Wizualizacja dynamiki granulek naprężeń G3BP w żywych komórkach pierwotnych

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zbadanie dynamiki granulek rybonukleoprotein w komórkach pierwotnych, a zwłaszcza tworzenia granulek stresu. Osiąga się to poprzez pierwszą hodowlę komórek, takich jak mysie, embrionalne, fibroblasty lub neurony hipokampa od zwierząt będących przedmiotem zainteresowania. W drugim kroku transfekowany składnik granulek naprężeniowych jest transfekowany, aby umożliwić ich wizualizację.

Następnie komórki są indukowane stresem i monitorowane za pomocą poklatkowej mikroskopii konfokalnej. Uzyskane wyniki pokazują dynamikę G 3 BP zawierającego granulki stresu w mitach lub neuronach lustrzanych i hipokampowych na podstawie ich bezpośredniej wizualizacji. Metody te mogą pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące reakcji na stres w komórkach takich jak neurony.

Na przykład u myszy stwierdzono wyciszenie RNA, zakaz stosowania białek niezbędnych do tworzenia granulek stresu, defekty neuronalne. Tak więc ta metoda może pomóc w zrozumieniu mechanizmów stojących za tymi obserwacjami. Po eutanazji ciężarnej myszy E 13,5 należy zdezynfekować mysz 90% etanolem i usunąć rogi macicy pod sterylnym kapturem.

Przenieś rogi do 37 stopni Celsjusza DPBS i usuń zarodki. Przenieś zarodki do 100-milimetrowej naczynia. Usuń nadmiar chusteczek i zmyj je ciepłym DPBS.

Teraz pod mikroskopem usuń kończyny, narządy wewnętrzne i górną część głowy zawierającą mózg. Sekcje ogona lub głowy mogą być używane do genotypowania. Pozostałe tkanki zmielić w osobnym naczyniu przez co najmniej minutę.

Nie należy łączyć genotypów, jeśli różnią się one w obrębie miotu. Przykryj tkankę mieloną jednym x trypsyną EDTA i inkubuj przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie dodaj 10 mililitrów kompletnego podłoża mes.

Aby zatrzymać reakcję, poluzuj tkankę pipetą i przenieś powstałą zawiesinę do 50-mililitrowej probówki. Uzupełnij tubę pożywką i pozwól, aby zawartość opadła. Następnie zdekantować zawieszone komórki.

Następnie obracaj zawieszenie z prędkością 300 G przez pięć minut. W temperaturze pokojowej ponownie zawiesić osad w sześciu mililitrach kompletnej pożywki na zarodek. Liczba żywotnych komórek jądrzastych powinna wynosić około 5 milionów na zarodek.

Następnie załaduj 60-milimetrowe płytki trzema mililitrami zawiesiny komórkowej i hodowli. Je. Zmień pożywkę następnego dnia i pozwól komórkom rosnąć do płynności. Kiedy komórki są hodowane pod hodowlą, przetrwają tylko fibroblasty.

Podziel zlewające się płytki na 35-milimetrowe szkło. Naczynia dolne. Zwiększ płynność tych potraw do poziomu od 50 do 70% i kontynuuj transfekcję.

Na każdą 35-milimetrową szalkę należy pobrać trzy mikrogramy oczyszczonego plazmidu do transfekcji. Wystarczy użyć dostępnego w handlu zestawu do transfekcji. W tym przykładzie wektor wyrażający przerwę RAs.

Białko wiążące trzy domeny SSH jest transfekowane. Jest ważnym składnikiem granulatu stresowego. Procedura ta ma oczywiście zastosowanie do badania dowolnego interesującego wektora w fibroblastach na dzień przed zbiorem młodych.

Przygotowanie potraw pokrytych lizyną Pauline rozpoczyna się od zebrania zarodków od 18,5 matek DPC i przeniesienia ich do HBSS w dużym naczyniu. W razie potrzeby nowonarodzone młode można zastąpić, aby zapobiec poświęceniu matki. Odetnij głowę i usuń mózg.

Następnie zbierz mózgi szczeniaka do czystego naczynia z HBSS pod mikroskopem. Usuń wszystkie opony mózgowe za pomocą drobnych kleszczy. Następnie oddziel pożądane części mózgu, takie jak hippo campi.

Przenieś chusteczki do 4,5 mililitra zimnego HPSS w 15-mililitrowych probówkach i trzymaj je na lodzie. Trawić tkanki, dodając 0,5 mililitra 2,5% roztworu trypsyny. Inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 do 20 minut.

Następnie wypłucz trypsynę trzema płukaniami HBSS, uważając, aby nie stracić żadnej tkanki. Teraz ponownie zawieś tkanki w jednej połowie do jednego mililitra DMM z 10% FBS. Następnie homogenizuj tkankę, przepuszczając ją przez pipetę.

Następnie przełącz się na końcówkę o pojemności 200 mikrolitrów i pipetuj roztwór, aż nie będzie widocznych zagięć. Następnie dodaj od 100 do 200 mikrolitrów zawiesiny komórek do 35 milimetrowej szklanki Naczynia dolne przygotowane na pożywce DMM FBS inkubują naczynia. Po trzech godzinach hodowli zastąp pożywkę wstępnie ogrzaną kompletną pożywką neuronową na pozostały czas hodowli.

Po pięciu do 14 dniach w hodowli przenieś neurony za pomocą metody fosforanu wapnia. 24 godziny po udanej transfekcji granulki stresu zaczną się gromadzić z powodu nadmiernej ekspresji G trzy BP. Dodatkowe naprężenia dodatkowo wywołają składanie granulek naprężeń, podgrzej elementy mikroskopu konfokalnego przez co najmniej 20 minut, w tym podgrzej stolik do 37 stopni Celsjusza.

Tuż przed wizualizacją komórek wymagany jest 35-milimetrowy uchwyt na płytkę. Wykonaj następujące czynności. Najpierw zastąp dowolną pożywkę komórkową zawierającą czerwień fenolową na pożywkę bez czerwieni fenolowej.

Natychmiast rozpocznij obrazowanie komórek. Granulki stresu utworzą się w mniej niż godzinę, więc stres zostanie wywołany po wizualizacji komórek. Ważne jest, aby rozpocząć akwizycję tak szybko, jak to możliwe po indukcji stresu i precyzyjnie dostosować dwa parametry w zależności od typu komórki i typu białka.

Intensywność lasera i czas trwania akwizycji są niższe niż oba w celu zmniejszenia cytotoksyczności. Następnie wyświetl komórki za pomocą obiektywu zanurzeniowego z olejkiem 40x i 63x. Upewnij się, że płytka jest płaska w uchwycie i używaj światła fluorescencyjnego w minimalnym stopniu.

Po zlokalizowaniu interesującego Cię pola użyj oprogramowania, aby uzyskać obrazy. Zacznij od mocy lasera na poziomie 10% lub mniej, a następnie ustaw wzmocnienie i przesunięcie, aby uzyskać najlepszy możliwy stosunek sygnału do szumu. Skanuj z częstotliwością 1000 herców, aby zminimalizować narażenie komórek na stos chorób ustawionych laserowo zgodnie z potrzebami i utrzymuj odstęp między skanowaniem tak długo, jak to możliwe, aby lepiej utrzymać zdrowie kultury.

Zbieraj dane tak długo, jak to konieczne, granulki MEF tworzą się w ciągu 10 minut i są wyraźnie widoczne w ciągu godziny. W neuronach proces ten jest nieco wolniejszy. G trzy BP powinno zapewniać odpowiednio silny sygnał przez co najmniej 45 minut przy użyciu opisanych technik.

Monitorowano tworzenie się granulek stresowych w hodowanych komórkach. Lokalizacja białka znakowanego G 3 BP była rozproszona w mitach hodowanych w cytoplazmie, a także dyfundowana w cytoplazmie neuronów. Po leczeniu arsonitem białka wyraźnie lokalizują się w określonych i większych ogniskach w obu typach komórek.

To są granulki stresu. Wykonane zdjęcia można zrekonstruować w film poklatkowy. Pierwszy i drugi film pokazują fibroblasty reagujące na stres.

Trzeci film pokazuje to samo. W neuronie hipokampa rekonstrukcje Zacka oferują lokalizację 3D oznaczonego G trzy B bp, a tym samym inną perspektywę śledzenia. Po tej procedurze można zastosować chemię immunocytochemiczną do wizualizacji składników granulek po różnego rodzaju stresie i po samoutrwaleniu.

Może to odpowiedzieć na pytania ilościowe dotyczące wielkości i liczby różnych ciał komórkowych w różnych warunkach.