Wysokorozdzielcza przyżyciowa mikroskopia pasiasta ośrodków rozrodczych

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przygotowanie standardowego mikroskopu dwufotonowego do obrazowania intravitalnego o wysokiej rozdzielczości. Jest to realizowane poprzez wstępne ustawienie mikroskopu, co obejmuje regulację laserów. Następnie przeprowadza się kalibrację multipleksera wiązki w celu uzyskania idealnego kształtu wiązki oraz odpowiedniego rozmieszczenia obszarów oświetlonych.

W przypadku skanowania wielowiązkowego surowe obrazy są pozyskiwane poprzez skanowanie próbki z wykorzystaniem prążkowanego wzoru oświetlenia. Na koniec stosuje się algorytm w celu obliczenia końcowego obrazu o wysokiej rozdzielczości. W rezultacie mikroskopia z prążkowanym oświetleniem jest wykorzystywana do ukazania szczegółów funkcjonowania układu odpornościowego w obrębie centrów rozmnażania w węzłach chłonnych myszy, co wcześniej było nieosiągalne dla mikroskopii in vivo.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak mikroskopia z oświetleniem strukturalnym lub mikroskopia lokalizacyjna, jest możliwość jej zastosowania w dużych głębokościach tkanek w próbkach żywych. Nie wymaga ona żadnej modyfikacji kształtu wiązki laserowej, co sprawia, że metoda jest bardzo prosta i łatwa do wdrożenia w dowolnym mikroskopie wielofotonowym. Przedstawiono tutaj układ wykorzystywany w mikroskopii z wielowiązkowym dwufotonowym oświetleniem pasmowym, który pozwala osiągnąć optymalną rozdzielczość i jakość kontrastu przy najniższym poziomie fotobielenia i najszybszym czasie akwizycji.

Należy rozważyć wprowadzenie korekt w konfiguracji urządzenia, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Po dokonaniu korekt należy sprawdzić, czy wiązka wraca do lustra znajdującego się bezpośrednio nad lustrem wlotowym na końcu kompresora impulsów opartego na pryzmatach. Po ustawieniu ścieżki świetlnej w tym punkcie wiązka jest odbijana do multipleksera wiązki.

W przypadku stosowania wielowiązkowego oświetlenia pasmowego w mikroskopii wielofotonowej przy wyłączonym skanerze, należy wyrównać lustra w multipleksorze wiązki, umieszczając na stoliku próbkę fluorescencyjną o jednorodnej intensywności i ogniskując wiązkę lasera wewnątrz próbki, lecz blisko jej górnej powierzchni, w pobliżu soczewki czołowej obiektywu.

Ustaw mikroskop w trybie wielowiązkowym, a następnie wybierz liczbę wiązek oraz polaryzację. Na przykład, aby zlokalizować wiązkę P poprzez obrazowanie preparatu fluorescencyjnego, otwórz migawkę P i uruchom kamerę CCD w trybie ciągłym podczas ustawiania ostrości wiązki, upewniając się, że znajduje się ona w pozycji centralnej. Podczas wyrównywania wiązki P przełącz system w tryb 64 wiązek i otwórz odpowiednią migawkę.

Sprawdź położenie wiązki. Dostrój lustra multipleksera od pierwszego do piątego, upewniając się, że plamki wiązki są w równych odstępach. Ponieważ algorytmy iluminacji pasmowej opierają się na tym założeniu, zastąp próbkę jednolicie fluorescencyjną próbką o niejednorodnej strukturze.

Na przykład, pobierz próbkę korzenia z obszaru Conval i wykonaj obrazowanie wielowiązkowe. Sprawdź, czy obraz jest ostry, jednolity i prosty. Zastąp próbkę heterogeniczną próbką homogeniczną.

Uruchom skaner XY, aby kontrolować proces skanowania. W celu wygenerowania prążkowego wzoru wzbudzenia dla skanowania wielowiązkowego, przesuń lustro skanera Y prostopadle do linii oświetlonej wiązką.

Powtórz wygenerowany wzór, określając liczbę bloków poprzez przesunięcie lustra skanera X, określane tutaj jako przesunięcie bloku, aby uzyskać prostokątny obraz prążkowany. Ponownie umieść heterogenną próbkę i użyj skanera jako wyzwalacza głównego. Zsynchronizuj kamerę ze skanerem, aby automatycznie pozyskiwać i zapisywać obraz prążkowany w celu wielokrotnego gromadzenia takich obrazów.

Przesuń lustro skanera X do różnych pozycji, wybierając odpowiednią liczbę kroków powtórzeń, liczbę przesunięć oraz właściwą długość kroku. Krok przesunięcia między dwoma kolejnymi obrazami prążkowanymi powinien pokrywać odległość między dwiema następującymi po sobie szerokościami wiązki. Ustaw przesunięcie X na wartość poniżej granicy rozdzielczości bocznej dla danej długości fali wzbudzenia.

Na przykład wykorzystanie 10 kroków lustra skanera X na przesunięcie oraz 12 lub 13 przesunięć pozwala uzyskać najlepszą rozdzielczość przestrzenną. Wyniki z preparatu z obszarem konwalacyjnym należy analizować, optymalizując te dwie wartości, aż obraz obszaru konwalacyjnego stanie się najostrzejszy. Należy użyć narzędzia profilu linii w odniesieniu do konwencjonalnych obrazów CCD oraz obliczonych obrazów z oświetleniem pasmowym.

Porównaj szerokość profilów linii, którymi w tym przykładzie jest sygnał fluorescencyjny z ścian komórkowych rośliny conval. Pozyskaj każdy surowy obraz prążkowany zsynchronizowany z ruchem skanera i zapisz go osobno, na przykład w formie plików TIFF lub binarnych. Aby wygenerować dwuwymiarową macierz obrazu oświetlenia prążkowanego o wysokiej rozdzielczości, otwórz kompletny zestaw surowych obrazów prążkowanych jako macierze w rutynie ewaluacyjnej.

Aby przeprowadzić wielofotonową mikroskopię wielowiązkową z prążkowanym oświetleniem w głębokich tkankach, należy zastosować algorytm minimum-maksimum lub algorytm oparty na transformacie Fouriera, zgodnie z wcześniejszym szczegółowym opisem. W organizmach żywych należy pozyskiwać obrazy prążkowane na różnych głębokościach tkanki w czasie, a następnie ocenić je w opisany wcześniej sposób, aby wygenerować wysokorozdzielczy film 3D przedstawiający dynamiczne interakcje między centrum rozmnażania, limfocytami B a komórkami dendrytycznymi mieszkowymi. Wymiary efektywnej funkcji rozmycia punktu odpowiadają rozdzielczości przestrzennej mikroskopu.

Pomiar tej funkcji trójwymiarowej przeprowadziliśmy poprzez rejestrację sygnału generowania drugiej harmonicznej włókien kolagenowych lub sygnału fluorescencyjnego kulek polistyrenowych o średnicy 100 nanometrów emitującego przy 515 nanometrach w węzłach chłonnych myszy. Wykorzystaliśmy w tym celu naszą metodę T-P-L-S-M z wielowiązkowym oświetleniem pasmowym w porównaniu z uznanymi technikami dwufotonowej laserowej mikroskopii skanującej, takimi jak T-P-L-S-M z detekcją polową za pomocą kamer CCD oraz T-P-L-S-M z detekcją punktową. Z tych pomiarów wynika jednoznacznie, że na powierzchni preparatu zarówno rozdzielczość boczna, jak i osiowa odpowiadają wartościom oczekiwanym, przewidzianym przez teorię dyfrakcji.

Jednak wraz ze zwiększaniem głębokości obrazowania, a tym samym wydłużeniem drogi optycznej zarówno promieniowania wzbudzenia, jak i emisji poprzez ośrodek o silnie zmiennych współczynnikach załamania, rozdzielczość przestrzenna ulega znacznemu pogorszeniu, niezależnie od zastosowanego układu. Stosując M-B-S-I-T-P-L-S-M niezależnie od głębokości obrazowania, osiągnęliśmy rozdzielczość boczną lepszą o około 20% oraz rozdzielczość osiową lepszą o 220% w porównaniu do standardowych metod T-P-L-S-M.

Klonalna selekcja limfocytów B podczas odpowiedzi immunologicznej w wtórnych narządach limfatycznych dorosłych myszy jest pierwszym krokiem na drodze do ich różnicowania w komórki B pamięci lub komórki plazmatyczne. Przyjmuje się, że w procesie tym kluczową rolę odgrywa wysoce dynamiczna interakcja między folikularnymi komórkami dendrytycznymi a limfocytami B na poziomie struktur kompleksów immunologicznych w obrębie centrów rozmnażania. Dopiero zastosowanie wysokorozdzielczej technologii intravitalnej mikroskopii pozwala na analizę tej komunikacji komórkowej i jej wpływu na odpowiedź immunologiczną, co przedstawiono tutaj poprzez znakowanie folikularnych komórek dendrytycznych przeciwciałem anti CD 2135 FAB ATO five 90.

M-B-S-I-T-P-L-S-M umożliwia po raz pierwszy wizualizację in vivo oraz ilościowe określenie wymiarów skupisk złogów kompleksów immunologicznych na głębokości do 120 micron w ośrodkach rozmnażania węzłów chłonnych popalnych. Obrazy te przedstawiają bezpośrednie porównanie trójwymiarowych obrazów fluorescencyjnych złogów kompleksów immunologicznych w ośrodku rozmnażania, uzyskanych za pomocą konwencjonalnego systemu opartego na PMT oraz M-B-S-I-T-P-L-S-M. Ponadto, oddziaływania złogów kompleksów immunologicznych z limfocytami B ośrodka rozmnażania mogą być obrazowane z wysoką rozdzielczością i mogą być teraz badane w połączeniu z funkcjonalnymi sondami in vivo do analizy proliferacji, różnicowania lub apoptozy.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że w technice opartej na detekcji kamerowej prędkość akwizycji jest około ośmiokrotnie wyższa, natomiast maksymalna głębokość obrazowania jest o około 25% mniejsza w porównaniu z wynikami uzyskiwanymi za pomocą standardowego mikroskopu wielofotonowego opartego na fotopowielaczu. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat konfiguracji mikroskopu wielofotonowego do pracy z metodą oświetlenia prążkowanego, w tym w zakresie regulacji toru optycznego mikroskopu, wyrównania luster wiązki, obliczania parametrów skanowania oraz sposobów generowania końcowego obrazu o wysokiej rozdzielczości do eksperymentów intravitalnych w głębokich tkankach.