Name: Model urazu neowaskularyzacji rogówki w oparzeniach zasadowych u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-07T15:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Poznaj model urazu neowaskularyzacji rogówki u myszy z zastosowaniem oparzenia zasadowego. Ta metoda umożliwia testowanie terapii przeciwangiogennych w badaniach nad ślepotą rogówkową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Jesteśmy wdzięczni za pomoc dr Xinyu Li w przygotowaniu manuskryptu. S.W. był wspierany przez fundusz startowy z Tulane University, President's Research Council New Investigator Award z UT Southwestern Medical Center, NIH Grant EY021862, nagrodę za rozwój kariery od fundacji Research to Prevent Blindness oraz nagrodę Bright Focus Award w badaniach nad zwyrodnieniem plamki żółtej związanym z wiekiem.

Uwaga: Poniższy protokół i reprezentatywne wyniki używają inhibitora HDAC SAHA jako przykładowego związku. Jednak protokół ten w żadnym wypadku nie ogranicza się do stosowania SAHA i jest zalecany jako ogólna metoda testowania wpływu rozpuszczalnych związków na neowaskularyzację rogówki. Konieczne będzie wprowadzenie niewielkich modyfikacji w odniesieniu do stopnia rozcieńczenia, a także częstotliwości i czasu trwania aplikacji. Dodatkowo związki, które są łatwo rozpuszczalne w wodzie, będą mogły być podawane przy braku DMSO.
Oświadczenie etyczne: Wszystkie eksperymenty na zwierzętach powinny być przeprowadzane wyłącznie zgodnie z prawem krajowym i regulacjami instytucjonalnymi. Protokół ten został zatwierdzony do użytku przez Tulane University Institutional Animal Care and Use Committee. 
1. Przygotowanie materiałów (w kolejności użycia)
<ol>
	<li>Wytnij kawałek celulozowej bibuły filtracyjnej (11 μm) na kółka o średnicy 2 mm.</li>
	<li>Przygotować 1 M roztwór NaOH rozpuszczając 20 g NaOH w 500 ml destylowanegoH2O. Przechowywać w temperaturze pokojowej. UWAGA: Roztwory NaOH są i mogą powodować oparzenia alkaliczne.</li>
	<li>Przygotuj koktajl znieczulający, rozcieńczając 10 ml 100 mg/ml ketaminy i 2,5 ml 20 mg/ml ksylazyny w 37,5 ml 1x PBS dla końcowego stężenia 20 mg/ml ketaminy i 4 mg/ml ksylazyny.</li>
	<li>Przygotować 0,5% roztwór chlorowodorku proparakainy (do stosowania miejscowego w analgezji), rozpuszczając 500 mg chlorowodorku proparakainy w 100 ml przefiltrowanego PBS.</li>
	<li>Przygotować 1x PBS, rozpuszczając 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4 i 0,23 g NaH2PO4 w 900 ml destylowanego H2O. Dostosować do 7,4 pH. Doprowadzić roztwór do końcowej objętości 1 000 ml za pomocą destylowanegoH2Oi przefiltrować w celu zapewnienia sterylności.</li>
	<li>Przygotuj 1,000x roztwory podstawowe SAHA w ~100 mM w dimetylosulfotlenku (DMSO), rozpuszczając 26,4 mg SAHA w 1 ml DMSO. Rozcieńczyć do 1x (~10 μM) roztworu w przefiltrowanym PBS dla każdego użycia. Przechowywać roztwór podstawowy w temperaturze -20 °C przez okres do jednego miesiąca. UWAGA: DMSO jest znaną toksyną i mutagenem.</li>
	<li>Przygotuj 4% roztwór paraformaldehydu (PFA) do utrwalenia. Pod kapturem chemicznym rozpuścić 4 g PFA w 90 ml PBS. Doprowadzić mieszaninę do temperatury 65 °C i miareczkować do pH 7,4. Po rozpuszczeniu PFA doprowadzić roztwór do końcowej objętości 100 ml. Przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do jednego miesiąca. UWAGA: PFA jest znany jako alergizujący, rakotwórczy i toksyczny.</li>
	<li>Przygotuj 1x bufor blokujący, rozcieńczając 5 ml koziej surowicy i 500 ul Triton X-100 w 94,5 ml PBS.</li>
	<li>Przygotuj 1x bufor do mycia, rozcieńczając 500 ul Triton X-100 w 99,5 ml PBS.</li>
</ol>
2. Leczenie oparzeń alkalicznych i leczenie związków
<ol>
	<li>Namoczyć okrągły kawałek bibuły filtracyjnej o średnicy ~2 mm w roztworze 1 M NaOH.</li>
	<li>Znieczulić mysz wstrzyknięciem 100 mg/kg ketaminy i 5 mg/kg ksylazyny, co stanowi ~100 μl koktajlu znieczulającego z kroku 1,3 na 25 g myszy. Znieczulenie powinno zająć ~1-2 minuty. Głębokość znieczulenia można określić poprzez delikatne uszczypnięcie palca u nogi lub ogona zwierzęcia, jeśli znieczulenie jest wystarczające, nie powinno być żadnej odpowiedzi. Uwaga: Należy zachować ostrożność, aby mysz nie uległa hipotermii wywołanej znieczuleniem.</li>
	<li>Za pomocą zakraplacza nanieś miejscowo kroplę 0,5% chlorowodorku proparakainy na powierzchnię rogówki w celu znieczulenia miejscowego.</li>
	<li>Za pomocą sterylnych kleszczy podnieś kawałek bibuły filtracyjnej nasączonej NaOH. Jeśli zauważysz nadmiar NaOH przylegający lub kapiący z bibuły filtracyjnej, krótko postukaj w nasączoną bibułę filtracyjną o suchy kawałek bibuły filtracyjnej, aby wchłonąć nadmiar. Umieść kawałek bibuły filtracyjnej nasączonej NAOH na centralnej rogówce. Pozostaw na 30 sekund, aby uzyskać ostre oparzenie alkaliczne o wymiarach ~2 x 2mm2 w obszarze. Mikroskop chirurgiczny jest pomocny w prawidłowym umieszczeniu bibuły filtracyjnej. Uwaga: Tylko jedno oko myszy powinno być zranione, a drugie służy jako kontrola.</li>
	<li>Usuń bibułę filtracyjną. Za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml delikatnie przepłukać oko 10 ml 1x PBS dwukrotnie, aby zmyć resztki 1 M NaOH.</li>
	<li>Natychmiast nanieść kroplę 1x roztworu roboczego SAHA (lub kontroli nośnika składającego się z rozcieńczonego PBS DMSO niezawierającego SAHA) miejscowo na rogówkę. Powtarzaj aplikację 3 razy dziennie przez 14 dni. Uwaga: w tym okresie nie zaleca się miejscowego stosowania maści z antybiotykiem, ponieważ może ona zakłócać rozwój urazu i dostarczanie związku. Zamiast tego użyj płynnego roztworu antybiotyku, takiego jak 3% roztwór gentamycyny.</li>
	<li>Przejdź bezpośrednio do oceny klinicznej (Protokół 3 poniżej) lub poświęć mysz i wyłuszczenie oczu w celu płaskiego montażu rogówki (Protokół 4 poniżej) lub konwencjonalnej parafiny/zamrożonej histologii.</li>
</ol>
3. Ocena kliniczna
<ol>
	<li>Wykonuj codzienne badanie myszy w ślepy sposób pod mikroskopem chirurgicznym i oceń NV rogówki na podstawie zmętnienia rogówki, NV i wielkości naczynia. Użyj co najmniej dwóch obserwatorów i zapisz końcowy wynik, który jest średnią z tych dwóch.
	<ol>
		<li>Oceń zmętnienie rogówki w skali 0-4. 0 = całkowicie czysty; 1 = lekko zamglony, tęczówka i źrenica są dobrze widoczne; 2 = lekko nieprzezroczysty, tęczówka i źrenica są nadal wykrywalne; 3 = nieprzezroczystości, źrenice prawie niewykrywalne; i 4 = całkowicie nieprzezroczyste bez widoku źrenicy.</li>
		<li>Oceń NV w skali od 0 do 3. 0 = brak naczyń neo, 1 = naczynia nowe na rąbku rogówki, 2 = naczynia nowe obejmujące rąbek rogówki i zbliżające się do środka rogówki, 3 = naczynia nowe obejmujące środek rogówki.</li>
		<li>Oceń wielkość naczynia w skali od 0 do 3. 0 = brak naczyń neo, 1 = naczynia nowe wykrywalne pod mikroskopem operacyjnym, 2 = naczynia nowe łatwo widoczne pod mikroskopem operacyjnym, 3 = naczynia nowotworowe łatwo widoczne bez mikroskopu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Za pomocą aparatu cyfrowego wykonaj reprezentatywne zdjęcia oka po 7 dniach i 14 dniach.</li>
</ol>
4. Barwienie rogówki i płaskie mocowania
<ol>
	<li>Utrwalić wyłuszczone oko w 4% PFA przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przenieś oko do 1x PBS i użyj kleszczy, aby ostrożnie usunąć nadmiar tkanki.</li>
	<li>Za pomocą mikroskopu chirurgicznego użyj igły (rozmiar 18) lub mikronoża, aby przebić obszar okołorogówkowy oka (uwaga: powinno to uwolnić płyn z oka).
	<ol>
		<li>Z perforacji wykonanej w punkcie 4.3.1 należy użyć nożyczek chirurgicznych, aby odciąć przednią część oka (rogówkę) od części tylnej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieść rogówkę z powrotem do 4% PFA w celu utrwalenia przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Wyrzuć 4% PFA (uwaga: PFA jest niebezpieczne i musi być utylizowane zgodnie z przepisami instytucjonalnymi) i przepłucz rogówkę trzy razy 1x PBS, aby usunąć wszelkie pozostałości PFA.</li>
	<li>Inkubować w 1x buforze blokującym przez co najmniej 2 godziny w temperaturze pokojowej, aby przeniknąć do tkanki i zapobiec niespecyficznemu wiązaniu się przeciwciała pierwszorzędowego.
	<ol>
		<li>Zastosuj przeciwciało pierwszorzędowe w buforze blokującym 1x, w rozcieńczeniu 100-500 krotnym. (np. szczurzy anty-mysi PECAM-1 do wykrywania naczyń krwionośnych w stosunku 1:100, króliczy anty-mysi-LYVE-1 do wykrywania naczyń limfatycznych w stosunku 1:500 i/lub szczurzy anty-mysie-F4/80 do wykrywania makrofagów w stosunku 1:100). Inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
		<li>Przemyć sześć razy 1x buforem myjącym przez 1 godzinę za każdym razem w temperaturze pokojowej, aby całkowicie usunąć niezwiązane przeciwciało pierwszorzędowe.</li>
		<li>Zastosuj przeciwciało drugorzędowe w buforze blokującym 1x w rozcieńczeniu 500-1,000 krotnie. (np. znakowana fluorescencyjnie kozia anty-szczurza IgG o długości fali 488 nm w stosunku 1:800 lub znakowana fluorescencyjnie kozia anty-IgG o długości fali 594 nm w temperaturze 1:800). Inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
		<li>Przemyć trzy razy 1x PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, aby całkowicie usunąć niezwiązane przeciwciało drugorzędowe.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieś rogówkę do świeżego 1x PBS i za pomocą mikroskopu chirurgicznego ostrożnie wykonaj cztery nacięcia od obwodu w kierunku środka. Powinno to podzielić rogówkę na cztery ćwiartki o mniej więcej równej wielkości (uzyskany kształt powinien wyglądać raczej jak motyl) i pozwolić jej leżeć płasko na szkiełku.</li>
	<li>Zamontuj za pomocą medium montażowego odpowiedniego do obrazowania fluorescencyjnego. W celu uzyskania najlepszych wyników należy niezwłocznie pobrać próbki i wykonać zdjęcia cyfrowe, ale można je przechowywać przez kilka tygodni w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>

<ol><li>Pascolini, D., Mariotti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+estimates+of+visual+impairment%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Global estimates of visual impairment.</a> Br. J. Ophthalmol. 96 (5), 614-618 (2010).</li>
<li>Whitcher, J., Srinivasan, M., Upadhyay, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+Blindness%3A+A+Global+Perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Bull.+World+Health+Org%22%5BJournal%5D)">Corneal Blindness: A Global Perspective.</a> Bull. World Health Org. 79 (3), 214-221 (2003).</li>
<li>Gupta, D., Illingworth, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatments+for+corneal+neovascularization%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Treatments for corneal neovascularization: a review.</a> Cornea. 30 (8), 927-938 (2011).</li>
<li>Cursiefen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consensus+statement+on+indications+for+anti-angiogenic+therapy+in+the+management+of+corneal+diseases+associated+with+neovascularisation%3A+outcome+of+an+expert+roundtable%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Consensus statement on indications for anti-angiogenic therapy in the management of corneal diseases associated with neovascularisation: outcome of an expert roundtable.</a> Br. J. Ophthalmol. 96 (1), 3-9 (2012).</li>
<li>Delmonte, D., Kim, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+and+Physiology+of+the+Cornea%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cataract+Refract.+Surg%22%5BJournal%5D)">Anatomy and Physiology of the Cornea.</a> J. Cataract Refract. Surg. 37 (3), 588-598 (2011).</li>
<li>Cursiefen, C., Seitz, B., Dana, M. R., Streilein, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+and+lymphangiogenesis+in+the+cornea.+Pathogenesis%2C+clinical+implications+and+treatment+options%5BTitle%5D)+AND+%22Der+Ophthalmologe%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis and lymphangiogenesis in the cornea. Pathogenesis, clinical implications and treatment options.</a> Der Ophthalmologe. 100 (4), 292-229 (2003).</li>
<li>Chang, J., Gabison, E., Kato, T., Azar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+Neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Corneal Neovascularization.</a> Curr. Opin Ophthalmol. 12 (4), 242-249 (2001).</li>
<li>Ambati, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+Avascularity+is+due+to+Soluble+VEGF+Receptor-1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Corneal Avascularity is due to Soluble VEGF Receptor-1.</a> Nature. 443 (7114), 993-997 (2006).</li>
<li>Cursiefen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF-A+Stimulates+Lymphangiogenesis+and+Hemangiogenesis+in+Inflammatory+Neovascularization+via+Macrophage+Recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">VEGF-A Stimulates Lymphangiogenesis and Hemangiogenesis in Inflammatory Neovascularization via Macrophage Recruitment.</a> J. Clin. Invest. 113 (7), 1040-1050 (2004).</li>
<li>Jiri, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paper+Strips+and+Rings+as+Simple+Tools+for+Standardization+of+Experimental+Eye+Injuries%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthal.+Res%22%5BJournal%5D)">Paper Strips and Rings as Simple Tools for Standardization of Experimental Eye Injuries.</a> Ophthal. Res. 1975 (7), 363-367 (2009).</li>
<li>Ormerod, L., Abelson, M., Kenyon, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+Models+of+Corneal+Injury+Using+Alkali-Immersed+Filter+Discs+Invest%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Standard Models of Corneal Injury Using Alkali-Immersed Filter Discs Invest.</a> Ophthalmol. Vis. Sci. 30 (10), 2148-2153 (1989).</li>
<li>Saika, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+effects+of+adenoviral+gene+transfer+of+bone+morphogenic+protein-7+on+a+corneal+alkali+injury+model+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Therapeutic effects of adenoviral gene transfer of bone morphogenic protein-7 on a corneal alkali injury model in mice.</a> Lab. Invest. 85 (4), 474-486 (2005).</li>
<li>Ferrari, G., Bignami, F., Giacomini, C., Franchini, S., Rama, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+efficacy+of+topical+infliximab+in+a+mouse+model+of+ocular+surface+scarring%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Safety and efficacy of topical infliximab in a mouse model of ocular surface scarring.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (3), 1680-1688 (2013).</li>
<li>Sosne, G., Christopherson, P., Barrett, R., Fridman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymosin-beta4+modulates+corneal+matrix+metalloproteinase+levels+and+polymorphonuclear+cell+infiltration+after+alkali+injury.Invest%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Thymosin-beta4 modulates corneal matrix metalloproteinase levels and polymorphonuclear cell infiltration after alkali injury.Invest.</a> Ophthalmol. Vis. Sci. 46 (7), 2388-2395 (2005).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Multiple+Pathogenic+Pathways+by+Histone+Deacetylase+Inhibitor+SAHA+in+a+Corneal+Alkali-Burn+Injury+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Multiple Pathogenic Pathways by Histone Deacetylase Inhibitor SAHA in a Corneal Alkali-Burn Injury Model.</a> Mol. Pharm. 10 (1), 307-318 (2013).</li>
<li>Yoeruek, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety%2C+penetration+and+efficacy+of+topically+applied+bevacizumab%3A+evaluation+of+eyedrops+in+corneal+neovascularization+after+chemical+burn%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Safety, penetration and efficacy of topically applied bevacizumab: evaluation of eyedrops in corneal neovascularization after chemical burn.</a> Acta Ophthalmol. 86 (3), 322-328 (2008).</li>
<li>Bucher, F., Parthasarathy, A., Bergua, A., Onderka, J., Regenfuß, B., Cursiefen, C., Bock, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topical+Ranibizumab+inhibits+inflammatory+corneal+hem-+and+lymphangiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Topical Ranibizumab inhibits inflammatory corneal hem- and lymphangiogenesis.</a> Acta Ophthalmol. , (2012).</li>
<li>Hajrasouliha, A., Sadrai, Z., Chauhan, S., Dana, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((b-FGF+induces+corneal+blood+and+lymphatic+vessel+growth+in+a+spatially+distinct+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">b-FGF induces corneal blood and lymphatic vessel growth in a spatially distinct pattern.</a> Cornea. 31 (7), 804-809 (2012).</li>
<li>Rogers, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+albino+mutation+of+tyrosinase+alters+ocular+angiogenic+responsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">The albino mutation of tyrosinase alters ocular angiogenic responsiveness.</a> Angiogenesis. 16 (3), 639-646 (2013).</li>
<li>Connor, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+oxygen-induced+retinopathy+in+the+mouse%3A+a+model+of+vessel+loss%2C+vessel+regrowth+and+pathological%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological.</a> Nat. Protoc. 4 (11), 1565-1573 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiony tutaj protokół skutkuje powtarzalnymi poziomami hemangiogenezy, limfangiogenezy i stanu zapalnego, co czyni go idealnym systemem do badania tych trzech (wzajemnie powiązanych) procesów. Podczas gdy ta metoda wytwarza scentralizowaną rogówkę NV, kilka metod, które zostały opracowane w celu spowodowania bardziej ukierunkowanego NV, a mianowicie szycie rogówki17 i wszczepiony czynnik wzrostu wyrażający granulki18, mogą być również interesujące. Nasz protokół został zaprojektowany do użytk...

Ślepota rogówki jest czwartą najczęstszą przyczyną ślepoty, odpowiedzialną za około 4% wszystkich przypadków1. Neowaskularyzacja rogówki (NV) odgrywa znaczącą rolę w wielu z tych patologii, w tym w opryszczkowym zapaleniu rogówki (główna zakaźna przyczyna ślepoty na Zachodzie) i jaglica (główna przyczyna ślepoty zakaźnej na całym świecie)2. Obecne terapie obejmują sterydy, niesteroidowe leki przeciwzapalne (NLPZ), terapie anty-VEGF i cyklosporynę A, a także konwencjonalne lub laserowe techniki chirurgiczne3. Jednak poważnie wyniszczający charakter patologii opartych na NV rogówki, niedostatek urządzeń chirurgicznych zdolnych do leczenia NV rogówki oraz brak silnie działającej opcji farmakologicznej skłoniły niedawny okrągły stół ekspertów do wniosku, że pomimo istniejących terapii, podstawowa potrzeba medyczna, jaką stanowią te patologie, pozostaje niezaspokojona4.
Ludzka rogówka składa się z 5 warstw, 3 warstw komórkowych (nabłonka, zrębu i śródbłonka) oraz 2 interfejsów (błona Bowmana i błona Descemeta). Działa jako bariera mechaniczna i powierzchnia refrakcyjna dla oka. Jego przezroczystość jest konsekwencją delikatnej równowagi jego składników i jest integralną częścią jego prawidłowego funkcjonowania5. Normalnie naczyniowa, rogówka otrzymuje krew z mikronaczyń biegnących wzdłuż jej zewnętrznej krawędzi, które są zasilane z tętnic rzęskowych i ocznych. NV rogówki występuje, gdy bodziec sprzyja angiogenezie tych naczyń, umożliwiając im wzrost w kierunku środka rogówki, a tym samym ograniczenie widzenia6. Angiogeneza rogówki obejmuje hemangiogenezę i limfangiogenezę, które powodują wrastanie naczyń krwionośnych i naczyń limfatycznych od rąbka naczyniowego w kierunku środka rogówki. Prowadzi to do załamania się "przywileju angiogennego" rogówki, zwiększenia zmętnienia i zwłóknienia rogówki, przerwania warstw rogówki i obrzęku7. Precyzyjne wyzwalacze rogówki NV są liczne, począwszy od odpowiedzi na chorobę zakaźną, taką jak jaglica, po stan wywołany chemicznie spowodowany tradycyjnymi lekami, chemikaliami przemysłowymi, a nawet chemicznymi środkami bojowymi.
Molekularne mechanizmy tego procesu nie są jeszcze w pełni scharakteryzowane; jednak zidentyfikowano kilka kluczowych graczy. W normalnych warunkach rogówka posiada unikalny "przywilej angiogenny" utrzymywany przez nadmiarowy zestaw czynników antyangiogennych (takich jak rozpuszczalny VEGF-R1)8. Jednak w odpowiedzi na bodziec zewnętrzny (taki jak uraz) nastąpi lokalna regulacja w górę czynników proangiogennych (np. VEGF-A). To przechyla równowagę czynników pro- i antyangiogennych, które leżą u podstaw angiogennego przywileju rogówki i prowadzi do hemangiogenezy, limfangeogenezy i stanu zapalnego, powodując w ten sposób patologię rogówki, a nawet ślepotę.
Biorąc pod uwagę niezaspokojoną potrzebę medyczną tej wysoce wyniszczającej patologii, warto mieć wiarygodny model zwierzęcy rogówki NV. Tutaj przedstawiamy taki model: kontrolowane oparzenia alkaliczne. Od lat siedemdziesiątych XX wieku stosuje się różne modele urazów oczu oparte na zastosowaniu pierścieni z bibuły filtracyjnej10. W 1989 roku grupa okulistów z Harvard Medical School scharakteryzowała standardowy model uszkodzenia centralnego uszkodzenia alkalicznego rogówki u królika na podstawie namoczenia kawałka okrągłej bibuły filtracyjnej wodorotlenkiem sodu (NaOH) i nałożenia go na rogówkę w określonym zakresie stężeń11. Od tego czasu technika ta została przystosowana do stosowania w myszy12-14. Niedawno laboratorium Wang badało efekty terapeutyczne inhibitora deacetylazy histonowej (HDAC) SAHA w patogenezie rogówki NV przy użyciu mysiego modelu uszkodzenia alkalicznego rogówki15. Przedstawiona tu metodologia mysiego modelu uszkodzenia alkalicznego rogówki została zbudowana głównie na wcześniejszych pracach dwóch innych prac14,16.

<table><tbody><tr><td>1 ml Strzykawka</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>18 G Igła</td><td>BD</td><td>305918</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Strzykawka</td><td>BD</td><td>306575</td><td></td></tr><tr><td>25 G Igła</td><td>BD</td><td>305916</td><td></td></tr><tr><td>Anti-F4/80 (anty-mysz szczura)</td><td>AbD Serotech</td><td>MCA497RT</td><td></td></tr><tr><td>Anti-LYVE-1 (anty-mysz królika)</td><td>Abcam</td><td>ab14917</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PECAM-1 (anty-mysz szczura)</td><td>BD</td><td>553370</td><td></td></tr><tr><td>Anti-IgG Alexa 488 (anty-szczur kóz)</td><td>Invitrogen</td><td>A11006</td><td></td></tr><tr><td>Anti-IgG Alexa 594 (koza anty-królik)</td><td>Invitrogen</td><td>A11012</td><td></td></tr><tr><td>Kamera</td><td>Tucsen</td><td>TCC 5.0 ICE</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>Fisher</td><td>12-548-B</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D4540-1L</td><td>Uwaga: Mutagenne, toksyczne</td></tr><tr><td>kleszcze (), kleszcze tęczówki</td><td>WPI</td><td>15915</td><td></td></tr><tr><td>(ostre), Dumont #4</td><td>WPI</td><td>500340</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór ketaminy</td><td>MedVet</td><td>RXKETAMINA</td><td>Substancja kontrolowana, do użytku wymagana jest odpowiednia licencja.</td></tr><tr><td>Źródło światła do mikroskopu</td><td>AmScope</td><td>LED-14M-YA</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop (Stereo 7X-45X)</td><td>AmScope</td><td>SM-1B</td><td></td></tr><tr><td>Medium montażowe, VECTASHIELD</td><td>Vector</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Fisher</td><td>S397-500</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher</td><td>S318-1</td><td>Uwaga:</td></tr><tr><td>paraformaldehyd</td><td></td><td>P6148-500G</td><td>Uwaga: Alergiczny, rakotwórczy, toksyczny</td></tr><tr><td>chlorowodorek proparakainy</td><td>Sigma</td><td>P4554-1G</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki (ostrze 5 mm), Vanas</td><td>WPI</td><td>14003</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka</td> mikroskopowe <td>MPBio</td><td>92939249</td><td></td></tr> Kozie <tr><td>Fisher</td><td></td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna Whatman klasy 1</td><td>Whatman</td><td>1001-6508</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór ksylazyny</td><td>MedVet</td><td>RXANASED-20</td><td></td></tr></tbody></table>

model urazu neowaskularyzacji rogówki w oparzeniach zasadowych u myszy

An Alkali-burn Injury Model of Corneal Neovascularization in the Mouse

W normalnych warunkach rogówka jest unaczyniona, a ta przezroczystość jest niezbędna do utrzymania dobrej ostrości widzenia. Neowaskularyzacja (NV) rogówki, która może być spowodowana urazem, keratoplastyką lub chorobą zakaźną, przełamuje tak zwany "angiogenny przywilej" rogówki i stanowi podstawę wielu patologii wzroku, które mogą nawet prowadzić do ślepoty. Chociaż dostępnych jest kilka opcji leczenia, podstawowa potrzeba medyczna, jaką stanowią patologie neowaskularne rogówki, pozostaje niezaspokojona. Aby opracować bezpieczne, skuteczne i celowane terapie, potrzebny jest wiarygodny model NV rogówki i interwencja farmakologiczna. W tym miejscu opisujemy model neowaskularyzacji rogówki po oparzeniu zasadowym u myszy. Protokół ten zapewnia metodę zastosowania kontrolowanego uszkodzenia rogówki w wyniku oparzenia zasadowego, podania interesującego go związku farmakologicznego i wizualizacji wyniku. Metoda ta może okazać się pomocna w badaniu mechanizmów i możliwości interwencji w NV rogówki i innych zaburzeniach neowaskularnych.

Po oparzeniu zasadowym neowaskularyzacja rogówki (NV) postępuje w przewidywalny sposób, zależny od czasu. Rysunek 1 przedstawia wyraźną różnicę zarówno w neowaskularyzacji, jak i w zmętnieniu rogówki pomiędzy zwierzęciem nieleczonym (Rysunek 1A) a zwierzęciem leczonym inhibitorem HDAC SAHA (Rysunek 1B) w siódmej dobie.
Rysunki 2A oraz 2B przedstawiają preparat płaski rogówki nieleczonego oka kontrolnego z barw...

Neowaskularyzacja (NV) rogówki może komplikować wiele patologii wzrokowych. Wykorzystując kontrolowany model uszkodzeń spowodowanych oparzeniami zasadowymi, można uzyskać wymierny poziom NV rogówki do mechanistycznego badania NV rogówki i oceny potencjalnych terapii zaburzeń neowaskularnych.

Model urazu neowaskularyzacji rogówki w oparzeniach zasadowych u myszy

Under normal conditions, the cornea is avascular, and this transparency is essential for maintaining good visual acuity. Neovascularization (NV) of the ...

Ogólnym celem eksperymentu jest obserwacja efektu terapii antyangiogennej w mysim modelu neowaskularyzacji rogówki. Osiąga się to poprzez krótkotrwałe zastosowanie jednomolarnego roztworu wodorotlenku sodu do oka myszy w celu wywołania kontrolowanego poziomu neowaskularyzacji rogówki. W drugim kroku codziennie podaje się związek antyangiogenny, który hamuje wzrost nowych naczyń w uszkodzonej rogówce.Następnie mysz zostaje uśpiona, a uszkodzone oko pobrane, wypreparowane i poddane barwieniu immunologicznemu. W celu ilościowego określenia stopnia neowaskularyzacji i stanu zapalnego, wyniki wykazują mierzalny spadek neowaskularyzacji na podstawie zarówno obserwacji klinicznych, jak i barwienia immunologicznego. Znaczenie tej techniki rozciąga się na nowe terapie ślepoty rogówkowej, ponieważ zapewnia ona powtarzalny poziom neowaskularyzacji, w odniesieniu do którego można testować nowe związki i terapie.W ten sposób metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat patologicznej neowaskularyzacji rogówki. Może ona również służyć jako model do badania mechanizmów angiogenezy i stanu zapalnego w ujęciu ogólnym. Procedura ta zostanie zaprezentowana w moim laboratorium w celu przygotowania do wywo

an-alkali-burn-injury-model-of-corneal-neovascularization-in-the-mouse

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Model urazu rogówki wywołanego zasadowym spaleniem u myszy

Ten protokół opisuje metodę polegającą na otarciu powierzchni oka myszy i śledzeniu procesu gojenia się ran. Protokół wykorzystuje zadzior oczny do częściowego usunięcia nabłonka powierzchniowego oka u znieczulonych myszy.

Otarcie nabłonka rogówki z zadziorem ocznym jako model gojenia się ran rogówki

Tutaj tworzone są modele zwierzęce oparte na myszach i królikach do mechanicznego i chemicznego uszkodzenia nabłonka rogówki, aby przebadać nowe terapie i leżący u ich podstaw mechanizm.

Modele zwierzęce ex vivo i in vivo do mechanicznych i chemicznych urazów nabłonka rogówki

Ten protokół skupia się na neowaskularyzacji rogówki wywołanej oparzeniami alkalicznymi u myszy. Metoda ta pozwala na stworzenie powtarzalnego i kontrolowanego modelu choroby rogówki w celu zbadania patologicznej angiogenezy i związanych z nią mechanizmów molekularnych oraz przetestowania nowych środków farmakologicznych zapobiegających neowaskularyzacji rogówki.

Mysi model neowaskularyzacji rogówki za pomocą oparzenia alkalicznego

Ten protokół opisuje metodę wywoływania dokładnego i powtarzalnego uszkodzenia rogówki i rąbków w modelu mysim. Protokół jest korzystny, ponieważ pozwala na równomierne rozłożenie uszkodzenia silnie zakrzywionej rogówki i rąbka myszy.

Indukcja alkaliów rogówki i rąbka za pomocą techniki stempla i trepanacji w modelu mysim

Mysi model uszkodzenia reperfuzyjnego niedokrwiennego nerek opisany tutaj składa się z prawej nefrektomii, która zapewnia tkankę kontrolną i zaciskania lewej szypułki nerki w celu wywołania niedokrwienia, które powoduje ostre uszkodzenie nerek. Model ten wykorzystuje laparotomię w linii środkowej, w której wszystkie kroki są wykonywane przez jedno nacięcie.

Uszkodzenie reperfuzyjne niedokrwienia nerek: mysi model urazu i regeneracji

Tutaj prezentujemy protokół neowaskularyzacji naczyniówki indukowanej laserem myszy (CNV), eksperymentalny model, który odtwarza naczyniowe cechy neowaskularnego zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem (AMD). Po opanowaniu może niezawodnie i skutecznie indukować CNV jako system modelowy do testowania różnych środków eksperymentalnych.

Mysi model do neowaskularyzacji naczyniówkowej indukowanej laserem

Sportowcy każdego roku doświadczają kilkuset łagodnych urazowych urazów mózgu (mTBI)/wstrząśnień mózgu; jednak ich konsekwencje dla mózgu są słabo poznane. W związku z tym zwierzęcy model pojedynczego i powtarzalnego mTBI, który konsekwentnie replikuje klinicznie istotne objawy, zapewnia środki do postępu w badaniach nad mTBI i wstrząsem mózgu.

Mysi model pojedynczego i powtarzalnego łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu

Neowaskularyzacja tęczówki, częste powikłanie choroby niedokrwiennej siatkówki, może prowadzić do zagrażającej wzrokowi jaskry neowaskularnej. W tym miejscu opisujemy mysi protokół indukowania eksperymentalnej neowaskularyzacji tęczówki, który może być wykorzystany do nieinwazyjnej oceny substancji modulujących angiogenezę.

Neowaskularyzacja tęczówki wywołana nakłuciem jako mysi model rubeozy tęczówki

Technika wirekowego miografu jest używana do badania funkcji mięśni gładkich naczyń krwionośnych i badania przesiewowego nowych leków. Przedstawiamy szczegółowy protokół pomiaru izometrycznej kurczliwości tętnicy krezkowej myszy oraz badań przesiewowych nowych środków zwiotczających mięśnie gładkie naczyń krwionośnych.

Izometryczny pomiar kurczliwości tętnicy krezkowej myszy za pomocą miografii drutowej

To badanie wprowadza protokół pomiaru mikrokrążenia w błonie śluzowej jamy ustnej człowieka za pomocą laserowego obrazowania z kontrastem. Monitorowanie gojenia się ran po przedsionkowoplastyce w połączeniu z ksenogennym przeszczepem kolagenu przedstawiono na przykładzie klinicznym.

Nowatorskie podejście do monitorowania neowaskularyzacji przeszczepu w ludzkim dziąśle

Poznaj model urazu neowaskularyzacji rogówki u myszy z zastosowaniem oparzenia zasadowego. Ta metoda umożliwia testowanie terapii przeciwangiogennych w badaniach nad ślepotą rogówkową.

Model urazu neowaskularyzacji rogówki w oparzeniach zasadowych u myszy

Przeglądaj więcej filmów