Name: Inicjacja przerzutowego raka piersi poprzez celowanie w nabłonek przewodowy za pomocą Adenovirus-Cre: nowy transgeniczny mysi model raka piersi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-26T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Poznaj metodę inicjacji nowotworu piersi u myszy za pomocą adenowirus-Cre w kanale gruczołowym. Model umożliwia badanie przerzutów przy zachowanym układzie odpornościowym i śledzenie komórek nowotworowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez NCI Grants RO1CA157664 i RO1CA124515, oraz nagrodę Breast Cancer Alliance. Chcielibyśmy podziękować Jeffreyowi Faustowi, Davidowi Ambrose'owi i Scottowi Weissowi z głównego ośrodka cytometrii przepływowej Wistar, Jamesowi Haydenowi z ośrodka Wistar Imaging oraz całemu personelowi Wistar Institute Animal Facility za ich nieocenione wsparcie techniczne.

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Instytutu Wistar.
1. Wytwarzanie i utrzymanie myszy transgenicznych
<ol>
	<li>Rozmnażaj LSL-K-rastm4Tyj 26 i Trp53tm1Brn 27 (uzyskane z mysich modeli NCI konsorcjum ludzkiego raka na mieszanym tle) do pełnego tła C57BL/6 28 poprzez krzyżowanie wsteczne co najmniej 10 pokoleń z myszami C57BL/6. Aby śledzić przerzuty guza, hoduj B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J (LSL-EYFP, uzyskany z The Jackson Laboratory na pełnym tle C57BL/6) z podwójnie transgenicznymi myszami LSL-K-rasG12D/+ p53loxP/loxP. 
	Uwaga: Transgeniczne myszy LSL-K-rasG12D/+ p53loxP/loxP mają miejsca loxP flankujące transkrypcyjnie wyciszony allel onkogennego K-ras i endogennego locus p53, tak że po wycięciu za pośrednictwem Cre uzyskuje się nadekspresję onkogennego mutanta K-ras i ablację p53. 
	Uwaga: Mysz LSL-EYFP zawiera kodon stop flankujący gen wzmocnionego białka żółtej fluorescencji (YFP), który po wycięciu za pośrednictwem Cre powoduje ekspresję YFP w tkankach, w których wycina się kasetę zatrzymania YFP.
	<ol>
		<li>Hoduj myszy transgeniczne, aby uzyskać myszy LSL-K-rasG12D/+ p53loxP/loxP lub myszy LSL-K-rasG12D/+ p53loxP/loxP LSL-EYFP do wstrzyknięć wewnątrzprzewodowych. 
		Uwaga: Myszy są hodowane jako homozygotyczne pod względemp53 loxP / loxP i heterozygotyczne pod względem LSL-K-rasG12D/+, ponieważ myszy z homozygotyczną delecją K-ras umierają w macicy. Do wstrzyknięć doprzewodowych należy używać naiwnych dziewiczych samic w wieku co najmniej sześciu tygodni. 
		Uwaga: Starterami do genotypowania homozygotycznego floksowanego allelu p53 są p53-T010-fwd (5'-AAGGGGTATGAGGGACAAGG-3') i p53-T011-rev (5'-GAAGACAGAAAAGGGGGGG-3'). Wytwarzają allel typu dzikiego przy 391 pz i allel floksowany p53 przy 461 pz29,30,<br / >
		Uwaga: Starterami do wykrywania zmutowanej formy K-ras są oIMR8273 (5'-CGCAGACTGTAGAGCAGCG-3') i oIMR8274 (5'-CCATGGCTTGAGTAAGTCTGC-3'). Wytwarzają one zmutowane pasmo wykryte przy 600 bp. 
		Uwaga: W przypadku potrójnie transgenicznych myszy reporterowych YFP, startery do wykrywania kasety ROSA (5'-AAGACCGCGAAGAGTTTGTC-3'), allelu typu dzikiego (5'-GGAGCGGGAGAAATGGATATG-3') i wspólnego allelu (5'-AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT-3') powodują amplifikację prążków przy 320 pz dla allelu floksowanego i 600 pz dla allelu typu dzikiego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie chirurgiczne
<ol>
	<li>Oczyść materiały chirurgiczne 75% EtOH i sterylizuj je w autoklawie przed i po wszystkich iniekcjach.</li>
	<li>Wykonuj operację na czystym, niezagraconym stole laboratoryjnym w odkażonym pomieszczeniu w obiekcie dla zwierząt. Przetrzyj wszystkie powierzchnie, w tym stolik i tarcze mikroskopu chirurgicznego, roztworem dezynfekującym o szerokim spektrum działania, a następnie 75% EtOH.</li>
	<li>Zważyć i znieczulić myszy przez dootrzewnowe wstrzyknięcie mieszanki ketaminy (80-100 mg / kg) i ksylazyny (8-10 mg / kg) w sterylnym roztworze soli fizjologicznej.</li>
	<li>Delikatnie umieść myszy z powrotem w klatkach bez przeszkód na 5 minut, podczas gdy przechodzą pod narkozą. W tym czasie wytrąca się wirus (patrz Protokół 3).</li>
	<li>Sprawdź brak reakcji na ból poprzez szczypanie palców u stóp. Delikatnie zakryj oczy znieczulonych myszy maścią weterynaryjną, aby zapobiec nadmiernemu wysuszeniu rogówki.</li>
	<li>Aby zapobiec hipotermii, umieść znieczulone myszy na poduszce grzewczej ustawionej na niskie ciepło podczas zabiegu chirurgicznego i do momentu, gdy zaczną wracać do zdrowia.</li>
	<li>W celu opanowania bólu meloksykam należy podawać myszom podskórnie w dawce 1 mg/kg mc. przed zabiegiem i 24 godziny po nim.</li>
</ol>
3. Powstawanie osadów wirusowych
UWAGA: Wektory adenowirusowe, mimo że zostały zmodyfikowane i nie są w stanie się replikować, stwarzają ryzyko infekcji. Z adenowirusem należy obchodzić się ostrożnie. Cały personel powinien być odpowiednio przeszkolony zgodnie z wytycznymi instytucji dotyczącymi postępowania z czynnikami BSL2 Po wstrzyknięciu doprzewodowym należy zutylizować adenowirusa zgodnie z wytycznymi BSL2.
<ol>
	<li>Skoncentrowane zapasy adenowirusa należy przechowywać w temperaturze -80 °C zamrożone w porcjach 4 x10 8 pfu każdy, wystarczających do wstrzyknięcia 16 zwierzętom 3 μl 2,5 x 107 pfu cząstek adenowirusa.</li>
	<li>Podwielokrotności adenowirusa należy przechowywać na suchym lodzie do około 15-20 minut przed rozpoczęciem wstrzykiwań. 
	Uwaga: Należy unikać powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania, ponieważ miano wirusa znacznie spada między każdym cyklem. 
	Uwaga: Osady adenowirusa powstają w wyniku modyfikacji protokołu opisanego wcześniej 31.</li>
	<li>Rozpuścić 504 mg proszku MEM w 50 ml sterylnej wody molekularnej, uzupełnić 244 mg wodorowęglanu sodu, przefiltrować w sterylnych warunkach i przechowywać w temperaturze 4 °C.
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór chlorku wapnia, dodając 1,5 g chlorku wapnia do 50 ml wody o czystości cząsteczkowej, przefiltrować w sterylnych warunkach i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Zmieszać podwielokrotności zawierające 4 x 108 pfu adenovirus-Cre z wystarczającą ilością 3% sacharozy w sterylnej wodzie, aby uzyskać końcową objętość 10 μl. Dodać 34 μl MEM do wirusa i delikatnie wymieszać. Następnie dodać 4 μl roztworu CaCl2, delikatnie wymieszać i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15-20 minut.</li>
		<li>Przechowuj adenowirusa na suchym lodzie, aż będzie gotowy do wytrącenia się. Unikać rozmrażania adenowirusa i przechowywania go na lodzie lub w temperaturze pokojowej przez dłuższy czas, chyba że utworzą się osady. 
		Uwaga: Możliwe jest również zmieszanie sacharozy, MEM i CaCl2 przed zabiegami chirurgicznymi, jeśli nie jest możliwe rozmrożenie podwielokrotności adenowirusa i rozpoczęcie wytwarzania osadów natychmiast po usunięciu z -80 °C. Tę porcję sacharozy, MEM i wapnia można zachować na suchym lodzie, aż będzie gotowa do dodania adenowirusa. 
		Uwaga: Cząsteczki wirusa są stabilne przez około 1 godzinę.</li>
		<li>Przed każdym wstrzyknięciem należy delikatnie przesunąć rurkę, aby upewnić się, że cząsteczki wirusa są wymieszane. Pobrać 3 μl (2,5 x 107 pfu) cząsteczek wirusa do strzykawki o pojemności 10 μl i przygotować mysz do wstrzyknięcia przewodowego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Wewnątrzprzewodowa iniekcja cząsteczek wirusa
<ol>
	<li>Delikatnie połóż mysz na plecach na oświetlonym stoliku czystego mikroskopu preparacyjnego. Oświetl stronę brzuszną dodatkowym źródłem światła i zlokalizuj lewy4-ty lub prawy9-ty pachwinowy gruczoł sutkowy za pomocą małych białych plam futra (widocznych u samic C57BL/6) otaczających każdy sutek.</li>
	<li>Delikatnie przetrzyj sutek sterylnym aplikatorem nasączonym etanolem z bawełnianą końcówką, aby usunąć włosy z brodawki sutkowej i wysterylizować miejsce wstrzyknięcia. Jeśli są trudne do zlokalizowania, delikatnie nałóż grubą warstwę kremu do depilacji lub użyj nożyc, aby odsłonić sutki.</li>
	<li>Usuń korek keratynowy, warstwę gęstych martwych komórek skóry, która pokrywa sutek. Po odsłonięciu brodawki sutkowej korek keratynowy powinien być dobrze widoczny pod mikroskopem preparacyjnym.</li>
	<li>Zabezpiecz sutek cienkimi kleszczami chirurgicznymi i pociągnij z lekką siłą, aby usunąć korek keratynowy.</li>
	<li>Ustabilizuj sutek między kleszczami.</li>
	<li>Delikatnie włóż igłę między kleszcze, kaniulując kanał pod kątem 90°. Wprowadzić do brodawki sutkowej nieco poza skos igły (nie więcej niż 2 mm), aby zapobiec przenikaniu przez tkankę sutkową do błon surowiczych brzusznej jamy ciała.
	<ol>
		<li>Nie należy wkładać igły zbyt głęboko. Aby zapewnić odpowiednią głębokość iniekcji, delikatnie pociągnij igłę do góry po włożeniu jej do światła kanału, ciągnąc sutek do góry wzdłuż krawędzi igły podczas jej podciągania. 
		Uwaga: Wizualizacja wstrzyknięcia jest trudna; Dlatego zaleca się praktykę na tym etapie przy użyciu błękitu trypanowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po odpowiednim umieszczeniu igły w przewodzie sutkowym, uwolnić 3 μl osadów wirusa (2,5 x 107 pfu adenowirusa-Cre), delikatnie zanurzając strzykawkę kciukiem ręki trzymającej strzykawkę. Sutek powinien się lekko napompować po dodaniu płynu.</li>
</ol>
5. Odzyskiwanie myszy
<ol>
	<li>Po wstrzyknięciu umieść mysz z powrotem na poduszce grzewczej, aż zacznie dochodzić do siebie po znieczuleniu.</li>
	<li>Po odzyskaniu myszy umieść ją z powrotem w czystej klatce i monitoruj, aby uzyskać pełną regenerację i ruch.</li>
	<li>24 godziny po wstrzyknięciu przewodowym należy podać podskórnie meloksykam w dawce 1 mg/kg.</li>
</ol>
6. Monitorowanie progresji nowotworu
<ol>
	<li>Wykonaj badanie palpacyjne wstrzykniętego gruczołu sutkowego w 30 dniu w celu powiększenia i obrzęku.
	<ol>
		<li>Monitoruj postęp guza co 5-7 dni po zaobserwowaniu obrzęku i powiększenia gruczołu sutkowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mierz objętość guza co 3-4 dni pod kątem kinetyki wzrostu guza po pojawieniu się wyczuwalnych guzów (około 50-60 dni po wstrzyknięciu adenowirusa).</li>
	<li>Eutanazja myszy, gdy objętość guza przekracza 10% masy ciała myszy.</li>
</ol>

<ol><li>Youlden, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+descriptive+epidemiology+of+female+breast+cancer%3A+an+international+comparison+of+screening%2C+incidence%2C+survival+and+mortality%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">The descriptive epidemiology of female breast cancer: an international comparison of screening, incidence, survival and mortality.</a> Cancer Epidemiol. 36, 237-248 (2012).</li>
<li>Siegel, R., Naishadham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%2C+2012%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+J.+Clin%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics, 2012.</a> Cancer J. Clin. 62, 10-29 (2012).</li>
<li>Sorlie, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+patterns+of+breast+carcinomas+distinguish+tumor+subclasses+with+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Gene expression patterns of breast carcinomas distinguish tumor subclasses with clinical implications.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 10869-10874 (2001).</li>
<li>Gatza, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pathway-based+classification+of+human+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A pathway-based classification of human breast cancer.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 6994-6999 (2010).</li>
<li>Bastien, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAM50+breast+cancer+subtyping+by+RT-qPCR+and+concordance+with+standard+clinical+molecular+markers%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med.+Genom%22%5BJournal%5D)">PAM50 breast cancer subtyping by RT-qPCR and concordance with standard clinical molecular markers.</a> BMC Med. Genom. 5, 44(2012).</li>
<li>Montagna, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+triple-negative+breast+cancer%3A+histologic+subtyping+to+inform+the+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Breast+Cancer%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of triple-negative breast cancer: histologic subtyping to inform the outcome.</a> Clin. Breast Cancer. 13, 31-39 (2013).</li>
<li>Karrison, T. G., Ferguson, D. J., Meier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dormancy+of+mammary+carcinoma+after+mastectomy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Dormancy of mammary carcinoma after mastectomy.</a> J. Natl. Cancer Inst. 91, 80-85 (1999).</li>
<li>Rakha, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prognostic+significance+of+lymphovascular+invasion+in+invasive+breast+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">The prognostic significance of lymphovascular invasion in invasive breast carcinoma.</a> Cancer. 118, 3670-3680 (2012).</li>
<li>Kim, I., Baek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+for+breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Mouse models for breast cancer metastasis.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 394, 443-447 (2010).</li>
<li>Vargo-Gogola, T., Rosen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+breast+cancer%3A+one+size+does+not+fit+all%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Modelling breast cancer: one size does not fit all.</a> Nat. Cancer. 7, 659-672 (2007).</li>
<li>Archer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steroid+hormone+receptor+status+defines+the+MMTV+promoter+chromatin+structure+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Steroid+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Steroid hormone receptor status defines the MMTV promoter chromatin structure in vivo.</a> J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 53, 421-429 (1995).</li>
<li>Cato, A., Henderson, D., Ponta, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hormone+response+element+of+the+mouse+mammary+tumour+virus+DNA+mediates+the+progestin+and+androgen+induction+of+transcription+in+the+proviral+long+terminal+repeat+region%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The hormone response element of the mouse mammary tumour virus DNA mediates the progestin and androgen induction of transcription in the proviral long terminal repeat region.</a> EMBO J. 6, 363-368 (1987).</li>
<li>Schoenenberger, C., Zuk, A., Groner, B., Jones, W., Andres, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+the+endogenous+whey+acidic+protein+%28Wap%29+gene+and+a+Wap-myc+hybrid+gene+in+primary+murine+mammary+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Induction of the endogenous whey acidic protein (Wap) gene and a Wap-myc hybrid gene in primary murine mammary organoids.</a> Dev. Biol. , 327-337 (1990).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiency+of+Pten+accelerates+mammary+oncogenesis+in+MMTV-Wnt-1+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Deficiency of Pten accelerates mammary oncogenesis in MMTV-Wnt-1 transgenic mice.</a> BMC Mol. Biol. 2, 2(2001).</li>
<li>Martelli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+lymph+node+migration+of+MNP-+and+%28111%29In-labeled+dendritic+cells+in+a+transgenic+mouse+model+of+breast+cancer+%28MMTV-Ras%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Imaging+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of lymph node migration of MNP- and (111)In-labeled dendritic cells in a transgenic mouse model of breast cancer (MMTV-Ras).</a> Mol. Imaging Biol. 14, 183-196 (2012).</li>
<li>Klover, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+STAT1+from+mouse+mammary+epithelium+results+in+an+increased+Neu-induced+tumor+burden%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Loss of STAT1 from mouse mammary epithelium results in an increased Neu-induced tumor burden.</a> Neoplasia. 12, 899-905 (2010).</li>
<li>Moody, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+activation+of+Neu+in+the+mammary+epithelium+of+transgenic+mice+results+in+reversible+pulmonary+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Conditional activation of Neu in the mammary epithelium of transgenic mice results in reversible pulmonary metastasis.</a> Cancer Cell. 2, 451-461 (2002).</li>
<li>Banerji, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+analysis+of+mutations+and+translocations+across+breast+cancer+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sequence analysis of mutations and translocations across breast cancer subtypes.</a> Nature. 486, 405-409 (2012).</li>
<li>Miyakis, S., Sourvinos, G., Spandidos, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+and+mutation+of+the+ras+family+genes+in+human+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Differential expression and mutation of the ras family genes in human breast cancer.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 251, 609-612 (1998).</li>
<li>Malaney, S., Daly, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ras+signaling+pathway+in+mammary+tumorigenesis+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mammary+Gland+Biol.+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">The ras signaling pathway in mammary tumorigenesis and metastasis.</a> J. Mammary Gland Biol. Neoplasia. 6, 101-113 (2001).</li>
<li>Loboda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene+expression+signature+of+RAS+pathway+dependence+predicts+response+to+PI3K+and+RAS+pathway+inhibitors+and+expands+the+population+of+RAS+pathway+activated+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med.+Genomics%22%5BJournal%5D)">A gene expression signature of RAS pathway dependence predicts response to PI3K and RAS pathway inhibitors and expands the population of RAS pathway activated tumors.</a> BMC Med. Genomics. 3, 26(2010).</li>
<li>von Lintig, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ras+activation+in+human+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res.+Treat%22%5BJournal%5D)">Ras activation in human breast cancer.</a> Breast Cancer Res. Treat. 62, 51-62 (2000).</li>
<li>Downward, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+RAS+signalling+pathways+in+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Targeting RAS signalling pathways in cancer therapy.</a> Nat. Rev. Cancer. 3, 11-22 (2003).</li>
<li>Eckert, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+Ras+activation+in+human+breast+cancer+cell+signaling%2C+invasion%2C+and+anoikis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Involvement of Ras activation in human breast cancer cell signaling, invasion, and anoikis.</a> Cancer Res. 64, 4585-4592 (2004).</li>
<li>Hollestelle, A., Elstrodt, F., Nagel, J., Kallemeijn, W., Schutte, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylinositol-3-OH+kinase+or+RAS+pathway+mutations+in+human+breast+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylinositol-3-OH kinase or RAS pathway mutations in human breast cancer cell lines.</a> Mol. Cancer Res. 5, 195-201 (2007).</li>
<li>Jackson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+lung+tumor+initiation+and+progression+using+conditional+expression+of+oncogenic+K-ras%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Analysis of lung tumor initiation and progression using conditional expression of oncogenic K-ras.</a> Genes Dev. 15, 3243-3248 (2001).</li>
<li>Jonkers, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+tumor+suppressor+activity+of+BRCA2+and+p53+in+a+conditional+mouse+model+for+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Synergistic tumor suppressor activity of BRCA2 and p53 in a conditional mouse model for breast cancer.</a> Nat. Genet. 29, 418-425 (2001).</li>
<li>Scarlett, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+cancer+progression+is+controlled+by+phenotypic+changes+in+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Ovarian cancer progression is controlled by phenotypic changes in dendritic cells.</a> Exp. Med. 209, 495-506 (2012).</li>
<li>Vooijs, M., Jonkers, J., Berns, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+efficient+ligand-regulated+Cre+recombinase+mouse+line+shows+that+LoxP+recombination+is+position+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">A highly efficient ligand-regulated Cre recombinase mouse line shows that LoxP recombination is position dependent.</a> EMBO Rep. 2, 292-297 (2001).</li>
<li>Young, N., Crowley, D., Jacks, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncoupling+cancer+mutations+reveals+critical+timing+of+p53+loss+in+sarcomagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Uncoupling cancer mutations reveals critical timing of p53 loss in sarcomagenesis.</a> Cancer Res. 71, 4040-4047 (2011).</li>
<li>Dinulescu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+K-ras+and+Pten+in+the+development+of+mouse+models+of+endometriosis+and+endometrioid+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Role of K-ras and Pten in the development of mouse models of endometriosis and endometrioid ovarian cancer.</a> Nat. Med. 11, 63-70 (2005).</li>
<li>Landua, J., Visbal, A., Lewis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+preparing+fluorescent+and+neutral+red-stained+whole+mounts+of+mouse+mammary+glands%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mammary+Gland+Biol.+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Methods for preparing fluorescent and neutral red-stained whole mounts of mouse mammary glands.</a> J. Mammary Gland Biol. Neoplasia. 14, 411-415 (2009).</li>
<li>Barham, W., Sherrill, T., Connelly, L., Blackwell, T. S., Yull, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraductal+injection+of+LPS+as+a+mouse+model+of+mastitis%3A+signaling+visualized+via+an+NF-kappaB+reporter+transgenic%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Intraductal injection of LPS as a mouse model of mastitis: signaling visualized via an NF-kappaB reporter transgenic.</a> J. Vis. Exp. , e4030(2012).</li>
<li>Murata, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ductal+access+for+prevention+and+therapy+of+mammary+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Ductal access for prevention and therapy of mammary tumors.</a> Cancer Res. 66, 638-645 (2006).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Powodzenie tej procedury zależy od właściwej techniki podczas iniekcji doprzewodowych, co będzie trudne dla nieprzeszkolonych eksperymentatorów. Doświadczeni badacze w naszym laboratorium zazwyczaj uzyskują guzy piersi w 79% przypadków, gdy podaje się im zastrzyki adenowirusowe. Problemy z wstrzyknięciem mogą skutkować znacznie opóźnionym, zmiennym lub brakiem rozwoju guza. Jeśli igła zostanie wprowadzona zbyt głęboko lub pod nieodpowiednim kątem, kanał przewodowy może zostać pominięty. Ważne jest, aby wejść do brodawki sutkowej nieco poza skos igły (nie więcej niż 2 mm), aby zapobiec przenikaniu przez tkankę sutkową do błon surowiczych brzusznej jamy ciała. Również zbyt płytkie umieszczenie igły lub wstrzyknięcie więcej niż 3 ml osadów wirusa może spowodować rozlanie preparatu wirusowego poza gruczoł sutkowy i indukcję niezamierzonych guzów. Jednym ze sposobów przezwyciężenia tych problemów jest włożenie igły do smoczka nieco głębiej niż 3 mm i powolne wyciągnięcie strzykawki z powrotem z kanału, aż znajdzie się w odległości 2 mm od końcówki skosu. Zapewni to, że celem będzie tkanka sutka zamiast mięśnia otaczającego jamę otrzewnową myszy (ryc. 1A). Spowoduje to również rozciągnięcie sutka wzdłuż krawędzi strzykawki, tak aby po wydaleniu wirusa do przewodu nie doszło do rozlania i utraty osadów wirusowych.
Wizualizacja wstrzyknięcia jest trudna i zaleca się praktykę na tym etapie. Zaobserwowaliśmy wzrost liczby udanych zastrzyków w następstwie praktyki, co skutkuje większą penetracją rozwoju guza. Ponieważ w tej technice wykorzystuje się dziewicze samice niekarmiące piersią, bardzo ważne jest usunięcie korka keratynowego pokrywającego sutek, aby odsłonić leżący pod spodem kanał przewodowy. Zalecamy przećwiczenie tego kroku poprzez wstrzyknięcie błękitu trypanowego lub innego sterylnego, śladowego barwnika do wnętrza kanału i przygotowanie całych mocowań sutkowych, aby potwierdzić celowanie w drzewo kanałowe. Dodatkowo opublikowano inne protokoły opisujące doprzewodową iniekcję odczynników33,34, które mogą być przydatne w opracowaniu prawidłowej techniki. Problemy z przygotowaniem wirusa lub infekcją światła przewodowego można również zbadać za pomocą adenowirusa wykazującego ekspresję mCherry. Myszy nietransgeniczne mogą być wykorzystywane do każdego z tych celów, dopóki technika wstrzykiwania nie zostanie zoptymalizowana.
Chociaż każdy gruczoł sutkowy może być użyty do zainicjowania nowotworów, osiągnęliśmy najbardziej spójne tempo wzrostu, celując w gruczoł sutkowy 4 lub 9, co naszym zdaniem wynika z tego, że łatwiej jest wykonać prawidłowe zastrzyki na te gruczoły, co skutkuje bardziej efektywnym celowaniem w przewód. Bliskość lewego4-tego lub prawego9-tego pachwinowego gruczołu sutkowego do drenującego pachwinowego węzła chłonnego jest również przydatna do badania przeciwnowotworowych odpowiedzi immunologicznych w różnych czasowych punktach progresji guza. Aby modelować i śledzić utajone przerzuty do miejsc dystalnych, myszy transgeniczne skrzyżowano z myszami LSL-EYFP. W miarę postępu guza układ naczyniowy łączący guz z pachowym węzłem chłonnym stanie się lekko nabrzmiały po około 5 tygodniach, zanim guz zacznie rosnąć wykładniczo (ryc. 3A). Ostatecznie, po 7-8 tygodniach, inwazja naczyń limfatycznych spowoduje wzrost guza w pachowym węźle chłonnym (ryc. 3A i 3B). Wykorzystując myszy reporterowe i technologię Cre-loxP, włączenie YFP tworzy platformę do śledzenia przerzutów komórek nowotworowych do dystalnych miejsc w trakcie progresji guza. Może to ułatwić badania mające na celu wyjaśnienie mechanizmów komórkowych i epigenetycznych, które sprzyjają przerzutom utajonym. W naszych rękach linie komórkowe guza piersi wykazywały ekspresję cytokeratyny-8, mezoteliny, receptora estrogenowego-α i Her2 / neu, potwierdzając celowanie w nabłonek przewodowy. Jednakże, w zależności od wywołanych mutacji oraz ze względu na trudność i zmienność wstrzyknięć, zalecamy histologiczną charakterystykę guzów, gdy model jest dobrze ugruntowany w laboratorium.
Ponieważ rak piersi jest tak śmiertelną i wszechobecną chorobą1,2, ważne jest, aby używać modeli zwierzęcych, które dokładnie odwzorowują złożoną interakcję między guzem a gospodarzem. Tutaj opisujemy w pełni krzyżowany wstecznie mysi model guza piersi C57BL / 6. Po pierwsze, indukując guzy z komórek natywnych, pozwalamy guzowi ewoluować naturalnie w pełnym mikrośrodowisku immunologicznym. Mikrośrodowisko immunologiczne w zaawansowanych guzach piersi myszy podsumowuje populacje limfocytów T αβ i γδ, komórek supresorowych pochodzenia szpikowego i makrofagów powszechnie obserwowanych w ludzkim raku piersi (ryc. 4). Jak już wcześniej opublikowaliśmy, używając adenowirusa-Cre do indukowania guzów jajnika, stwierdziliśmy, że wstrzyknięcie wirusa miało znikomy wpływ na odpowiednie nacieki guza i progresję guza28. Po drugie, niezależna od endokrynologicznej ekspresja onkogenów zapewnia, że komórki nowotworowe mają stale wysoki poziom ekspresji genów docelowych. Po trzecie, wykorzystując utajone mutacje, możemy kontrolować czas nowotworzenia, aby ułatwić precyzyjne śledzenie ewolucji guza. Zastosowania tego modelu obejmują badania nad biologią komórek nowotworowych, badania nad czynnikami w mikrośrodowisku guza, przeciwnowotworowe odpowiedzi immunologiczne, a nawet ocenę skuteczności nowych terapii. Dzięki dostępności systemu Cre-loxP, technika ta może być wykorzystana jako platforma do badania różnorodnych dodatkowych mutacji w inicjacji i progresji nowotworów piersi. Mamy nadzieję, że zastosowanie tego modelu przyczyni się do lepszego zrozumienia biologii raka piersi i ostatecznie doprowadzi do opracowania nowych metod leczenia raka piersi z przerzutami.

A correction was made to <a href="/video/51171">Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer</a>. Protocol sections 3.1, 3.3.2, 3.4, and 4.7 were updated. The materials table was also updated.
Protocol section 3.1 was updated from:
3.1) Store adenovirus concentrated virus stocks at -80&#176;C frozen in aliquots of 4 x 108 pfu each, sufficient for injecting 16 animals with 3 ml of 2.5 x 107 pfu of adenovirus particles.
to:
3.1) Store adenovirus concentrated virus stocks at -80&#176;C frozen in aliquots of 4 x 108 pfu each, sufficient for injecting 16 animals with 3 &#181;l of 2.5 x 107 pfu of adenovirus particles.
Protocol section 3.3.2 was updated from:
Mix aliquots containing 4 x 108 pfu adenovirus-Cre with sufficient 3% sucrose in sterile water for a final volume of 10 ml. Add 34 ml of MEM to the virus and gently mix. Then add 4 ml of the CaCl2 solution, gently mix, and incubate at room temperature for 15-20 min.
to:
Mix aliquots containing 4 x 108 pfu adenovirus-Cre with sufficient 3% sucrose in sterile water for a final volume of 10 &#181;l. Add 34 &#181;l of MEM to the virus and gently mix. Then add 4 &#181;l of the CaCl2 solution, gently mix, and incubate at room temperature for 15-20 min.
Protocol section 3.4 was updated from:
Prior to each injection, gently flick the tube to make sure virus particles are mixed. Draw up 3 ml (2.5 x 107 pfu) of virus particles into the 10 ml syringe and prepare the mouse for the intraductal injection.
to:
Prior to each injection, gently flick the tube to make sure virus particles are mixed. Draw up 3 &#181;l (2.5 x 107 pfu) of virus particles into the 10 &#181;l syringe and prepare the mouse for the intraductal injection.
Protocol section 4.7 was updated from:
When the needle is appropriately placed into the mammary duct, release the 3 ml of virus precipitates (2.5 x 107 pfu of adenovirus-Cre) by gently plunging the syringe with the thumb of the hand holding the syringe. The nipple should slightly inflate as the liquid is added.
to:
When the needle is appropriately placed into the mammary duct, release the 3 &#181;l of virus precipitates (2.5 x 107 pfu of adenovirus-Cre) by gently plunging the syringe with the thumb of the hand holding the syringe. The nipple should slightly inflate as the liquid is added.
Item 15 in the Materials table under Comments was updated from:
10ml syringe, RN series Autoclave before and after each use. Clean with PBS and 75% ethanol.
to:
10&#181;l syringe, RN series Autoclave before and after each use. Clean with PBS and 75% ethanol.

A correction was made to <a href="/video/51171">Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer</a>. Protocol sections 3.1, 3.3.2, 3.4, and 4.7 were updated. The materials table was also updated.

Erratum: Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

Rak piersi jest najczęściej występującym nowotworem złośliwym u kobiet na całym świecie1,2 i drugą najczęstszą przyczyną zgonów związanych z rakiem2. Złożone fenotypy genetyczne3,4,histologiczne5 i kliniczne6 są wykorzystywane do charakteryzowania różnych podtypów raka piersi i często są wykorzystywane jako środek do przewidywania przeżycia. Analiza dużej kohorty kobiet z rakiem piersi wykazała, że większość (około 80%) pacjentek, które zmarły, nawróciła w ciągu 10 lat po usunięciu guza pierwotnego7. Wykazano, że w przypadku większości inwazyjnych raków piersi inwazja naczyń limfatycznych jest silnie skorelowana ze złym wynikiem i bardziej agresywnym przebiegiem klinicznymchoroby 8.
Ze względu na genetyczną i fenotypową złożoność raka piersi, nie istnieje model zwierzęcy, który podsumowuje cały przebieg choroby. Linie komórkowe ludzkiego guza piersi są często stosowane jako modele ksenoprzeszczepu lub ortotopowego9 inwazyjnego i przerzutowego raka piersi u myszy z niedoborem odporności. Chociaż pouczające, modele te występują przy braku ciśnienia immunologicznego i ponieważ jest to przeszczep międzygatunkowy, zniekształcają działanie całego mikrośrodowiska guza. Indukowane mutacje genetyczne napędzane przez promotory specyficzne dla sutka, takie jak mysi wirus guza sutka (MMTV) i kwaśne białko serwatkowe (WAP), przyczyniły się do ogromnej ilości wiedzy na temat genetycznej natury raka piersi. Jednak specyficzna tkankowo ekspresja tych promotorów jest zagrożona przez ich reakcję na układ hormonalny10-16, co skutkuje zmienną ekspresją indukowanych mutacji genetycznych, które nie odzwierciedlają ekspresji onkogenów zwykle nadekspresji w ludzkim raku piersi. Aby przezwyciężyć endokrynologiczne sterowanie ekspresją onkogenów sterowaną przez MMTV, Moody i in. stworzyli warunkowy, indukowany doksycykliną model nadekspresji Neu w nabłonku piersi17. Model ten jest przydatny do deindukcji Neu po powstaniu guza w celu zbadania regresji i nawrotu, ale wymaga stałego podawania doksycykliny w celu spójnej, długoterminowej ekspresji onkogenu. Obszerne omówienie wielu istotnych dostępnych modeli guzów piersi można znaleźć w przeglądzie Vargo-Gogola i wsp.10
Naszym celem było opracowanie mysiego modelu identyfikowalnego raka piersi na pełnym tle C57BL/6, który po stałej indukcji zdarzeń mutacyjnych modeluje powstawanie nowotworu w obecności ciśnienia immunologicznego. Wprowadziliśmy adenowirusa eksprymującego Cre-rekombinazę do przewodów sutkowych transgenicznych myszy zawierających floksowane allele Tp53 oraz onkogenną formę K-ras i YFP. Ekspresja Cre abluje Tp53, często zmutowany gen w wielu nowotworach piersi18 i indukuje onkogenny allel K-ras oprócz ekspresji YFP specyficznie w nabłonku przewodowym sutka. Chociaż mutacje w K-ras są rzadkie w raku piersi, występując tylko u 6,5% pacjentek z rakiem piersi19,20, nadekspresja kinaz poprzedzających, takich jak Her2 / neu i EGFR, powoduje konstytutywną aktywację szlaku sygnałowego Ras w ludzkich guzach piersi21-23. Odnotowano również aktywację szlaku sygnałowego Ras w wielu liniach komórkowych guza piersi24,25. Opiszemy inicjację powstawania nowotworu i technikę doprzewodowego wstrzykiwania adenowirusa eksprymującego Cre-rekombinazę do dojrzałych płciowo, dziewiczych samic myszy. W tym modelu raka piersi rozwijają się jawne zmiany, które rosną wykładniczo po około 8 tygodniach powolnej progresji guza, z inwazją naczyń limfatycznych i przerzutami do pachowego węzła chłonnego po 7-8 tygodniach. Ponieważ myszy te znajdują się na pełnym tle C57BL/6, a komórki nowotworowe wykazujące ekspresję YFP są identyfikowalne w dystalnych węzłach chłonnych, model ten stanowi odpowiednie narzędzie do badania komórkowych i immunologicznych mechanizmów utajonych przerzutów i pomoże opracować nowe podejścia terapeutyczne w leczeniu przerzutowego przewodowego raka piersi.

<table><tbody><tr><td>Trp53tm1Brn Myszy transgeniczne K-rastm4Tyj Myszy transgeniczne</td><td>Uzyskano z mysich modeli NCI konsorcjum</td><td></td> ludzkiego raka <td>Myszy skrzyżowano wstecznie dziesięć razy z pełnym tłem C57BL/6</td></tr><tr><td>B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/JMyszy transgeniczne</td><td>Jackson Labs</td><td>006148</td><td></td></tr><tr><td>Startery p53loxP/loxP</td><td>Zintegrowane technologie</td><td></td> DNA <td>5'-AAGGGGTATGAGGGACAAGG-3' 5'-GAAGACAGAAAAGGGGAGGG-3'Startery</td></tr> <tr><td>LSL-K-rasG12D/+</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td></td><td>5'-CGCAGACTGTAGAGCAGCG-3' 5'-CCATGGCTTGAGTAAGTCTGC-3'</td></tr> <tr><td>Startery do LSL-EYFP do wykrywania promotora Rosa</td><td>Zintegrowany DNA Technologies</td><td></td><td>5'-AAGACCGCGAAGAGTTTGTC-3' 5'-GGAGCGGGAGAAATGGATATG-3' 5'-AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT-3'</td></tr> <tr><td>Startery do wykrywania ekspresji mezoteliny</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td></td><td>5'-TTGGGTGGATACCACGTCTG-3' 5'-CGGAGTGTAATGTTCTTCTGTC-3'Startery</td></tr> <tr><td>do wykrywania ekspresji receptora progesteronu</td><td>Zintegrowane Technologie</td><td></td> DNA <td>5'-GCAATGGAAGGGCAGCATAA-3' 5'-TGGCGGGACCAGTTGAATTT-3'Startery</td></tr> <tr><td>do wykrywania ekspresji cytokeratyny 8</td><td>Zintegrowane technologie DNA 5</td><td></td><td>'-ATCAGCTCTTCCAGCTTTTCCC-3' 5'-GAAGCGCACCTTGTCAATGAAGG-3'Startery</td></tr> <tr><td>do wykrywania ekspresji Erbb2</td><td>Zintegrowane technologie</td><td></td> <td>DNA5'-ACCTGCCCCTACAACTACCT-3' 5'-AAATGCCAGGCTCCCAAAGA-3'Startery</td></tr> <tr><td>do wykrywania ekspresji receptora estrogenowego</td><td>A Zintegrowane technologie</td><td></td> DNA <td>5'-ATGAAAGGCGGCATACGGAA-3' 5'-GCGGTTCAGCATCCAACAAG-3'Startery</td></tr> <tr><td>do wykrywania ekspresji receptora estrogenowego B</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td></td><td>5'-ACCCAATGTGCTAGTGAGCC-3' 5'-TGAGGACCTGTCCAGAACGA-3'Startery</td></tr> <tr><td>do wykrywania ekspresji B-aktyny</td><td>Zintegrowane technologie</td><td></td> DNA <td>5'-GCCTTCCTTCTTGGATGG-3' 5'-CAGCTCAGTAACAGTCCGCC-3'Rdzeń</td></tr> <tr><td>wektora transferu genu</td> <td>adenowirusa-Cre</td> z Uniwersytetu Iowa <td>Ad5CMVCre</td><td>Przechowuj porcje wirusa (4 x 108 pfu/aliquot) pod adresem -80 &#176; C, aby uniknąć powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania.</td></tr><tr><td>Rdzeń wektora transferu genu</td> <td>Adenovirus-mCherry</td> z University of Iowa <td>Ad5CMVmCherry</td><td>Store podwielokrotności wirusa (4 x 108 pfu/aliquot) przy -80 &#176; C, aby uniknąć powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania.</td></tr><tr><td>Strzykawka Hamilton</td><td>firmy Hamilton</td><td>701RN</td><td>10 &#956; l strzykawka, seria RN. Autoklaw przed i po każdym użyciu. Czyścić PBS i 75% etanolem.</td></tr><tr><td>Niestandardowa igła</td><td>firmy Hamilton</td><td>7803-05</td><td>33 G 0,5 cala długa igła RN, ze skosem 12&#176. Autoklaw przed i po każdym użyciu. Czyścić PBS i 75% etanolem.</td></tr><tr><td>Kleszcze chirurgiczne</td><td>Dumont</td><td>52100-58</td><td>Kleszcze Dumostar nr 5. Po każdym użyciu wyczyść 75% etanolem, a następnie autoklawizuj</td></tr><tr><td>proszek MEM</td><td>Cellgro</td><td>50 012 PB</td><td>Przechowywać pod numerem 4 &#176; C w proszku i postaci odtworzonej</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Fisher</td><td>S233</td><td>Dodaj do MEM i przefiltruj stearylizować</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma</td><td>C4901</td><td>Minimum 96%, bezwodny</td></tr></tbody></table>

inicjacja przerzutowego raka piersi poprzez celowanie w nabłonek przewodowy za pomocą adenovirus-cre: nowy transgeniczny mysi model raka piersi

Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

Rak piersi jest chorobą heterogenną, polegającą na złożonych interakcjach komórkowych między rozwijającym się guzem a układem odpornościowym, co ostatecznie prowadzi do wykładniczego wzrostu guza i przerzutów do tkanek dystalnych oraz załamania odporności przeciwnowotworowej. Istnieje wiele użytecznych modeli zwierzęcych do badania raka piersi, ale żaden z nich nie podsumowuje całkowicie postępu choroby, który występuje u ludzi. Aby lepiej zrozumieć interakcje komórkowe, które powodują powstawanie utajonych przerzutów i zmniejszenie przeżywalności, stworzyliśmy indukowalny transgeniczny model myszy raka przewodowego z ekspresją YFP, który rozwija się po osiągnięciu dojrzałości płciowej u myszy kompetentnych immunologicznie i jest napędzany przez stałą, niezależną od endokrynologicznej ekspresję onkogenu. Aktywację YFP, ablację p53 i ekspresję onkogennej formy K-ras osiągnięto poprzez dostarczenie adenowirusa eksprymującego Cre-rekombinazę do przewodu sutkowego dojrzałych płciowo, dziewiczych samic myszy. Guzy zaczynają pojawiać się 6 tygodni po rozpoczęciu zdarzeń onkogennych. Po tym, jak guzy staną się widoczne, postępują powoli przez około dwa tygodnie, zanim zaczną rosnąć wykładniczo. Po 7-8 tygodniach od wstrzyknięcia adenowirusa obserwuje się unaczynienie łączące masę guza z dystalnymi węzłami chłonnymi, z ewentualną inwazją limfatyczną komórek nowotworowych YFP+ do dystalnych pachowych węzłów chłonnych. Naciekające populacje leukocytów są podobne do tych występujących w ludzkich rakach piersi, w tym obecność limfocytów T αβ i γδ, makrofagów i MDSC. Ten unikalny model ułatwi badanie mechanizmów komórkowych i immunologicznych związanych z przerzutami utajonymi i uśpieniem, a także będzie przydatny do projektowania nowych interwencji immunoterapeutycznych w leczeniu inwazyjnego raka piersi.

Prawidłowe celowanie w drzewo przewodowe gruczołu mlekowego można zwizualizować poprzez przygotowanie całych preparatów gruczołu mlekowego zgodnie z wcześniejszym opisem32 po wstrzyknięciu błękitu trypanowego (w celu weryfikacji właściwej techniki wstrzykiwania (Rysunek 1A)) lub adenowirusa wykazującego ekspresję mCherry (w celu weryfikacji prawidłowego przygotowania wirusa i infekcji komórek nabłonkowych przewodów, Rysunek 1B).
<img alt="schemat struktury naczyniowej; mikroskopia; barwienie niebieskim barwnikiem (A) i znakowanie fluorescencyjne (B); TD, LD, MG." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51171/51171fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51171/51171fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Kierunkowe dostarczenie do wnętrza przewodów gruczołów mlekowych poprzez wstrzyknięcie błękitu trypanowego lub adenowirusa-mCherry. A) Przygotowano preparat całego organu (whole mount), zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami32, gruczołu mlekowego po wstrzyknięciu błękitu trypanowego do gruczołu nr 4, 3 h po iniekcji, aby zwizualizować/potwierdzić dotarcie preparatu do całego drzewa przewodowego. Obrazy wykonano przy powiększeniu 4X. B) Zakażenie nabłonka przewodowego adenowirusem poprzez wstrzyknięcie 2,5 x 107 pfu adenowirusa wykazującego ekspresję mCherry. Myszy poddano iniekcji wewnątrzprzewodowej, a 4 dni po zabiegu przygotowano preparat całego organu gruczołu mlekowego, aby potwierdzić zakażenie wirusowe drzewa przewodowego. Obraz wykonano przy powiększeniu 4X. MG oznacza gruczoł mlekowy, LD to przewód mleczny lub główny, a TD to przewód końcowy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51171/51171fig1highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.</a>
W przypadku indukowania guzów u myszy transgenicznych p53loxP/loxP LSL-K-rasG12D/+, guzy nie będą widoczne aż do około 40. dnia, kiedy gruczoły mlekowe powiększą się i opuchną. W momencie zaobserwowania tych zmian konieczne jest rozpoczęcie palpacji i monitorowanie wzrostu guza co 5-7 dni. W naszych doświadczeniach twardnienie gruczołu mlekowego zawsze poprzedza rozpoczęcie rozwoju nowotworu. Guzy będą rozwijać się powoli przez kolejne 2 tygodnie. Od około 56. dnia guzy zaczną rosnąć wykładniczo (Rycina 2B). W tym momencie, w przypadku planowania badań kinetycznych, kluczowe jest mierzenie objętości guzów co 3 dni, ponieważ występuje niewielka zmienność w postępie rozwoju nowotworu między poszczególnymi myszami, co jest zjawiskiem normalnym (Ryciny 2A i 3A). Duże masy brzuszne będą widoczne do 80. dnia (Ryciny 2A, 2B i 3A), po czym myszy powinny zostać poddane eutanazji, jeśli masa guzów przekroczy 10% masy ciała zwierzęcia. Analiza cDNA trzech klonów z myszy z nowotworem wykazała ekspresję mezoteliny, cytokeratyny-8, Her2/neu oraz receptora estrogenowego α (Rycina 2C).
<img alt="Badanie wzrostu guza u myszy; wykres, objętość guza; analiza ekspresji białek metodą Western blot." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51171/51171fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51171/51171fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Rozwój guza u myszy p53loxP/loxP LSL-K-rasG12D/+ po wewnątrzprzewodowym wstrzyknięciu adenowirusa-Cre. A) Dwa przykłady guzów 80 dni po wstrzyknięciu adenowirusa wykazującego ekspresję Cre. Myszy otrzymały 2,5 x 107 PFU adenowirusa wykazującego ekspresję Cre; 80 dni po zainicjowaniu guza widoczne są duże, wyczuwalne palcami masy wystające z brzusznej strony zwierzęcia. B) Typowa kinetyka wzrostu guza i harmonogram palpacji dla guzów indukowanych u myszy p53loxP/loxP LSL-K-rasG12D/+. C) Charakterystyka trzech klonów komórek nowotworowych pochodzących z tego samego homogenizowanego guza myszy p53loxP/loxP LSL-K-rasG12D/+. RNA zostało wyekstrahowane, a cDNA zsyntetyzowane do analizy RT-PCR z użyciem starterów specyficznych dla β-aktyny, mezoteliny, cytokeratyny-8, Her2/neu, receptora progesteronu, receptora estrogenowego-α oraz receptora estrogenowego-β. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51171/51171fig2highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.</a>
Podobnie jak w mikrośrodowisku komórkowym raka piersi u ludzi, zaobserwowaliśmy naciekanie komórek T αβ i γδ, a także mieloidalnych komórek supresorowych i makrofagów do guzów (Rycina 4). Unaczynienie odprowadzające do węzła chłonnego pachy zaczyna się poszerzać, zanim guzy urosną do rozmiarów obejmujących całą tkankę gruczołu mlekowego, w której wykonano wstrzyknięcie (Rycina 3A). Inwazję limfowascularną i przerzuty komórek nowotworowych można śledzić, krzyżując myszy LSL-K-rasG12D/+ p53loxP/loxP z myszami LSL-EYFP. Po wycięciu zależnym od Cre, komórki nowotworowe wykazujące ekspresję YFP (zarówno wysoką, jak i niską) są wykrywane w guzie i można śledzić ich przerzuty do drenującego węzła chłonnego pachy (Rycina 3B). Przerzuty do dystalnego węzła chłonnego pachy potwierdzono poprzez udaną hodowlę linii komórek nowotworowych z tego miejsca u myszy z nowotworem LSL-K-rasG12D/+ p53loxP/loxP (dane nie przedstawiono).
<img alt="Progresja guzów u myszy i wykresy cytometrii przepływowej, analiza tkanek, wykresy rozrzutu SSC vs YFP." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51171/51171fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51171/51171fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Tworzenie się guzów i utajone przerzuty do węzła chłonnego pachowego. A) Przykład trzech zaawansowanych guzów piersi o różnym tempie progresji. Tworzy się lita masa, wskazana grotem strzałki, która ostatecznie rozrasta się do rozmiarów całej tkanki gruczołu mlekowego w okolicy brzusznej. Guz pozostaje ograniczony do tkanki gruczołu mlekowego i nie obserwuje się jego naciekania ani przylegania do mięśnia pokrywającego jamę otrzewną. Widoczne jest przekrwienie powierzchownej żyły nadłonowej między węzłami chłonnymi pachwinowymi a pachowymi, zaznaczone białymi grotami strzałek. Po 7-8 tygodniach węzeł chłonny pachowy zaczyna się powiększać w wyniku nacieku limfowaskularnego komórek nowotworowych, wskazanego strzałką. B) Przerzuty komórek nowotworowych wykazujących ekspresję YFP można zwizualizować w węźle chłonnym pachowym za pomocą cytometrii przepływowej. Do indukowania guzów i aktywacji YFP poprzez wewnątrzprzewodowe podanie adenowirusa-Cre wykorzystano myszy LSL-K-rasG12D/+ p53loxP/loxP LSL-EYFP. Aby zweryfikować naciek limfowaskularny komórek nowotworowych do węzła chłonnego pachowego, 80 dni po wstrzyknięciu adenowirusa, pobrano wskazane węzły chłonne i organy, zabarwiono je na markery limfocytów i zbadano pod kątem ekspresji YFP. CL oznacza przeciwległy węzeł chłonny nieodprowadzający chłonki z guza. Wyniki przedstawiają bramkowanie na komórkach nowotworowych CD45-ujemnych, co wskazuje, że komórki nowotworowe naciekają oddalony węzeł chłonny pachowy. Liczby reprezentują procent komórek YFP-dodatnich w całkowitej populacji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51171/51171fig3highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.</a>
<img alt="Wykresy cytometrii przepływowej; markery CD3, CD45, γδTCR, CD11b, GR1; analiza populacji komórek." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51171/51171fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51171/51171fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Infiltraty immunologiczne w transgenicznych guzach piersi myszy. Guzy piersi myszy poddano homogenizacji i barwieniu na CD45, CD3, γδTCR, CD11b oraz GR1. Liczby reprezentują procent pozytywnych leukocytów w całym guzie (63,5), całkowite CD3+ (46,7), całkowite CD3 negatywne (40,1), całkowite CD3+ γδ+ (limfocyty γδ T, 13), CD3+ γδ negatywne (24), całkowite GR1 high CD11b (MDSC, 28,6) oraz całkowite CD11b GR1 low (makrofagi, 18,5). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51171/51171fig4highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.</a>
Ze względu na anatomię myszy oraz technikę wstrzykiwań dokanałowych, stwierdziliśmy, że celowanie w gruczoły piersiowe 4 i 9 (Rysunek 5) daje najbardziej spójne wyniki i zapewnia niezawodne wstrzyknięcia. Niemniej jednak, zależnie od preferencji technika wykonującego zabieg, można wybrać dowolny gruczoł.
<img alt="Schemat anatomii gryzonia z opisanymi oznaczeniami eksperymentalnymi dla badań biologicznych." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51171/51171fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51171/51171fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5. Numeracja przewodów mlecznych. Przewody mleczne 4 i 9 zostały zaznaczone na czerwono na schemacie oraz wskazane strzałkami na myszy. W naszej praktyce ustaliliśmy, że najłatwiej jest wykonywać iniekcje w te przewody mleczne, jednak we wszystkich pozostałych tkankach gruczół mlekowy, które były celem badań, guzy rozwijały się z podobną kinetyką. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51171/51171fig5highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.</a>

Aktywacja utajonych mutacji z adenowirusem-Cre w systemie przewodowym sutka powoduje klinicznie istotny przerzutowy rak piersi. Włączenie promotora YFP umożliwia śledzenie dystalnych komórek nowotworowych z przerzutami. Model ten jest przydatny do badania utajonych przerzutów, odporności przeciwnowotworowej oraz do projektowania nowych immunoterapii w leczeniu raka piersi.

Inicjacja przerzutowego raka piersi poprzez celowanie w nabłonek przewodowy za pomocą Adenovirus-Cre: nowy transgeniczny mysi model raka piersi

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest opracowanie mysiego modelu raka piersi, który ostatecznie daje przerzuty w obecności zdrowego układu odpornościowego. Osiąga się to najpierw poprzez podanie adenowirusa wyrażającego ekspresję Cree do kanału przewodowego sutka zwierząt doświadczalnych. Gruczoł sutkowy jest następnie regularnie badany palpacyjnie w celu monitorowania postępu guza.Ostatecznie przerzuty guza i naciek leukocytów do pachowego węzła chłonnego można ocenić za pomocą analizy cytometrii przepływowej. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi modelami guzów piersi jest to, że umożliwia precyzyjną inicjację guzów, które mogą rozwijać się w obecności dojrzałego układu odpornościowego i które można śledzić za pomocą ekspresji YFP. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy wprowadzające do iniekcji są trudne do nauczenia.Prawidłowe umieszczenie igły wymaga precyzji i wprawy. W dniu eksperymentu przechowuj Eloqua składającą się z czterech razy 10 ósmych jednostek tworzących płytkę adenowirusa Cree na suchym lodzie, rozmrozić wirusa o ustalonej temperaturze pokojowej i wymieszać go z wystarczającą ilością 3% sacharozy w sterylnej wodzie, aby uzyskać ostateczną objętość do 10 mikrolitrów. Następnie delikatnie wymieszaj 34 mikrolitry memu i cztery mikrolitry świeżo przygotowanego chlorku wapnia z wirusem i inkubuj roztwór w temperaturze pokojowej.Po 15 do 20 minutach podłoże stanie się mętne, co wskazuje na tworzenie się osadów adenowirusa. Delikatnie przesuń rurkę, aby upewnić się, że cząsteczki wirusa są równomiernie rozmieszczone w zawiesinie, a następnie, aby wstrzyknąć cząsteczki wirusa, wciągnij trzy mikrolitry wirusa do strzykawki o pojemności 10 mikrolitrów. Następnie umieść znieczuloną mysz na grzbiecie na oświetlonym stoliku czystego mikroskopu preparacyjnego.Oświetl brzuch dodatkowym źródłem światła i zlokalizuj lewą czwartą lub prawą dziewiątą pachwinową gruczoł sutkowy za małymi białymi plamami futra otaczającymi każdy sutek. Teraz delikatnie przetrzyj sutek sterylnym aplikatorem nasączonym etanolem z bawełnianą końcówką. Następnie zabezpiecz sutek cienkimi kleszczami chirurgicznymi i podciągnij z lekką siłą.Aby usunąć korek keratynowy, ustabilizuj sutek między kleszczami i delikatnie włóż igłę między końcówki. Kaniulując kanał kanałowy pod kątem 90 stopni, aby zapewnić odpowiednią głębokość wstrzyknięcia, delikatnie pociągnij igłę do góry po włożeniu jej do światła kanału, ciągnąc sutek do góry wzdłuż krawędzi igły podczas jej ciągnięcia. Po odpowiednim umieszczeniu igły należy delikatnie zanurzyć całą zawartość strzykawki.Smoczek powinien się lekko napompować podczas dodawania płynu. Po wstrzyknięciu umieść mysz z powrotem na poduszce grzewczej, aż zacznie dochodzić do siebie po znieczuleniu. Następnie umieść zwierzę z powrotem w czystej klatce i monitoruj je, aż zaobserwuje się pełne wyzdrowienie.Wykonaj badanie palpacyjne wstrzykniętego gruczołu pamięciowego w 30 dniu w celu oceny powiększenia i obrzęku gruczołu. Monitoruj postęp guza co pięć do siedmiu dni. Po zaobserwowaniu obrzęku i powiększenia gruczołu sutkowego należy mierzyć objętość guza co trzy do czterech dni pod kątem kinetyki wzrostu guza.Gdy pojawią się wyczuwalne palpacyjnie guzy, skuteczne celowanie w drzewo przewodowe sutka można uwidocznić, przygotowując całe wierzchy gruczołu sutkowego po wstrzyknięciu tripu i niebieskiego w celu sprawdzenia prawidłowego wstrzyknięcia lub po wstrzyknięciu adenowirusa z ekspresją wiśni M w celu sprawdzenia prawidłowego przygotowania wirusa i infekcji ciągliwych komórek nabłonka. Kiedy guzy są indukowane u transgenicznych myszy F Fluxed P 53 LSLK RAs, początkowe guzy nie staną się widoczne aż do około 40 dnia, kiedy gruczoły sutkowe staną się powiększone i spuchnięte. Począwszy od około 56 dnia, guzy zaczną rosnąć wykładniczo.W tym momencie bardzo ważne jest, aby mierzyć objętość guza co trzy dni. Jeśli pożądane są badania kinetyczne, ponieważ będzie normalna zmienność progresji guza między myszami, duże masy brzuszne będą widoczne do 80 dnia, po czym myszy powinny zostać poddane eutanazji, jeśli guzy przekraczają więcej niż 10% masy ciała zwierzęcia. Analiza CDNA trzech linii komórkowych pochodzących z guzów piersi w transgenicznych myszach transgenicznych Stream P 53 LSL KRAS wykazała, że guzy wyrażają mezotelinę cytokeratynę osiem, HER dwie nowe i receptor estrogenowy alfa, podobne do mikrośrodowiska komórkowego w ludzkim raku piersi infiltracja limfocytów T alfa, beta i gamma delta, a także komórek supresorowych pochodzenia szpikowego i makrofagów do guzów.Naczynia krwionośne odprowadzające się do pachowego węzła chłonnego zaczną puchnąć, zanim guzy urosną i ostatecznie obejmą całą tkankę pamięci, w której wykonano wstrzyknięcie. Widoczny będzie również obrzęk powierzchownej żyły nadbrzusza między pachwinowymi i pachowymi węzłami chłonnymi. Po siedmiu do ośmiu tygodniach pachowy węzeł chłonny ulegnie powiększeniu z powodu inwazji limfaczno-naczyniowej komórek nowotworowych.Inwazję naczyń limfatycznych i przerzuty komórek nowotworowych można śledzić, krzyżując transgeniczne myszy Flocked P 53 LSLK RA z myszami L-S-L-E-Y-F-P. Po wycięciu w guzie wykrywa się komórki wyrażające zarówno wysoki, jak i niski poziom YFP, a ich przerzuty można prześledzić do drenującego węzła chłonnego pachowego. Po opanowaniu technika ta może być wykonana na eksperymentalnej kohorcie 20 myszy w ciągu dwóch do trzech godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.Po tej procedurze można opracować inne modele nowotworów poprzez hodowlę myszy z dodatkowymi blokadami, transgenami p, aby odpowiedzieć na pytania, takie jak, w jaki sposób różne onkogeny wpływają na patologię, mikrośrodowisko immunologiczne i inwazję przerzutową raka piersi.

initiation-metastatic-breast-carcinoma-targeting-ductal-epithelium

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Inicjacja przerzutowego raka piersi poprzez ukierunkowanie na nabłonek przewodów z użyciem adenowirusa-Cre: nowy transgeniczny model myszy raka piersi

Ten film opisuje technikę iniekcji wewnątrzprzewodowych, w której dostarczamy mieszankę iniekcyjną do przewodów mysich gruczołów sutkowych.

Iniekcja doprzewodowa: dostarczanie mieszanki iniekcyjnej do przewodów gruczołu sutkowego myszy

Ten film opisuje generowanie modelu myszy jelita grubego przez segmentową infekcję adeno-cre. Zakażony odcinek jelita grubego prowadzi do nowotworzenia w obrębie tego odcinka błony śluzowej, w wyniku czego gruczolaki ostatecznie przechodzą w raka inwazyjnego i przerzutowego. Model ten stanowi atrakcyjną platformę do badań nad biologią nowotworów i przedklinicznych badań terapeutycznych.

Segmentalna infekcja Adeno-Cre: technika generowania izolowanego raka jelita grubego przy użyciu genetycznie modyfikowanych modeli myszy

Opisany jest ortotopowy model pierwotnego guza raka piersi i chirurgiczne usunięcie pierwotnego guza w celu przedłużenia życia myszy w celu wytworzenia spontanicznych przerzutów. Wzrost i progresja guza są monitorowane i oznaczane ilościowo za pomocą obrazowania fluorescencyjnego lucyferazy.

Ortotopowy mysi model spontanicznych przerzutów raka piersi

Brakuje modeli przedklinicznych oceniających terapię adjuwantową ukierunkowaną na przerzuty raka piersi. Aby temu zaradzić, opracowaliśmy mysi model przerzutów de novo gruczolakoraka sutka do płuc, w którym terapie stosowane w trybie adjuwantowym (pooperacyjna resekcja guzów pierwotnych) mogą być oceniane pod kątem skuteczności w oddziaływaniu na wcześniej zasiane przerzuty do płuc.

Procedury chirurgiczne i metodyka przedklinicznego mysiego modelu przerzutów raka sutka de novo

Procedura chirurgiczna została opracowana w celu dostarczenia komórek guza sutka do mysiej wątroby poprzez wstrzyknięcie do żyły wrotnej. Model ten umożliwia badanie późnych stadiów przerzutów do wątroby u w pełni kompetentnego immunologicznie gospodarza, w tym wynaczynienia komórek nowotworowych, siewu, przeżycia i przerzutowego wzrostu w wątrobie.

Model iniekcji żyły wrotnej do badania przerzutów raka piersi do wątroby

Wprowadzamy mysi ortotopowy model raka piersi i model radykalnej mastektomii z technologią bioluminescencji, aby określić ilościowo obciążenie guza, aby naśladować postęp ludzkiego raka piersi.

Generowanie mysiego ortotopowego modelu raka piersi z przerzutami i wykonywanie radykalnej mastektomii u myszy

Celem tego protokołu jest opisanie nowego podejścia do modelowania raka piersi opartego na doprzewodowym wstrzykiwaniu adenowirusa z ekspresją Cre do mysich gruczołów sutkowych. Takie podejście pozwala na manipulowanie zdarzeniami onkogennymi zarówno w zależności od typu komórki, jak i narządu, w sposób kontrolowany czasowo.

Modelowanie raka piersi poprzez doprzewodowe wstrzyknięcie adenowirusa z ekspresją Cre do mysiego gruczołu sutkowego

Modele ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów (PDX) oraz genetycznie modyfikowane modele myszy do przeszczepu wiernie odwzorowują ludzką chorobę i są preferowanymi modelami do podstawowych i translacyjnych badań nad rakiem piersi. W tym miejscu opisano metodę ortotopowego przeszczepiania fragmentów guza piersi do poduszeczki tłuszczowej sutka w celu zbadania biologii guza i oceny odpowiedzi na lek.

Ortotopowe przeszczepy guzów piersi jako modele przedkliniczne raka piersi

Dożylne wstrzykiwanie komórek rakowych jest często stosowane w badaniach nad przerzutami, ale obciążenie guzem przerzutowym może być trudne do analizy. W tym artykule demonstrujemy model przerzutów do iniekcji żyły ogonowej i uwzględniamy nowatorskie podejście do analizy wynikającego z przerzutowego obciążenia guzem płuc.

Analiza patologiczna przerzutów do płuc po bocznym wstrzyknięciu komórek nowotworowych do żyły ogonowej

Opisano metodę doprzewodowego wstrzykiwania odczynników do roztworu ablacyjnego na bazie etanolu do mysiego drzewa sutkowego do obrazowania in vivo i zapobiegania rakowi piersi. Wstrzyknięcie bezpośrednio do otworu brodawki sutkowej pozwala na celowanie w komórki nabłonka sutka przy minimalnym uszkodzeniu tkanek ubocznych.

Dostarczanie wewnątrzprzewodowe i wizualizacja rentgenowska roztworu ablacyjnego na bazie etanolu w profilaktyce i leczeniu miejscowym raka piersi w modelach mysich

Obecny protokół opisuje doprzewodową iniekcję wektorów wirusowych przez smoczek w celu dostarczenia interesujących genów do komórek nabłonka sutka.

In vivo (in vivo) Dostarczanie genów do komórek nabłonka sutka myszy poprzez wstrzyknięcie doprzewodowe sutka

Poznaj metodę inicjacji nowotworu piersi u myszy za pomocą adenowirus-Cre w kanale gruczołowym. Model umożliwia badanie przerzutów przy zachowanym układzie odpornościowym i śledzenie komórek nowotworowych.

Inicjacja przerzutowego raka piersi poprzez celowanie w nabłonek przewodowy za pomocą Adenovirus-Cre: nowy transgeniczny mysi model raka piersi (Wideo) | JoVE Journal

Inicjacja przerzutowego raka piersi poprzez celowanie w nabłonek przewodowy za pomocą Adenovirus-Cre: nowy transgeniczny mysi model raka piersi

Przeglądaj więcej filmów