Name: Iniekcja dosercowa pod kontrolą obrazowania ultrasonograficznego w celu opracowania mysiego modelu przerzutów raka piersi do mózgu, a następnie podłużnego rezonansu magnetycznego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-06T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: Poznaj technikę iniekcji dosercowej pod kontrolą ultrasonograficzną w celu opracowania mysiego modelu przerzutów raka piersi do mózgu. Metoda ta umożliwia długoterminowe monitorowanie rozwoju guzów za pomocą rezonansu magnetycznego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni doktorom Diane Palmieri i Patricii Steeg z NCI za dostarczenie nam komórek MDA-MB231Br. Dziękujemy dr Ralphowi Masonowi, panu Jasonowi Reneau i pani Ramonie Lopes za wsparcie techniczne i koleżeńskie. Prace te były częściowo wspierane przez nagrody DOD IDEA Awards W81XWH-08-1-0583 i W81XWH-12-1-0317. Eksperymenty MRI przeprowadzono w Advanced Imaging Research Center, placówce NIH BTRP # P41-RR02584, a wstrzyknięcie dosercowe pod kontrolą USG wykonano za pomocą VisualSonics Vevo 770 pod numerem 1S10RR02564801.

Wszystkie procedury dla zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Teksańskiego Southwestern Medical Center.
1. Przygotowanie komórek MDA-MB231/Br-GFP
<ol>
	<li>Pobrać i wyhodować komórki MDA-MB231 / Br-GFP (uprzejmie dostarczone przez dr Palmieri i Steega, NCI) w pożywce DMEM zawierającej 10% FBS, 1% glutaminy i 1% penicyliny/streptomycyny.</li>
	<li>Obserwuj stan komórek i kolor pożywki i wymieniaj pożywkę co 2-3 dni.</li>
	<li>Trypsynizuj i zbieraj komórki, gdy zostanie osiągnięte 80% zbiegu, jak opisano w krokach 1.3.1-1.3.5:
	<ol>
		<li>Całkowicie usuń starą pożywkę i dodaj 5 ml PBS (1x), aby delikatnie umyć komórki. Wyjmij PBS z naczynia.</li>
		<li>Dodaj 1,5 ml trypsyny do naczynia; delikatnie przechyl naczynie, aby upewnić się, że wszystkie komórki są pokryte trypsyną. Włożyć naczynie z powrotem do inkubatora komórkowego i utrzymywać je w temperaturze 37 °C przez 1 minutę.</li>
		<li>Wyjmij naczynie z inkubatora i obserwuj komórki pod mikroskopem optycznym, aby upewnić się, że komórki odłączają się od naczynia.</li>
		<li>Dodaj 3 ml pożywki, aby zatrzymać działanie trypsyny. Zebrać mieszaninę komórek w probówce wirówkowej. Odwirować mieszaninę z prędkością 2 000 obr./min przez 5 min.</li>
		<li>Ostrożnie usunąć pożywkę i ponownie zawiesić komórki w 5 ml pożywki wolnej od surowicy do uzyskania jednorodnej konsystencji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Policz odpowiednią liczbę komórek i zawieś je ponownie w pożywce DMEM wolnej od surowicy o końcowym stężeniu 1,75 x 105 komórek w objętości 100 μl.
	<ol>
		<li>Weź 50 μl mieszanki komórek i dodaj 50 μl błękitu trypanowego. Po wymieszaniu weź 10 μl mieszaniny i ostrożnie dodaj do szkiełka do liczenia komórek. Użyj wielu próbek, aby zapewnić dokładne oszacowanie liczby komórek.</li>
		<li>Przyklej suwak do liczenia komórek, jeden koniec na raz, a licznik komórek zacznie liczyć automatycznie. Weź średnią ze wszystkich wyników zliczania i oblicz całkowitą liczbę komórek.</li>
		<li>Ponownie odwirować komórki i ponownie zawiesić je w odpowiedniej objętości pożywki wolnej od surowicy, aby uzyskać końcowe stężenie 1,75 x 105 komórek/objętość 100 μl.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść komórki na lodzie przed wstrzyknięciem dosercowym.</li>
</ol>
2. Iniekcja dosercowa pod kontrolą obrazowania ultrasonograficznego
<ol>
	<li>Użyj samic nagich myszy (BALB/c nu/nu) w wieku 6-8 tygodni.</li>
	<li>Zaloguj się do systemu obrazowania. Zainicjuj przetwornik 704 (40 MHz).</li>
	<li>Rozpocznij nowe badanie i uzupełnij informacje.</li>
	<li>Znieczulenie (3% izofluranu/100%O2 w komorze indukcyjnej) i utrzymywanie zwierząt z izofluranem (2%) w 100%O2 (1 dm3/min) przez cały zabieg za pomocą stożka nosowego. Znieczulenie potwierdza się, gdy nie obserwuje się odruchu odstawienia z uszczypnięciem palca u nogi.</li>
	<li>Ustaw temperaturę stołu do obrazowania na 37 °C. Przyklej znieczuloną mysz do podgrzewanego stołu obrazowania w pozycji leżącej.</li>
	<li>Żel do ultradźwięków należy przechowywać w temperaturze 37 °C przed obrazowaniem. Nałóż żel na klatkę piersiową myszy.</li>
	<li>Zamontuj przetwornik w uchwycie. Opuść przetwornik, aż do osiągnięcia żądanej głębokości obrazowania. Przesuwaj stolik, aż lewa komora zostanie zidentyfikowana z aortą wstępującą jako punkt orientacyjny (ryc. 1A). Zablokuj scenę, gdy widoczny jest wyraźny widok lewej komory.</li>
	<li>Pobrać 100 μl mieszaniny komórek do strzykawki o pojemności 1 ml za pomocą igły 22 G. Umieścić i zamocować strzykawkę na uchwycie strzykawki.</li>
	<li>Przesunąć strzykawkę do przodu w kierunku klatki piersiowej myszy i ostrożnie przesuwać ją na boki, aż końcówka igły znajdzie się w polu obrazowania view (przed wejściem do myszy).</li>
	<li>Dostosuj wysokość i kąt igły, aby wycelować w dół lewej komory.</li>
	<li>Natychmiast wbić igłę strzykawki w przestrzeń międzyprzybrzeżną przez warstwy skóry i mięśni do lewej komory pod kierunkiem obrazowania ultrasonograficznego. 
	Oznaką udanego wprowadzenia igły do lewej komory jest refluks świeżej krwi tętniczej (różowy kolor w przeciwieństwie do ciemnoczerwonej krwi żylnej) do strzykawki</li>
	<li>Powoli wstrzykiwać mieszaninę komórek (ryc. 1B).</li>
	<li>Po zakończeniu wyjmij igłę, podnieś przetwornik, wyczyść żel ultradźwiękowy zwilżoną gazą i usuń taśmę.</li>
	<li>Przygotuj czystą klatkę z podgrzaną podkładką.</li>
	<li>Umieść zwierzę na podkładce i obserwuj je aż do pełnego wyzdrowienia.</li>
	<li>Monitoruj zachowanie zwierzęcia co 24 godziny przez dwa dni.</li>
	<li>Warunki ogólne i neurologiczne objawy powikłań u myszy eksperymentalnych są rutynowo monitorowane.</li>
</ol>
3. Monitorowanie MRI rozwoju guza wewnątrzczaszkowego
<ol>
	<li>Użyj magnesu o natężeniu 9,4 Tesli, aby monitorować wewnątrzczaszkowy rozwój przerzutów do mózgu.</li>
	<li>Rozpocznij rezonans magnetyczny dwa tygodnie po implantacji guza i powtarzaj raz w tygodniu przez okres do trzech tygodni.</li>
	<li>Uspokoić zwierzęta 3% izofluranem i utrzymywać je w znieczuleniu ogólnym (1,5% izofluranu).</li>
	<li>Monitoruj i utrzymuj stałą temperaturę ciała i oddech zwierzęcia przez cały czas trwania eksperymentu.</li>
	<li>Obrazy koronalne T 1- i T 2-zależne o wysokiej rozdzielczości (14 warstw o grubości 1 mm, bez przerwy) T1- iT 2-zależne obrazy koronalne, obejmujące obszar od płata czołowego do tylnego dołu, są pozyskiwane z następującymi parametrami: obrazy T1-zależne: spin echo multiple slice (SEMS), TR/TE = 400 ms/20 ms, matryca: 256 x 256, Pole widzenia 20 x 20 mm, w płaszczyźnie rozdzielczość: 78 x 78 μm2. T2-ważone obrazy: szybkie sekwencje wielowarstwowe echa wirowego (FSEMS), TR/TE = 2500 ms/48 ms, 8 ciągów echa, matryca: 256 x 256, FOV 20 x 20 mm, rozdzielczość w płaszczyźnie: 78 x 78 μm 28,9,9,<br />
	Zmiany nowotworowe wydają się jaśniejsze niż normalne tkanki mózgowe na obrazach T2-zależnych.</li>
	<li>Wielkość guza określa się na obrazach T2-zależnych poprzez ręczne obrysowanie wzmacniającej części masy na każdym obrazie za pomocą programów MATLAB napisanych przez nas8. 
	Biorąc pod uwagę, że większość średnic guza jest mniejsza niż grubość plastra (1 mm), rozmiar guza jest przedstawiany jako obszar płaski, a nie objętość.</li>
</ol>
4. Barwienie H&E potwierdzające przerzuty
<ol>
	<li>Złóż myszy, poświęć je natychmiast po ostatnim badaniu MR, wypreparuj mózgi zawierające guz i umieść je w pożywce OCT i zamrożone w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Przekrój serię koronalnych próbek mózgu o grubości 10 μm za pomocą kriostatu.</li>
	<li>Wykonaj barwienie H&E na odcinkach mózgu.</li>
</ol>

<ol><li>Schouten, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+of+brain+metastases+in+a+cohort+of+patients+with+carcinoma+of+the+breast%2C+colon%2C+kidney%2C+and+lung+and+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Incidence of brain metastases in a cohort of patients with carcinoma of the breast, colon, kidney, and lung and melanoma.</a> Cancer. 94, 2698-2705 (2002).</li>
<li>Lin, N. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNS+metastases+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">CNS metastases in breast cancer.</a> J. Clin. Oncol. 22, 3608-3617 (2004).</li>
<li>Eichler, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+brain+metastases-translation+to+new+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">The biology of brain metastases-translation to new therapies.</a> Nat. Rev. Clin. Oncol. , (2011).</li>
<li>Lockman, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneous+blood-tumor+barrier+permeability+determines+drug+efficacy+in+experimental+brain+metastases+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Heterogeneous blood-tumor barrier permeability determines drug efficacy in experimental brain metastases of breast cancer.</a> Clin. Cancer Res. 16, 5664-5678 (2010).</li>
<li>Yoneda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bone-seeking+clone+exhibits+different+biological+properties+from+the+MDA-MB-231+parental+human+breast+cancer+cells+and+a+brain-seeking+clone+in+vivo+and+in%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">A bone-seeking clone exhibits different biological properties from the MDA-MB-231 parental human breast cancer cells and a brain-seeking clone in vivo and in.</a> 16, 1486-1495 (2001).</li>
<li>Palmieri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Her-2+overexpression+increases+the+metastatic+outgrowth+of+breast+cancer+cells+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Her-2 overexpression increases the metastatic outgrowth of breast cancer cells in the brain.</a> Cancer Res. 67, 4190-4198 (2007).</li>
<li>Percy, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+characterization+of+changing+blood-tumor+barrier+permeability+in+a+mouse+model+of+breast+cancer+metastasis%3A+a+complementary+magnetic+resonance+imaging+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Radiol%22%5BJournal%5D)">In vivo characterization of changing blood-tumor barrier permeability in a mouse model of breast cancer metastasis: a complementary magnetic resonance imaging approach.</a> Invest. Radiol. 46, 718-725 (2011).</li>
<li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+MRI+evaluation+of+intracranial+development+and+vascular+characteristics+of+breast+cancer+brain+metastases+in+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Longitudinal MRI evaluation of intracranial development and vascular characteristics of breast cancer brain metastases in a mouse model.</a> PLoS One. 8, (2013).</li>
<li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+near-infrared+optical+imaging+of+2-deoxyglucose+uptake+by+intracranial+glioma+of+athymic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Dynamic near-infrared optical imaging of 2-deoxyglucose uptake by intracranial glioma of athymic mice.</a> PLoS One. 4, (2009).</li>
<li>Zhang, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+permeability+of+the+blood-brain+barrier+in+experimental+brain+metastases+produced+by+human+neoplasms+implanted+into+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Differential permeability of the blood-brain barrier in experimental brain metastases produced by human neoplasms implanted into nude mice.</a> Am. J. Pathol. 141, 1115-1124 (1992).</li>
<li>Mason, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+oximetry%3A+comparison+of+19F+MR+EPI+and+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Tumor oximetry: comparison of 19F MR EPI and electrodes.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 530, 19-27 (2003).</li>
<li>Gril, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pazopanib+reveals+a+role+for+tumor+cell+B-Raf+in+the+prevention+of+HER2%2B+breast+cancer+brain+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Pazopanib reveals a role for tumor cell B-Raf in the prevention of HER2+ breast cancer brain metastasis.</a> Clin. Cancer Res. 17, 142-153 (2010).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

W niniejszym badaniu wykazaliśmy, że wstrzyknięcie do lewej komory pod kontrolą obrazowania ultrasonograficznego zapewnia dokładność, dzięki której u każdego zwierzęcia w tym badaniu rozwinęły się przerzuty do mózgu i nie zaobserwowano śmierci zwierzęcia. Piękno iniekcji sterowanej obrazem polega na tym, że ścieżka penetracji igły przez skórę i ostatecznie do lewej komory może być monitorowana i dostosowywana pod obrazem, co różni się od procedury ręcznej wymagającej ścisłych anatomicznych punktów orientacyjnych, któryc...

Przerzuty do mózgu to najczęstszy nowotwór wewnątrzczaszkowy u dorosłych. Rokowanie jest bardzo złe, z medianą przeżycia wynoszącą 4-6 miesięcy nawet przy agresywnym leczeniu. Rak piersi jest jednym z trzech głównych nowotworów pierwotnych o wysokiej zachorowalności na przerzuty do mózgu1-3. Kilka linii mózgowo-tropowych raka piersi jest zdolnych do rozwoju przerzutów do mózgu po wstrzyknięciu dosercowym lub doszyjkowym4. Bezpośrednie wstrzyknięcie komórek nowotworowych do lewej komory może ominąć łożysko naczyń włosowatych płuc, a tym samym zwiększyć częstość powstawania przerzutów do mózgu, jednocześnie minimalizując przerzuty trzewne. Linia MDA-MB231Br jest jedną z najczęściej stosowanych linii ludzkiego raka piersi do rozwoju przerzutów do mózgu w modelach gryzoni5,6.
Podobnie jak w wielu innych badaniach4,7, przeprowadziliśmy manualną procedurę iniekcji dosercowej w naszych poprzednich badaniach. Jednak tylko 50% wskaźnik sukcesu uzyskano przy ręcznym wstrzyknięciu, a część myszy zmarła z powodu powtarzających się procedur inwazyjnych, jeśli wcześniejsze próby zakończyły się niepowodzeniem. Tutaj wprowadzamy zastosowanie procedury pod kontrolą obrazowania, aby zapewnić wstrzyknięcie komórek raka piersi poszukujących mózgu do lewej komory myszy atymicznych. Podłużny rezonans magnetyczny o wysokiej rozdzielczości stosuje się do śledzenia wewnątrzczaszkowego rozwoju przerzutów do mózgu.

<table><tbody><tr><td></td><td>DMEM HyClone</td><td>SH30022.01</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Mediatech</td><td>25-051-C1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Automatyczny licznik komórek</td><td>BioRad</td><td>TC10</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter International, Inc.</td><td>1001936060</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>System obrazowania o wysokiej rozdzielczości VisualSonics Vevo 770&nbsp;</td><td>Visual Sonics Inc.</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Magnes z otworem poziomym 9,4 T z systemem Varian INOVA Unity&nbsp;</td><td>Agilent</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Związek O.C.T</td><td>Sakura Finetek USA</td><td>4583</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

iniekcja dosercowa pod kontrolą obrazowania ultrasonograficznego w celu opracowania mysiego modelu przerzutów raka piersi do mózgu, a następnie podłużnego rezonansu magnetycznego

Ultrasound Imaging-guided Intracardiac Injection to Develop a Mouse Model of Breast Cancer Brain Metastases Followed by Longitudinal MRI

Przerzuty raka piersi do mózgu, występujące u 30% pacjentek z rakiem piersi w IV stadium, wiążą się z wysoką śmiertelnością. Mediana przeżycia wynosi tylko 6 miesięcy. Bardzo ważne jest, aby mieć odpowiednie modele zwierzęce, aby naśladować hemodynamiczne rozprzestrzenianie się komórek przerzutowych w scenariuszu klinicznym. Tutaj wprowadzamy zastosowanie obrazowania ultrasonograficznego na małych zwierzętach, aby poprowadzić dokładne wstrzyknięcie komórek tropikalnego raka piersi do lewej komory atymicznym nagim myszom. Podłużny rezonans magnetyczny służy do oceny inicjacji wewnątrzczaszkowej i wzrostu przerzutów do mózgu. Iniekcja dosercowa pod kontrolą USG zapewnia nie tylko dokładne wstrzyknięcie, a tym samym wyższy wskaźnik sukcesu, ale także znacznie zmniejszoną śmiertelność w porównaniu z naszą poprzednią procedurą ręczną. Rezonans magnetyczny o wysokiej rozdzielczości in vivo umożliwia wizualizację hiperintensywnych zmian wieloogniskowych o średnicy zaledwie 310 μm na obrazach T2-zależnych po 3 tygodniach od wstrzyknięcia. Kontrolny rezonans magnetyczny ujawnia wzrost guza wewnątrzczaszkowego i zwiększoną liczbę przerzutów, które rozprowadzają się po całym mózgu.

Dzięki wysokiej rozdzielczości przestrzennej MRI (rozdzielczość w płaszczyźnie 78 µm), można zidentyfikować hiperintensywne zmiany o średnicy nawet 310 µm (Rycina 2). Ponieważ przerzuty w niniejszym badaniu są bardzo małe, a rozwój martwicy i obrzęku jest minimalny, hiperintensywna zmiana w obrazach T2-zależnych faktycznie reprezentowała masę guza.
Podłużne badania MRI umożliwiają nieinwazyjną ocenę wzrostu guza in vivo. Jak pokazano na Rysunku 3</s...

Mysi model przerzutów do mózgu raka piersi jest tworzony za pomocą obrazowania ultradźwiękowego we wstrzyknięciu dosercowym komórek MDA-MB231/Br-GFP. Rozwój wieloogniskowych przerzutów wewnątrzczaszkowych monitorowano podłużnie za pomocą rezonansu magnetycznego 9,4 T o wysokiej rozdzielczości.

Iniekcja dosercowa pod kontrolą obrazowania ultrasonograficznego w celu opracowania mysiego modelu przerzutów raka piersi do mózgu, a następnie podłużnego rezonansu magnetycznego

Breast cancer brain metastasis, occurring in 30% of breast cancer patients at stage IV, is associated with high mortality. The median survival is only 6 ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykorzystanie naprowadzania ultradźwiękowego do stworzenia mysiego modelu przerzutów raka piersi do mózgu, który może być następnie monitorowany za pomocą MRI. Osiąga się to poprzez wyizolowanie komórek raka piersi wykazujących tropizm do mózgu i wstrzyknięcie ich do lewej komory serca. Następnie, przy wsparciu naprowadzania ultradźwiękowego, monitoruje się rozwój guza wewnątrzczaszkowego.Zastosowanie MRI oraz potwierdzenie obecności przerzutów za pomocą barwienia H&amp;E. Ostatecznie, precyzyjna iniekcja pod kontrolą obrazowania może znacząco zwiększyć skuteczność monitorowania tworzenia się i rozwoju przerzutów raka piersi do mózgu. Podłużne badanie MRI umożliwia nieinwazyjne monitorowanie powstawania i rozwoju raka piersi.Wszystkie procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt (Institutional Animal Care and Use Committee) Uniwersytetu Texas Southwestern Medical Center. W ramach niniejszego protokołu należy przygotować komórki M-D-A-M-B 2 31 B-R-G-F-P hodowane w pożywce DMEM zawierającej 10% FBS, 1% glutaminy oraz 1% penicyliny i streptomycyny. Należy stale monitorować stan komórek i wymieniać pożywkę co dwa do trzech dni. Po osiągnięciu 80% konfluencji należy przeprowadzić trypsynizację i zebrać komórki.W pierwszej kolejności całkowicie usuń stare medium za pomocą pipety próżniowej. Następnie dodaj 5 mL PBS, aby delikatnie przemyć komórki, aż wszystkie zostaną pokryte PBS. Następnie usuń roztwór do płukania.Następnie do naczynia dodaje się 1,5 milliliters trypsyny. Naczynie należy delikatnie przechylić, aby upewnić się, że wszystkie komórki są pokryte trypsyną. Naczynie umieszcza się z powrotem w inkubatorze do hodowli komórek w temperaturze 37 degrees Celsius.Odczekaj jedną minutę i zaobserwuj komórki pod mikroskopem. Jeśli są okrągłe i pływające, oznacza to, że się oddzieliły. Dodaj 3 ml pożywki, aby zatrzymać proces trawienia, a następnie przenieś mieszaninę komórek pipetą do probówki do wirowania.Odwiruj mieszaninę z prędkością 1 160 G przez pięć minut. Następnie ostrożnie usuń medium za pomocą pipety próżniowej. Dalej, delikatnie resuspenduj komórki w pięciu mililitrach medium beztłuszczowego, używając pipety, aż do momentu, gdy nie będzie widocznego pelletu komórkowego, a roztwór w ilości 50 µL mieszaniny komórkowej będzie wydawał się homogenny.Po dokładnym wymieszaniu dodać 50 µL błękitu trypanowego. Nanieść aliquoty po 10 µL na kilka szkiełek do liczenia komórek. Następnie policzyć komórki, korzystając z wartości z licznika komórek.Oblicz i wykorzystaj średnią ze wszystkich zliczeń. Następnie przygotuj dokładniejszą zawiesinę komórkową. Ponownie je odwiruj i zawieś w stężeniu 175 000 komórek na 100 µL medium bezzserwatkowego.Następnie przechowuj komórki w lodzie do czasu wykonania wstrzyknięcia wewnątrzsercowego. W tym protokole należy wykorzystać samice myszy BC nude w wieku od sześciu do ośmiu tygodni. Zaloguj się do systemu obrazowania i zainicjuj przetwornik.7 0 4 przy 40 megahertz. Rozpocznij nowe badanie i uzupełnij odpowiednio pola z prośbami o informacje. Następnie znieczul mysz, podając środek znieczulający za pomocą maski nosowej.Podczas iniekcji prowadzonej pod kontrolą obrazowania ustaw temperaturę stołu do obrazowania na 37 °C i przymocuj mysz do stołu taśmą w pozycji grzbietnej. Przed rozpoczęciem obrazowania podgrzej żel do USG do 37 °C i nałóż niewielką ilość na klatkę piersiową myszy. Następnie zamocuj przetwornik w uchwycie i obniż go do pożądanej głębokości obrazowania.Następnie przesuń stolik, aż zostanie zidentyfikowana lewa komora, wykorzystując aortę wstępującą jako punkt orientacyjny, a następnie zablokuj stolik w pozycji, w której obraz jest najwyraźniejszy. Teraz pobierz 100 µL schłodzonej mieszaniny komórek do strzykawki o pojemności 1 mL z igłą o rozmiarze 22G. Zamocuj napełnioną strzykawkę w uchwycie do strzykawek.Następnie przesuń strzykawkę w stronę klatki piersiowej. Przed wprowadzeniem jej do organizmu myszy, ostrożnie przesuwaj ją na boki, aż końcówka igły znajdzie się w polu widzenia obrazowania. Dostosuj wysokość i kąt nachylenia igły, aby wycelować w lewą komorę, a po ustawieniu w odpowiedniej pozycji, szybko wprowadź igłę przez warstwy skóry i mięśni do lewej komory.Pod kontrolą obrazu ultradźwiękowego wskaźnikiem prawidłowego wprowadzenia igły do lewej komory jest cofnięcie świeżej, różowej krwi tętniczej do strzykawki. Następnie powoli wstrzyknij mieszaninę komórek, wyjmij igłę, podnieś przetwornik i usuń żel do USG za pomocą zwilżonej gazy. Po tym odczep zwierzę od taśmy i przenieś je do czystej klatki z uprzednio podgrzaną podkładką.Obserwuj mysz aż do pełnego powrotu do zdrowia, a następnie kontroluj jej stan codziennie przez kilka dni. Przy rozdzielczości obrazu 78 µm² można zidentyfikować hiperintensywne zmiany w MRI o średnicy 310 µm. Ponieważ przerzuty w niniejszym badaniu były bardzo małe, a martwica i obrzęk minimalne, hiperintensywne zmiany na obrazach ważonych T2 rzeczywiście reprezentowały guz.Masowe podłużne badania MRI umożliwiają nieinwazyjną ocenę wzrostu guza in vivo. MRI o wysokiej rozdzielczości pozwoliło wykryć kilka małych zmian trzy tygodnie po wtryskiwaniu wewnątrzsercowym; w czwartym tygodniu zmiany widoczne w poprzednim badaniu uległy powiększeniu. Na obrazach ważonych T2 pojawiły się kolejne nowe zmiany.Barwienie H&amp;E ujawniło rozproszone zmiany przerzutowe lub barwienie H&amp;E ujawniło zmiany przerzutowe typu skupiskowego. Wokół guza często obserwowano powiększone naczynia, co wskazywało na zachodzenie angiogenezy niekiełkującej. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat przeprowadzania pod kontrolą obrazowania ultradźwiękowego iniekcji igłowej do lewej komory serca myszy.

ultrasound-imaging-guided-intracardiac-injection-to-develop-mouse

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Pod przewodnictwem obrazowania ultrasonograficznego zastrzyk do jamy serca w celu opracowania modelu mysiego przerzutów do mózgu raka piersi, po którym następuje longitudynalne MRI

Obrazowanie bioluminescencyjne aktywności czynnika indukowanego hipoksją-1α jest stosowane do monitorowania rozwoju hipoksji guza wewnątrzczaszkowego w mysim modelu przerzutów raka piersi do mózgu.

In vivo obrazowanie bioluminescencyjne dynamiki niedotlenienia guza w przerzutach raka piersi do mózgu w modelu mysim

W patogenezie przerzutów do kości angiogeneza jest procesem kluczowym, w związku z czym stanowi cel obrazowania i terapii. W niniejszej pracy przedstawiamy szczurzy model miejscowych przerzutów raka piersi do kości oraz opisujemy strategie nieinwazyjnego obrazowania angiogenezy in vivo z wykorzystaniem obrazowania rezonansem magnetycznym, wolumetrycznej tomografii komputerowej i ultrasonografii.

Wielomodalne obrazowanie angiogenezy w modelu przerzutów raka piersi do kości u szczurów nago z wykorzystaniem obrazowania rezonansem magnetycznym, wolumetrycznej tomografii komputerowej i ultradźwięków

Przezskórne wstrzyknięcie do mięśnia sercowego pod kontrolą echokardiografii stanowi efektywną, niezawodną i celowaną metodę dostarczania czynników transferu genów lub komórek do mysiego serca. Postępując zgodnie z krokami opisanymi w tym protokole, operator może szybko stać się kompetentny w tej wszechstronnej, minimalnie inwazyjnej technice.

Iniekcja przezklatkowa domięśniowa pod kontrolą USG u myszy

Rak jest złożoną chorobą, na którą wpływ ma tkanka otaczająca guz, a także lokalne mediatory pro- i przeciwzapalne. Dlatego ortotropowe modele iniekcyjne, a nie modele podskórne, mogą być przydatne do badania progresji raka w sposób, który lepiej naśladuje ludzką patologię.

Ortotopowe wstrzyknięcie komórek raka piersi do poduszeczki tłuszczowej sutka myszy w celu zbadania wzrostu guza.

Przerzuty do mózgu stały się pilną, niezaspokojoną potrzebą medyczną, ponieważ częstość ich występowania wzrosła, podczas gdy opcje terapeutyczne pozostały paliatywne. Tworzenie eksperymentalnych modeli zwierzęcych przerzutów do mózgu poprzez wstrzyknięcie komórek nowotworowych do tętnicy szyjnej ułatwia badania mechanistyczne biologii choroby i ocenę nowych schematów interwencji.

Wstrzyknięcie komórek raka tętnicy szyjnej w celu wytworzenia mysich modeli przerzutów do mózgu

Tutaj prezentujemy protokół wszczepiania komórek raka piersi do poduszeczki tłuszczowej w prosty, mniej inwazyjny i łatwy w obsłudze sposób, a ten mysi ortotopowy model raka piersi z odpowiednim środowiskiem poduszeczki tłuszczowej może być wykorzystany do badania różnych aspektów raka.

Ortotopowe wstrzyknięcie komórek raka piersi do poduszeczki tłuszczowej sutka myszy

Ta praca wstępnie ustawia zaawansowany protokół do dokładnej oceny obciążenia guza poprzez detekcję zielonego białka fluorescencyjnego i sygnałów bioluminescencji, a także integrację ilościowej techniki wykrywania molekularnego.

Badanie potrójnie ujemnego raka piersi przy użyciu ortotopowego modelu raka piersi

Modelowanie przerzutów wewnątrzczaszkowych do mózgu jest skomplikowane przez niemożność monitorowania wielkości guza i odpowiedzi na leczenie za pomocą precyzyjnych i szybkich metod. Przedstawiona metodologia łączy iniekcję guza śródczaszkowego z analizą rezonansu magnetycznego, która w połączeniu zapewnia precyzyjne i spójne iniekcje, ulepszone monitorowanie zwierząt i dokładne pomiary objętości guza.

Modelowanie przerzutów do mózgu poprzez iniekcję wewnątrzczaszkową i rezonans magnetyczny

Opisujemy mysi model raka piersi z przerzutami do mózgu generowanymi przez wstrzyknięcie do żyły ogonowej endogennej linii komórkowej zapalnego raka piersi z amplifikacją HER2.

Modelowanie przerzutów do mózgu poprzez wstrzyknięcie do żyły ogonowej komórek zapalnego raka piersi

Przerzuty do mózgu są przyczyną ciężkiej zachorowalności i śmiertelności u pacjentów z rakiem. Większość mysich modeli przerzutów do mózgu jest skomplikowana przez przerzuty ogólnoustrojowe, mylące analizę śmiertelności i wyników interwencji terapeutycznej. Przedstawiono tutaj protokół wewnętrznego wstrzykiwania komórek rakowych do tętnicy szyjnej, który wytwarza spójne guzy wewnątrzczaszkowe z minimalnymi guzami ogólnoustrojowymi.

Modelowanie przerzutów do mózgu poprzez wstrzyknięcie komórek rakowych do tętnicy szyjnej wewnętrznej

Poznaj technikę iniekcji dosercowej pod kontrolą ultrasonograficzną w celu opracowania mysiego modelu przerzutów raka piersi do mózgu. Metoda ta umożliwia długoterminowe monitorowanie rozwoju guzów za pomocą rezonansu magnetycznego.

Iniekcja dosercowa pod kontrolą obrazowania ultrasonograficznego w celu opracowania mysiego modelu przerzutów raka piersi do mózgu, a następnie podłużnego rezonansu magnetycznego (Wideo) | JoVE Journal

Iniekcja dosercowa pod kontrolą obrazowania ultrasonograficznego w celu opracowania mysiego modelu przerzutów raka piersi do mózgu, a następnie podłużnego rezonansu magnetycznego

Przeglądaj więcej filmów