Name: Wizualizacja dynamiki granulek naprężeń G3BP w żywych komórkach pierwotnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Poznaj dynamikę granulek naprężeń G3BP w żywych komórkach pierwotnych myszy, w tym fibroblastach zarodkowych i neuronach hipokampalnych. Ta metoda obrazowania konfokalnego ujawnia zachowanie ziaren stresowych w odpowiedzi na stres komórkowy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować platformie Montpellier Rio Imaging (MRI), na której dokonano przejęć. Dziękują Isabel Cristinie Lopez Mejia, Alexandrze Metz, Irinie Lassot, Solange Desagher, Fabienowi Loustalotowi i Virginie Georget za ich pomoc w różnych częściach protokołu. Prace te były wspierane przez Fondation pour la Recherche Médicale (FRM) (Equipe FRM 2011 -n°DEQ20111223745).

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt w tym protokole są ściśle zgodne z wytycznymi Dyrektywy Rady Wspólnoty Europejskiej z dnia 24 listopada 1986 r. (86-609/EWG). Trzymaj myszy w grupie, pozwalając na jedzenie i wodę ad libitum. Utrzymuj je w kontrolowanym środowisku (22 ±1 °C, 55 ±5% wilgotności) z cyklem 12 godzin: 12 godzin światło: ciemność (światło włączone o 7:00).
1. Hodowla mysich komórek pierwotnych: mysie fibroblasty embrionalne (MEF)
<ol>
	<li>Cienkie kleszcze do autoklawu, a także zakrzywione kleszcze i nożyczki preparacyjne. Przechowywać w sterylnym pojemniku. Użyj sterylnego D-PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco). Przygotuj kompletną pożywkę MEF: zmodyfikowaną pożywkę Eagle (DMEM)/F12 firmy Dulbecco uzupełnioną 10% płodową surowicą cielęcą (FBS), 1 mM L-glutaminy, 1 mM pirogronianu sodu, 1% aminokwasów endogennych i 0,5 mM 2-merkaptoetanolu i podgrzaną w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Eutanazja ciężarnej myszy (13,5 dnia po stosunku płciowym (dpc)) przez zwichnięcie szyjki macicy. Usuń rogi macicy myszy zdezynfekowane 90% EtOH. Pod sterylnym i czystym kapturem umieścić rogi wraz z zarodkami w podgrzanym D-PBS w temperaturze 37 °C. Otwórz rogi, umieść zarodki na sterylnej plastikowej szalce Petriego o średnicy 100 mm, oczyść je z materiału pępowinowego i umyj ciepłym D-PBS, aby usunąć nadmiar krwi. Pod lornetką usuń kończyny zarodka, narządy wewnętrzne i górną część głowy, w której znajduje się mózg.</li>
	<li>Na nowej szalce Petriego zmiel zarodki na bardzo małe kawałki za pomocą sterylnego ostrza chirurgicznego lub nożyczek (przynajmniej przez 1 minutę). W przypadku zarodków o różnych genotypach należy uważać, aby umieścić każdy zarodek na osobnych szalkach Petriego i zachować ogon lub górną część głowy do genotypowania.</li>
	<li>Przykryj zarodek 1x trypsyną-EDTA (0,25% trypsyny, 1 mM EDTA) . Inkubować przez 30 minut do 1 godziny w inkubatorze o temperaturze 37 °C. Dodać 10 ml kompletnej pożywki MEF, aby zatrzymać reakcję trypsyny. Pigazować w górę i w dół, aby usunąć wszystkie kruszywa. Pozostawić zawiesinę komórek w probówce o pojemności 50 ml (wypełnionej kompletną pożywką) na 10 minut i odwirować supernatant przez 5 minut przy 300 x g w temperaturze pokojowej. Zawiesić osad w kompletnym podłożu (6 ml na 1 zarodek). Żywotne komórki jądrzaste można policzyć za pomocą błękitu trypanowego (około 5 x 106 komórek można się spodziewać z jednego zarodka). Płytka 3 ml na szalkę Petriego o średnicy 60 mm.</li>
	<li>Zmień pożywkę następnego dnia i pozwól komórkom rosnąć, aż naczynia zaczną się zlewać. Można zaobserwować wiele typów komórek, ale tylko fibroblasty przetrwają subkulturę. </li>
	<li>Podziel komórki i pozwól im rosnąć w 35-milimetrowych szalkach ze szklanym dnem (ważne w eksperymencie poklatkowym), aż do 50-70% zbiegu do transfekcji. Test na obecność Mykoplazmy i patogenów myszy. </li>
</ol>
2. Adaptacje kulturowe w przypadku neuronów
<ol>
	<li>Dzień przed hodowlą pokryj szalki Petriego o średnicy 35 mm ze szklanym dnem poli-L-lizyną (200 μl 0,1 mg/ml) pod sterylnym i czystym kapturem i pozostaw na noc.</li>
	<li>Następnego ranka spłukać sterylną, czystą wodą, dwa razy przez 5 minut i raz przez 45 minut do 1 godziny. Zastąp 2 ml DMEM plus 10% pożywki FBS i trzymaj w inkubatorze o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Wypreparuj zarodki z prędkością 18,5 dpc. Pod sterylnym i czystym kapturem umieść rogi wraz z zarodkami w zimnym sterylnym HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) na 100 mm szalce Petriego. Nowonarodzone młode mogą być również wykorzystywane zamiast zarodków w celu zachowania życia matki i umożliwienia jej wydania większej liczby potomstwa, szczególnie w przypadku zwierząt transgenicznych, które mogą być trudne do uzyskania. Na poszczególnych szalkach Petriego weź każdy zarodek lub noworodka i odetnij głowę nożyczkami. Przytrzymaj głowę, wkładając zakrzywione kleszcze do oczu, przetnij skórę i ostrożnie otwórz miękką czaszkę od tyłu głowy aż do oczu, po obu stronach głowy. Przetnij nerwy wzrokowe i pień mózgu, usuń mózg i umieść go na nowej szalce Petriego zawierającej HBSS. Pod stereoskopem usuń wszystkie opony mózgowe za pomocą dwóch cienkich kleszczy. Oddziel hipokampy, korę lub jakąkolwiek inną część mózgu w zależności od struktury, którą chcesz badać.</li>
	<li>Wypreparowaną strukturę mózgu zanurzyć w 4,5 ml zimnego HBSS przygotowanego wcześniej w probówkach o pojemności 15 ml i trzymać na lodzie do czasu trawienia trypsyną. Dodać 0,5 ml 2,5% trypsyny i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut do 20 minut. Wypłucz trypsynę 3x HBSS, bardzo uważając, aby nie wyrzucić strawionych części mózgu.</li>
	<li>Zawiesić ponownie w 500 μl (hipokamp) do 1 ml (kora) DMEM plus 10% FBS i kilkakrotnie pipetować w górę i w dół za pomocą mikropipety o pojemności 1 ml wyposażonej w końcówkę o pojemności 1 ml, a następnie wyposażonej w końcówki o pojemności 1 ml plus 200 μl, aż do momentu, gdy nie będzie widocznego agregatu.</li>
	<li>Rozprowadzić 100-200 μl zawiesiny komórek do każdego naczynia o szklanym dnie o średnicy 35 mm zawierającego DMEM plus 10% FBS i pozwolić neuronom przylegać w temperaturze 37 °C przez co najmniej 3 godziny. Zastąp wstępnie podgrzaną kompletną pożywką neuronową (pożywka neuropodstawowa uzupełniona 250 μM L-glutaminą i NS21, przygotowana zgodnie z opisem w Chen i wsp.19) i pozostawić w temperaturze 37 °C, aby umożliwić wzrost neuronów. Transfekcja neuronów po 5 do 14 dniach in vitro (div) (skuteczność transfekcji jest wyższa po kilku div, ale połączenia synaptyczne są lepiej ustalone od 7-10 div).</li>
</ol>
3. Transfekcja konstrukcji EGFP-G3BP1
Transfekuj komórki wektorem zawierającym cDNA interesującego Cię białka (dowolny składnik SGs) połączonego z markerem fluorescencyjnym (GFP, YFP, itp.), używając 3 μg oczyszczonego plazmidu na szalkę 35 mm.
<ol>
	<li>Transfekcję MEF należy przeprowadzić metodą komercyjną, zgodnie z protokołem producenta (patrz Tabela materiałów/odczynników).</li>
	<li>Transfekcja neuronów za pomocą metody fosforanu wapnia zaadaptowanej z Xia i wsp.20 W skrócie:
	<ol>
		<li>Przygotować roztwory: DMEM-wash: DMEM zawierający 25 mM KCl; roztwór transfekcji: DMEM-wash zawierający 1x DMKY (HEPES 5 mM, MgCl2 10 mM, czerwień fenolowa); i roztwór szokowy: HeBS 1x, DMKY 1x i DMSO 2% (v/v); i utrzymywać je w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Usunąć pożywkę z neuronów, przesączyć i utrzymać w temperaturze 37 °C. Przemyć DMEM-wash, a następnie zastąpić pożywką transfekcyjną i utrzymywać w temperaturze 37 °C podczas przygotowywania osadów DNA z fosforanu wapnia i plazmidu.</li>
		<li>W probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml dodać (w tej kolejności) wodę Brauna (końcowa objętość 50 μl), 5 μl CaCl2 2,5 M i 3 μg plazmidowego DNA. Wrzuć tę mieszaninę na 50 μl HeBS 2x już wprowadzonego w rurkę polipropylenową z okrągłym dnem. Wymieszaj probówkę obracając się wraz z upuszczeniem. Pozwól osadowi uformować się w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
		<li>Osad należy dodawać kroplami na neurony i pozostawić w temperaturze 37 °C na 30 do 50 minut.</li>
		<li>Zastąp roztworem szokowym na 1 minutę, następnie spłucz DMEM-wash i na koniec ponownie wprowadź wstępnie przygotowane medium. Utrzymuj komórki w temperaturze 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Wizualizacja G3BP zawierająca montaż i dynamikę SG
<ol>
	<li>Zastąp pożywkę komórek, która zawiera czerwień fenolową, pożywką wolną od czerwieni fenolowej.</li>
	<li>Do akwizycji należy użyć mikroskopu konfokalnego wyposażonego we fluorescencję. Włącz systemy mikroskopowe: lampę rtęciową, komputer i lasery. Rozgrzać komorę do temperatury 37 °C co najmniej 20 minut przed rozpoczęciem akwizycji.</li>
	<li>Nadekspresja G3BP indukuje spontaniczne tworzenie się typu SG. W ten sposób można obserwować montaż SG przez 24 godziny bezpośrednio po transfekcji bez indukcji naprężeń. Alternatywnie można indukować naprężenie, aby dalej indukować składanie SG. Dodać 0,5 mM arsenianu sodu i rozpocząć akwizycję zaraz po dodaniu związku (granulki będą dobrze uformowane w ciągu 1 godziny).</li>
	<li>Dodaj olej do obiektywu zanurzeniowego (użyj obiektywów 40X lub 63X) i zainstaluj szalkę Petriego nad obiektywem w przystosowanym uchwycie mikroskopu 35 mm, ustabilizowanym na uchwycie stolika. Sprawdź, czy naczynie jest płaskie, w przeciwnym razie nabytki zostaną zmienione. Włącz światło fluorescencyjne zgodnie z odpowiednim fluoroforem i wizualizuj transfekowane komórki. Wyłącz fluorescencję, gdy komórka będąca przedmiotem zainteresowania znajdzie się w terenie, aby zminimalizować bielenie i cytotoksyczność.</li>
	<li>W zakładce "akwizycja" wybierz lasery w zależności od długości fali wzbudzenia znacznika fluoroforu (488 nm w naszym protokole, który wykorzystuje G3BP oznaczonego EGFP) i wybierz dostosowaną długość emisji dla PMT (lampy fotopowielacza). Dostosuj moc lasera (zwykle nie więcej niż 10%), aby zminimalizować szum i przesycenie, a także toksyczność, a także ustaw wzmocnienie i przesunięcie, aby zmodyfikować stosunek sygnału do szumu. Szybkie skanowanie (1 000 Hz) w celu zminimalizowania czasu ekspozycji lasera (średnia linii 2, średnia klatki 1). W razie potrzeby ustaw parametry stosu Z, aby móc zrekonstruować obraz w 3D (krok Z wynoszący 1 μm jest zwykle odpowiedni w przypadku komórek). Określ odstęp czasu między każdą akwizycją: mniejsze interwały pozwalają uzyskać bardziej spójny film, ale może to wywołać fotowybielanie i toksyczność (w opisywanych eksperymentach zastosowano interwał 20 sekund). Czas trwania całkowitej akwizycji może się różnić w zależności od rodzaju stresu. Wiele SG zawierających G3BP powstaje bardzo szybko podczas obróbki arsenianem i jest dobrze widocznych po 1 godzinie leczenia: w takim przypadku należy szybko wybrać komórki do filmu i rozpocząć akwizycję zaraz po stresie, przy czym całkowity czas trwania akwizycji wynosi 15-20 minut, w dużej mierze wystarczający do zaobserwowania składania się kilku SG.</li>
	<li>Zapisz zdjęcia i zrekonstruuj stosy i film za pomocą oprogramowania ImageJ.</li>
</ol>

<ol><li>Thomas, M. G., Loschi, M., Desbats, M. A., Boccaccio, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+granules%3A+The+good%2C+the+bad+and+the+ugly%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Signalling%22%5BJournal%5D)">RNA granules: The good, the bad and the ugly.</a> Cellular Signalling. 23 (2), 324-334 (2011).</li>
<li>Kedersha, N., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+granules%3A+sites+of+mRNA+triage+that+regulate+mRNA+stability+and+translatability%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+transactions%22%5BJournal%5D)">Stress granules: sites of mRNA triage that regulate mRNA stability and translatability.</a> Biochemical Society transactions. 30 (6), 963-969 (2002).</li>
<li>Anderson, P., Kedersha, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+granules%3A+the+Tao+of+RNA+triage%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Stress granules: the Tao of RNA triage.</a> Trends in Biochemical Sciences. 33 (3), 141-150 (2008).</li>
<li>Gilks, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+granule+assembly+is+mediated+by+prion-like+aggregation+of+TIA-1%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Stress granule assembly is mediated by prion-like aggregation of TIA-1.</a> Molecular biology of the cell. 15 (12), 5383-5398 (2004).</li>
<li>Tourrière, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RasGAP-associated+endoribonuclease+G3BP+assembles+stress+granules%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The RasGAP-associated endoribonuclease G3BP assembles stress granules.</a> The Journal of Cell Biology. 160 (6), 823-831 (2003).</li>
<li>Parker, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Ras-GTPase-activating+protein+SH3-domain-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">A Ras-GTPase-activating protein SH3-domain-binding protein.</a> Molecular and Cellular Biology. 16 (6), 2561-2569 (1996).</li>
<li>Annibaldi, A., Dousse, A., Martin, S., Tazi, J., Widmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+G3BP1+as+a+RasGAP+binding+protein%3A+sensitization+of+tumor+cells+to+chemotherapy+by+the+RasGAP+317-326+sequence+does+not+involve+G3BP1%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Revisiting G3BP1 as a RasGAP binding protein: sensitization of tumor cells to chemotherapy by the RasGAP 317-326 sequence does not involve G3BP1.</a> PLOS ONE. 6 (12), (2011).</li>
<li>Kennedy, D., French, J., Guitard, E., Ru, K., Tocque, B., Mattick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+G3BPs%3A+tissue+specific+expression%2C+chromosomal+localisation+and+rasGAP%28120%29+binding+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of G3BPs: tissue specific expression, chromosomal localisation and rasGAP(120) binding studies.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 84 (1), 173-187 (2001).</li>
<li>Kobayashi, T., Winslow, S., Sunesson, L., Hellman, U., Larsson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKC%CE%B1+Binds+G3BP2+and+Regulates+Stress+Granule+Formation+Following+Cellular+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">PKCα Binds G3BP2 and Regulates Stress Granule Formation Following Cellular Stress.</a> PLOS ONE. 7 (4), (2012).</li>
<li>Tourrière, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RasGAP-associated+endoribonuclease+G3Bp%3A+selective+RNA+degradation+and+phosphorylation-dependent+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">RasGAP-associated endoribonuclease G3Bp: selective RNA degradation and phosphorylation-dependent localization.</a> Molecular and Cellular Biology. 21 (22), 7747-7760 (2001).</li>
<li>Costa, M., Ochem, A., Staub, A., Falaschi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+DNA+helicase+VIII%3A+a+DNA+and+RNA+helicase+corresponding+to+the+G3BP+protein%2C+an+element+of+the+ras+transduction+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Human DNA helicase VIII: a DNA and RNA helicase corresponding to the G3BP protein, an element of the ras transduction pathway.</a> Nucleic acids research. 27 (3), 817-821 (1999).</li>
<li>Solomon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+structural+features+of+caprin-1+mediate+its+interaction+with+G3BP-1+and+its+induction+of+phosphorylation+of+eukaryotic+translation+initiation+factor+2alpha%2C+entry+to+cytoplasmic+stress+granules%2C+and+selective+interaction+with+a+subset+of+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Distinct structural features of caprin-1 mediate its interaction with G3BP-1 and its induction of phosphorylation of eukaryotic translation initiation factor 2alpha, entry to cytoplasmic stress granules, and selective interaction with a subset of mRNAs.</a> Molecular and Cellular Biology. 27 (6), 2324-2342 (2007).</li>
<li>Soncini, C., Berdo, I., Draetta, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ras-GAP+SH3+domain+binding+protein+%28G3BP%29+is+a+modulator+of+USP10%2C+a+novel+human+ubiquitin+specific+protease%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Ras-GAP SH3 domain binding protein (G3BP) is a modulator of USP10, a novel human ubiquitin specific protease.</a> Oncogene. 20 (29), 3869-3879 (2001).</li>
<li>Zekri, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+fetal+growth+and+neonatal+survival+by+the+RasGAP-associated+endoribonuclease+G3BP%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Control of fetal growth and neonatal survival by the RasGAP-associated endoribonuclease G3BP.</a> Molecular and Cellular Biology. 25 (19), 8703-8716 (2005).</li>
<li>Martin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiency+of+G3BP1%2C+the+stress+granules+assembly+factor%2C+results+in+abnormal+synaptic+plasticity+and+calcium+homeostasis+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Deficiency of G3BP1, the stress granules assembly factor, results in abnormal synaptic plasticity and calcium homeostasis in neurons.</a> Journal of neurochemistry. , (2013).</li>
<li>Mazroui, R., Huot, M. -E., Tremblay, S., Filion, C., Labelle, Y., Khandjian, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trapping+of+messenger+RNA+by+Fragile+X+Mental+Retardation+protein+into+cytoplasmic+granules+induces+translation+repression%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">Trapping of messenger RNA by Fragile X Mental Retardation protein into cytoplasmic granules induces translation repression.</a> Human molecular genetics. 11 (24), 3007-3017 (2002).</li>
<li>Colombrita, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP-43+is+recruited+to+stress+granules+in+conditions+of+oxidative+insult%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurochemistry%22%5BJournal%5D)">TDP-43 is recruited to stress granules in conditions of oxidative insult.</a> Journal of neurochemistry. 111 (4), 1051-1061 (2009).</li>
<li>Thomas, M. G., Tosar, L. J. M., Desbats, M. A., Leishman, C. C., Boccaccio, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+Staufen+1+is+recruited+to+stress+granules+and+impairs+their+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mammalian Staufen 1 is recruited to stress granules and impairs their assembly.</a> Journal of Cell Science. 122 (4), 563-573 (2009).</li>
<li>Chen, Y., Stevens, B., Chang, J., Milbrandt, J., Barres, B. A., Hell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NS21%3A+re-defined+and+modified+supplement+B27+for+neuronal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">NS21: re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures.</a> Journal of neuroscience. 171 (2), 239-247 (2008).</li>
<li>Xia, Z., Dudek, H., Miranti, C. K., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Influx+via+the+NMDA+Receptor+Induces+Immediate+Early+Gene+Transcription+by+a+MAP+Kinase%2FERK-Dependent+Mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Calcium Influx via the NMDA Receptor Induces Immediate Early Gene Transcription by a MAP Kinase/ERK-Dependent Mechanism.</a> The Journal of Neuroscience. 16 (17), 5425-5436 (1996).</li>
<li>Dudek, H., Ghosh, A., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+phosphate+transfection+of+DNA+into+neurons+in+primary+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Calcium phosphate transfection of DNA into neurons in primary culture.</a> Current protocols in neuroscience. 3, (2001).</li>
<li>Reineke, L. C., Dougherty, J. D., Pierre, P., Lloyd, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+G3BP-induced+granules+trigger+eIF2%CE%B1+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Large G3BP-induced granules trigger eIF2α phosphorylation.</a> Molecular biology of the cell. 23 (18), (2012).</li>
<li>Kedersha, N., Tisdale, S., Hickman, T., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+and+quantitative+imaging+of+mammalian+stress+granules+and+processing+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Real-time and quantitative imaging of mammalian stress granules and processing bodies.</a> Methods in enzymology. 448, 521-552 (2008).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Najbardziej krytyczne etapy protokołu dotyczą transfekcji, a w szczególności akwizycji poklatkowej, które muszą być dokładnie monitorowane w celu obniżenia cytotoksyczności.
Hodowla komórek pierwotnych nie jest trudną częścią, o ile zachowane są sterylne warunki i zachowana jest ostrożność, aby zapobiec uszkodzeniom podczas etapów rozwarstwiania i dysocjacji komórek. MEF-y mogą być utrzymywane w stanie zamrożonym we wczesnych przejściach. Wykazano, że transfekcja neuronów fosforanem wapnia dzi...

Granulki stresu (SGs) to niebłoniaste ogniska cytoplazmatyczne utworzone jako komórkowa odpowiedź ochronna na stres środowiskowy, taki jak podwyższona temperatura, stres oksydacyjny, niedotlenienie, szok osmotyczny, promieniowanie UV, deprywacja glukozy lub infekcja wirusowa1. Można je indukować chemicznie poprzez leczenie związkami takimi jak arsenian sodu, który wyzwala stres oksydacyjny. SG gromadzą zatrzymane przez translację kompleksy rybonukleoproteiny przekaźnikowej (mRNP)2, sekwestrując mRNA z maszynerii translacyjnej, a ich montaż może być wywołany przez fosforylację eIF2α (eukariotyczny czynnik inicjacji 2 α). SG to dynamiczne struktury, które wymieniają składniki z polisomami i innymi granulkami, takimi jak ciała P. Stanowią one "centrum triażu", w którym mRNA są sortowane i przetwarzane w celu translacji, reinicjacji, degradacji lub pakowania w stabilne niepolisomalne mRNP3. Montaż SG jest szybki, ale jest to proces stopniowy, w którym początkowo powstają liczne małe agregaty, które łączą się w większe granulki. Zastosowanie chemicznych inhibitorów, które rozrywają lub stabilizują mikrotubule, pokazuje, że sieć mikrotubul jest wymagana do dynamiki SG, w tym procesów składania, koalescencji i demontażu.
Dynamiczne składanie SG jest również promowane przez agregację specyficznych białek wiążących RNA (RNA-B), takich jak TIA-1 (wewnętrzny antygen komórek T-1) i TIAR (białko pokrewne TIA-1), które są w stanie dimeryzować i promować rozkład polisomów oraz kierowanie mRNA do SG4. G3BP (białko wiążące domenę RasGAP SH3) to taki RNA-BP, który lokalizuje się w SG, gdy komórki są obciążone arsenitem lub wysoką temperaturą, a nadekspresja defosforylowanego G3BP może indukować montaż SGs5.
G3BP to ewolucyjnie konserwatywny RNA-BP, który początkowo został scharakteryzowany poprzez interakcję z białkiem aktywującym Ras-GTPazę (RasGAP p120 6); ale ta interakcja została niedawno ponownie przeanalizowana7. Rodzina G3BP obejmuje dwóch członków ssaków, G3BP1 (określany jako G3BP) i G3BP2 8. Oba białka kolokalizują się w SG, gdy komórki są poddawane stresowi9. G3BP zawierają N-końcową domenę NTF2, co do której sugeruje się, że wpływa na ich lokalizację i oligomeryzację, po której następują motywy bogate w prolinę (PxxP), a następnie motywy C-końcowe związane z wiązaniem RNA: kanoniczny motyw rozpoznawania RNA (RRM) z konserwatywnymi motywami RNP1 i RNP2, po którym następuje pudełko bogate w argininę i glicynę (RGG). Co ciekawe, analiza różnych części białka poprzez konstruowanie różnych domen połączonych z EGFP wykazała, że domena podobna do NTF2 i domena wiążąca RNA były najefektywniej rekrutowane do SG, co sugeruje znaczenie właściwości dimeryzacji i wiązania RNA w składaniu SG. Różne modele ujawniły różne funkcje białek G3BP in vitro10-13. Zakłócenie G3BP u myszy wykazało znaczenie tego białka we wzroście rozwojowym i przeżyciu14, a także ważną rolę G3BP w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN), charakteryzującym się ataksją i defektami przestrzennej pamięci roboczej15. Niedobór G3BP prowadzi do zmienionej plastyczności neuronów i homeostazy wapnia, ustanawiając bezpośredni związek między powstawaniem SG a chorobami neurodegeneracyjnymi15. Dlatego ważne jest, aby móc badać dynamikę SG w komórkach pierwotnych, takich jak neurony.
Ten protokół zapewnia prosty sposób na obserwację montażu SG zawierających G3BP1 w pierwotnych komórkach poddanych leczeniu arsenitem. Może być używany do badania montażu SG w różnych warunkach, na przykład w różnych rodzajach naprężeń. Może być również dostosowany do innych granulek lub innych składników SG. Rzeczywiście, protokół ten koncentruje się na G3BP1, ale istnieją inne markery granulek stresu, takie jak TIA-1 / R, TTP (tristetraprolin)2, FMRP (białko zespołu upośledzenia umysłowego Fragile X)16, TDP-43 (białko wiążące DNA odpowiedzi transaktywnej 43)17 lub Staufen18. W szczególności białka takie jak TIA-1 / R są, podobnie jak G3BP, zarodkującymi białkami wiążącymi RNA, które mogą indukować składanie SG w przypadku nadekspresji, nawet jeśli różne utworzone SG mogą różnić się funkcją, regulacją i powiązanymi transkryptami. Transfekcja znakowanej fluoroforem wersji któregokolwiek z tych kluczowych składników lub nukleatorów SG może być przeprowadzona w celu zobrazowania określonego montażu i dynamiki SG.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>21331</td><td>Wstępne rozgrzanie przy 37 & stopni; C</td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Gibco</td><td>11360</td><td></td></tr><tr><td>Aminokwasy endogenne</td><td>Gibco</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Gibco</td><td>15096</td><td></td></tr><tr><td>Szklane dno B-35</td><td>Greiner</td><td>627860/627861</td><td>Leczony lub nie (leczony: zwiększa przyczepianie przylegających komórek)</td></tr><tr><td>Poli-L-lizyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>31966</td><td>Rozgrzany przy 37 & stopniach; C</td></tr><tr><td>HeBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51558</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103</td><td>Wstępne rozgrzanie przy 37 & stopniach; C</td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Gibco</td><td>31350</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Biotek</td><td>DU-110-A</td><td>Bardzo cienkie, końcówki 0,1 mm (przydatne do usuwania opon mózgowych)</td></tr><tr><td>Kleszcze zakrzywione</td><td>Biotek</td><td>P-110-BUF</td><td>Bardzo cienkie, końcówki 0,1 mm</td></tr><tr><td>Małe nożyczki</td><td>Biotek</td><td>CM-85-BS</td><td>Może być przydatny do usuwania hipokampa</td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji Polyplus JetPEI&nbsp;</td><td>Transfekcja Ozyme</td><td>101-10</td><td>MEFs, postępuj zgodnie z protokołem do przodu</td></tr><tr><td>Odwrócony laserowy skaningowy mikroskop konfokalny</td><td>Leica</td><td>SP5</td><td></td></tr></tbody></table>

wizualizacja dynamiki granulek naprężeń g3bp w żywych komórkach pierwotnych

Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells

SGs mogą być wizualizowane w komórkach poprzez barwienie immunologiczne określonych składników białkowych lub mRNA poliA+. SG są bardzo dynamiczne, a badanie ich budowy i losu jest ważne dla zrozumienia odpowiedzi komórkowej na stres. Niedobór kluczowych czynników SG, takich jak G3BP (białko wiążące domenę RasGAP SH3), prowadzi do wad rozwojowych u myszy i zmian w ośrodkowym układzie nerwowym. Aby zbadać dynamikę SG w komórkach organizmu, można hodować komórki pierwotne i śledzić lokalizację transfekowanego znakowanego składnika SG. Opisujemy eksperyment poklatkowy w celu zaobserwowania SG zawierających G3BP1 w mysich fibroblastach embrionalnych (MEF). Technika ta może być również wykorzystana do badania SG zawierających G3BP w żywych neuronach, co ma kluczowe znaczenie, ponieważ niedawno wykazano, że te SG powstają na początku chorób neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Alzheimera. Podejście to można dostosować do dowolnego innego składnika białka komórkowego i ziarnistego ciała i przeprowadzić na zwierzętach transgenicznych, umożliwiając badanie dynamiki granulek na żywo na przykład przy braku określonego czynnika tych granulek.

Tworzenie granul stresowych jest istotne w odpowiedzi komórek na stres, umożliwiając adaptację komórkową poprzez zahamowanie translacji do czasu ustąpienia stresu, co wiąże się z zapobieganiem apoptozie. Niniejszy test pozwala na badanie granul stresowych (SGs) w komórkach pierwotnych poprzez śledzenie lokalizacji kluczowych białkowych komponentów SGs (Rysunek 1). G3BP, kluczowy czynnik montażu SGs, występuje w sposób rozproszony w cytoplazmie hodowlanych MEF-ów lub neuronów (Rysunek 2A ...

Granulki stresu (SGs) to granulki cytoplazmatycznego RNA zawierające zatrzymane cząstki rybonukleoproteiny (RNP) i ważne w odpowiedzi komórkowej na różne stresy. Dynamikę SG można śledzić w żywych komórkach, wizualizując lokalizację znakowanego składnika SG w transfekowanych komórkach pierwotnych po stresie.

Wizualizacja dynamiki granulek naprężeń G3BP w żywych komórkach pierwotnych

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest badanie dynamiki granulek rybonukleoproteinowych w komórkach pierwotnych, w szczególności tworzenia się granulek stresowych. Osiąga się to poprzez uprzednie hodowanie komórek, takich jak mysie embrionalne fibroblasty lub neurony hipokampa z wybranych zwierząt. W drugim kroku przeprowadza się transfekcję oznakowanego komponentu granulek stresowych, aby umożliwić ich wizualizację.Następnie komórki są poddawane stresowi, a następnie monitorowane za pomocą konfokalnej mikroskopii poklatkowej. Uzyskane wyniki pokazują dynamikę ziarnulek stresowych zawierających G3BP1 w neuronach mysich lub małp oraz w neuronach hipokampu na podstawie ich bezpośredniej wizualizacji. Metody te mogą pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące reakcji komórek, takich jak neurony, na stres.Na przykład u myszy, w przypadku wyciszenia RNA kodującego białka niezbędne do tworzenia ziarnistości stresowych, stwierdzono defekty neuronalne. Zatem metoda ta może pomóc w zrozumieniu mechanizmów stojących za tymi obserwacjami. Po uśpieniu ciężarnej myszy w dniu E 13.5, zdezynfekuj zwierzę 90% ethanol i usuń rogi macicy pod sterylnym dygestorium.Przenieś rogi do DPBS o

visualization-of-g3bp-stress-granules-dynamics-in-live-primary-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wizualizacja dynamiki granul stresowych G3BP w żywych komórkach pierwotnych

Obrazowanie mikroskopowe żywych komórek śródbłonka wykazujących ekspresję GFP-actin pozwala na charakterystykę dynamicznych zmian w strukturach cytoszkieletu. W przeciwieństwie do technik wykorzystujących utrwalone preparaty, metoda ta umożliwia szczegółową ocenę zmian czasowych w cytoszkielecie aktynowym w tych samych komórkach przed, w trakcie i po różnych bodźcach fizycznych, farmakologicznych lub zapalnych.

Badanie cytoszkieletu aktynowego w żywych komórkach śródbłonka wykazujących ekspresję GFP-aktyny

Ten film demonstruje test do charakteryzowania i ilościowego oznaczania granulek stresu u ssaków, które składają się z mRNA, białek wiążących RNA (RBP) i różnych innych białek.

Test immunofluorescencyjny do charakterystyki i ilościowego oznaczania granulek stresu ssaków

Społeczny ameba Dictyostelium discoideum został niedawno założony jako system do badania nieprawidłowego fałdowania białek i proteostazy. W tym miejscu opisujemy nową metodologię opartą na obrazowaniu do badania agregacji białek wywołanej temperaturą i odpowiedzi na stres komórkowy u D. discoideum.

Badanie systemu kontroli jakości białek D. discoideum przy użyciu obrazowania żywych komórek w kontrolowanej temperaturze

Aby odróżnić podział komórek od zmian cyklu komórkowego w kardiomiocytach, prezentujemy protokoły wykorzystujące dwie transgeniczne linie myszy: myszy transgeniczne Myh6-H2B-mCh, do jednoznacznej identyfikacji jąder kardiomiocytów, oraz myszy CAG-eGFP-anilin, do odróżniania podziału komórek od zmian cyklu komórkowego.

Wizualizacja zmian cyklu komórkowego i oznaczanie zarodkowania w kardiomiocytach postnatalnych

Opisujemy metodę jakościowej i ilościowej analizy tworzenia się granulek stresu w komórkach ssaków po tym, jak komórki są wystawione na działanie bakterii i wielu różnych stresów. Protokół ten można zastosować do badania odpowiedzi granulek stresu komórkowego w szerokim zakresie interakcji gospodarz-bakteria.

Analiza immunofluorescencyjna tworzenia się granulek stresowych po prowokacji bakteryjnej komórek ssaków

Granulki stresu (SGs) to niebłoniaste struktury cytoplazmatyczne, które tworzą się w komórkach narażonych na różne stresy. SG zawierają mRNA, białka wiążące RNA, małe podjednostki rybosomalne, czynniki związane z translacją i różne białka sygnalizacji komórkowej. Protokół ten opisuje przepływ pracy, który wykorzystuje kilka podejść eksperymentalnych do wykrywania, charakteryzowania i ilościowego określania SG w dobrej wierze.

Metody klasyfikacji ognisk cytoplazmatycznych jako granulek stresu ssaków

Obrazowanie żywych komórek dostarcza bogactwa informacji o pojedynczych komórkach lub całych populacjach, które są nieosiągalne przez samo obrazowanie komórek stałych. W tym miejscu opisano protokoły obrazowania żywych komórek w celu oceny decyzji dotyczących losu komórek po leczeniu lekiem antymitotycznym paklitakselem.

Długoterminowe obrazowanie żywych komórek w celu oceny losu komórek w odpowiedzi na paklitaksel

Niezbędne barwniki fluorescencyjne są niezbędnymi narzędziami do analiz obrazowania żywych komórek w nowoczesnej biologii komórek grzybów. W artykule szczegółowo opisano zastosowanie znanych i mniej znanych barwników fluorescencyjnych do śledzenia dynamiki błony plazmatycznej, endo-/egzocytozy i morfogenezy ściany komórkowej u grzybów strzępkowych.

Zastosowanie selektywnych barwników fluorescencyjnych błonowych i ścian komórkowych do obrazowania żywych komórek grzybów strzępkowych

Prezentujemy swobodnie dostępny przepływ pracy stworzony do szybkiej eksploracji i dokładnej analizy ciał komórkowych w określonych przedziałach komórkowych na obrazach mikroskopii fluorescencyjnej. Ten przyjazny dla użytkownika przepływ pracy został zaprojektowany na oprogramowaniu open source Icy i wykorzystuje również funkcje ImageJ. Potok jest przystępny cenowo bez wiedzy z zakresu analizy obrazu.

Substructure Analyzer: Przyjazny dla użytkownika przepływ pracy do szybkiej eksploracji i dokładnej analizy ciał komórkowych na obrazach mikroskopii fluorescencyjnej

Poniższy protokół przedstawia wykrywanie jednoniciowych ognisk DNA w fazie G1 cyklu komórkowego za pomocą synchronizacji cyklu komórkowego, a następnie barwienia immunofluorescencyjnego RPA2.

Wizualizacja ognisk jednoniciowego DNA w fazie G1 cyklu komórkowego

Protokół ten opisuje dwie metody zatrzymania cyklu komórkowego drożdży oraz opcjonalnego uwalniania oraz rozwija zastosowanie mikroskopii fluorescencyjnej do badania procesów zależnych od cyklu komórkowego u S. cerevisiae.

Manipulacja i analiza procesów zależnych od cyklu komórkowego u drożdży pączkujących

Poznaj dynamikę granulek naprężeń G3BP w żywych komórkach pierwotnych myszy, w tym fibroblastach zarodkowych i neuronach hipokampalnych. Ta metoda obrazowania konfokalnego ujawnia zachowanie ziaren stresowych w odpowiedzi na stres komórkowy.

Wizualizacja dynamiki granulek naprężeń G3BP w żywych komórkach pierwotnych

Przeglądaj więcej filmów