Iniekcja dosercowa pod kontrolą obrazowania ultrasonograficznego w celu opracowania mysiego modelu przerzutów raka piersi do mózgu, a następnie podłużnego rezonansu magnetycznego

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykorzystanie naprowadzania ultradźwiękowego do stworzenia mysiego modelu przerzutów raka piersi do mózgu, który może być następnie monitorowany za pomocą MRI. Osiąga się to poprzez wyizolowanie komórek raka piersi wykazujących tropizm do mózgu i wstrzyknięcie ich do lewej komory serca. Następnie, przy wsparciu naprowadzania ultradźwiękowego, monitoruje się rozwój guza wewnątrzczaszkowego.

Zastosowanie MRI oraz potwierdzenie obecności przerzutów za pomocą barwienia H&E. Ostatecznie, precyzyjna iniekcja pod kontrolą obrazowania może znacząco zwiększyć skuteczność monitorowania tworzenia się i rozwoju przerzutów raka piersi do mózgu. Podłużne badanie MRI umożliwia nieinwazyjne monitorowanie powstawania i rozwoju raka piersi.

Wszystkie procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt (Institutional Animal Care and Use Committee) Uniwersytetu Texas Southwestern Medical Center. W ramach niniejszego protokołu należy przygotować komórki M-D-A-M-B 2 31 B-R-G-F-P hodowane w pożywce DMEM zawierającej 10% FBS, 1% glutaminy oraz 1% penicyliny i streptomycyny. Należy stale monitorować stan komórek i wymieniać pożywkę co dwa do trzech dni. Po osiągnięciu 80% konfluencji należy przeprowadzić trypsynizację i zebrać komórki.

W pierwszej kolejności całkowicie usuń stare medium za pomocą pipety próżniowej. Następnie dodaj 5 mL PBS, aby delikatnie przemyć komórki, aż wszystkie zostaną pokryte PBS. Następnie usuń roztwór do płukania.

Następnie do naczynia dodaje się 1,5 milliliters trypsyny. Naczynie należy delikatnie przechylić, aby upewnić się, że wszystkie komórki są pokryte trypsyną. Naczynie umieszcza się z powrotem w inkubatorze do hodowli komórek w temperaturze 37 degrees Celsius.

Odczekaj jedną minutę i zaobserwuj komórki pod mikroskopem. Jeśli są okrągłe i pływające, oznacza to, że się oddzieliły. Dodaj 3 ml pożywki, aby zatrzymać proces trawienia, a następnie przenieś mieszaninę komórek pipetą do probówki do wirowania.

Odwiruj mieszaninę z prędkością 1 160 G przez pięć minut. Następnie ostrożnie usuń medium za pomocą pipety próżniowej. Dalej, delikatnie resuspenduj komórki w pięciu mililitrach medium beztłuszczowego, używając pipety, aż do momentu, gdy nie będzie widocznego pelletu komórkowego, a roztwór w ilości 50 µL mieszaniny komórkowej będzie wydawał się homogenny.

Po dokładnym wymieszaniu dodać 50 µL błękitu trypanowego. Nanieść aliquoty po 10 µL na kilka szkiełek do liczenia komórek. Następnie policzyć komórki, korzystając z wartości z licznika komórek.

Oblicz i wykorzystaj średnią ze wszystkich zliczeń. Następnie przygotuj dokładniejszą zawiesinę komórkową. Ponownie je odwiruj i zawieś w stężeniu 175 000 komórek na 100 µL medium bezzserwatkowego.

Następnie przechowuj komórki w lodzie do czasu wykonania wstrzyknięcia wewnątrzsercowego. W tym protokole należy wykorzystać samice myszy BC nude w wieku od sześciu do ośmiu tygodni. Zaloguj się do systemu obrazowania i zainicjuj przetwornik.

7 0 4 przy 40 megahertz. Rozpocznij nowe badanie i uzupełnij odpowiednio pola z prośbami o informacje. Następnie znieczul mysz, podając środek znieczulający za pomocą maski nosowej.

Podczas iniekcji prowadzonej pod kontrolą obrazowania ustaw temperaturę stołu do obrazowania na 37 °C i przymocuj mysz do stołu taśmą w pozycji grzbietnej. Przed rozpoczęciem obrazowania podgrzej żel do USG do 37 °C i nałóż niewielką ilość na klatkę piersiową myszy. Następnie zamocuj przetwornik w uchwycie i obniż go do pożądanej głębokości obrazowania.

Następnie przesuń stolik, aż zostanie zidentyfikowana lewa komora, wykorzystując aortę wstępującą jako punkt orientacyjny, a następnie zablokuj stolik w pozycji, w której obraz jest najwyraźniejszy. Teraz pobierz 100 µL schłodzonej mieszaniny komórek do strzykawki o pojemności 1 mL z igłą o rozmiarze 22G. Zamocuj napełnioną strzykawkę w uchwycie do strzykawek.

Następnie przesuń strzykawkę w stronę klatki piersiowej. Przed wprowadzeniem jej do organizmu myszy, ostrożnie przesuwaj ją na boki, aż końcówka igły znajdzie się w polu widzenia obrazowania. Dostosuj wysokość i kąt nachylenia igły, aby wycelować w lewą komorę, a po ustawieniu w odpowiedniej pozycji, szybko wprowadź igłę przez warstwy skóry i mięśni do lewej komory.

Pod kontrolą obrazu ultradźwiękowego wskaźnikiem prawidłowego wprowadzenia igły do lewej komory jest cofnięcie świeżej, różowej krwi tętniczej do strzykawki. Następnie powoli wstrzyknij mieszaninę komórek, wyjmij igłę, podnieś przetwornik i usuń żel do USG za pomocą zwilżonej gazy. Po tym odczep zwierzę od taśmy i przenieś je do czystej klatki z uprzednio podgrzaną podkładką.

Obserwuj mysz aż do pełnego powrotu do zdrowia, a następnie kontroluj jej stan codziennie przez kilka dni. Przy rozdzielczości obrazu 78 µm² można zidentyfikować hiperintensywne zmiany w MRI o średnicy 310 µm. Ponieważ przerzuty w niniejszym badaniu były bardzo małe, a martwica i obrzęk minimalne, hiperintensywne zmiany na obrazach ważonych T2 rzeczywiście reprezentowały guz.

Masowe podłużne badania MRI umożliwiają nieinwazyjną ocenę wzrostu guza in vivo. MRI o wysokiej rozdzielczości pozwoliło wykryć kilka małych zmian trzy tygodnie po wtryskiwaniu wewnątrzsercowym; w czwartym tygodniu zmiany widoczne w poprzednim badaniu uległy powiększeniu. Na obrazach ważonych T2 pojawiły się kolejne nowe zmiany.

Barwienie H&E ujawniło rozproszone zmiany przerzutowe lub barwienie H&E ujawniło zmiany przerzutowe typu skupiskowego. Wokół guza często obserwowano powiększone naczynia, co wskazywało na zachodzenie angiogenezy niekiełkującej. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat przeprowadzania pod kontrolą obrazowania ultradźwiękowego iniekcji igłowej do lewej komory serca myszy.