Name: Rozwarstwienie grzebienia nerwowego Xenopus laevis do hodowli eksplantatów in vitro lub przeszczepu in vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-04T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Poznaj metodę rozwarstwienia grzebienia nerwowego Xenopus laevis do badań migracji komórek in vitro i in vivo. Technika umożliwia śledzenie rozwoju zarodkowego i różnicowania komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy dziękują Adeline Dolly za zdjęcia eksplantatu na fibronektynie, Ericowi Theveneau za pomocne dyskusje oraz Animal Facility Instytutu Curie. C.M. jest adiunktem w Regionie Ile de France (Domaine d'Interet Majeur Stem Pole), Universite Paris Sud (Attache Temporaire d'Enseignement et de Recherche) oraz Agence Nationale de la Recherche. Praca została sfinansowana przez Universite Paris Sud (Attractivite 2011), Centre National de la Recherche Scientifique (Action Thematique et Incitative sur Programme), Association pour la Recherche contre le Cancer Grant SFI20101201882, Ligue contre le Cancer oraz Agence Nationale de la Recherche (Agence Nationale de la Recherche Programme Blanc).

Eksperymenty są zgodne z krajowymi i europejskimi przepisami dotyczącymi ochrony zwierząt wykorzystywanych do celów naukowych oraz z międzynarodowymi zasadami zastępowania, zmniejszania i udoskonalania.
1. Przygotowanie potraw pokrytych fibronektyną14
<ol>
	<li>Odpipetować 500 ml fibronektyny o sile 10 mg/ml klasy hodowlanej, rozcieńczonej w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) na standardową plastikową szalkę Petriego (Ø 40 x 11 mm). Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Uwaga: w przypadku używania szklanych naczyń lub szkiełek nakrywkowych do późniejszego obrazowania należy użyć roztworu fibronektyny o stężeniu 100 mg/ml.</li>
	<li>Spłucz trzy razy 1x PBS.</li>
	<li>Zastąp PBS 500 ml 1x PBS/0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA). Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.</li>
	<li>Spłucz trzy razy 1x PBS.</li>
	<li>Napełnij 1x PBS i trzymaj w temperaturze 4 °C do czasu użycia (zwykle przez 24-48 godzin).</li>
</ol>
2. Sekcja eksplantatów NC
<ol>
	<li>Przygotować 3/4 normalnego podłoża dla (NAM) (110 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM Ca(NO3)2, 1 mM MgSO4, 0,1 mM EDTA, 1 mM NaHCO3, 0,2x PBS, 50 mg/ml gentamycyny10,15). Nie przechowywać dłużej niż 1 tydzień do sekcji, przechowywać w temperaturze 4 °C. Starsze NAM mogą być używane do przygotowania naczyń separacyjnych pokrytych agarozą (poniżej).</li>
	<li>Przygotować 60-milimetrowe szalki Petriego do rozwarstwienia, pokryte 10 ml 2% agarozy w 3/4 NAM.</li>
	<li>Zbierz narzędzia do preparowania: plastikowe pipety Pasteura, najdelikatniejszą szpilkę do owadów zamontowaną na uchwycie na szpilkę (patrz tabela materiałów w celach informacyjnych), "nóż do brwi" (wykonany z włosków brwiowych zatopionych w parafinie na końcu szklanej pipety Pasteura16), dwa cienkie kleszcze preparacyjne, pipetę i końcówki P1000, lornetkowy stereoskop o powiększeniu od 8-40X do 50, Jasne źródło światła z przewodnikami światłowodowymi. Wszystkie narzędzia preparacyjne powinny być utrzymywane w czystości; Po każdym eksperymencie spłucz je dwukrotnie wodą destylowaną, raz 100% etanolem i pozostaw do wyschnięcia. Przechowywać z dala od kurzu.</li>
	<li>Napełnij naczynie rozwarstwiające świeżym NAM prawie do góry.</li>
	<li>Pozyskać zarodki X. laevis zgodnie ze standardowymi procedurami10 i postarzać je do osiągnięcia stadium neuruli 16 (zgodnie z tabelą rozwojową Nieuwkoopa i Fabera17).</li>
	<li>Umieść zarodki w stadium 16 w naczyniu separacyjnym za pomocą plastikowej pipety Pasteura.</li>
	<li>Wykonaj wszystkie kolejne kroki pod lunetą lornetkową. Usuń błonę witelinową za pomocą dwóch par kleszczy. Uważaj, aby nie uszkodzić grzbietowej części zarodków.</li>
	<li>Poczekaj, aż zarodki osiągną stadium 17, aby rozpocząć sekcję. Etap 17 jest odpowiedni, ponieważ grzebień nerwowy jest wyraźnie oddzielony od cewy nerwowej, w przeciwieństwie do wcześniejszych etapów. Po etapie 17 NC zaczyna migrować i mieszać się z otaczającym mezenchymem.</li>
	<li>Wykop mały otwór w agarozie za pomocą kleszczy, aby zrobić niszę dla zarodków, aby utrzymać je podczas sekcji. Umieść jeden zarodek grzbietem do góry. Uwaga: do utrzymania zarodków można użyć plasteliny, zamiast kopania w agarozie.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie w bocznej części przedniego fałdu nerwowego za pomocą noża do brwi i szpilki do owadów. Uważaj, aby nie wchodzić zbyt głęboko w zarodek: staraj się przeciąć 2-3 warstwy komórek (nigdy nie sięgaj tak głęboko, jak archenteron!). Podczas całego procesu preparacji nigdy nie dopuszczaj do tego, aby wypreparowane tkanki zetknęły się z powierzchnią międzypowietrzno-cieczową, ponieważ tkanki zarodkowe X. laevis są poddawane lizie pod wpływem napięcia powierzchniowego.</li>
	<li>Wykonaj drugie równoległe nacięcie w bardziej grzbietowej części fałdu nerwowego za pomocą tych samych instrumentów.</li>
	<li>W razie potrzeby obróć naczynie o 90°. Wykonaj trzecie prostopadłe nacięcie nożem do brwi i szpilką do owadów, po tylnej stronie pierwszych dwóch nacięć. NC to gruba masa komórek pod pigmentowaną zewnętrzną warstwą ektodermy, boczną w stosunku do cewy nerwowej.</li>
	<li>Użyj czubka noża do brwi, aby oderwać pigmentowaną warstwę ektodermy od leżącego poniżej NC, zaczynając od trzeciej krawędzi nacięcia.</li>
	<li>Użyj boku noża do brwi, aby odłączyć tkankę NC, zaczynając od trzeciego nacięcia. Tkanka NC jest raczej szarawa, podczas gdy leżąca pod nią mezoderma głowowa jest biała. Ostrożnie oddziel NC od mezodermy.</li>
	<li>Odłącz tkankę NC z przodu od pęcherzyka wzrokowego i przetnij na tym poziomie, aby uwolnić eksplantat. Jako kontrolę przed pierwszymi eksperymentami zaleca się sprawdzenie ekspresji ślimaka2 (kanonicznego markera NC) w niektórych eksplantatach poprzez hybrydyzację in situ.</li>
</ol>
3. Poszycie eksplantatów na fibronektynie
<ol>
	<li>Napełnij naczynie pokryte fibronektyną zmodyfikowanym podłożem Danilchick (MDM, NaCl 53 mM, Na2CO3 5 mM, K Glukonian 4,5 mM, Na Glukonian 32 mM, MgSO4 1 mM, CaCl2 1 mM, BSA 0,1%, dostosuj pH do 8,3 za pomocą 1 M Bicine18).</li>
	<li>Przenieś eksplantaty do naczynia pokrytego fibronektyną za pomocą pipety P1000. Nigdy nie pozwól, aby eksplantaty dotykały granicy faz powietrze-ciecz. Najpierw odpipetuj trochę płynu do końcówki, następnie eksplantaty, a następnie ponownie trochę płynu. Nie wpuszczaj powietrza do końcówki podczas przenoszenia eksplantatów do naczynia pokrytego fibronektyną. Gdy końcówka znajdzie się w płynie naczynia pokrytego fibronektyną, pozwól eksplantatom powoli opadać grawitacyjnie lub bardzo delikatnie popchnij. Unikaj zbyt szybkiego wyrzucania eksplantatów.</li>
	<li>Umieść 10-30 eksplantatów w naczyniu za pomocą noża do brwi. Unikaj boków naczynia, które nie są odpowiednie do późniejszego obrazowania.</li>
	<li>Staraj się nie przesuwać naczynia, dopóki eksplantaty nie przyczepią się do fibronektyny (zajmuje to około 15-30 minut). W razie potrzeby bardzo ostrożnie przesuwaj naczynie.</li>
	<li>Umieść naczynie w inkubatorze w lodówce (w zakresie 15-20 °C, tabela temperatur patrz17). Po umieszczeniu w temperaturze 15 °C komórki zwykle migrują efektywnie i rozpraszają się po 6 godzinach inkubacji (czas ten może się różnić w zależności od eksperymentu).</li>
</ol>
4. Szczepienie eksplantatów w zarodkach gospodarza
<ol>
	<li>Pokrój cienkie szklane szkiełko nakrywkowe na bardzo małe kawałki za pomocą grubych kleszczy. Rozmiar kawałków powinien wynosić około 1,5 mm2. Zanurz kawałki na szalce Petriego zawierającej 3/4 NAM lub PBS za pomocą kleszczy.</li>
	<li>Przygotowanie zarodka gospodarza: wypreparować NC gospodarza w 3/4 NAM, jak opisano w ppkt 3), zwracając szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić zarodka gospodarza podczas usuwania błony witelinowej i preparowania NC. Napięcie tkanek ma tendencję do zwiększania rozmiaru ablacji: pozwól zarodkowi gospodarza częściowo się zagoić podczas preparowania zarodka dawcy.</li>
	<li>W innym naczyniu pokrytym agarozą lub w innej części tego samego naczynia należy wyciąć eksplant NC z zarodka dawcy, jak opisano w protokole 3. Ostrożnie przenieść przeszczep NC do naczynia zawierającego żywiciela, zgodnie z opisem w protokole 3.</li>
	<li>Natychmiast umieść eksplant NC na obszarze ablacji gospodarza za pomocą kleszczy. Eksplant powinien być częściowo przymocowany. Umieść kawałek szklanego szkiełka nakrywkowego na przeszczepionym zarodku, aby utrzymać przeszczep na miejscu. Wybierz kawałek szkła większy niż zarodek, aby go nie uszkodzić. Zarodek będzie nieco spłaszczony.</li>
	<li>Odczekaj co najmniej 15-20 minut, a następnie delikatnie usuń szkiełko nakrywkowe. Pozwól zarodkowi zregenerować się przez kolejne 10 minut i ostrożnie pipetuj go do czystego naczynia wypełnionego 3/4 NAM, używając plastikowej pipety Pasteura.</li>
</ol>

<ol><li>Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene+regulatory+network+orchestrates+neural+crest+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A gene regulatory network orchestrates neural crest formation.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (7), 557-568 (2008).</li>
<li>Theveneau, E., Mayor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+delamination+and+migration%3A+from+epithelium-to-mesenchyme+transition+to+collective+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Neural crest delamination and migration: from epithelium-to-mesenchyme transition to collective cell migration.</a> Dev. Biol. 366 (1), 34-54 (2012).</li>
<li>Stuhlmiller, T. J., García-Castro, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+perspectives+of+the+signaling+pathways+directing+neural+crest+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Current perspectives of the signaling pathways directing neural crest induction.</a> Cell. Mol. Life Sci. 69 (22), 3715-3737 (2012).</li>
<li>Milet, C., Monsoro-Burq, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+induction+at+the+neural+plate+border+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Neural crest induction at the neural plate border in vertebrates.</a> Dev. Biol. 366 (1), 22-33 (2012).</li>
<li>Pegoraro, C., Monsoro-Burq, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+and+transcriptional+regulation+in+neural+crest+specification+and+migration%3A+lessons+from+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Signaling and transcriptional regulation in neural crest specification and migration: lessons from Xenopus embryos.</a> Dev. Biol. 2 (2), 247-259 (2013).</li>
<li>Etchevers, H. C., Amiel, J., Lyonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Bases+of+Human+Neurocristopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Crest+Induct.+Different%22%5BJournal%5D)">Molecular Bases of Human Neurocristopathies.</a> Neural Crest Induct. Different. 589, 213-234 (2005).</li>
<li>Nieuwkoop, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+and+organization+of+the+central+nervous+system+in+amphibians.+Part+II.+Differentiation+and+organization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Zool%22%5BJournal%5D)">Activation and organization of the central nervous system in amphibians. Part II. Differentiation and organization.</a> J. Exp. Zool. 120 (1), 33-81 (1952).</li>
<li>Nieuwkoop, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+and+organization+of+the+central+nervous+system+in+amphibians+Part+I.+Induction+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Zool%22%5BJournal%5D)">Activation and organization of the central nervous system in amphibians Part I. Induction and activation.</a> J. Exp. Zool. 120 (1), 1-31 (1952).</li>
<li>Sharpe, C. R., Fritz, A., De Robertis, E. M., Gurdon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+homeobox-containing+marker+of+posterior+neural+differentiation+shows+the+importance+of+predetermination+in+neural+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A homeobox-containing marker of posterior neural differentiation shows the importance of predetermination in neural induction.</a> Cell. 50 (5), 749-758 (1987).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSive%2C+HL+%22Early+development+of+Xenopus+laevis%3A+a+laboratory+manual%22">Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2000).</li>
<li>Monsoro-Burq, A. -H., Fletcher, R. B., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+induction+by+paraxial+mesoderm+in+Xenopus+embryos+requires+FGF+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Neural crest induction by paraxial mesoderm in Xenopus embryos requires FGF signals.</a> Development. 130 (14), 3111-3124 (2003).</li>
<li>Milet, C., Maczkowiak, F., Roche, D. D., Monsoro-Burq, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pax3+and+Zic1+drive+induction+and+differentiation+of+multipotent%2C+migratory%2C+and+functional+neural+crest+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Pax3 and Zic1 drive induction and differentiation of multipotent, migratory, and functional neural crest in Xenopus embryos.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (14), 5528-5533 (2013).</li>
<li>Sadaghiani, B., Thiébaud, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+development+in+the+Xenopus+laevis+embryo%2C+studied+by+interspecific+transplantation+and+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Neural crest development in the Xenopus laevis embryo, studied by interspecific transplantation and scanning electron microscopy.</a> Dev. Biol. 124 (1), 91-110 (1987).</li>
<li>Theveneau, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+chemotaxis+requires+contact-dependent+cell+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Collective chemotaxis requires contact-dependent cell polarity.</a> Dev. Cell. 19 (1), 39-53 (2010).</li>
<li>Slack, J. M., Forman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+interaction+between+dorsal+and+ventral+regions+of+the+marginal+zone+in+early+amphibian+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Embryol.+Exp.+Morphol%22%5BJournal%5D)">An interaction between dorsal and ventral regions of the marginal zone in early amphibian embryos.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 56, 283-299 (1980).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo+dissection+and+micromanipulation+tools%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Embryo dissection and micromanipulation tools.</a> CSH Protoc. , (2007).</li>
<li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+table+of+Xenopus+laevis+%28Daudin%29%3A+a+systematical+and+chronological+survey+of+the+development+from+the+fertilized+egg+till+the+end+of+metamorphosis%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Normal table of Xenopus laevis (Daudin): a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis.</a> , Garland Pub. New York. (1994).</li>
<li>Theveneau, E., Mayor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beads+on+the+run%3A+beads+as+alternative+tools+for+chemotaxis+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Beads on the run: beads as alternative tools for chemotaxis assays.</a> Methods Mol. Biol. 769, 449-460 (2011).</li>
<li>Bronner, M. E., LeDouarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evolution+of+the+neural+crest%3A+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Development and evolution of the neural crest: An overview.</a> Dev. Biol. 366 (1), 2-9 (2012).</li>
<li>Alfandari, D., Cousin, H., Gaultier, A., Hoffstrom, B. G., DeSimone, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+%CE%B15%CE%B21+supports+the+migration+of+Xenopus+cranial+neural+crest+on+fibronectin%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Integrin α5β1 supports the migration of Xenopus cranial neural crest on fibronectin.</a> Dev. Biol. 260 (2), 449-464 (2003).</li>
<li>Fort, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+of+the+RhoU%2FWrch1+GTPase+is+critical+for+cranial+neural+crest+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Activity of the RhoU/Wrch1 GTPase is critical for cranial neural crest cell migration.</a> Dev. Biol. 350 (2), 451-463 (2011).</li>
<li>Matthews, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directional+migration+of+neural+crest+cells+in+vivo+is+regulated+by+Syndecan-4%2FRac1+and+non-canonical+Wnt+signaling%2FRhoA%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Directional migration of neural crest cells in vivo is regulated by Syndecan-4/Rac1 and non-canonical Wnt signaling/RhoA.</a> Development. 135 (10), 1771-1780 (2008).</li>
<li>Kashef, J., Köhler, A., Kuriyama, S., Alfandari, D., Mayor, R., Wedlich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cadherin-11+regulates+protrusive+activity+in+Xenopus+cranial+neural+crest+cells+upstream+of+Trio+and+the+small+GTPases%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Cadherin-11 regulates protrusive activity in Xenopus cranial neural crest cells upstream of Trio and the small GTPases.</a> Genes Dev. 23 (12), 1393-1398 (2009).</li>
<li>Hwang, Y. -S., Luo, T., Xu, Y., Sargent, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin-X+is+required+for+cranial+neural+crest+cell+migration+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Myosin-X is required for cranial neural crest cell migration in Xenopus laevis.</a> Dev. Dyn. 238 (10), 2522-2529 (2009).</li>
<li>Lee, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+pathogenesis+and+treatment+of+familial+dysautonomia+using+patient-specific+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs.</a> Nature. 461 (7262), 402-406 (2009).</li>
<li>Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Neural+Crest+Induction%2C+Melanocyte+Specification%2C+and+Disease-Related+Pigmentation+Defects+in+hESCs+and+Patient-Specific+iPSCs.%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Modeling Neural Crest Induction, Melanocyte Specification, and Disease-Related Pigmentation Defects in hESCs and Patient-Specific iPSCs.</a> Cell Reports. 3 (4), 1140-1152 (2013).</li>
<li>Shnitsar, I., Borchers, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PTK7+recruits+dsh+to+regulate+neural+crest+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">PTK7 recruits dsh to regulate neural crest migration.</a> Development. 135 (24), 4015-4024 (2008).</li>
<li>Matthews, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directional+migration+of+neural+crest+cells+in+vivo+is+regulated+by+Syndecan-4%2FRac1+and+non-canonical+Wnt+signaling%2FRhoA%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Directional migration of neural crest cells in vivo is regulated by Syndecan-4/Rac1 and non-canonical Wnt signaling/RhoA.</a> Development. 135 (10), 1771-1780 (2008).</li>
<li>Matthews, H. K., Broders-Bondon, F., Thiery, J. P., Mayor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt11r+is+required+for+cranial+neural+crest+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Wnt11r is required for cranial neural crest migration.</a> Dev. Dyn. 237 (11), 3404-3409 (2008).</li>
<li>Carmona-Fontaine, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contact+inhibition+of+locomotion+in+vivo+controls+neural+crest+directional+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Contact inhibition of locomotion in vivo controls neural crest directional migration.</a> Nature. 456 (7224), 957-961 (2008).</li>
<li>Guiral, E. C., Faas, L., Pownall, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+migration+requires+the+activity+of+the+extracellular+sulphatases+XtSulf1+and+XtSulf2%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Neural crest migration requires the activity of the extracellular sulphatases XtSulf1 and XtSulf2.</a> Dev. Biol. 341 (2), 375-388 (2010).</li>
<li>Cousin, H., Abbruzzese, G., Kerdavid, E., Gaultier, A., Alfandari, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocation+of+the+Cytoplasmic+Domain+of+ADAM13+to+the+Nucleus+Is+Essential+for+Calpain8-a+Expression+and+Cranial+Neural+Crest+Cell+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Translocation of the Cytoplasmic Domain of ADAM13 to the Nucleus Is Essential for Calpain8-a Expression and Cranial Neural Crest Cell Migration.</a> Dev. Cell. 20 (2), 256-263 (2011).</li>
<li>Borchers, A., David, R., Wedlich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+cadherin-11+restrains+cranial+neural+crest+migration+and+influences+neural+crest+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Xenopus cadherin-11 restrains cranial neural crest migration and influences neural crest specification.</a> Development. 128 (16), 3049-3060 (2001).</li>
<li>Borchers, A., Epperlein, H. -H., Wedlich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assay+system+to+study+migratory+behavior+of+cranial+neural+crest+cells+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">An assay system to study migratory behavior of cranial neural crest cells in Xenopus.</a> Dev. Genes Evol. 210 (4), 217-222 (2000).</li>
<li>Kerney, R., Gross, J. B., Hanken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Runx2+is+essential+for+larval+hyobranchial+cartilage+formation+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Runx2 is essential for larval hyobranchial cartilage formation in Xenopus laevis.</a> Dev. Dyn. 236 (6), 1650-1662 (2007).</li>
<li>Yan, C. Y. I., Skourides, P., Chang, C., Samba Brivanlou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Xenopus+hnRNP+expressed+in+neural+and+neural+crest+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">a Xenopus hnRNP expressed in neural and neural crest tissues.</a> Dev. Dyn. 238 (1), 204-209 (2009).</li>
<li>Acloque, H., Adams, M. S., Fishwick, K., Bronner-Fraser, M., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-mesenchymal+transitions%3A+the+importance+of+changing+cell+state+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Epithelial-mesenchymal transitions: the importance of changing cell state in development and disease.</a> J. Clin. Invest. 119 (6), 1438-1449 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten opisuje łatwą technikę eksplantacji przedmigracyjnego NC czaszki w zarodkach X. laevis . Zarodki wykorzystywane do takich eksperymentów muszą być wytrzymałe i dobrze się goić. Wyrzuć każdą partię niezdrowych zarodków. Ponadto hodować zarodki w różnych temperaturach (od 12 do 18-20 °C), w celu wycięcia grzebienia nerwowego na etapie 17, a nie później. Po etapie 17 grzebień nerwowy może zostać zmieszany z mezodermą głowową i nie można go całkowicie usunąć. Tkanki Xenopus szybko się g...

Grzebień nerwowy (NC) to przejściowa populacja komórek embrionalnych, która wyłania się z cewy nerwowej pod koniec neurulacji u embrionów kręgowców. Sygnalizacja i zdarzenia genetyczne, które kontrolują specyfikację NC, rozpoczynają się już w momencie gastrulacji. NC jest określany na granicy ektodermy neuronalnej i nieneuronalnej za pomocą sygnałów z otaczających tkanek grzbietowych. Pod koniec neurulacji komórki NC przechodzą przejście od nabłonka do mezenchymy (EMT) i intensywnie migrują w zarodku zgodnie ze stereotypowymi trasami, reagując na otaczające sygnały prowadzące. Po dotarciu do miejsca przeznaczenia różnicują się w szeroką gamę pochodnych, np. neurony, komórki glejowe, kości, chrząstki i komórki barwnikowe1-5. Ze względu na ich udział w wielu typach komórek i tkankach embrionalnych, defekty na każdym etapie rozwoju komórek NC, od indukcji do końcowego różnicowania, mogą powodować zespoły wrodzone zwane neurokrystopatiami6. Eksperymentalna manipulacja rozwijającym się NC na różnych etapach - specyfikacji, EMT, migracji i różnicowania - poprawi naszą wiedzę na temat neurokrystopatii i pozwoli na zaprojektowanie potencjalnych strategii terapeutycznych.
Zarodek Xenopus laevis jest modelem z wyboru do badania rozwoju NC. Duża liczba zarodków jest łatwa do uzyskania, a zapłodnienie zewnętrzne daje dostęp do pierwszych etapów rozwoju. Dostępnych jest wiele narzędzi do eksperymentalnego manipulowania rozwojem embrionalnym X. laevis. Wzmocnienie funkcji genów i knockdown są łatwe do przeprowadzenia poprzez mikrowstrzyknięcie pojedynczych komórek wczesnych blastuli. Tkanki embrionalne mogą być cięte w celu reasocjacji in vitro 7-11 lub testów przeszczepu wstecznego12,13.
W tym protokole opisujemy, jak przeprowadzić preparację przedmigracyjnego NC czaszki u X. laevis late neurulas, przed migracją. Te eksplantaty mogą być hodowane na płytkach pokrytych fibronektyną w celu zbadania migracji i różnicowania w kontrolowanych warunkach eksperymentalnych in vitro. Eksplantaty NC mogą być również szczepione do normalnych lub zmanipulowanych zarodków gospodarza w celu zbadania ich migracji i różnicowania in vivo.

<table><tbody><tr><td>Fibronektyna z osocza bydlęcego</td><td>Sigma</td><td>F4759-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej, frakcja V</td><td>Euromedex</td><td>04-100-811-C</td><td>Niższa klasa jakości może&nbsp; być odpowiednia do tego zastosowania</td></tr><tr><td>Szpilki do owadów ze stali nierdzewnej, rozmiar 000</td><td>FST</td><td>26001</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Dumont #5 0,05 mm x 0,02 mm</td><td>FST</td><td>11252-20</td><td></td></tr></tbody></table>

rozwarstwienie grzebienia nerwowego xenopus laevis do hodowli eksplantatów in vitro lub przeszczepu in vivo

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

Grzebień nerwowy (NC) to przejściowa populacja komórek grzbietowej cewy nerwowej, która przechodzi przejście z nabłonka do mezenchymy (EMT) pod koniec neurulacji, migruje intensywnie w kierunku różnych organów i różnicuje się na wiele typów pochodnych (neurony, glej, chrząstki i kości, komórki barwnikowe i endokrynne). W tym protokole opisujemy, jak przeprowadzić preparację przedmigracyjnej czaszki NC z zarodków Xenopus laevis, w celu zbadania rozwoju NC in vivo i in vitro. Model żaby oferuje wiele korzyści w badaniu wczesnego rozwoju; Dostępne są obfite partie, zarodki rozwijają się szybko, strategie przyrostu i utraty funkcji in vivo umożliwiają manipulowanie ekspresją genów przed sekcją NC w zarodkach dawcy i/lub gospodarza. Eksplantaty NC można posiewać na fibronektynie i stosować do badań in vitro. Można je hodować przez kilka dni w pożywce niezawierającej surowicy. Opisujemy również, jak przeszczepić eksplantaty NC z powrotem do zarodków gospodarza w celu zbadania migracji i różnicowania NC in vivo.

Po wysianiu na fibronektynę eksplanty grzebienia neuronalnego szybko przytwierdzają (15-30 min), a eksplant rozpłaszcza się w ciągu 2 hr (Rycina 1A). Po 3-6 hr komórki zaczynają się rozpraszać. Po 24 hr w temperaturze 15 °C wiele komórek zaczyna migrować w kierunku od eksplantu (Ryciny 1B i 1C). Żółtko sprawia, że komórki są bardzo jasne w kontraście fazowym (Rycina 1B). Wypustki komórkowe (filopodia i lamelipodia) są wyraźnie widoczne po barwieniu cytos...

Ten protokół opisuje, jak przeprowadzić preparację premigracyjnego grzebienia nerwowego czaszki (NC) od Xenopus laevis neurulas. Te eksplantaty można posiewać na fibronektynie i hodować in vitro lub przeszczepiać z powrotem do zarodków gospodarza. Technika ta pozwala na badanie mechanizmów przejścia, migracji i różnicowania nabłonka NC do mezenchymy.

Rozwarstwienie grzebienia nerwowego Xenopus laevis do hodowli eksplantatów in vitro lub przeszczepu in vivo

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of ...

Ogólnym celem poniższej procedury jest śledzenie migracji komórek grzebienia neuronalnego opus Lavis. Osiąga się to poprzez najpierw wypreparowanie grzebieni neuronalnych z embrionów w stadium neuronalnym. W drugim kroku eksplanty wysiewa się na szalkę pokrytą fibronektyną, aby badać ich migrację komórkową in vitro.Alternatywnie, po usunięciu grzebienia neuronalnego z zarodka gospodarza, eksplantaty można przeszczepić z powrotem, aby śledzić ich migrację in vivo. W ten sposób można zbadać udział migracji embrionalnych komórek grzebienia neuronalnego w rozwoju opus lavis. Zazwyczaj osoby początkujące w tej metodzie mogą napotkać trudności ze względu na delikatność wczesnych zarodków.Grzebień neuronalny stanowi dość niewielką populację komórek, dlatego konieczne jest wykonanie własnych narzędzi do dysekcji. Wizualna demonstracja tego protokołu ma kluczowe znaczenie. Każdy element procesu dysekcji został zoptymalizowany, aby zapewnić czyste wyizolowanie grzebienia neuronalnego.W dniu eksperymentu należy przygotować 60 milimetrową szalkę do sekcji pokrytą około 10 mililitrami 2% agarozy i wypełnić ją w trzech czwartych normalnym medium dla płazów (NAM), niemal do pełna. Następnie, za p

dissection-xenopus-laevis-neural-crest-for-vitro-explant-culture-or

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Sekcja Xenopus laevis Grzbietu Nerwowego do in vitro hodowli eksplantatów lub in vivo przeszczepu

Hodowla eksplantów neuronalnych z wypreparowanych embrionów Xenopus laevis wykazujących ekspresję fluorescencyjnych białek fuzyjnych umożliwia obrazowanie dynamiki cytoszkieletu stożka wzrostu.

Kultury eksplantów neuronalnych z Xenopus laevis

Mezenchyma czaszki ulega gwałtownym ruchom morfogenetycznym, które prawdopodobnie stanowią siłę napędową dla uniesienia fałdów neuronalnych.1,2W niniejszym opracowaniu opisujemy prostą ex vivo test z eksplantem w celu charakterystyki zachowań komórkowych mezenchymy czaszki podczas neurulacji. Metoda ta znajduje liczne zastosowania, w tym możliwość wprowadzania manipulacji farmakologicznych oraz przeprowadzania analiz z wykorzystaniem obrazowania na żywo.

Test eksplantacyjny do oceny zachowania komórkowego mezenchymy czaszki

Xenopus laevis dostarcza idealnego systemu modelowego do badania specyfikacji losu komórki i funkcji fizjologicznych poszczególnych komórek siatkówki w pierwotnej hodowli komórkowej. Tutaj przedstawiamy technikę preparowania tkanek siatkówki i generowania pierwotnych kultur komórkowych, które są obrazowane pod kątem aktywności wapnia i analizowane przez hybrydyzację in situ.

Sekcja, hodowla i analiza embrionalnej tkanki siatkówki Xenopus laevis

W niniejszej pracy opracowujemy narzędzia niezbędne do obrazowania żywych komórek ex vivo w celu śledzenia podziałów pojedynczych komórek w neuroepitelium myszy w stadium...

Ex vivo obrazowanie na żywo podziałów pojedynczych komórek w neuroepitelium myszy

Ten film ilustruje technikę izolowania fałdów nerwowych czaszki od śródmózgowia zarodków piskląt. Przedstawiono szczegółowy proces rozwarstwiania fałdów nerwowych, ich rozmieszczenia i mocowania na szkiełkach nakrywkowych pokrytych fibronektyną, a następnie obserwację migracji komórek grzebienia nerwowego z fałdów nerwowych.

Izolowanie fałdów nerwowych czaszki od zarodka kurcząt w celu hodowli komórek grzebienia nerwowego

Ten protokół opisuje ulepszoną procedurę eksplantacji, która obejmuje elektroporację ex utero, sekcję i hodowlę całych półkul mózgowych od embrionalnej myszy. Preparat ułatwia badania farmakologiczne i testy funkcji genów we wczesnym okresie rozwoju kory mózgowej.

Ex utero Elektroporacja i eksplantaty całej półkuli: prosta metoda eksperymentalna do badań nad wczesnym rozwojem kory mózgowej

Technika przeszczepiania tkanki twarzy "Extreme Anterior Domain" pomiędzy embrionami Xenopus laevis została opracowana. Tkanka może być przenoszona z jednego tła ekspresji genów do drugiego, co pozwala na badanie lokalnych wymagań dotyczących rozwoju twarzoczaszki i sygnalizowania interakcji między regionami twarzy.

Przeszczepy twarzy w zarodkach Xenopus laevis

W embrionach Xenopus, komórki z dachu blastocoelu są pluripotencjalne i mogą być zaprogramowane do generowania różnych tkanek. W tym miejscu opisujemy protokoły stosowania eksplantatów dachowych z blastocoelu jako systemu testowego do badania kluczowych cech in vivo i in vitro wczesnego rozwoju neuronalnego.

Podobne do komórek macierzystych eksplantaty embrionalne Xenopus do badania wczesnych cech rozwojowych neuronów in vitro i in vivo

Przejście nabłonkowe do mezenchymalnego (EMT) pozwala nowotworom stać się inwazyjnymi. W celu zbadania EMT opisano model in vitro oparty na neuronalnych komórkach macierzystych (NSC) pozbawiony surowicy i enzymów. Ten ustandaryzowany system umożliwia ilościową i jakościową ocenę migracji komórek, ekspresji genów i białek. Model nadaje się do odkrywania leków.

Wolny od enzymów i surowicy model hodowli nerwowych komórek macierzystych do badań EMT, odpowiedni do odkrywania leków

Ten protokół opisuje sekcję i hodowlę komórek grzebienia nerwowego czaszki z modeli mysich, głównie do badania migracji komórek. Opisujemy stosowane techniki obrazowania na żywo oraz analizę zmian prędkości i kształtu komórek.

Sekcja, hodowla i analiza pierwotnych komórek grzebienia nerwowego czaszki od myszy w celu zbadania delaminacji i migracji komórek grzebienia nerwowego

Prezentujemy dwuczęściowy protokół, który łączy fluorescencyjne obrazowanie wapnia z hybrydyzacją in situ, pozwalając eksperymentatorowi skorelować wzorce aktywności wapnia z profilami ekspresji genów na poziomie pojedynczej komórki.

Fluorescencyjne obrazowanie wapnia i późniejsza hybrydyzacja in situ w celu charakterystyki prekursorów neuronalnych u Xenopus laevis

Poznaj metodę rozwarstwienia grzebienia nerwowego Xenopus laevis do badań migracji komórek in vitro i in vivo. Technika umożliwia śledzenie rozwoju zarodkowego i różnicowania komórek.

Rozwarstwienie grzebienia nerwowego Xenopus laevis do hodowli eksplantatów in vitro lub przeszczepu in vivo

Przeglądaj więcej filmów