstrowano również różne metody obrazowania in vivo, które umożliwiają fluorescencyjne znakowanie wielu kohort komórkowych siatkówki.

Przezźrenicowe dwufotonowe obrazowanie in vivo siatkówki myszy

Ten protokół opisuje szczegółową metodę przygotowania i immunofluorescencji barwienia płaskich mocowań siatkówki myszy oraz analizy. Szczegółowo opisano również zastosowanie angiografii dna oka fluoresceiny (FFA) u młodych myszy i przetwarzanie obrazu.

Monitorowanie dynamicznego wzrostu naczyń siatkówki w mysim modelu retinopatii indukowanej tlenem

Ten artykuł opisuje dobrze sprawdzony i powtarzalny test barwienia lektyny dla całego preparatu siatkówki Mount oraz protokoły wymagane do ilościowego pomiaru parametrów naczyniowych często zmienianych w retinopatiach proliferacyjnych i nieproliferacyjnych.

Kwantyfikacja parametrów naczyniowych w całych siatkówkach górskich myszy z retinopatiami nieproliferacyjnymi i proliferacyjnymi

Tutaj prezentujemy trzy protokoły analizy danych dla obrazów angiografii fluoresceinowej (FA) i optycznej koherentnej tomografii (OCT) w badaniu okluzji żył siatkówki (RVO).

In vivo (in vivo) Odczyty uszkodzeń naczyniowych w siatkówce myszy w celu zwiększenia odtwarzalności

Unaczynienie siatkówki myszy jest szczególnie interesujące w zrozumieniu mechanizmów powstawania wzorców naczyniowych. Protokół ten automatycznie mierzy średnicę naczyń siatkówki myszy na podstawie obrazów dna oka angiografii fluorescencyjnej w stałej odległości od tarczy nerwu wzrokowego.

Pomiar średnicy naczynia siatkówki na podstawie obrazów angiografii fluorescencyjnej myszy

Poznaj metodę pomiaru przepływu krwi w siatkówce myszy przy użyciu wideomikroskopii przyżyciowej z fluorescencyjnymi mikrosferami. Technika ta umożliwia precyzyjne określenie średnic naczyń i prędkości krwi.

Przyżyciowe pomiary wideomikroskopii przepływu krwi w siatkówce u myszy

Przeglądaj więcej filmów