Inicjacja przerzutowego raka piersi poprzez celowanie w nabłonek przewodowy za pomocą Adenovirus-Cre: nowy transgeniczny mysi model raka piersi

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest opracowanie mysiego modelu raka piersi, który ostatecznie daje przerzuty w obecności zdrowego układu odpornościowego. Osiąga się to najpierw poprzez podanie adenowirusa wyrażającego ekspresję Cree do kanału przewodowego sutka zwierząt doświadczalnych. Gruczoł sutkowy jest następnie regularnie badany palpacyjnie w celu monitorowania postępu guza.

Ostatecznie przerzuty guza i naciek leukocytów do pachowego węzła chłonnego można ocenić za pomocą analizy cytometrii przepływowej. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi modelami guzów piersi jest to, że umożliwia precyzyjną inicjację guzów, które mogą rozwijać się w obecności dojrzałego układu odpornościowego i które można śledzić za pomocą ekspresji YFP. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy wprowadzające do iniekcji są trudne do nauczenia.

Prawidłowe umieszczenie igły wymaga precyzji i wprawy. W dniu eksperymentu przechowuj Eloqua składającą się z czterech razy 10 ósmych jednostek tworzących płytkę adenowirusa Cree na suchym lodzie, rozmrozić wirusa o ustalonej temperaturze pokojowej i wymieszać go z wystarczającą ilością 3% sacharozy w sterylnej wodzie, aby uzyskać ostateczną objętość do 10 mikrolitrów. Następnie delikatnie wymieszaj 34 mikrolitry memu i cztery mikrolitry świeżo przygotowanego chlorku wapnia z wirusem i inkubuj roztwór w temperaturze pokojowej.

Po 15 do 20 minutach podłoże stanie się mętne, co wskazuje na tworzenie się osadów adenowirusa. Delikatnie przesuń rurkę, aby upewnić się, że cząsteczki wirusa są równomiernie rozmieszczone w zawiesinie, a następnie, aby wstrzyknąć cząsteczki wirusa, wciągnij trzy mikrolitry wirusa do strzykawki o pojemności 10 mikrolitrów. Następnie umieść znieczuloną mysz na grzbiecie na oświetlonym stoliku czystego mikroskopu preparacyjnego.

Oświetl brzuch dodatkowym źródłem światła i zlokalizuj lewą czwartą lub prawą dziewiątą pachwinową gruczoł sutkowy za małymi białymi plamami futra otaczającymi każdy sutek. Teraz delikatnie przetrzyj sutek sterylnym aplikatorem nasączonym etanolem z bawełnianą końcówką. Następnie zabezpiecz sutek cienkimi kleszczami chirurgicznymi i podciągnij z lekką siłą.

Aby usunąć korek keratynowy, ustabilizuj sutek między kleszczami i delikatnie włóż igłę między końcówki. Kaniulując kanał kanałowy pod kątem 90 stopni, aby zapewnić odpowiednią głębokość wstrzyknięcia, delikatnie pociągnij igłę do góry po włożeniu jej do światła kanału, ciągnąc sutek do góry wzdłuż krawędzi igły podczas jej ciągnięcia. Po odpowiednim umieszczeniu igły należy delikatnie zanurzyć całą zawartość strzykawki.

Smoczek powinien się lekko napompować podczas dodawania płynu. Po wstrzyknięciu umieść mysz z powrotem na poduszce grzewczej, aż zacznie dochodzić do siebie po znieczuleniu. Następnie umieść zwierzę z powrotem w czystej klatce i monitoruj je, aż zaobserwuje się pełne wyzdrowienie.

Wykonaj badanie palpacyjne wstrzykniętego gruczołu pamięciowego w 30 dniu w celu oceny powiększenia i obrzęku gruczołu. Monitoruj postęp guza co pięć do siedmiu dni. Po zaobserwowaniu obrzęku i powiększenia gruczołu sutkowego należy mierzyć objętość guza co trzy do czterech dni pod kątem kinetyki wzrostu guza.

Gdy pojawią się wyczuwalne palpacyjnie guzy, skuteczne celowanie w drzewo przewodowe sutka można uwidocznić, przygotowując całe wierzchy gruczołu sutkowego po wstrzyknięciu tripu i niebieskiego w celu sprawdzenia prawidłowego wstrzyknięcia lub po wstrzyknięciu adenowirusa z ekspresją wiśni M w celu sprawdzenia prawidłowego przygotowania wirusa i infekcji ciągliwych komórek nabłonka. Kiedy guzy są indukowane u transgenicznych myszy F Fluxed P 53 LSLK RAs, początkowe guzy nie staną się widoczne aż do około 40 dnia, kiedy gruczoły sutkowe staną się powiększone i spuchnięte. Począwszy od około 56 dnia, guzy zaczną rosnąć wykładniczo.

W tym momencie bardzo ważne jest, aby mierzyć objętość guza co trzy dni. Jeśli pożądane są badania kinetyczne, ponieważ będzie normalna zmienność progresji guza między myszami, duże masy brzuszne będą widoczne do 80 dnia, po czym myszy powinny zostać poddane eutanazji, jeśli guzy przekraczają więcej niż 10% masy ciała zwierzęcia. Analiza CDNA trzech linii komórkowych pochodzących z guzów piersi w transgenicznych myszach transgenicznych Stream P 53 LSL KRAS wykazała, że guzy wyrażają mezotelinę cytokeratynę osiem, HER dwie nowe i receptor estrogenowy alfa, podobne do mikrośrodowiska komórkowego w ludzkim raku piersi infiltracja limfocytów T alfa, beta i gamma delta, a także komórek supresorowych pochodzenia szpikowego i makrofagów do guzów.

Naczynia krwionośne odprowadzające się do pachowego węzła chłonnego zaczną puchnąć, zanim guzy urosną i ostatecznie obejmą całą tkankę pamięci, w której wykonano wstrzyknięcie. Widoczny będzie również obrzęk powierzchownej żyły nadbrzusza między pachwinowymi i pachowymi węzłami chłonnymi. Po siedmiu do ośmiu tygodniach pachowy węzeł chłonny ulegnie powiększeniu z powodu inwazji limfaczno-naczyniowej komórek nowotworowych.

Inwazję naczyń limfatycznych i przerzuty komórek nowotworowych można śledzić, krzyżując transgeniczne myszy Flocked P 53 LSLK RA z myszami L-S-L-E-Y-F-P. Po wycięciu w guzie wykrywa się komórki wyrażające zarówno wysoki, jak i niski poziom YFP, a ich przerzuty można prześledzić do drenującego węzła chłonnego pachowego. Po opanowaniu technika ta może być wykonana na eksperymentalnej kohorcie 20 myszy w ciągu dwóch do trzech godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Po tej procedurze można opracować inne modele nowotworów poprzez hodowlę myszy z dodatkowymi blokadami, transgenami p, aby odpowiedzieć na pytania, takie jak, w jaki sposób różne onkogeny wpływają na patologię, mikrośrodowisko immunologiczne i inwazję przerzutową raka piersi.